A demanda global por energia tem acompanhado o desenvolvimento de novas indústrias, o que exige um constante aprimoramento e busca por novas fontes de energia. Com a conscientização da população a respeito da necessidade de fontes de energia renovável se abriu uma expectativa otimista para o uso da biomassa como fonte de energia. Uma variedade de microrganismos, como bactérias e fungos produzem enzimas que podem ser usadas para a despolimerização de biomassa celulósica em monômeros de glicose. Dentro deste contexto, estudamos uma celulase (XCC3535) de Xanthomonas campestris. Esta proteína é um híbrido natural com dois domínios (um domínio glicosilhidrolase e um domínio semelhante à expansina) que podem possuir funções complementares. Acredita-se que expansinas e proteínas semelhantes a expansinas possam ajudar na degradação da celulose cristalina, participando na ligação ao substrato, seguida pela formação de complexos enzimáticos ou, possivelmente, associadas à superfície para degradação. Este trabalho foi iniciado com análises de bioinformática da sequência para a proteína Glicosilhidrolase permitindo três construções para clonagem : uma completa contendo ambos os domínios (catalítico e semelhante a Expansina), outro com apenas o domínio catalítico GH5, e uma terceiro com apenas o domínio semelhante a Expansina. Obtemos por expressão recombinante em Escherichia coli Rosetta proteína das três construções. A amostra protéica pura foi utilizada para estudos por espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), dicroísmo circular (CD) e cristalização para uso aplicando difração de raios-X. Assim, nosso principal objetivo neste estudo foi a descrição da Glicosilhidrolase XCC3535, permitindo assim a geração de conhecimento para o entendimento da função desta proteína e de seus domínios. / Global demand for energy has grown with the development of new industries that requires constant improvement and search for new sources of energy. Nowadays, the growing awareness of the population about the need for renewable energy have opened an optimistic expectation for the use of biomass as energy source. A variety of microorganisms like bacteria and fungi produce enzymes that can be used for the depolymerization of cellulosic biomass into glucose monomers. Within this context, we study one cellulase (XCC3535) from Xanthomonas campestris organism. This protein is a natural hybrid with two domains (a glicosyl hidrolase domain and an expansin-like domain) which seem to have complementary functions. It is believed that expansins help in the degradation of crystalline cellulose by participating in substrate binding, followed by formation of enzyme complexes or possibly attaching to cell surface. This work was initiated using bioinformatics analysis of the protein sequence and three constructs were made: a full length containing both domains (catalytic and expansin), another with only the catalytic domain, and a third one with only the expansin-like domain. We were able to overexpress these recombinant proteins in Escherichia coli Rosetta strain. The pure protein sample was used for studied by Dynamic Light Scattering (DLS), Small angle X-ray scattering, Circular Dichroism (CD) and Crystallization for X-ray diffraction. Thus, our main objective in this study was structurally describe these proteins, thereby allowing the generation of knowledge for understanding function of these proteins.

Sistemas de Secreção Tipo IV (T4SSs), normalmente compostos por 12 proteínas (VirB1-VirB11 e VirD4) são tipicamente associados às funções de conjugação bacteriana e transferência de fatores de patogenicidade para células hospedeiras. Mas também, muitas espécies da ordem Xanthomonadales possuem um T4SS associado a matar bactérias. O modelo atual de morte de uma célula-alvo mediada pelo T4SS é baseado na secreção de toxinas denominadas XVIPs (\"Xanthomonas VirD4 interacting proteins\") ou X-Tfe (Xanthomonadaceae-T4SS effector) no qual cada XVIP/X-Tfe apresenta uma proteína de imunidade cognata denominada X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). Demonstramos que um XVIP, XAC2609, é secretado através do T4SS de modo que depende de contato célula-célula e do seu domínio XVIPCD (\"XVIP conserved domains\"). A porção N-terminal de XAC2609 codifica um domínio GH19 que cliva a peptideoglicana de E. coli, mas perde a sua atividade na presença do seu inibidor cognato, o X-Tfi XAC2610. Portanto, XAC2609/XAC2610 formam um par de proteínas efetora/imunidade associado ao T4SS de X. citri. Através de diferentes técnicas de microscopias utilizando a cepa Δxac2610, foi observado que XAC2610 protege o envelope celular de X. citri contra efeitos de autólise celular promovidos pela atividade de XAC2609. Ensaios funcionais baseados nas observações de fenótipos de colônias e de formação de biofilme mostraram que XAC2610 confere imunidade para X. citri contra uma atividade 7 intrínseca de XAC2609. A proteína com o papel de reconhecer os substratos através da interação com os sinais de secreção do T4SS é VirD4. No T4SS de X. citri, existe a hipótese de que o domínio XVIPCD seja o sinal de secreção presente nas XVIPs. Logo, os aspectos bioquímicos e biofísicos da interação VirD4-XVIPCD foram investigados através de experimentos de co-purificação por cromatografia de afinidade e exclusão molecular, RMN e SAXS. Demonstramos que o domínio AAD de VirD4 (VirD4AAD) está associado a interagir especificamente com o domínio XVIPCD de XAC2609 (XAC2609XVIPCD), formando um heterodímero em solução. VirD4AAD é um domínio globular e monomérico e XAC2609XVIPCD é desenovelado mas se enovela concomitante à interação com VirD4AAD. Construções de XAC2609 contendo mutações pontuais no domínio XVIPCD foram utilizadas em ensaios in vivo de secreção pela X. citri e ensaios in vitro de interação com VirD4AAD por titulação monitorada por calorimetria isotérmica (ITC). Através desses experimentos, observamos que uma forte interação entre VirD4AAD-XAC2609XVIPCD é essencial para secreção de XAC2609 via o T4SS. Esses resultados permitem concluir que o domínio XVIPCD é o sinal de secreção dos substratos do T4SS de X. citri e que o AAD confere especificidade à VirD4 por interagir com o XVIPCD. Finalmente, através de ensaios de competições bacterianas entre E. coli e X. citri, foram observados diferentes fenótipos associados à função do T4SS: i) nocautes gênicos das subunidades estruturais VirB5, VirB11 abolem a função do T4SS em X. citri.; ii) nocautes de xac2611, apresentaram uma maior vantagem adaptativa do que a cepa selvagem de X. citri em competições e a expressão epissomal de XAC2611 inibe fortemente a função do T4SS e iii) a atividade ATPásica de VirD4 é essencial para a função do sistema e a expressão de mutantes 8 de VirD4 exerce um fenótipo de dominância negativa sobre a função do T4SS em X. citri. / The Type IV secretion System (T4SS) is typically associated with the function of bacterial conjugation and as a pathogenicity factor. T4SSs are normally composed of 12 proteins, VirB1-VirB11 and VirD4. Many species of the order Xanthomonadales possess a T4SS associated with killing bacteria. The current model of the T4SS killing is based on the secretion of toxins denominated XVIPs/X-Tfes (Xanthomonas VirD4 interacting proteins) /(Xanthomonadaceae-T4SS effector) in which each XVIP/X-Tfe has a cognate immunity protein denominated X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). We demonstrate that an XVIP, XAC2609, is secreted through the T4SS so that it depends on cell-cell contact and its XVIPCD domain (\"XVIP conserved domains\"). The N-terminal portion of XAC2609 encodes a GH19 domain which cleaves the E. coli peptidoglycan but loses its activity in the presence of its cognate inhibitor, X-Tfi XAC2610. Therefore, XAC2609 /XAC2610 form a pair of effector/immunity proteins associated with X. citri T4SS. By using the X. citri Δxac2610 strain, has been shown through different microscopic techniques that XAC2610 protects the cell envelope of X. citri against the effects of cellular autolysis promoted by XAC2609 activity. Functional assays based on observations of colony phenotypes and biofilm formation has shown that XAC2610 confers immunity to X. citri against an intrinsic activity of XAC2609. VirD4 is the protein that recognizes the substrates through the interaction with the T4SS secretion signals. In the T4SS of X. citri, is hypothesized that the XVIPCD domain is the secretion signal present in the XVIPs. Here, the biochemical and biophysical aspects of the VirD4-XVIPCD interaction were investigated through Pull- Down, Molecular Exclusion Chromatography, NMR and SAXS assays. It has been shown the AAD domain of VirD4 (VirD4AAD) is associated with specifically interacting with the XAC2609XVIPCD domain (XAC2609XVIPCD), forming a heterodimer in solution. VirD4AAD is a globular and monomeric domain while XAC2609XVIPCD is elongated, but upon interaction with VirD4AAD goes through structural compaction process. Constructs of XAC2609 containing point mutations in the XVIPCD domain were used to perform secretion experiments in X. citri and Isothermal titration calorimetry against VirD4AAD. Through these assays, it has been characterized that a strong interaction between VirD4AAD-XAC2609XVIPCD is essential for secretion of XAC2609 via T4SS. Consequently, these results allow concluding that the XVIPCD domain is the secretion signal of X. citri T4SS substrate and the AAD confer specificity to VirD4 by interact with the XVIPCD domains. Finally, bacterial competitions between E. coli and X. citri showed different phenotypes associated with T4SS function: i) virB5, virB11 knockouts abolish the function of T4SS in X. citri.; ii) knockouts of xac2611 exhibited a higher adaptive efficiency than the wild-type X. citri strain in competitions, but the expression of XAC2611 abolishes the function of T4SS in the wild strain of X. citri; iii) The ATPase activity of VirD4 is essential and exerts a negative dominance over the T4SS function in X.citri.

O maracujazeiro-doce (Passiflora alata Curtis) é uma espécie de cruzamento e diploide (2n = 18) que vem se destacando no Brasil por alcançar melhores cotações no mercado de frutas. Apesar disso, é sensível às adversidades em monocultura, sendo extremamente afetada por variações climáticas, pragas e doenças, dentre elas, a bacteriose causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. O patógeno é endêmico no país, apresentando considerável variabilidade genética nas populações naturais. O presente trabalho teve como objetivo contribuir para o melhoramento genético do maracujazeiro-doce por meio do mapeamento de QTL (Quantitative Trait Loci) relacionados à resistência à bacteriose de uma população F1 segregante, composta de 100 indivíduos e oriunda do cruzamento simples entre dois acessos não endogâmicos. A população foi mantida em casa de vegetação, em delineamento em blocos ao acaso, e foi inoculada com três isolados bacterianos, M129, PA8-2 e AP302, durante 2010, 2012 e 2013, respectivamente. Aos 14 dias após a inoculação, as folhas foram fotografadas e a partir das imagens digitalizadas foram mensuradas as áreas: sadia, de clorose, necrose e lesão (soma das áreas de clorose e necrose), além da área total da folha. Inicialmente, foi realizada uma análise exploratória dos dados e subsequentemente foram selecionados os caracteres área de necrose e de lesão foliar para fins de mapeamento de QTL. Para tanto foi usada uma estratégia desenvolvida para a detecção de QTL em F1 segregantes, com base em modelos mistos, considerando diferentes estruturas de variância e covariância, visando explicar os padrões de variação existentes. A herdabilidade variou de 14% a 64% para o carater necrose, e se manteve estável (28%) para o carater área de lesão, nos três anos de avaliação. Com base em um mapa de ligação integrado previamente construído, foi realizado o mapeamento de QTL por intervalo composto. Foram identificados 20 QTL, sendo 9 deles referentes à necrose e 11 referentes à lesão. Os efeitos individuais variaram de 0,2% a 15,7%, sendo que dois QTL de maior efeito (R² = 15,7%) foram identificados em resposta ao isolado PA8-2, um localizado no grupo de ligação III e o outro no IV do mapa genético integrado do maracujazeiro-doce. Essas informações, aliadas a outros estudos relacionados à produção de frutos, devem contribuir para o melhoramento do maracujazeiro-doce. / The sweet passion fruit (Passiflora alata Curtis) is an outcrossing and diploid (2n = 18) species that is achieving a competitive advantage in the fruit markets in Brazil. Nevertheless, the crop is sensitive to monoculture, being greatly affected by weather changes, pests and diseases, among them the bacterial disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. The pathogen is endemic in the country, with considerable genetic variability in natural populations. The present study aimed to contribute to genetic improvement of sweet passion fruit through QTL (Quantitative Trait Loci) mapping associated with bacterial resistance using a F1 segregating population containing 100 individuals, which resulted from a single cross between two outbred accessions. The population was kept in a greenhouse, arranged in a randomized block design, and innoculated with three bacterial isolates, M129, PA8-2 and AP302, during 2010, 2012 and 2013, respectively. At 14 days after inoculation, the inoculated leaves were photographed, and the following areas from the scanned images were measured: healthy, with chlorosis, necrosis and leaf lesion (sum of the areas with chlorosis and necrosis), in addition to the total area of the leaf. Initially all data were investigated trough an exploratory analysis and those relative to necrotic and leaf lesion areas were subsequently used for QTLmapping. For that we used a strategy developed for QTL detection in F1 segregating populations based on composite interval mapping and mixed models considering different variance and covariance structures in order to explain the existing patterns of variation. Heritabilities ranged from 14% to 64% for the trait necrosis, and remained stable (28%) for the trait leaf lesion for the three years of evaluation. Based on an integrated linkage map previously constructed, we performed a composite interval mapping of QTL. Twenty QTL were identified, 9 of them related to necrosis and 11 related to the leaf lesion. The individual effects ranged from 0,2% to 15,7%, and two large-effect QTL (R² = 15,7%) were identified in response to isolate PA8-2, one assigned to linkage group III and other to linkage group IV of the integrated genetic map of sweet passion fruit. This information combined with other studies related to fruit production may contribute to sweet passion fruit breeding.

Sistemas de transporte tipo ABC são responsáveis pelo transporte de uma grande variedade de substâncias dentre elas os oligopeptídeos e molibdato. Neste trabalho estudamos dois sistemas de transportadores do tipo ABC (mod, envolvido na captação de molibdato e o opp na capação de oligopeptídeos) presentes na bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Em particular analisamos a organização genética dos óperons mod e as proteínas ModA e OppA, componentes solúveis localizados no periplasma e responsáveis pela ligação aos substratos. Por meio de técnicas de modelagem molecular, definimos modelos estruturais para as proteínas ModA e OppA. Para a proteína ModA caracterizamos cinco resíduos que compõem a cavidade ligadora e são responsáveis pelas interações com o íon molibdato, assim como a sua similaridade estrutural e sequencial com ortólogos de 3 grupos distintos de bactérias. Para a OppA, descrevemos o seu comportamento na ancoragem de diferentes oligopeptídeos. Avaliamos parâmetros como a extensão da cadeia e estabelecemos uma ordem crescente de afinidade entre os oligopeptídeos com diferente composição residual e a proteína OppA. / ABC transport system are responsable for the uptake of a large variety of substrates, including oligopeptides and molybdate. In this work we studied two ABC transporter systems (mod and opp responsable for molybdate and oligopeptide uptake, respectively) present in plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). We investigated the genetic organization of mod operon and, particularly, structural feature of periplasmic components, ModA and OppA proteins, of the uptake systems. Using molecular modeling techniques, we defined the structural models of both ModA and OppA proteins. Based on the ModA structural model, amino acid residues involved in molybdate interaction were identified. In addition, both the structural and sequence similarities of Xac ModA and other bacterial orthologs with experimentally defined structural organizations were described. Based on the OppA structural model, we applied molecular docking tools to determine the binding specificity for different oligopeptide regarding number and amino acid composition. Collectively, our results represent an important contribution to the study of ABC transporters in an economically relevant phytopathogen bacterial species.

Les effecteurs TAL (« Transcription Activator-Like ») sont des protéines présentes majoritairement chez les bactéries phytopathogènes du genre Xanthomonas. Ces protéines bactériennes sont dirigées vers le noyau des cellules de la plante hôte où elles induisent l’expression de gènes. L’induction de gènes de « susceptibilité » de la plante est responsable de la maladie. Les effecteurs TAL sont capables de se lier à l’ADN grâce à un motif particulier consistant en une série de répétitions quasi-identiques s’enroulant autour de l’ADN et formant une super-hélice. Au sein des répétitions deux acides aminés localisés à l’intérieur de chaque boucle de la super-hélice interagissent directement et spécifiquement avec les nucléotides. Des combinaisons différentes de ces deux acides aminés se lient spécifiquement à certains nucléotides, selon un code unique.Une conséquence de cette interaction étroite est que les plantes et les bactéries co-évoluent selon une course aux armements où le génome de la plante se diversifie pour éviter d’être la cible des effecteurs TAL, tandis que les gènes tal se diversifient pour s’adapter à de nouvelles cibles. Les aspects évolutifs des effecteurs TAL sont encore largement inconnus, notamment comment la spécificité évolue vers de nouvelles cibles végétales. Cette thèse présente les premiers travaux sur la compréhension des mécanismes évolutifs des gènes tal, principalement abordés par la bioinformatique. Nous avons développé la suite de programmes « QueTAL » qui permet d’une part la construction d’arbres phylogénétiques basés soit sur la séquence des répétitions, soit sur la séquence des sites cibles, d’autre part la recherche de motifs de répétitions pouvant constituer les unités évolutives des effecteurs TAL. Cette suite bioinformatique est publique, en ligne, et activement utilisée par la communauté des scientifiques travaillant sur les effecteurs TAL des Xanthomonas.Ces programmes ont été appliqués (ainsi que d’autres approches) à plus de 900 séquences d’effecteurs TAL de 22 groupes bactériens. Nous avons mis en évidence i) une perte de diversité dans les répétitions chez les Xanthomonas, qui aurait des conséquence sur l’évolution de la structure des effecteurs TAL; ii) l’existence de groupes fonctionnels de gènes tal spécifiques à certains pathovars ; iii) un probable mécanisme évolutif reposant sur la recombinaison (principalement par conversion génique), révélé par le gain ou la perte de répétitions en blocs entiers. Notre hypothèse est que le moteur de la spécialisation des effecteurs TAL est la recombinaison de ces blocs entre gènes conduisant à une diversification fonctionnelle rapide vers de nouvelles cibles végétales.Nous avons ensuite analysé plus en détail la diversité des séquences TAL de souches africaines de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), agent de la bactériose vasculaire, maladie bactérienne la plus importante du riz. Nous avons montré qu’un gène tal résultant d’une conversion génique pouvait être fonctionnel, indiquant que ce mécanisme peut être un moteur évolutif chez les effecteurs TAL. Les données de transcriptomique et de gain de fonction ont permis de mettre en évidence un effecteurs TAL dont la virulence s’exerce par l’activation de deux gènes de susceptibilité, dont l’un n’avait jamais été décrit chez Xoo. Enfin nous présentons des résultats préliminaires sur les effets d’une déconstruction de TALome sur le transcriptome de riz ainsi que des travaux fonctionnels et évolutifs issus de collaborations sur d’autres Xanthomonas.Cette thèse offre un nouveau cadre conceptuel ainsi que de nouveaux outils pour l’analyse fonctionnelle et évolutive des effecteurs TAL qui devraient améliorer la mise au point de stratégies pour la résistance des plantes aux Xanthomonas. / Transcription activator-like (TAL) effectors are proteins found mainly in the genus of Xanthomonas phytopathogenic bacteria. These proteins enter the nucleus of cells in the host plant and can induce the expression of genes. The induction of “susceptibility” S genes in the plant will result in disease. TAL effectors are able to bind DNA thanks to a unique motif consisting of a series of nearly-identical repeats that wrap around the DNA forming a super-helix, in each repeat two amino-acids found in a loop on the inner side of the helix directly interact with nucleotides. Different combination of amino-acids in this loop bind specific nucleotides following a unique code.A consequence of this tight interaction is that plants and bacteria co-evolve following an arms race where the plant genome diversifies to avoid being targeted by the TAL effectors, while tal effector genes diversify to adapt to new targets.Various aspects of TAL effector evolution are still unknown, specially how does specificity arise towards certain targets in the host plant? As first steps towards answering this question, in these thesis we show the results of using primarily bioinformatic strategies to find evolutionary patterns in TAL effector sequences. We designed the suite “QueTAL” containing software for 1) the construction of phylogenetic trees based on repeat sequences, 2) comparison of predicted binding sites for TAL effectors, 3) identification of repeat motifs in TAL effector pairs. This suite was made publicly available and it is being actively used by the Xanthomonas research community.We used these programs along with other strategies to analyze variation in over 900 TAL effector sequences from 22 taxonomic groups finding 1) a loss of diversity of repeats through the Xanthomonas genus, which may impact the evolution of TAL effector architecture, 2) groups of TAL effector orthologs specific to certain taxonomic groups of pathovars that may share common functions, 3) evidence of repeat motifs shared and lost between TAL effectors hinting at extensive recombination (particularly gene conversion) events. We propose that the swapping of repeat blocks between TAL effectors is a motor for TAL effector specialization that allows for fast functional diversification through the acquisition of new targets in the host plants.We then analyzed in detail the diversity of TAL effector sequences in African strains of Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), causing agent of bacterial leaf blight of rice, the most destructive bacterial disease in rice. We found indications of virulence activity of a TAL effector being the product of a gene conversion event, supporting our hypothesis of gene conversion as a motor of TAL effector evolution. We also used transcriptomic data and systematic gain-of-function assays to uncover a TAL effector that exerts a virulence role through the induction of two susceptibility genes, one of which represents a novel class of susceptibility gene in bacterial blight. Finally, we present partial results of transcriptomic analyses aimed at de-constructing the effects of each TAL effector from one strain on the rice transcriptome, as well as results from collaborative functional and evolutionary analyses in other groups of Xanthomonas.Altogether, this thesis offers a new conceptual framework and new tools for the analysis of TAL effector function and evolution, and we hope this will help in the design of strategies aimed at improving resistance to bacteria in agronomically important plants.

A escaldadura das folhas, causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas albilineans, é uma das doenças mais importantes que afetam o cultivo da cana-de-açúcar, causando significativa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda da qualidade do caldo extraído. O impacto dessa doença somado à ausência de agentes químicos ou biológicos para o controle estimula a pesquisa para a descoberta e desenvolvimento de moléculas bioativas como candidatos a novos defensivos agrícolas. Nesse contexto, a enzima N5, N10-metilenotetrahidrofolato desidrogenase ciclohidrolase (FolD) destaca-se como potencial alvo molecular. O projeto de doutoramento visou a caracterização estrutural e funcional da FolD de X. albilineans (XaFolD), além da triagem de moléculas candidatas a inibidores. Para tanto, foram conduzidos estudos integrados em biologia molecular estrutural e química biológica. A expressão heteróloga e purificação da XaFolD resultaram na produção de proteína funcional e adequada aos ensaios de cristalização. A caracterização das atividades desidrogenase e ciclohidrolase da XaFolD indicou os valores de KM para os substratos de ambas as reações, N5, N10-metileno-tetrahidrofolato (50 ± 10 µM) e N5, N10-metenil-tetrahidrofolato (32 ± 3 µM) e do cofator NADP+ (688 ± 81 µM). A estrutura da XaFolD na forma apo, elucidada a 2,1 Å de resolução, revelou uma proteína constituída por 11 hélices alfa e 9 fitas beta distribuídas em um domínio N-terminal catalítico e um domínio C-terminal de ligação ao dinucleotídeo. A enzima pura foi utilizada para a triagem de 1.124 fragmentos por interferometria de biocamada (BLI) e foram identificados três ligantes, DDD00808259 (KD = 260 μM), DDD01305586 (KD = 3 mM) e DDD00100784 (KD = 210 μM), com valores de afinidade na faixa do submilimolar até baixo milimolar. Paralelamente, uma abordagem computacional foi empregada para a triagem virtual de base de dados de compostos como candidatos a ligantes da XaFolD. Os critérios utilizados resultaram na seleção e aquisição de 31 compostos de diferentes classes químicas para avaliação da atividade inibitória frente a enzima alvo. Por fim, ensaios fenotípicos de triagem de inibidores resultaram na descoberta de compostos capazes de inibir o crescimento in vitro de X. albilineans. Dentre os inibidores identificados o composto THP2 apresentou a maior potência, com valor determinado de EC50 igual a 23 ± 2 μM. Os dados estruturais, cinéticos e biofísicos obtidos nesta tese de doutoramento formam a base experimental e computacional para a descoberta e planejamento de inibidores candidatos a novos agroquímicos para o tratamento da escaldadura das folhas. / The leaf scald disease is a severe condition which affects sugarcane crops. Leaf scald is caused by the Gram-negative bacteria Xanthomonas albilineans and it has a dramatic impact on crop productivity, including the yield reduction and dropping the quality of the juice. The impact of this disease besides the absence of chemical or biological agents to treat it stimulates the research towards the discovery and development of bioactive molecules as lead candidates to new agrochemicals. In this context, the enzyme N5, N10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolase (XaFolD) stands out as a potential molecular target. Facing this scenario, the PhD project comprised the structural and functional characterization of X. albilineans FolD (XaFolD) and the screening of molecules to identify inhibitors. For this purpose, integrated studies in structural molecular biology and biological chemistry have been carried out. Suitable protein for crystallization and kinetic assays was produced by heterologous expression. The XaFolD dehydrogenase and cyclohydrolase activities were characterized, revealing KM values of 50 ± 10 µM for N5, N10- methylenetetrahydrofolate, 32 ± 3 µM for N5, N10-methenyltetrahydrofolate, and 688 ± 81 µM for NADP+. The structure of XaFolD in the apo form was elucidated at 2.1 Å resolution and it revealed a protein consisting of 11 alpha helices and 9 beta sheets distributed in the catalytic N-terminal domain and the C-terminal dinucleotide binding domain. Screening of 1,124 fragments by biolayer interferometry (BLI) revealed three ligands, DDD00808259, DDD01305586 and DDD00100784, with determined KD values of 260 µM, 3 mM and 210 M, respectively. Furthermore, a virtual screening was performed to identify XaFolD ligands. As a result, 31 chemically diverse compounds were selected to be evaluated by potency assays. Additionally, phenotypical assays against X. albilineans have been performed and inhibitors were identified. Among them, the compound THP2 presented the highest potency, with a determined value of EC50 equal to 23 ± 2 µM. The structural, kinetic, and biophysical data obtained in this PhD thesis provide the molecular basis for discovering and planning bioactive molecules as agrochemicals to control leaf scald disease.

O presente trabalho visa compreender o processo de degradação da parede celular vegetal de hospedeiros de fitopatógenos da família Xanthomonadaceae. Criamos e aperfeiçoamos uma técnica de enumeração dos genes relacionados ao metabolismo de polissacarídeos, com enfoque na distinção entre aqueles que agem sobre os componentes da parede celular vegetal e sobre outros polissacarídeos. A história evolutiva desse conjunto de enzimas foi delineada através de inferências sobre as relações de homologia entre os genes enumerados, sua presença ou ausência nos diversos genomas abordados e comparação das taxas de mutação entre grupos de homólogos. Além disso, procuramos também, com essa etapa de bioinformática e a etapa seguinte, incrementar a anotação desses genes, muitos descritos como hipotéticos ou com vaga definição de sua função. Na segunda parte do desenvolvimento do projeto foram feitos experimentos de expressão heteróloga e verificação da atividade enzimática para validação da anotação de alguns dos genes identificados. / This study aims to understand the process of degradation of host plant cell walls by plant pathogens of the Xanthomonadaceae family. We created and perfected a technique for enumeration of genes related to the metabolism of polysaccharides, focusing on the distinction between those who act on components of plant cell wall and on other polysaccharides. The evolutionary history of this group of enzymes has been outlined through inferences about the relations of homology between the genes listed, their presence or absence in different genomes and comparison of mutation rates between groups of homologues. Moreover, we also attempted with this bioinformatics step and the next step, to enhance the annotation of these genes, many described as hypothetical or vague in the determination of its function. In the second part of the project development heterologous expression and enzymatic activity assays were made to validate the annotation of some of the genes identified.

O cancro cítrico é considerado na atualidade uma das doenças mais perigosas e prejudiciais à citricultura brasileira e mundial, devido aos danos causados na produção e qualidade dos frutos, sendo a Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) a bactéria fitopatogênica responsável por tais prejuízos. Nosso laboratório iniciou estudos de identificação e análise funcional das interações proteína-proteína de Xac envolvendo sistemas importantes para sua patogenicidade (Alegria et. al., 2004). Nosso objetivo principal foi o estudo funcional e fisiológico de interações já identificadas entre proteínas do sistema de secreção do tipo III (T3SS) da Xac. O foco de nossa pesquisa foi tentar desvendar a importância biológica, na patogenicidade de Xac, das interações proteína-proteína: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaB-HrcV; HrpD6-HrpB1- HrpW. Com este intuito clonamos, expressamos e purificamos as proteínas recombinantes. Produzimos soros policlonais específicos contra cada uma das proteínas citadas acima. Estudamos a interação entre as proteínas in vitro por meio de técnicas como Far-Western Blot, Pull Down, fluorescência e dicroísmo circular. Outro enfoque do nosso trabalho foi monitorar a contribuição individual destas proteínas no desenvolvimento da doença in planta. Para isso produzimos cepas de Xac mutantes para os genes hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 e hrpG. Os nocautes não polares foram infiltrados em plantas de laranja pêra, assim como também as cepas de complementação correspondentes, e assim foi testada a habilidade de desenvolver o cancro cítrico e/ou reverter os sintomas da doença. Também foi monitorada a capacidade de multiplicação e sobrevida in planta das cepas Xac ΔhrpB2, ΔhrcU e ΔhpaB, assim como a secreção das proteínas HrpB2 e HpaA pelo T3SS de Xac. Estudamos com mais detalhe a possível função de HrpB2 no T3SS de Xac, desenvolvendo experimentos para determinar a região da proteína imprescindível para sua função permanecer inalterada. Realizamos mutações sítio dirigidas, a fim de introduzir códons de terminação em diferentes regiões da proteína e testar a habilidade desses fragmentos de reverter os sintomas da doença na planta. Monitoramos a capacidade de proteínas mutantes de reverter fenótipos de patogenicidade em citrus, ausentes na cepa Xac ΔhrpB2 e revertidos na cepa de complementação Xac ΔhrpB2+pUFR047_hrpB2. Desta maneira, determinamos que os últimos seis aminoácidos de HrpB2 estão envolvidos no desenvolvimento da/s função/ões em Xac. / Citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is a disease with significant economic consequences for the Brazilian and global citrus industry due to reductions in production and fruit quality. Our laboratory has initiated studies for the identification and functional analysis of protein-protein interactions involving Xac systems involved in pathogenicity (Alegria et. al., 2004). One objective has been to study functional and physiological interactions between proteins that make up the Xac Type III secretion system (T3SS). The focus of the present study is to unravel the biological significance in Xac pathogenicity of the following previously identified protein-protein interactions: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaBHrcV; HrpD6-HrpB1-HrpW. With therefore cloned, expressed and purified the above-mentioned recombinant proteins. Specific polyclonal serum were produced and interactions between the proteins were studied in vitro using a variety of methods, including Far-Western Blot, Pull Down, fluorescence and circular dichroism. To monitor the individual contribution of these proteins in disease development in planta, we produced mutant Xac strains in which the hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 and hrpG genes were disrupted. The nonpolar knockouts as well as the corresponding complementation strains were infiltrated into Citrus sensensis plants and the development of citrus canker symtoms and bacterial proliferation in planta was evaluated. We also evaluated the T3SS-dependent secretion of proteins HpaA and HrpB2 by these Xac mutant strains. Structure-function relationships of the HrpB2 protein were studied in more detail. We developed experiments to determine the region of the protein essential for its function. We produced a series of hrpB2 mutants which were used to complement the hrpB2 knockout strain and evaluated their abilities to reverse the symptoms of the disease in the plant. The results demonstrate that the last six amino acids HrpB2 are important for its function in the development of disease symptoms by Xac.

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) est l’agent causal de la bactériose vasculaire du riz (BLB), une maladie dévastatrice dans de nombreux pays rizicoles. Chez cette bactérie, les effecteurs de type TAL (Transcription Activator-Like) jouent un rôle majeur dans le pouvoir pathogène. En effet ces effecteurs qui sont secrétés à l’intérieur des cellules eucaryotes hôtes par le système de sécrétion de type III de Xanthomonas agissent comme de véritables facteurs de transcription capables de manipuler le transcriptome de l’hôte via l’induction de gènes spécifiques. L’interaction entre les TALs et le promoteur hôte ciblé est régi selon un code, tel que la région centrale des répétitions des TALs s’associe spécifiquement à sa séquence cible à raison d’une répétition pour un nucléotide. Un TAL peut agir comme une protéine de virulence via l’induction de gènes dits de sensibilité (S) dont l’activation est nécessaire au développement de la maladie, et comme protéine d’avirulence via l’induction d’un gène dit exécuteur (E), dont l’activation promeut les réponses de défense de la plante. L’objectif de cette thèse était d’identifier et de caractériser de nouvelles sources de résistance dépendants des effecteurs de type TAL pour contrôler la BLB. Chez le riz, les gènes de sensibilité à Xoo les mieux caractérisés sont ceux du clade III de la famille SWEET des transporteurs de sucres. L’un d’entre eux, OsSWEET14, est particulièrement important puisqu’il est ciblé par 4 effecteurs TALs différents et issus de souches de Xoo appartenant à des lignées génétiques distinctes et d’origines géographiques différentes. Partant du constat de la convergence pour l’induction de ce gène S majeur, un crible moléculaire du promoteur de OsSWEET14 a été réalisé dans le but d’identifier du polymorphisme pouvant affecter la liaison TAL-ADN et en conséquence entrainer une perte de sensibilité. Ces travaux ont permis l’identification du gène xa41(t) qui confère une forme de résistance récessive et à large spectre contre Xoo. Dans une seconde partie, le criblage phénotypique d’une centaine de variétés de riz résistantes à la souche africaine de Xoo MAI1 a permis d’identifier cinq TALs agissant comme des protéines d’avirulence. C’est le cas des effecteurs Tal2 et Tal9 qui provoquent spécifiquement une réaction de résistance sur la variété de riz IR64 dont le génome a été séquencé. Des analyses de type RNAseq ont été réalisées et ont permis d’identifier une dizaine de gènes exécuteurs E candidats expliquant potentiellement la résistance de IR64 à la souche de Xoo MAI1. Finalement, une troisième stratégie a été menée dans le cadre d’un projet collaboratif, visant à démontrer que PiCO39 conférant la résistance du riz au champignon pathogène Magnaporthe oryzae pouvait aussi contrôler les bactérioses vasculaire et à stries foliaires. Pour ce faire, des TAL artificiels (dTALE) ont été dessinés pour induire spécifiquement l’expression de la construction de M. oryzae AVR1-CO39 dans des riz transgéniques résistant (PiCO39) et sensible (pico39). Nos données montrent que l’induction de AVR1-CO39 par Xoo ou Xoc conduit de manière PiCO39-dépendante à une réduction spectaculaire des symptômes. Ceci démontre que les réactions de défense induites par un gène de résistance à M. oryzae sont également fonctionnelles contre X. oryzae, ouvrant de nouvelles perspectives originales quant aux stratégies de contrôle des bactérioses dues à Xanthomonas. / Bacterial blight caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is the most destructive bacterial disease of rice. Xoo pathogenicity critically depends on the TAL (Transcription Activator-Like) effectors. TALs are type three effectors secreted through a type three secretion system into the eukaryotic cell where they act as transcription factors able to manipulate the host transcriptome via the induction of specific genes. DNA-binding specificity involves a unique central repeated region in the TAL effector whereby each repeat directly binds to one single nucleotide. TALs can act as major virulence effector thtough the induction of so-called susceptibility (S) genes that are essential for disease development, or act as avirulence effector by inducing so-called executor (E) resistance genes that promote host defense responses. The goal of this PhD project was to identify and characterize novel TAL-dependent resistance sources to control BLB. In rice, the best characterized S genes are those of the clade III of the sugar transporters SWEET family. The most important is OsSWEET14 as this gene is targeted at unrelated DNA boxes by four TAL effectors, which belong to strains of different lineages and geographic origins. The evolutionary convergence for the induction of SWEET14 reflects its crucial role as major determinant of rice susceptibility to Xoo. A molecular screening of the OsSWEET14 promoter was performed using the natural diversity of wild African rice in order to identify polymorphism that could affect the TAL/DNA binding and thus lead to loss of susceptibility. This work allowed the identification of xa41(t) that confers broad spectrum recessive resistance to Xoo. In a second part of my PhD project, a phenotypic screen for resistance against the Xoo African strain MAI1 of a hundred of rice accessions enabled to identify five TALs. Among them, Tal2 and Tal9 were shown to trigger resistance on the rice variety IR64 the genome of which is fully sequenced. RNAseq analysis identified a small set of resistance E gene candidates underlying potentially IR64 resistance against Xoo strain MAI1. Finally, as a third strategy we aimed within a collaborative project to investigate if PiCO39 that confers resistance of rice towards Magnaporthe oryzae could also control BLB and BLS (Bacterial leaf streak). To that end, Artificial TAL effectors (dTALe) were designed to induce specifically the M. oryzae AVR1-CO39 construct in resistant (PiCO39) and susceptible (piCO39) transgenic backgrounds. We show that the induction of AVR1-CO39 by Xoo or Xoc drastically impairs bacterial colonization in a PiCO39-dependent manner, highlighting the potential of exploiting rice blast or other resistance genes as novel strategies to control rice pathogenic Xanthomonas bacteria.

O ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), substância utilizada como autoindutor nos sistemas de Quorum Sensing da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, foi utilizado como um modelo de estudos para a análise de moléculas secretadas por populações celulares utilizando técnicas eletroanalíticas. Cultivos celulares provenientes de três linhagens diferentes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri foram utilizados para os estudos. Uma linhagem selvagem (WT), que produzia DSF em quantidades naturalmente observadas, e duas linhagens geneticamente modificadas. Em uma linhagem (ΔC) a modificação genética resultava em elevada produção de DSF, para a segunda (ΔF) o resultado era a anulação da produção do autoindutor. As principais técnicas analíticas utilizadas foram: voltametria cíclica, eletroforese capilar e cromatografia líquida (com detecção UV-Vis e acoplada a espectrometria de massas), sendo a última para efeitos de comparação. Procedimentos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos foram realizados como etapas de pré-tratamento de amostras, visando diminuir a quantidade de interferentes e realizar uma pré-concentração do analito. Três metodologias principais foram adotadas. Uma primeira voltada para a diferenciação dos cultivos celulares, analisando-se ou os sobrenadantes provenientes dos cultivos ou os extratos resultantes dos pré-tratamentos desses sobrenadantes, tendo como principal foco a identificação de um sinal diferencial entre os cultivos que correspondesse às quantidades de DSF, ou seja, inexistente para a linhagem ΔF, de alta intensidade para linhagem ΔC e de intensidade intermediária para a linhagem WT. A segunda metodologia foi baseada no uso de uma molécula modelo para realizar experimentos e obter dados como parâmetros físico-químicos, o ácido láurico (ácido dodecanóico) foi escolhido por sua semelhança estrutural e facilidade de obtenção, curvas de calibração e experimentos de separação de moléculas com estrutura semelhante foram realizados com a técnica de eletroforese capilar. Uma terceira metodologia foi desenvolvida utilizando o padrão do ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), curvas de calibração foram obtidas com o padrão isolado apresentando ótimas linearidades, tanto com a técnica de eletroforese capilar quanto com cromatografia líquida com detecção UV-Vis, experimentos de adição de padrão às amostras também foram executados. Os experimentos realizados com as amostras não apresentaram os resultados esperados, os problemas foram associados principalmente à quantidade de interferentes na amostra e a baixa concentração do analito nos cultivos, sendo que os métodos de extração realizados não foram suficientes para solucioná-los. O insucesso da técnica de voltametria cíclica foi associado ao envenenamento do eletrodo, devido à alta quantidade de compostos orgânicos presentes na amostra, e dúvidas relacionadas à eletroatividade do DSF. As dificuldades encontradas com a técnica de eletroforese capilar foram associadas à alta força iônica da amostra, presença de interferentes e baixa concentração do analito nos cultivos. Mesmo os experimentos realizados com cromatografia líquida acoplada a detecção com espectrometria de massas não atenderam às expectativas, dificultando a elucidação dos problemas encontrados até então e impossibilitando o desenvolvimento de uma metodologia que atendesse aos objetivos propostos. / Cis-11-methyl-2-dodecenoic acid, also known as DSF (autoinducer of the Quorum Sensing system used by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri) was explored as a study model for the cell secreted molecules analysis by electroanalytical techniques. Cell cultures from three different cell lines of the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri were used for this study. A wild type (WT), which produced DSF in naturally observed quantities and two genetically modified ones. One of the lines (ΔC) had a genetic modification that resulted in an elevated production of DSF, and the other (ΔF) had a modification that stopped DSF production. Main analytical techniques used were: cyclic voltammetry, capillary electrophoresis and liquid chromatography (with UV-Vis detection and coupled with mass spectrometry), this last one was used with comparison purposes. Liquid-liquid extractions with organic solvents were realized as sample pre-treatment steps aiming the reduction of interfering species and analyte pre-concentration. Three main methodologies were adopted. One based in the differentiation of cell cultures analyzing or the cell culture supernatants or the resulting extracts from the pre-treatment steps. The main focus was the identification of a differential signal between the cultures that corresponded to the DSF quantities, in other words, null for the ΔF line, high intensity for the ΔC line and a an intermediary intensity for the WT line. The second methodology was based in experiments with a model molecule to obtain some data such as physical-chemistry parameters. Lauric acid (dodecanoic acid) was chosen for its structural similarity and easily acquisition. Calibration curves and similar structure molecules separation experiments were realized using capillary electrophoresis. Third and last methodology was developed using standard cis-11-methyl-2-dodecenoic acid (DSF). Calibration curves were obtained with the isolated standard showing great linearities using both capillary electrophoresis and liquid chromatography with UV-Vis detection. Experiments of standard addiction to the samples were also realized. Experiments using the samples did not show the expected results. Problems found were mainly associated with high amount of interfering species and low analyte concentration at the cultures, extraction methods used were not enough to solve this. The failures with the cyclic voltammetric techniques were associated to electrode poisoning, due to the high amount of organic compounds present at the sample, and DSF lack of electroactivity. Difficulties found with capillary electrophoresis were associated with the samples high ionic strength, presence of interfering species and low analyte concentration. Even liquid chromatography coupled with mass spectrometry experiments didn\'t attended the expectations. Making it difficult to elucidate the problems and not allowing the development of a methodology that could achieve the proposed objectives.