Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Adalberto Pessoa Junior / Banca: Luciano Takeshi Kishi / Resumo: O complexo enzimático xilanolítico é responsável por hidrolisar as ligações glicosídicas entre os monômeros constituintes da xilana, sendo esta um polissacarídeo presente na porção hemicelulolítica das paredes celulares vegetais, e suas enzimas se destacam pelas diversas aplicações industriais. O objetivo do projeto foi efetuar a caracterização e isolamento das xilanases produzidas pelo fungo termofílico Rasamsonia emersonii em cultivo em estado sólido. Foram realizados ensaios para avaliar os efeitos do pH, da temperatura, de diversas substâncias químicas, cátions e compostos fenólicos na atividade enzimática. A estimativa da massa molecular foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e por cromatografia de filtração em gel em resina Sephadex G-75. Como valor ótimo para o extrato enzimático bruto obteve-se 5,5 e 7,0 para o pH, e 80ºC para a temperatura ótima em incubação de 4 minutos. Em relação à estabilidade do extrato bruto, os maiores valores ocorreram entre as faixas de pH de 4 a 5,5, e 50ºC para temperatura. Todos os reagentes testados apresentaram diminuição da atividade enzimática sobre o extrato bruto, por outro lado, o agente quelante EDTA aumentou 4%. Os cátions testados aumentaram (Na+, K+, Cd2+, Sr2+, Ca2+) ou diminuíram (Zn2+, Al3+, Fe3+, Mn2+, Mg2+, Ni2+, Ba2+, Li+, Co2+, Cr3+ e Cu2+) a atividade. Em relação aos compostos fenólicos, somente o ácido tânico induziu decréscimo da atividade xilanolítica do extrato bruto. O pI foi estimado em... / Abstract: The xylanolytic enzyme complex is responsible for hydrolyzing glycosidic bonds between the monomers of xylan, being a polysaccharide present of the hemicellulolitic in plant walls. These enzymes standing out because have many industrial applications. The objective of this investigation was to characterize and isolate the xylanases present in the crude extract produced by the thermophilic fungus Rasamsonia emersonii in solid state cultivation. Tests were performed to evaluate the effects of pH, temperature, various chemicals and cations on enzymatic activity, determining optimal conditions and stability of the enzymes. The molecular weight estimation was performed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and gel filtration chromatography on Sephadex G-75 resin. Optimum pH values obtained were 5.5 and 7.0 and 80ºC for the optimum temperature for a 4 minutes incubation for the crude enzyme extract. Regarding the stability of the crude extract, the highest values occurred between the ranges of 4 to 5.5 for pH, and 50ºC for thermal stability. All the reagents tested showed enzymatic inhibition on the crude extract, on the other hand, the chelating agent EDTA increased enzyme activity by 4%. The tested cations increased (Na+, K+, Cd2+, Sr2+, Ca2+) or decreased (Zn2+, Al3+, Fe3+, Mn2+, Mg2+, Ni2+, Ba2+, Li+, Co2+, Cr3+ and Cu2+) activity. In relation to the phenolic compounds, only tannic acid induced a decrease in the xylanolytic activity of the crude extract. The pI ... / Mestre

Um dos desafios relacionados à utilização de xilana para a fabricação de biofilmes, aditivos para fabricação de papéis, medicamentos e alimentos é a sua extração na forma polimérica e com alta pureza. Neste trabalho o material de partida para a obtenção de xilana foi o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado quimio-termomecanicamente com álcali e sulfito, visando aproveitar esta fração, que corresponde a aproximadamente 25% (m/m). A composição química das xilanas no material original foi determinada, bem como o tipo e a proporção dos grupos pendentes. A extração de xilanas do bagaço de cana pré-tratado foi feita utilizando uma endoxilanase recombinante da família GH30, denominada xilanase VI, com mecanismo de ação dependente da presença de ácidos urônicos para a clivagem da cadeia principal de xilana. Partindo-se do DNA genômico de Trichoderma reesei QM6a, que contém o gene da xilanase VI, foi feita a clonagem em um vetor e este foi inserido em Escherichia coli Rosetta-gami, Pichia pastoris e Aspergillus nidulans A773. Os melhores resultados de expressão da xilanase VI foram obtidos em E. coli, porém os estudos com este sistema serão conduzidos em outro trabalho. A xilanase VI expressa em A. nidulans A773 foi parcialmente purificada e exibiu ótimos de atividade em pH 4-5 à 50 oC. Esta xilanase apresentou maior ação em glucuronoxilana de beechwood e em arabinoglucuronoxilana extraída de bagaço de cana, quando comparado à xilana de oat spelts e à medula de cana. Os dados de Km e Vmax em xilana beechwood exibiram valores de 0,783 mg/ml e 0,4675 UI/ml, respectivamente, em 10 min de reação. A extração enzimática do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino solubilizou 14% das xilanas e após uma extração alcalina o rendimento aumentou para 32%. A massa molar média das xilanas extraídas na etapa enzimática foi de 4000 Da, produzindo oligossacarídeos em vez de xilobiose ou xilose, mesmo após longos tempos de reação. Esta enzima se mostrou eficaz para a extração de xilanas de cadeias longas quando se comparada às xilanas extraídas por xilanases de outras famílias. / One of the challenges related to the use of xylan for the manufacture of biofilms, papermaking additives, drugs and food is its extraction in polymer form with high purity. In this project, the starting material for xylan isolation was the sugarcane bagasse pretreated with alkali-sulfite chemothermomechanical process, to recover this fraction, which corresponds to approximately 25% (w/w). The chemical composition of original xylans was determined, as well as the type and proportion of the pendant groups. Xylan extraction from pre-treated sugarcane bagasse was performed using a recombinant endoxylanase from the GH30 family, named xylanase VI, with an appendage-dependent mechanism of action for the xylan backbone cleavage. Starting from the genomic DNA of Trichoderma reesei QM6a, which contains the xylanase VI gene, cloning was done in a vector that was inserted into Escherichia coli Rosetta-gami, Pichia pastoris and Aspergillus nidulans A773. The highest xylanase VI expression results were obtained in E. coli, but studies with this system it will be conducted in future works. Xylanase VI expressed in A. nidulans A773 was purified and showed the higher activity at pH 4-5 at 50 oC. This xylanase present higher activities on beechwood glucuronoxylan and on arabinoglucuronoxylan extracted from sugarcane bagasse than on oat spelts xylan and sugarcane pith. Data for Km and Vmax in xylan beechwood showed values of 0.783 mg / ml and 0.4675 IU / ml, respectively, in 10 min of reaction. The enzymatic extraction of alkaline sulphite pretreated sugarcane bagasse solubilized 14% of the xylans followed by an alkaline extraction with yield of 32%. The average molar mass of xylans extracted in the enzymatic step was 4000 Da, producing oligosaccharides instead of xylobiose or xylose, even after long reaction periods. This enzyme proved effective for xylan extraction of long chains when compared to xylan hydrolysates by xylanases from other families.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-26Bitstream added on 2014-06-13T18:41:37Z : No. of bitstreams: 1 benedetti_acep_dr_arafcf.pdf: 555249 bytes, checksum: c34c45268021bed2af4612d36cdf1d73 (MD5) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A descoberta de resíduos agrícolas, como fonte de energia renovável tem colaborado para o desenvolvimento industrial e preservação do meio ambiente. Desta maneira, a degradação da parede celular destes resíduos tem grande importância na fabricação de pães, alimentos, bebidas, têxtil, papel e celulose entre outros produtos. A degradação enzimática destes polímeros esta se tornando uma alternativa mais atraente do que a utilização de substâncias químicas e processos mecânicos. Alguns fungos termófilos participam desta degradação enzimática, como Humicola grisea var. thermoidea, isolado do solo, é conhecido como bom produtor do complexo xilanolítico. Além deste, um fungo termófilo isolado da polpa do fruto cupuaçuzeiro em decomposição foi estudado e produziu xilanase. Esses fungos foram mantidos em meios sólidos contendo ágar e farinha de aveia. O fungo isolado da polpa do fruto cresceu em meio liquido empregando diferentes resíduos agrícolas como fonte de carbono. Dentre os vários resíduos empregados para se otimizar a produção de xilanase, o melhor foi o sabugo de milho. Esse foi utilizado nos experimentos na proporção de 1,0% (m/v), em meio líquido contendo 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 0,1% NH4Cl; 0,5% água de maceração de milho. O pH ótimo foi 5,0 e a temperatura ótima de 60ºC. A xilanase presente no extrato clarificado em caulim apresentou cinética Michaeliana com Km de 10,41 ± 0,282 mgmL-1 e Vmax 3,32 ± 0,053 U (mg protein)-1. Para acompanhar o processo de clarificação da enzima solúvel realizou-se SDS-PAGE verificando a presença de uma banda protéica com atividade xilanolítica de massa molecular de aproximadamente 30kDa e a Cromatografia Sílica Gel P60 para verificar os produtos da hidrólise da xilana em função do tempo e da associação de xilosidase do fungo termófilo Humicola com a xilanase do fungo isolado do fruto... / The researches of agricultural residues as renewable energy sources have been contributing for the industrial development and the environment conservation. Thus, the degradation of these residues’ cell walls has great importance in fabrication of bread, food, drinks, textile, paper, cellulose, and other products. The enzymatic degradation of such polymers is becoming an attractive option when compared to the use of chemical substances and mechanical processes. Some thermophilic fungi take role in this enzymatic degradation, such as Humicola grisea var. thermoidea, isolated from soil, and is known to be a good producer of the xylanolytic complex. Besides it, another thermophilic fungus, isolated from the Theobroma grandiflorum decomposing fruit pulp, was studied and also produced xylanases. These fungi were kept in solid media containing agar and oat bran. The fungus isolated from the fruit pulp grew in liquid media in wich different kinds of agricultural residues were employed as carbon sources. Among the various types of residues that were used to optimize the xylanase production, corn cobs proved to be the best one. It was used in assays in a proportion of 1,0% (m/v), in liquid media containing 0.1% of CaCO3, 0.5% of NaCl, 0.1% of NH4Cl, and 0.5% of corn steep liquor. The pH optima was 5.0 and the temperature optima was 60ºC. The xylanase present in the kaolin clarified extract showed a Km of 10.41 ± 0.282 mg.mL-1, and Vmax 3.32 ± 0.053 U (mg.protein)-1. In order to follow the soluble enzyme clarification process, SDS-PAGE was run, verifying the presence of a proteic band with xylanolytic activity of, approximately, 30kDa of molecular mass. Furthermore, Silica Gel 60 Thin Layer Chromatography (TLC) was used to verify the xylan hydrolysis products in function of time and the association of Humicola sp. thermophylic fungus xylosidase with the xylanase produced by the fruit pulp... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Aline Aparecida Pizzirani Kleiner / Banca: Helia Hamuri Sato / Banca: Rosa dos Prazeres M.F. Inocentes / Banca: Marcia Regina Brochetto Braga / Resumo: Enzimas degradadoras de xilana, principal componente da hemicelulose, têm sido utilizadas em várias aplicações biotecnológicas, sendo que em alguns processos é necessário o uso de enzimas purificadas. Aplicações comerciais para as enzimas xilanolíticas envolvem a hidrólise enzimática da xilana, que está presente nos resíduos agrícolas e agroindustriais, sendo convertido a xilose e outros açúcares, que podem ser utilizados como substratos em processos fermentativos para a obtenção de proteínas celulares, combustíveis líquidos e outras substâncias químicas. A utilização destas enzimas também diminui a liberação de agentes poluentes em determinados efluentes, como da indústria de polpa de celulose. Xilanases e β- xilosidases são produzidas principalmente por bactérias e fungos, sendo que em geral, os fungos as produzem em níveis mais elevados. O gênero Penicillium apresenta espécies já caracterizadas como boas produtoras destas enzimas. Uma linhagem deste gênero, isolada de solo brasileiro, na região da Mata Atlântica e identificada como Penicillium sclerotiorum destacou-se por produzir xilanase em níveis elevados. O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da influência das condições de cultivo sobre a produção do complexo xilanolítico produzido por P. sclerotiorum, na caracterização físico-química desse sistema, bem como purificação e caracterização bioquímica de seus principais componentes. Por meio da determinação das condições ótimas de produção e da caracterização deste complexo enzimático foi possível estabelecer metodologias eficientes de purificação de xilanases e uma β-xilosidase. Através da caracterização físico-química das enzimas purificadas, foi possível avaliar seu potencial biotecnológico, visando futuras aplicações em processos industriais. / Abstract: Xylan degrading enzymes, the main component of hemicellulose, have been used in various biotechnological applications, and in some cases the use of purified enzymes is necessary. Commercial applications of xylanolytic enzymes involve the enzymatic hydrolysis of xylan, which is present in agricultural and agro-industrial wastes, and can be converted to xylose and other sugars, which can be further used as substrates in fermentation processes to obtaining cellular protein, liquid fuels and other chemicals. The utilization of these enzymes also decreases the release of certain pollutants in wastewater, as in the pulp and paper industry. Xylanases and β-xilosidases are mainly produced by bacteria and fungi, and in general, the fungi produce them at higher levels. The genus Penicillium presents species already characterized as good producers of these enzymes. One strain of this genus isolated from Brazilian soil in the Mata Atlântica region and identified as Penicillium sclerotiorum attracted attention by producing xylanase in high levels. The objective of this study was to evaluate the influence of culture conditions on the production of the xylanolytic complex produced by P. sclerotiorum to characterize physical and chemical properties of this system as well to purify and biochemical characterize its main components. By determining optimal conditions for production and by characterizing this enzymatic complex it was possible to establish efficient methodologies for purification of xylanases and one β-xylosidase. Through their physical and chemical characterization, it was possible to evaluate their biotechnological potential for future applications in industrial processes. / Doutor

O cultivo da cana-de-açúcar é uma das atividades agrícolas mais importantes no Brasil, produzindo após a moagem o caldo, utilizado para a produção de açúcar e etanol, e o bagaço, resíduo lignocelulósico. O bagaço é recalcitrante à hidrólise enzimática, em parte pela baixa porosidade, resultante do recobrimento das fibrilas de celulose com lignina e hemicelulose. Neste estudo, o bagaço foi pré-tratado com sulfito alcalino nas concentrações de 2,5% de NaOH e 5% de Na2SO3 versus 5% de NaOH e 10% de Na2SO3 para produzir substratos para hidrólise enzimática. Ambos pré-tratamentos produziram substratos com teor de hemicelulose, grupos ácidos, grau de retenção de água e área superficial semelhantes. O conteúdo de lignina foi bem diferente nos bagaços pré-tratados com 5% de sulfito (21% de lignina) e 10% de sulfito (13% de lignina). A hidrólise da celulose e hemicelulose do bagaço com alto teor de lignina, utilizando a carga enzimática de 40 FPU/g e 80 U/g de ?-glicosidase foram próximas a 50% em 48 horas e, mesmo no bagaço com pouca lignina a conversão dos polissacarídeos não foi completa (90%). Considerando a importância do tipo de enzimas para a conversão dos polissacarídeos dos bagaços pré-tratados, realizou-se um planejamento experimental 24 com 6 pontos centrais ampliado em estrela, para avaliar uma mistura de enzimas partindo de 5 FPU/g do extrato comercial de Trichoderma reesei (celluclast) combinado com enzimas purificadas comerciais: xilanase de Neocallimastix patriciarum (família 10), xilanase de Thermotoga maritima (família 11), ?-xilosidase de Selelomonas ruminantium e ?-glicosidase de Aspergillus niger. A aplicação da mistura de enzimas otimizada no bagaço pré-tratado com alta carga de sulfito aumentou a conversão de celulose e hemicelulose em 6,6% e 15% respectivamente, comparado com a mistura de referência (5FPU de celluclast e 10UI de Novozyme 188 por grama de bagaço). A suplementação da celluclast com ?-xilosidase e ?- glicosidase foi estatisticamente significativa em 24 horas de hidrólise a um nível de 95% de confiança e a interação da xilanase 10 e 11 foi significativa com um nível de confiança de 90%. Quando foram realizados os mesmos ensaios do planejamento com o substrato com alto teor de lignina, as hidrólises da celulose e hemicelulose com a mistura de enzimas foram inferiores à obtida com a referência. A suplementação com xilanases e ?-xilosidase aumentou a conversão enzimática da hemicelulose apenas do substrato com pouca lignina, entretanto nos hidrolisados de ambos os substratos foi detectada a presença de xilooligossacarídeos, indicando a necessidade de adição de mais ?-xilosidase à mistura enzimática. As velocidades iniciais de hidrólise da celulose e hemicelulose foram pouco alteradas quando a lignina do bagaço reduziu de 21% para 13%, porém a conversão em 48 h de reação foi o dobro. Este estudo mostrou que o acesso das enzimas à hemicelulose foi limitado pelo alto teor de lignina do substrato, e que o benefício do uso de xilanases para a conversão de celulose foi obtido no substrato pré-tratado com alta carga de sulfito. / The cultivation of sugarcane is one of the most important agricultural activities in Brazil. The juice obtained from the crushed stalks of sugarcane is used to produce sugar and ethanol and the dry, fibrous residue remaining is the bagasse. Bagasse is recalcitrant to enzymatic hydrolysis, in part by low porosity due to the partial filling of space between the cellulose microfibrils by lignin and hemicelluloses. In this study, bagasses were pretreated with alkaline sulfite at concentrations of 2.5% NaOH and 5% Na2SO3 NaOH versus 5% and 10% Na2SO3 to produce substrates for enzymatic hydrolysis. Both substrates presented similar hemicellulose content, acid groups, water retention and specific surface area. Lignin content differed between pretreated bagasse with 5% sulfite (21%) and 10% sulfite (13%). The hydrolysis of cellulose and hemicellulose of bagasse with high lignin content, using 40 FPU/g and 80 U/g of ?-glucosidase was aproximately 50% in 48 hours and even on bagasse with low lignin content, the polysaccharides conversion was not complete (90%). Considering the importance of the type of enzymes for the conversion of polysaccharides of pretreated bagasses, a 24 full factorial experimental design with six central points was performed to evaluate a mixture of enzymes. A load of 5 FPU/g of Trichoderma reesei extract (celluclast) was combined with purified commercial enzymes: Neocallimastix patriciarum xylanase (family 10), Thermotoga maritima xylanase (family 11), Selelomonas ruminantium ?-xylosidase and ?-glucosidase from Aspergillus niger. The optimized mixture improved the conversion of cellulose and hemicellulose of the substrate with low lignin content in 6.6% and 15% respectively, when compared to the reference mixture (5FPU of celluclast and 10 IU of novozyme 188 per gram of bagasse). Supplementation with ?-xylosidase and ?-glucosidase was statistically significant at 24 hours of reaction and also the interaction of xylanases 10 and 11. When the same assays were performed with the substrate with low lignin, hydrolysis of the cellulose and hemicellulose with a mixture of purified enzymes was inferior to that obtained by the reference. Supplementation with xylanase and ?-xylosidase improved the enzymatic conversion only for substrate with low lignin content, however in supernatants of both substrates was detected the presence of xylo-oligosaccharides, suggesting the need for further addition of ?-xylosidase to the enzyme mixture. Initial rate of cellulose and hemicellulose hydrolysis changed very little when the lignin in the bagasse was reduced from 21% to 13%, but the conversion at 48 h conversion time was twice higher. This study showed that access of enzymes to the hemicellulose was limited by the high lignin content of the substrate, and that the benefit of using xylanases for the conversion of cellulose was obtained on the substrate pretreated with high sulfite load.

O cultivo da cana-de-açúcar é uma das atividades agrícolas mais importantes no Brasil, produzindo após a moagem o caldo, utilizado para a produção de açúcar e etanol, e o bagaço, resíduo lignocelulósico. O bagaço é recalcitrante à hidrólise enzimática, em parte pela baixa porosidade, resultante do recobrimento das fibrilas de celulose com lignina e hemicelulose. Neste estudo, o bagaço foi pré-tratado com sulfito alcalino nas concentrações de 2,5% de NaOH e 5% de Na2SO3 versus 5% de NaOH e 10% de Na2SO3 para produzir substratos para hidrólise enzimática. Ambos pré-tratamentos produziram substratos com teor de hemicelulose, grupos ácidos, grau de retenção de água e área superficial semelhantes. O conteúdo de lignina foi bem diferente nos bagaços pré-tratados com 5% de sulfito (21% de lignina) e 10% de sulfito (13% de lignina). A hidrólise da celulose e hemicelulose do bagaço com alto teor de lignina, utilizando a carga enzimática de 40 FPU/g e 80 U/g de ?-glicosidase foram próximas a 50% em 48 horas e, mesmo no bagaço com pouca lignina a conversão dos polissacarídeos não foi completa (90%). Considerando a importância do tipo de enzimas para a conversão dos polissacarídeos dos bagaços pré-tratados, realizou-se um planejamento experimental 24 com 6 pontos centrais ampliado em estrela, para avaliar uma mistura de enzimas partindo de 5 FPU/g do extrato comercial de Trichoderma reesei (celluclast) combinado com enzimas purificadas comerciais: xilanase de Neocallimastix patriciarum (família 10), xilanase de Thermotoga maritima (família 11), ?-xilosidase de Selelomonas ruminantium e ?-glicosidase de Aspergillus niger. A aplicação da mistura de enzimas otimizada no bagaço pré-tratado com alta carga de sulfito aumentou a conversão de celulose e hemicelulose em 6,6% e 15% respectivamente, comparado com a mistura de referência (5FPU de celluclast e 10UI de Novozyme 188 por grama de bagaço). A suplementação da celluclast com ?-xilosidase e ?- glicosidase foi estatisticamente significativa em 24 horas de hidrólise a um nível de 95% de confiança e a interação da xilanase 10 e 11 foi significativa com um nível de confiança de 90%. Quando foram realizados os mesmos ensaios do planejamento com o substrato com alto teor de lignina, as hidrólises da celulose e hemicelulose com a mistura de enzimas foram inferiores à obtida com a referência. A suplementação com xilanases e ?-xilosidase aumentou a conversão enzimática da hemicelulose apenas do substrato com pouca lignina, entretanto nos hidrolisados de ambos os substratos foi detectada a presença de xilooligossacarídeos, indicando a necessidade de adição de mais ?-xilosidase à mistura enzimática. As velocidades iniciais de hidrólise da celulose e hemicelulose foram pouco alteradas quando a lignina do bagaço reduziu de 21% para 13%, porém a conversão em 48 h de reação foi o dobro. Este estudo mostrou que o acesso das enzimas à hemicelulose foi limitado pelo alto teor de lignina do substrato, e que o benefício do uso de xilanases para a conversão de celulose foi obtido no substrato pré-tratado com alta carga de sulfito. / The cultivation of sugarcane is one of the most important agricultural activities in Brazil. The juice obtained from the crushed stalks of sugarcane is used to produce sugar and ethanol and the dry, fibrous residue remaining is the bagasse. Bagasse is recalcitrant to enzymatic hydrolysis, in part by low porosity due to the partial filling of space between the cellulose microfibrils by lignin and hemicelluloses. In this study, bagasses were pretreated with alkaline sulfite at concentrations of 2.5% NaOH and 5% Na2SO3 NaOH versus 5% and 10% Na2SO3 to produce substrates for enzymatic hydrolysis. Both substrates presented similar hemicellulose content, acid groups, water retention and specific surface area. Lignin content differed between pretreated bagasse with 5% sulfite (21%) and 10% sulfite (13%). The hydrolysis of cellulose and hemicellulose of bagasse with high lignin content, using 40 FPU/g and 80 U/g of ?-glucosidase was aproximately 50% in 48 hours and even on bagasse with low lignin content, the polysaccharides conversion was not complete (90%). Considering the importance of the type of enzymes for the conversion of polysaccharides of pretreated bagasses, a 24 full factorial experimental design with six central points was performed to evaluate a mixture of enzymes. A load of 5 FPU/g of Trichoderma reesei extract (celluclast) was combined with purified commercial enzymes: Neocallimastix patriciarum xylanase (family 10), Thermotoga maritima xylanase (family 11), Selelomonas ruminantium ?-xylosidase and ?-glucosidase from Aspergillus niger. The optimized mixture improved the conversion of cellulose and hemicellulose of the substrate with low lignin content in 6.6% and 15% respectively, when compared to the reference mixture (5FPU of celluclast and 10 IU of novozyme 188 per gram of bagasse). Supplementation with ?-xylosidase and ?-glucosidase was statistically significant at 24 hours of reaction and also the interaction of xylanases 10 and 11. When the same assays were performed with the substrate with low lignin, hydrolysis of the cellulose and hemicellulose with a mixture of purified enzymes was inferior to that obtained by the reference. Supplementation with xylanase and ?-xylosidase improved the enzymatic conversion only for substrate with low lignin content, however in supernatants of both substrates was detected the presence of xylo-oligosaccharides, suggesting the need for further addition of ?-xylosidase to the enzyme mixture. Initial rate of cellulose and hemicellulose hydrolysis changed very little when the lignin in the bagasse was reduced from 21% to 13%, but the conversion at 48 h conversion time was twice higher. This study showed that access of enzymes to the hemicellulose was limited by the high lignin content of the substrate, and that the benefit of using xylanases for the conversion of cellulose was obtained on the substrate pretreated with high sulfite load.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-07Bitstream added on 2014-06-13T19:22:45Z : No. of bitstreams: 1 knob_a_dr_rcla.pdf: 1207813 bytes, checksum: 318e70abc84de2d440d3a9b60c7b7088 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Enzimas degradadoras de xilana, principal componente da hemicelulose, têm sido utilizadas em várias aplicações biotecnológicas, sendo que em alguns processos é necessário o uso de enzimas purificadas. Aplicações comerciais para as enzimas xilanolíticas envolvem a hidrólise enzimática da xilana, que está presente nos resíduos agrícolas e agroindustriais, sendo convertido a xilose e outros açúcares, que podem ser utilizados como substratos em processos fermentativos para a obtenção de proteínas celulares, combustíveis líquidos e outras substâncias químicas. A utilização destas enzimas também diminui a liberação de agentes poluentes em determinados efluentes, como da indústria de polpa de celulose. Xilanases e β- xilosidases são produzidas principalmente por bactérias e fungos, sendo que em geral, os fungos as produzem em níveis mais elevados. O gênero Penicillium apresenta espécies já caracterizadas como boas produtoras destas enzimas. Uma linhagem deste gênero, isolada de solo brasileiro, na região da Mata Atlântica e identificada como Penicillium sclerotiorum destacou-se por produzir xilanase em níveis elevados. O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da influência das condições de cultivo sobre a produção do complexo xilanolítico produzido por P. sclerotiorum, na caracterização físico-química desse sistema, bem como purificação e caracterização bioquímica de seus principais componentes. Por meio da determinação das condições ótimas de produção e da caracterização deste complexo enzimático foi possível estabelecer metodologias eficientes de purificação de xilanases e uma β-xilosidase. Através da caracterização físico-química das enzimas purificadas, foi possível avaliar seu potencial biotecnológico, visando futuras aplicações em processos industriais. / Xylan degrading enzymes, the main component of hemicellulose, have been used in various biotechnological applications, and in some cases the use of purified enzymes is necessary. Commercial applications of xylanolytic enzymes involve the enzymatic hydrolysis of xylan, which is present in agricultural and agro-industrial wastes, and can be converted to xylose and other sugars, which can be further used as substrates in fermentation processes to obtaining cellular protein, liquid fuels and other chemicals. The utilization of these enzymes also decreases the release of certain pollutants in wastewater, as in the pulp and paper industry. Xylanases and β-xilosidases are mainly produced by bacteria and fungi, and in general, the fungi produce them at higher levels. The genus Penicillium presents species already characterized as good producers of these enzymes. One strain of this genus isolated from Brazilian soil in the Mata Atlântica region and identified as Penicillium sclerotiorum attracted attention by producing xylanase in high levels. The objective of this study was to evaluate the influence of culture conditions on the production of the xylanolytic complex produced by P. sclerotiorum to characterize physical and chemical properties of this system as well to purify and biochemical characterize its main components. By determining optimal conditions for production and by characterizing this enzymatic complex it was possible to establish efficient methodologies for purification of xylanases and one β-xylosidase. Through their physical and chemical characterization, it was possible to evaluate their biotechnological potential for future applications in industrial processes.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Quimica. / Made available in DSpace on 2012-10-24T15:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 266669.pdf: 2251672 bytes, checksum: 4670a0dfd5caff713b421ebabbbe066c (MD5) / As condições severas do processo de purga empregado tradicionalmente em fibras celulósicas ocasionam um ataque generalizado, especificamente em tecidos 100% algodão, resultando em elevada perda de massa e diminuição da resistência das fibras. A substituição do processo de purga alcalina pela enzimática, além de permitir menor agressão química às fibras, devido à elevada especificidade das enzimas às substâncias que necessitam serem removidas como gorduras, proteínas, entre outras. Também possibilitam produtos acabados com melhores características de toque e resistência. Muitas enzimas já foram testadas para a remoção das substâncias hidrofóbicas das fibras, entretanto poucos são os estudos para a remoção dos fragmentos das cascas do capulho e gravetos presentes nas malhas produzidos por fios de algodão cardado. Neste trabalho foram avaliados a termoestabilidade do caldo bruto centrifugado de Bacillus pumilus CBMAI 0008 e a influência da interação entre a enzima e substâncias químicas frequentemente utilizadas no processamento têxtil tais como os agentes tensoativos, ácidos e bases utilizados para a correção de pH, a adição de polióis para a estabilização enzimática e também o efeito de inibição ou ativação da atividade enzimática na presença de íons que comporiam as fibras de algodão. Utilizou-se como parâmetro de comparação à preparação comercial Pulpzyme HC (Novozymes), que possui o mesmo tipo de atividade de endoxilanase. Os efeitos inibitórios decorrentes dos íons presentes na fibra de algodão poderiam impossibilitar a utilização da purga enzimática de substratos têxteis, especificamente malha de fio cardado 100% algodão. Dentre os reagentes testados, o KCl, NaCl and (NH4)2SO4 promoveram aumento na atividade quando utilizados na concentração de 5,0 mM. Dentre as diversas condições testadas constatou-se que o sorbitol 1,0 M, em tampão glicina-NaOH 0,01 M, com 5,0 g/L de umectante e 37,5 minutos de incubação são condições capazes de manter 62,94% da atividade inicial da enzima, e que o emulsificante não tem efeito significativo sobre a atividade da enzima. O agente umectante apresentou efeito significativo, provavelmente por ser composto por álcoois alifáticos. Os resultados da biopurga com xilanase mostraram que a enzima não apresentou o efeito desejado como agente de biopurga, considerando-se os padrões de qualidade exigidos pela indústria.

Submitted by Alexandre Soares (alexandredesoares@yahoo.com.br) on 2016-08-25T12:15:22Z No. of bitstreams: 1 ricardo_salviano_dos_santos.pdf: 10951738 bytes, checksum: c0a4f85e54d112293b5db8023ebbe5a7 (MD5) / Submitted by Alexandre Soares (bicalho.sam@gmail.com) on 2017-01-09T12:48:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) ricardo_salviano_dos_santos.pdf: 10951738 bytes, checksum: c0a4f85e54d112293b5db8023ebbe5a7 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2017-01-10T12:26:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) ricardo_salviano_dos_santos.pdf: 10951738 bytes, checksum: c0a4f85e54d112293b5db8023ebbe5a7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-10T12:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) ricardo_salviano_dos_santos.pdf: 10951738 bytes, checksum: c0a4f85e54d112293b5db8023ebbe5a7 (MD5) Previous issue date: 2015 / A demanda por enzimas holocelulot?ticas tem aumentado nos ?ltimos anos, impulsionada, principalmente, pelo mercado rec?m estabelecido de etanol de 2? gera??o. Diante disso, o objetivo central desta tese foi avaliar o potencial de fungos filamentosos selecionados e de res?duos agroindustriais derivados de oleaginosas, usados aqui como fontes de carbono, para a produ??o de enzimas celulol?ticas e xilanol?ticas por fermenta??o em estado s?lido (FES) conduzida em batelada simples. O desenvolvimento deste projeto envolveu as seguintes etapas: caracteriza??o centesimal dos res?duos agroindustriais; avalia??o do potencial indutor de cada res?duo agroindustrial sobre a produ??o enzim?tica de holocelulases por cada uma das linhagens f?ngicas pesquisadas; otimiza??o da produ??o das hidrolases de interesse com o uso da linhagem f?ngica e do res?duo agroindustrial que se destacaram; caracteriza??o do extrato enzim?tico obtido na condi??o otimizada; e avalia??o da aplica??o do extrato enzim?tico obtido na condi??o otimizada na sacarifica??o de biomassas lignocelul?sicas. Cinco linhagens de fungos filamentosos, Aspergillus niger INCQS:40065, Aspergillus tubingensis AN1257, Fusarium oxysporum INCQS:40144, Penicillium oxalicum INCQS:40103 e Trichoderma reesei CCT2768, e seis res?duos agroindustriais, tortas de caro?o de algod?o, dend?, girassol, maca?ba, mamona e pinh?o manso, usados como fontes de carbono, foram avaliados para a produ??o das enzimas de interesse. Dentre as linhagens testadas, Aspergillus tubingensis AN1257 foi a que se destacou para a produ??o de enzimas celulol?ticas e xilanol?ticas, especialmente quando combinado com a torta de caro?o de algod?o. A otimiza??o de processo conduzida com A. tubingensis e a torta de caro?o de algod?o para a produ??o das atividades de CMCase, FPase, ?-glucosidase e xilanase apontou a raz?o s?lido:l?quido (S/L) de 35%, a fonte de nitrog?nio de 1,30 g de (NH4)2SO4 /100g torta, e o tamanho do in?culo de 1,00 x 107 con?dios/g de torta, como determinantes para a condi??o fermentativa otimizada. Nesta condi??o fermentativa otimizada foram obtidos valores de atividade aproximados de 20 U/g para CMCase, 50U/g para FPase, 300 U/g para ?-glucosidase e 1300 U/g para xilanase, ap?s 8 dias de fermenta??o. Os efeitos combinados da temperatura e do pH sobre as atividades das enzimas holocelulol?ticas produzidas por A. tubingensis AN1257 denotam uma boa aplicabilidade destas enzimas sob temperaturas entre 40 e 60?C, e pH em torno de 4,0 a 5,0. O extrato enzim?tico produzido por A. tubingensis AN1257 na condi??o fermentativa otimizada mostrou-se eficiente na sacarifica??o das pr?prias tortas vegetais usadas inicialmente como fontes de carbono, sobretudo quando aplicado em processo de sacarifica??o e fermenta??o simult?nea da torta de girassol pr?-tratada. Este processo resultou na produ??o de 16 g de etanol por 100g de torta de caro?o de algod?o e um mosto fermentado com a concentra??o de 20g/L de etanol. O conjunto dos resultados obtidos nesta tese aponta como promissor o uso de alguns res?duos agroindustriais e fungos filamentosos selecionados para a produ??o de enzimas holocelulol?ticas com potencial aplica??o para a produ??o de bioetanol de 2? gera??o. Palavras / Programa de P?s-gradua??o em Biocombust?veis, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2015. / The demand for hollocelulolytic enzymes has increased in recent years, driven mainly by the newly established market for 2ndgeneration ethanol. The potential of selected filamentous fungi and derivatives of agro-industrial waste oil, used here as carbon sources for the production of cellulolytic and xylan-degrading enzymes, was evaluated. The development of the project involved the following steps: partial characterization of agro-industrial waste; the inducing potential of each agroindustrial residue on enzyme production by each filamentous fungus strain was investigated; optimization of the production of the hydrolases by the fungal strain and the agro-industrial waste that showed the greatest potential; characterization of the enzyme extract obtained under the optimum conditions; and evaluation of the implementation of the enzymatic extract obtained under the optimum condition for saccharification of lignocellulosic biomass. Five strains of filamentous fungi - Aspergillus niger INCQS: 40065, Aspergillus tubingensis AN1257, Fusarium oxysporum INCQS:40144, Penicillium oxalicum INCQS:40103 and Trichoderma reesei CCT2768 -- and six agro-industrial wastes -- cottonseed, palm, sunflower, maca?ba, castor and jatropha cakes, used as carbon sources -- were assessed for production of the enzymatic activities of interest. Among the strains tested, Aspergillus tubingensis AN1257 was most noteworthy for the production of cellulolytic and xylanase enzymes, especially when combined with cottonseed cake. The optimization conducted with A. tubingensis and cottonseed cake for the production of CMCase, FPase, ?-glucosidase and xylanase activities indicated that the conditions for an optimum fermentation were a solid/liquid (S/L) ratio of 35%, 1.30 g (NH4)2SO4/100 g cake as the source of nitrogen, and an inoculum size of 1.00 x 107 conidia/g of cake. Activity values of approximately 20 U/g for CMCase, 50 U/g for FPase, 300 U/g for ?-glucosidase and 1300 U/g for xylanase were obtained after 8 days of fermentation under optimized fermentation conditions. The combined effects of temperature and pH on the activities of the holocellulolytic enzymes produced by A. tubingensis AN1257 indicated that these enzymes were most efficient at temperatures between 40 and 60 ?C and pH between 4.0 and 5.0. The enzyme extract produced by A. tubingensis under optimized fermentation conditions was efficient in the saccharification of the same vegetable cakes initially used as carbon sources, especially when applied to the simultaneous saccharification and fermentation of pretreated sunflower cake. This process resulted in the production of 16 g of ethanol per 100 g of cottonseed cake and a fermented must with a concentration of 20 g/L of ethanol. Thus, the use of some agro-industrial wastes and selected filamentous fungi for the production of holocelulol?ticas enzymes with potential application for the production of 2nd generation bioethanol was shown to be very promising.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-03. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:31Z : No. of bitstreams: 1 000843898.pdf: 1360987 bytes, checksum: eeb1170ea817515b2c839bf006aca6f0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho visou à produção de fitases por fungos termofílicos em cultivo em estado sólido (CES), utilizando resíduos agroindustriais como substratos, e secá-las, juntamente com xilanases, por spray drying. Após a secagem, os pós foram armazenados e a redução da atividade enzimática com o tempo de armazenamento foi avaliada. Para a produção das fitases foram testados 13 fungos pertencentes do Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada do IBILCE/UNESP, sendo o termotolerante Lichtheimia ramosa escolhido para seguir com os experimentos. A xilanase foi metabolizada pelo fungo Myceliophtora thermophila I-1D3b. O fungo L. ramosa foi cultivado em bagaço de cana de açúcar, bagaço de laranja e farelo de trigo, enquanto que M. thermophila foi cultivado em bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo, ambos a 45 oC. Os ensaios de secagem foram divididos entre discriminação do adjuvante que proporcionasse maior proteção às enzimas, otimização das condições de secagem e armazenamento dos pós secos. Para os ensaios de discriminação de adjuvante, foram escolhidas como variáveis o adjuvante e a temperatura de saída do ar do spray dryer, Os adjuvantes empregados foram farelo de trigo, farelo de milho e farelo de soja, sendo que este último forneceu os melhores resultados. A temperatura não foi um fator significativo na análise de variância. Para os ensaios de otimização das condições de secagem foi empregada a técnica de superfície de resposta, sendo usadas variáveis preditoras a temperatura de saída do ar, a vazão de alimentação de suspensão e a concentração de sólidos. Os resultados indicaram a vazão e concentração de sólidos como variáveis significativas. A suspensão na condição ótima de secagem continha 7,5% e a vazão foi de 3 mL/min, sendo a temperatura escolhida de 83 oC. O ensaio realizado nestas condições proporcionou retenção 83% de atividade de fitase e de 85%... / This work aimed to produce phytases by thermophilic molds in solid state cultivation, using solid agro-industrial by-products as substrates, and dry the enzymes, along with xylanases, by spray-drying. Following the drying, the powders were storage and the reduction of the enzyme activities was evaluated. For the phytase production, 13 fungi were tested, and Lichthemia ramose was chosen. Xylanase was metabolized by Myceliophtora thermophila I-1D3b. All tested microorganisms belonged to the Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada. L. ramose was cultivated in sugar cane bagasse, Orange pulp and peel and wheat bran, while M. thermophila was cultivated in sugar cane bagasse and wheat bran, both at 45 oC. Drying experiments were done to discriminate the adjuvant able to provide the best protection to the enzymes. The tested variables were the adjuvants (brans of wheat, corn and soybean) and the air temperature at the spray dryer outlet. The temperature was not a statistically significant factor and soybean bran provided the best protection. Experiments to optimize the drying conditions for soybean bran were carried out following a response surface approach, having the outlet air temperature, the suspension flow rate and the total solid concentration as the controlled variables. The results showed that the flow rate and the solid concentration were the significant variables. The estimated optimum condition had 7,5% of solids and the flow rate was 3 mL/min. The experiment carried at this condition, at 83 oC showed 83% of retention for phytase and 85%...