Orientador: Fabio Marcio Squina, Roberto Ruller / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:46:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hoffmam_ZairaBruna_M.pdf: 4922807 bytes, checksum: df6edae9e54a10424f07783fcf889151 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O etanol de segunda geração, produzido a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica, apresenta-se como uma alternativa promissora para tornar a matriz energética brasileira sólida e, em grande parte, renovável. A biomassa é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose devem ser hidrolisadas a açúcares monoméricos fermentescíveis para produzir etanol. Entretanto, a tarefa de propor um processo enzimático de hidrólise eficiente e de baixo custo com a finalidade de sacarificar a biomassa é desafiadora, pois os polissacarídeos que a compõem são complexos e recalcitrantes. Embora as hemiceluloses representem cerca de 30% dos açúcares do bagaço da cana-de-açúcar, uma das biomassas mais promissoras para a produção de etanol de segunda geração no Brasil, ainda poucos estudos são direcionados ao estudo da sacarificação dessa fração de polissacarídeos. Hemicelulases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise dos polissacarídeos hemicelulósicos, e que em atuação sinérgica com celulases promove a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de maneira mais eficiente que as classes de enzimas isoladamente. A primeira parte dessa dissertação apresenta a caracterização bioquímica e biofísica de uma arabinofuranosidase GH51 do micro-organismo Bacillus subtilis 168. ?-L-arabinofuranosidases são hemicelulases que hidrolisam terminais não redutores de polissacarídeos contendo arabinose. A AbfA mostrou-se robusta, atuando numa ampla faixa de temperatura, e capaz de liberar monômeros de arabinose hidrolisando 1,5-?-L-arabinoheptaose a partir da extremidade não-redutora. A análise dos dados de SAXS combinada com simulações de dinâmica molecular mostrou que a AbfA em solução é hexamérica, com cada subunidade contendo uma molécula com domínio catalítico em enovelado na forma de barril (?/?)8 seguido por um domínio acessório ?-sandwich. Esses dados evidenciam que a estrutura quaternária pode ser importante para o desempenho de atividade das arabinofuranosidases da família 51. A segunda parte da dissertação aborda uma avaliação da influência dos domínios de ligação a carboidratos na atividade de xilanases mesofílicas e termofílicas. Xilanases são hemicelulases que catalisam a hidrólise de ligações endo-1,4-?-D-xilosídicas na molécula de xilano. Fusões gênicas uniram end-to-end um CBM6 de Clostridium thermocellum aos domínios catatalíticos xilanásicos das enzimas GH10 termofílica (de Thermotoga petrophila) e GH11 mesofílica (de Bacillus subtilis 168). O CBM6 alterou o padrão de hidrólise das quimeras termofílicas e aumentou a constante de eficiência da quimera mesofílica, quando comparadas as enzimas nativas respectivas. Além disso, na hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar a xilanase quimérica mesofílica suplementou o coquetel comercial Accellerase 1500, liberando mais açúcares redutores. Dessa forma a fusão ao CBM6 mostrou-se uma alternativa para construir enzimas com melhor desempenho cinético / Abstract: The second generation ethanol, produced from lignocellulosic biomass polysaccharides, presents itself as a promising alternative to make the Brazilian energy matrix solid and largely renewable. Biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose must be hydrolyzed in fermentable monomeric sugars to produce ethanol. However, the task of proposing a process for enzymatic hydrolysis efficient and low cost in order to saccharify the biomass is challenging because its polysaccharides are complex and recalcitrant, so it requires the presence of several different catalytic activities for hydrolysis. Although hemicelluloses represent about 30% of sugars from sugarcane bagasse, one of the most promising biomass for the production of second generation ethanol in Brazil, few studies are directed to the saccharification study of this polysaccharidic fraction. Hemicellulases are glycoside hydrolases that catalyze the hydrolysis of hemicellulosic polysaccharides and works synergistically with cellulases promoting the hydrolysis of sugarcane bagasse more efficiently than each one class of enzymes alone. The first part of this dissertation presents the biochemistry and biophysics characterization of a GH51 arabinofuranosidase from microorganism Bacillus subtilis 168. ?-Larabinofuranosidases are hemicellulases that hydrolyze linkages in terminal nonreducing ends of polysaccharides containing arabinose. The AbfA showed itself robust, working in a wide temperature range, and able to release arabinose monomers hydrolyzing 1,5-?-L-arabinoheptaose from the non-reducing end. The analysis of SAXS data in combination with molecular dynamics simulations showed that AbfA solution is hexameric, with each subunit containing a molecule with catalytic domain coiled in the form of barrel (?/?)8 followed by a ?-sandwich domain accessory. These results evidence and corroborate data that the quaternary structure may be important for the activity of GH51 arabinofuranosidases family. The second part of the thesis adresses an evaluation of the influence of carbohydratebinding modules, non-catalytic domains of polysaccharides recognition, in the activity of mesophilic and thermophilic xylanases. Xylanases are hemicellulases that catalyze the hydrolysis of endo-1 ,4-?-D-xylosidic linkages in xylan molecule. Gene fusions joined end-to-end a CBM6 from Clostridium thermocellum to catalytic xylanasic domains of enzymes thermophilic GH10 (from Thermotoga petrophila) and mesophilic GH11 (from Bacillus subtilis 168). The CBM6 changed the hydrolysis pattern of thermophilic chimeras increased the efficiency constant of mesophilic chimera, when compared to the respective native enzymes. Furthermore, in the sugarcane biomass hydrolysis mesophilic chimeric xylanase supplemented the commercial cocktail Accellerase 1500, releasing more reducing sugars. In conclusion, the CBM6 fusion proved itself an alternative to construct enzymes with better kinetic performance / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Rubens Monti / Banca: Rubens Monti / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Olga Luisa Tavano / Banca: Maristela de Freitas Sanches Peres / Banca: Luis Vitor Silva do Sacramento / Resumo: A descoberta de resíduos agrícolas, como fonte de energia renovável tem colaborado para o desenvolvimento industrial e preservação do meio ambiente. Desta maneira, a degradação da parede celular destes resíduos tem grande importância na fabricação de pães, alimentos, bebidas, têxtil, papel e celulose entre outros produtos. A degradação enzimática destes polímeros esta se tornando uma alternativa mais atraente do que a utilização de substâncias químicas e processos mecânicos. Alguns fungos termófilos participam desta degradação enzimática, como Humicola grisea var. thermoidea, isolado do solo, é conhecido como bom produtor do complexo xilanolítico. Além deste, um fungo termófilo isolado da polpa do fruto cupuaçuzeiro em decomposição foi estudado e produziu xilanase. Esses fungos foram mantidos em meios sólidos contendo ágar e farinha de aveia. O fungo isolado da polpa do fruto cresceu em meio liquido empregando diferentes resíduos agrícolas como fonte de carbono. Dentre os vários resíduos empregados para se otimizar a produção de xilanase, o melhor foi o sabugo de milho. Esse foi utilizado nos experimentos na proporção de 1,0% (m/v), em meio líquido contendo 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 0,1% NH4Cl; 0,5% água de maceração de milho. O pH ótimo foi 5,0 e a temperatura ótima de 60ºC. A xilanase presente no extrato clarificado em caulim apresentou cinética Michaeliana com Km de 10,41 ± 0,282 mgmL-1 e Vmax 3,32 ± 0,053 U (mg protein)-1. Para acompanhar o processo de clarificação da enzima solúvel realizou-se SDS-PAGE verificando a presença de uma banda protéica com atividade xilanolítica de massa molecular de aproximadamente 30kDa e a Cromatografia Sílica Gel P60 para verificar os produtos da hidrólise da xilana em função do tempo e da associação de xilosidase do fungo termófilo Humicola com a xilanase do fungo isolado do fruto... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The researches of agricultural residues as renewable energy sources have been contributing for the industrial development and the environment conservation. Thus, the degradation of these residues' cell walls has great importance in fabrication of bread, food, drinks, textile, paper, cellulose, and other products. The enzymatic degradation of such polymers is becoming an attractive option when compared to the use of chemical substances and mechanical processes. Some thermophilic fungi take role in this enzymatic degradation, such as Humicola grisea var. thermoidea, isolated from soil, and is known to be a good producer of the xylanolytic complex. Besides it, another thermophilic fungus, isolated from the Theobroma grandiflorum decomposing fruit pulp, was studied and also produced xylanases. These fungi were kept in solid media containing agar and oat bran. The fungus isolated from the fruit pulp grew in liquid media in wich different kinds of agricultural residues were employed as carbon sources. Among the various types of residues that were used to optimize the xylanase production, corn cobs proved to be the best one. It was used in assays in a proportion of 1,0% (m/v), in liquid media containing 0.1% of CaCO3, 0.5% of NaCl, 0.1% of NH4Cl, and 0.5% of corn steep liquor. The pH optima was 5.0 and the temperature optima was 60ºC. The xylanase present in the kaolin clarified extract showed a Km of 10.41 ± 0.282 mg.mL-1, and Vmax 3.32 ± 0.053 U (mg.protein)-1. In order to follow the soluble enzyme clarification process, SDS-PAGE was run, verifying the presence of a proteic band with xylanolytic activity of, approximately, 30kDa of molecular mass. Furthermore, Silica Gel 60 Thin Layer Chromatography (TLC) was used to verify the xylan hydrolysis products in function of time and the association of Humicola sp. thermophylic fungus xylosidase with the xylanase produced by the fruit pulp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Heloiza Ferreira Alves Prado / Banca: Maria de Lourdes Texeira de Moraes Polizeli / Banca: Paulo Cezar Ceresini / Resumo: Cento e quarenta e oito linhagens fúngicas, mesofílicas e termofílicas, foram isoladas de amostras de solo e de matéria orgânica em decomposição de áreas de Cerrado no estado do Mato Grosso Sul. Essas linhagens tiveram suas capacidades de crescimento a 35 ºC e 45 °C analisadas em meios contendo palha de milho como fonte de carbono. Sessenta e seis fungos, com crescimento a 45 ºC foram selecionados para testes de produção enzimática. A maioria das linhagens isoladas produziram xilanase e celulases (avicelase e CMCase) por fermentação em estado sólido (FES), inicialmente utilizando o farelo de trigo como substrato. Posteriormente, foram realizados os estudos do efeito da fonte de carbono e do perfil de produção de enzimas, utilizando diferentes substratos como: farelo de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, serragem, sabugo de milho e com misturas destes na proporção de 1:1. A produção mais elevada de CMCase, 18 U/g, foi obtida pelo fungo Penicillium sp 1IP4-A2, em farelo de trigo, após 48 horas de cultivo. As maiores produções de avicelase 13,1 U/g, e xilanase, 370 U/g, foram obtidas pelo fungo Aspergillus sp 1IP2B1, quando cultivado em farelo de trigo e sabugo de milho, após 24 horas e 96 horas de cultivo, respectivamente. A xilanase referida acima, produzida pelo fungo Aspergillus sp 1IP2B1, apresentou atividade máxima em 55 ºC com pH de 5,5 e se manteve estável até 55 °C / Abstract: One hundred forty-eight mesophilic and thermophilic fungal strains were isolated from samples of soil and decomposing organic matter from Cerrado in the state of Mato Grosso do Sul. These strains have had their capacity for growth at 35 °C and 45 °C analyzed in culture medium containing corn straw as the carbon source. Sixty-six fungi, growing at 45 °C, were selected for enzyme production testing. The most of the isolated strains produced xylanase and cellulase (CMCase and avicelase) by solid state fermentation (SSF), initially using wheat bran as substrate. Subsequently, studies of the effect of carbon source and enzyme production profile were performed using different substrates: wheat bran, sugar cane bagasse, sawdust, corn cobs and mixtures in a 1:1 ratio. The highest CMCase production, 18 U/g, was produced by fungi Penicillium sp 1IP4-A2 in wheat bran, after 48 hours of cultivation. The highest avicelase production, 13.1 U/g, and xylanase, 370 U/g, were obtained by fungi Aspergillus sp 1IP2B1, in wheat bran and corn cob, after 24 hours and 96 hours of culture on solid fermentation, respectively. The xylanase produced by fungi Aspergillus sp 1IP2B1 showed maximum activity at 55 °C at pH 5.5 and it was stable up to 55 °C / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Márcia Luzia Rizzatto / Banca: Tatiane Iembo / Resumo: Os resíduos agroindustriais compostos por, em sua maior parte, lignocelulose, podem ser desestruturados em monômeros de açúcares e derivados fenólicos que, por sua vez, podem ser convertidos em bioprodutos com valor agregado como etanol de segunda geração, ácidos orgânicos, aditivos para alimentos, entre outros. O processo de desestruturação da lignocelulose envolve, geralmente, um tratamento químico e/ou físico, seguido de sacarificação enzimática, que requer um coquetel multi-enzimático composto por celulases, hemicelulases, ligninases e enzimas acessórias, como as oxidases e pectinases. Estas últimas, além de aumentar a eficiência das primeiras, com consequente aumento no rendimento, aumentam também a velocidade do processo, devido à degradação da pectina da parede celular vegetal. Considerando que o grupo de pesquisa ao qual esse trabalho está vinculado tem desenvolvido pesquisas com as ligninases, celulases, hemicelulases e pectinases, este estudo teve por objetivo a produção, caracterização físico-química e a purificação parcial de pectinases produzidas pelo fungo termofílico Rasamsonia emersonii BC, e a avaliação do efeito dessas enzimas quando adicionadas ao coquetel enzimático produzido pelo fungo Myceliophthora thermophila JCP 1-4, composto por celulases e hemicelulases, sobre a hidrólise da palha de cana-deaçúcar. Os resultados mostraram que, utilizando-se a mistura de bagaço de laranja e de cana-de-açúcar como substrato para cultivo em estado sólido para produção... / Abstract: Agroindustrial wastes whose composition mainly lignocellulose can be deconstruted into sugar monomers and phenolic derivatives, which can be converted into added value bioproducts such as second generation ethanol, organic acids, additives for food and others. The process of destruction of lignocellulose usually involves a chemical and/or physical treatment, followed by enzymatic saccharification. This process requires a multi-enzymatic cocktail composed of cellulases, hemicellulases, ligninases and accessory enzymes, such as oxidases and pectinases. The addition of the pectinases increases the efficiency of the saccarification, resultin in the higher yield and speed of the process, due to the degradation of pectin from the plant cell wall. Considering that the research group to which this work is linked, has developed researches with ligninases, cellulases, hemicelluloses and pectinase, this study had the objective of the production, physicochemical characterization and partial purification of pectinases produced by the thermophilic fungus Rasamsonia emersonii BC and the evaluation of the effect of the addition of this enzyme to the enzymatic cocktail produced by the fungus Myceliophthora thermophila JCP 1-4 containing cellulases and hemicellulases, on the hydrolysis of sugarcane straw. The results showed that, using a mixture of orange and sugarcane bagasses as a substrate for fungus cultivation by solid-state fermentation, 471.05 U g-1 of pectinase activity (evaluated as ... / Mestre

Orientador: João Cláudio Thoméo / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Izabela Dutra Alvin / Resumo: Este trabalho visou à produção de fitases por fungos termofílicos em cultivo em estado sólido (CES), utilizando resíduos agroindustriais como substratos, e secá-las, juntamente com xilanases, por spray drying. Após a secagem, os pós foram armazenados e a redução da atividade enzimática com o tempo de armazenamento foi avaliada. Para a produção das fitases foram testados 13 fungos pertencentes do Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada do IBILCE/UNESP, sendo o termotolerante Lichtheimia ramosa escolhido para seguir com os experimentos. A xilanase foi metabolizada pelo fungo Myceliophtora thermophila I-1D3b. O fungo L. ramosa foi cultivado em bagaço de cana de açúcar, bagaço de laranja e farelo de trigo, enquanto que M. thermophila foi cultivado em bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo, ambos a 45 oC. Os ensaios de secagem foram divididos entre discriminação do adjuvante que proporcionasse maior proteção às enzimas, otimização das condições de secagem e armazenamento dos pós secos. Para os ensaios de discriminação de adjuvante, foram escolhidas como variáveis o adjuvante e a temperatura de saída do ar do spray dryer, Os adjuvantes empregados foram farelo de trigo, farelo de milho e farelo de soja, sendo que este último forneceu os melhores resultados. A temperatura não foi um fator significativo na análise de variância. Para os ensaios de otimização das condições de secagem foi empregada a técnica de superfície de resposta, sendo usadas variáveis preditoras a temperatura de saída do ar, a vazão de alimentação de suspensão e a concentração de sólidos. Os resultados indicaram a vazão e concentração de sólidos como variáveis significativas. A suspensão na condição ótima de secagem continha 7,5% e a vazão foi de 3 mL/min, sendo a temperatura escolhida de 83 oC. O ensaio realizado nestas condições proporcionou retenção 83% de atividade de fitase e de 85%... / Abstract: This work aimed to produce phytases by thermophilic molds in solid state cultivation, using solid agro-industrial by-products as substrates, and dry the enzymes, along with xylanases, by spray-drying. Following the drying, the powders were storage and the reduction of the enzyme activities was evaluated. For the phytase production, 13 fungi were tested, and Lichthemia ramose was chosen. Xylanase was metabolized by Myceliophtora thermophila I-1D3b. All tested microorganisms belonged to the Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada. L. ramose was cultivated in sugar cane bagasse, Orange pulp and peel and wheat bran, while M. thermophila was cultivated in sugar cane bagasse and wheat bran, both at 45 oC. Drying experiments were done to discriminate the adjuvant able to provide the best protection to the enzymes. The tested variables were the adjuvants (brans of wheat, corn and soybean) and the air temperature at the spray dryer outlet. The temperature was not a statistically significant factor and soybean bran provided the best protection. Experiments to optimize the drying conditions for soybean bran were carried out following a response surface approach, having the outlet air temperature, the suspension flow rate and the total solid concentration as the controlled variables. The results showed that the flow rate and the solid concentration were the significant variables. The estimated optimum condition had 7,5% of solids and the flow rate was 3 mL/min. The experiment carried at this condition, at 83 oC showed 83% of retention for phytase and 85%... / Mestre

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:36:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Nyessia versao finalissima 15-04-2015.pdf: 1194358 bytes, checksum: 0a6089c54d46aca60776ce97f1474515 (MD5) Previous issue date: 2014-11-28 / The aim of this study was to optimize the production of xylanase by Penicillium crustosum using Plackett-Burman the Design (BDP) and Central Composite Rotational Design (CCRD), and its application in the bleaching process of kraft pulp. The PBD-12 was carried out to screening the significant variables of the compounds of the culture medium: NaNO3; KH2PO4; MgSO4 7H2O; KCl; Fe2(SO4)3, yeast extract, corn stover and initial pH under liquid static culture at 28 °C for 6 days. The variables corn stover, KH2PO4, and pH were significant at p <0.10 by DPB. Statistical analysis of the results obtained with CCRD exhibited the three variables (KH2PO4 0.15%, corn stover 2% and initial pH 6.0) that showed significant effects at p <0.05, and the maximum production of xylanase was 50 U/mL, 14 times higher compared to enzyme activity before optimization. The treatment of the kraft pulp with P. crustosum xylanase showed a significant reduction in kappa number (5.27 Kappa points and efficiency (35.04%). Thus, there is evidence of the potential application of xylanase produced by P. crustosum in the bleaching process of kraft pulp in paper industry / As xilanases são complexos enzimáticos pertencentes ao grupo das glicosidases, e são capazes de atuar em vários sítios da cadeia do xilano e degradá-lo em xilooligossacarídeos, xilotrioses, xilobioses e xiloses. As xilanases são utilizadas nos diversos setores industriais, como biobranqueamento de celulose, na melhoria da textura e do volume do pão, clareamento de sucos e vinho, melhoria do valor nutricional de ração de animais monogástricos. Este trabalho teve como objetivo otimizar a produção de xilanase pelo Penicillium crustosum utilizando o Delineamento Plackett-Burman (DPB) e Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), bem como aplicação da xilanase otimizada no processo de branqueamento da polpa de celulose. A seleção dos componentes de meio de cultivo: NaNO3; KH2PO4; MgSO4·7H2O; KCl; Fe2(SO4)3, extrato de levedura, palha de milho e pH inicial foi realizada utilizando DPB-12 em condições de cultivo líquido estacionário a 28ºC por 6 dias. As variáveis palha de milho, KH2PO4, e pH apresentaram efeitos significativos em p<0,10 por DPB. A análise estatística dos resultados obtidos com DCCR exibiram as três variáveis (KH2PO4 0,15 %, palha de milho 2% e pH inicial 6,0) que mostraram efeitos significativos em p<0,05, e a produção máxima de xilanase foi de 50 U/mL, 14 vezes superior em comparação à atividade enzimática antes da otimização. O tratamento da polpa celulósica com a xilanase de P. crustosum mostrou uma redução significativa do número kappa em 5,27 pontos e eficiência Kappa de 35,04%. Dessa forma, evidencia-se o potencial de aplicação da xilanase produzida por P. crustosum no processo de branqueamento da polpa kraft de Eucaliptos para indústria de papel e celulose

Made available in DSpace on 2017-07-10T13:59:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Nyessia versao finalissima 15-04-2015.pdf: 1194358 bytes, checksum: 0a6089c54d46aca60776ce97f1474515 (MD5) Previous issue date: 2014-11-28 / SIM (não especificado) / The aim of this study was to optimize the production of xylanase by Penicillium crustosum using Plackett-Burman the Design (BDP) and Central Composite Rotational Design (CCRD), and its application in the bleaching process of kraft pulp. The PBD-12 was carried out to screening the significant variables of the compounds of the culture medium: NaNO3; KH2PO4; MgSO4 7H2O; KCl; Fe2(SO4)3, yeast extract, corn stover and initial pH under liquid static culture at 28 °C for 6 days. The variables corn stover, KH2PO4, and pH were significant at p <0.10 by DPB. Statistical analysis of the results obtained with CCRD exhibited the three variables (KH2PO4 0.15%, corn stover 2% and initial pH 6.0) that showed significant effects at p <0.05, and the maximum production of xylanase was 50 U/mL, 14 times higher compared to enzyme activity before optimization. The treatment of the kraft pulp with P. crustosum xylanase showed a significant reduction in kappa number (5.27 Kappa points and efficiency (35.04%). Thus, there is evidence of the potential application of xylanase produced by P. crustosum in the bleaching process of kraft pulp in paper industry / As xilanases são complexos enzimáticos pertencentes ao grupo das glicosidases, e são capazes de atuar em vários sítios da cadeia do xilano e degradá-lo em xilooligossacarídeos, xilotrioses, xilobioses e xiloses. As xilanases são utilizadas nos diversos setores industriais, como biobranqueamento de celulose, na melhoria da textura e do volume do pão, clareamento de sucos e vinho, melhoria do valor nutricional de ração de animais monogástricos. Este trabalho teve como objetivo otimizar a produção de xilanase pelo Penicillium crustosum utilizando o Delineamento Plackett-Burman (DPB) e Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), bem como aplicação da xilanase otimizada no processo de branqueamento da polpa de celulose. A seleção dos componentes de meio de cultivo: NaNO3; KH2PO4; MgSO4·7H2O; KCl; Fe2(SO4)3, extrato de levedura, palha de milho e pH inicial foi realizada utilizando DPB-12 em condições de cultivo líquido estacionário a 28ºC por 6 dias. As variáveis palha de milho, KH2PO4, e pH apresentaram efeitos significativos em p<0,10 por DPB. A análise estatística dos resultados obtidos com DCCR exibiram as três variáveis (KH2PO4 0,15 %, palha de milho 2% e pH inicial 6,0) que mostraram efeitos significativos em p<0,05, e a produção máxima de xilanase foi de 50 U/mL, 14 vezes superior em comparação à atividade enzimática antes da otimização. O tratamento da polpa celulósica com a xilanase de P. crustosum mostrou uma redução significativa do número kappa em 5,27 pontos e eficiência Kappa de 35,04%. Dessa forma, evidencia-se o potencial de aplicação da xilanase produzida por P. crustosum no processo de branqueamento da polpa kraft de Eucaliptos para indústria de papel e celulose

A crescente demanda por energia e a necessidade de promover o desenvolvimento sustentável colocam em foco os combustíveis renováveis. Dentro de biocombustíveis, os 2G ou segunda geração, têm como objetivo a utilização da energia contida na biomassa vegetal. Muitos microorganismos são capazes de excretar enzimas que quebram a lignocelulose, o principal componente das paredes celulares da planta, em açúcares fermentáveis. Os objetivos deste trabalho foram selecionar fungos filamentosos que produzem enzimas que degradam a biomassa e otimizar suas condições de cultivo. Quatro isolados e duas linhagems padrão foram testadas para a produção de celulases e identificadas pelo sequencimaneto da região ITS (Internal Transcribed Spacer). Após a caracterização inicial, três linhagens foram selecionadas e testadas em diferentes fontes de nitrogênio e carbono, e agentes tamponantes, visando o cultivo ótimo para cada delas. As condições ideais foram escolhidas com base em critérios de atividade enzimática, proteínas totais liberadas e pH. Após o estabelecimento das condições ótimas, os sobrenadantes das culturas foram liofilizados e o teor de proteínas determinado. O mesmo extrato foi testado quanto à FPA (Filter Paper Activity), atividades de &beta;-glicosidase e xilanases, e quanto sua capacidade hidrolitica na biomassa pré-tratada. As linhagens selecionadas foram identificadas como Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) e a linhagem padrão Trichoderma reesei QM9414. A melhor combinação de fontes de nitrogênio foi a razão 4:3:3; 5:3:2 e 6:3:1 (sulfato de amónio, ureia e extrato de levedura) para F88, F811 e T. reesei, respectivamente. O ácido cítrico foi selecionado como agente tamponante para F88 e T. reesei, e PIPES para F811. Bagaço pré-tratado por explosão a vapor (BPT), como fonte de carbono, foi o melhor para induzir a produção de celulases e xilanases por F88 e F811, enquanto, Solka-Floc&reg; foi a melhor para T. reesei. As atividades de &beta;-glicosidase e xilanase foram maiores em F811 do que para T. reesei. No entanto, para FPA, T. reesei apresentou o melhor rendimento. Nos ensaios de hidrólise, as conversões de glicana e xilana foram semelhantes para ambas as linhagens, mesmo havendo acúmulo de celobiose no ensaio de T. reesei. Comparando os dados obtidos para ambas linhagens, uma selvagem e outra que é considerada referência industrial, F811 se mostrou promissor para a produção de enzimas hidrolíticas e como consequência, a habilidade em transformar a biomassa em açúcares fermentáveis. / The increasing demand for energy and the necessity to promote sustainable development has focused on renewable fuels. Within the available biofuels, 2G or second generation, has the aim of releasing the energy contained in plant biomass. Many microorganisms are able to secret enzymes capable of breaking down lignocellulose, the main component of plant cell walls, into fermentable sugars. The objectives of this project was to select filamentous fungi that produce enzymes that degrade biomass and optimize the growth conditions for them. Four isolates and two standards strains were tested for the production of cellulases and identified by ITS (Internal Transcribed Spacer) sequencing. After initial characterization, three strains were selected and tested in different sources of nitrogen and carbon, and buffering agents for optimal growth. The ideal conditions were chosen based on the criteria of enzymatic activity, total proteins released and pH. After the ideal condition for each strain were established, cell free extracts from each culture were lyophilized and the total protein content determined. This extract was tested for FPA (Filter Paper Activity), &beta;- glucosidase and xylanase activity and the hydrolysis assays were carried out using pretreated biomass. The selected strains were identified as Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) and the standard strain Trichoderma reesei QM9414. The best combination of nitrogen sources was the ratio 4:3:3; 5:3:2 and 6:3:1 (ammonium sulfate, urea and yeast extract) for F88, F811 and T. reesei, respectively. Citric acid was selected as buffering agent for F88 and T. reesei, and PIPES for F811. Steam exploded bagasse, as a carbon source, was the best to induce the cellulase and xylanase production for F88 e F811, while, Solka-floc&reg; was better for T. reesei. The activities of &beta;-glucosidase and xylanase were higher for F811 than for T. reesei. However, for FPA, T. reesei showed the best yield. In the hydrolysis assays, conversions of glucan and xylan were similar for both strains, even though there was an accumulation of celobiose in the T. reesei\'s assay. Comparing the data obteined for both strains, a wild type and an industrial reference, F811 showed as a promising strain to produce hydrolytic enzymes and as consequence, break down biomass into fermentable sugars.

O uso desenfreado dos recursos naturais durante as últimas décadas têm impactado drasticamente o meio ambiente, direcionando a humanidade a investir no desenvolvimento de tecnologias para produção sustentável e ecológica de novas fontes de energia renovável e de produtos verdes. Nesse âmbito, o uso de resíduos derivados da biomassa vegetal tem sido apresentado como uma promissora alternativa à substituição de combustíveis, componentes químicos e polímeros de origem fóssil. Esse material é barato, abundante e não compete direta ou indiretamente com a segurança alimentar. Hoje, mais de 200 compostos químicos e biopolímeros de valor agregado podem ser obtidos a partir do processamento de material lignocelulósico. Todavia, essa tecnologia ainda não é plenamente desenvolvida, afetando sua competitividade econômica, sendo que o maior custo atribui-se à despolimerização enzimática dos polissacarídeos que formam a parede celular vegetal (PCV). Essa etapa requer preparados enzimáticos compostos por diversas enzimas, que agem sinergicamente sobre a complexa estrutura da PCV. Dentre essas enzimas, as pectinases e xilanases desempenham um importante papel na desconstrução dos polímeros pécticos e da hemicelulose. O presente trabalho objetivou o estudo funcional e estrutural de diferentes classes de pectinases e xilanases com potencial biotecnológico, no intuito de contribuir para o desenvolvimento pleno da despolimerização enzimática da PCV. Dentro dessa perspectiva, foram estudadas: uma pectina metilesterase (Sl-PME) e uma endo-poligalacturonase (Sl-EndoPG) do inseto Sphenophorus levis; uma exo-poligalacturonase (Bl-ExoPG) de Bacillus licheniformis; uma xilanase GH10 (MT-Xyn10) e duas GH11 (MT-Xyn11a e MT-Xyn11b) identificadas no metatranscriptoma de um consórcio microbiótico derivado de compostagem de bagaço de cana-de-açúcar. A estrutura cristalográfica da Sl-PME evidenciou alta semelhança com outra PME de inseto. Também foi concluído que as PMEs de inseto são mais similares às bacterianas, quando comparadas às fúngicas e vegetais, principalmente em relação ao sulco catalítico. Além disso, PMEs de inseto, exclusivamente, apresentam uma permutação circular, possívelmente realcionada a um evento de transferência horizontal. A Bl-ExoPG apresentou-se monomérica em solução, com atividade ótima em pH neutro a 60&deg;C, sendo estável em uma ampla faixa de pH (5-10) e com considerável termoestabilidade em elevadas temperaturas. Essa enzima, também, apresentou especificidade por pectina não-metilada, liberando unicamente monômeros de ácido galacturônico. As três xilanases estudadas apresentaram-se monoméricas em solução, com maior atividade entre 30 e 45&deg;C e pHs de 6 a 9, retendo atividade acima de 50% nos pHs 5 e 10. Além disso, todas elas apresentam especificidade por xilano, sendo que a MT-Xyn10 apresentou, também, alta atividade sobre arabinoxilano. A MT-Xyn10 apresentou um conjunto de propriedades enzimáticas bastante atrativas às aplicações industriais, uma vez que é altamente estável em uma ampla faixa de pH (4-10), termoestável em temperaturas de até 50&deg;C e sua ação catalítica produz diversos xilo-oligossacarídeos de alto valor agregado. A análise da estrutura cristalográfica da MT-Xyn11a revela três particularidades estruturais, compartilhadas com a MT-Xyn11b, mas não descritas para outras GH11. Dentre essas particularidades, um loop parece limitar o acesso do substrato ao sítio catalítico, contribuindo diretamente para a baixa afinidade ao substrato apresentada por essas duas enzimas. / Decades of unbridled use of natural resources have drastically affected the global environment, driving humanity to invest in the development of novel technologies for production of sustainable and ecofriendly renewable energy sources and green products. In this context, plant biomass residues have been presented as a promising alternative to fuels, chemicals and polymers derived from fossil reserves. This feedstock is abundant, cheap and does not compete directly or indirectly with food security. Today, more than 200 value-added chemicals and biopolymers can be generated by processing lignocellulosic material. However, this technology is not fully developed yet; its major costs stem from the enzymatic depolymerization of the polysaccharides that constitute the plant cell wall (PCW). This step requires enzymatic cocktails composed of several enzymes that synergistically deconstruct the complex PCW. Among these enzymes, pectinases and xylanases play an important role in the depolymerization of pectic polymers and hemicellulose. The present work is a functional and structural study of different classes of pectinase and xylanases with biotechnological potential. It intends to contribute to the full development of PCW enzymatic depolymerization. With this perspective, we studied a pectin methylesterase (Sl-PME) and an endo-polygalacturonase (Sl-EndoPG) from the insect Sphenophorus levis; an exo-polygalacturonase (Bl-ExoPG) from Bacillus licheniformis; a GH10 xylanase (MT-Xyn10); and two GH11 xylanases (MT-Xyn11a and MT-Xyn11b) from the metatranscriptome of sugarcane bagasse compost-derived microbial consortia. The Sl-PME crystallographic structure showed high similarity with other insect PME. It was also concluded that insect PMEs are more similar to bacterial PMEs than fungi or plant PMEs, especially in relation to the catalytic groove. Moreover, insect PMEs exclusively presented a circular permutation that is possibly related to an event of horizontal gene transfer. Bl-ExoPG is monomeric in solution, with optimal activity on neutral pH and 60&deg;C, being stable in a wide pH range (5-10) and with considerable thermostability at high temperatures. This enzyme, also presented specificity for non-methylated pectin substrates, releasing only monomers of galacturonic acid as catalytic product. All three xylanases studied here are monomeric in solution, with optimal activity between 30&deg;C and 45&deg;C and between pHs 6 and 9, retaining more than 50% of original activity in the pHs 5 and 10. Besides, they all showed specificity for xylan, and MT-Xyn10 also showed high activity on arabinoxylan. MT-Xyn10 revealed a set of enzymatic properties attractive for industrial applications, such as high stability in a wide pH range (4-10), thermostability up to 50&deg;C and released products that are high value-added xilo-oligosaccharides. The MT-Xyn11a crystallographic structure revealed three structural particularities shared with MT-Xyn11b, but not previously described in other GH11. Among these particularities, a loop seems to limit the substrate access to the catalytic site, contributing to the low enzyme affinity presented by both MT-Xyn11a and MT-Xyn11b.

A crescente demanda por energia e a necessidade de promover o desenvolvimento sustentável colocam em foco os combustíveis renováveis. Dentro de biocombustíveis, os 2G ou segunda geração, têm como objetivo a utilização da energia contida na biomassa vegetal. Muitos microorganismos são capazes de excretar enzimas que quebram a lignocelulose, o principal componente das paredes celulares da planta, em açúcares fermentáveis. Os objetivos deste trabalho foram selecionar fungos filamentosos que produzem enzimas que degradam a biomassa e otimizar suas condições de cultivo. Quatro isolados e duas linhagems padrão foram testadas para a produção de celulases e identificadas pelo sequencimaneto da região ITS (Internal Transcribed Spacer). Após a caracterização inicial, três linhagens foram selecionadas e testadas em diferentes fontes de nitrogênio e carbono, e agentes tamponantes, visando o cultivo ótimo para cada delas. As condições ideais foram escolhidas com base em critérios de atividade enzimática, proteínas totais liberadas e pH. Após o estabelecimento das condições ótimas, os sobrenadantes das culturas foram liofilizados e o teor de proteínas determinado. O mesmo extrato foi testado quanto à FPA (Filter Paper Activity), atividades de &beta;-glicosidase e xilanases, e quanto sua capacidade hidrolitica na biomassa pré-tratada. As linhagens selecionadas foram identificadas como Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) e a linhagem padrão Trichoderma reesei QM9414. A melhor combinação de fontes de nitrogênio foi a razão 4:3:3; 5:3:2 e 6:3:1 (sulfato de amónio, ureia e extrato de levedura) para F88, F811 e T. reesei, respectivamente. O ácido cítrico foi selecionado como agente tamponante para F88 e T. reesei, e PIPES para F811. Bagaço pré-tratado por explosão a vapor (BPT), como fonte de carbono, foi o melhor para induzir a produção de celulases e xilanases por F88 e F811, enquanto, Solka-Floc&reg; foi a melhor para T. reesei. As atividades de &beta;-glicosidase e xilanase foram maiores em F811 do que para T. reesei. No entanto, para FPA, T. reesei apresentou o melhor rendimento. Nos ensaios de hidrólise, as conversões de glicana e xilana foram semelhantes para ambas as linhagens, mesmo havendo acúmulo de celobiose no ensaio de T. reesei. Comparando os dados obtidos para ambas linhagens, uma selvagem e outra que é considerada referência industrial, F811 se mostrou promissor para a produção de enzimas hidrolíticas e como consequência, a habilidade em transformar a biomassa em açúcares fermentáveis. / The increasing demand for energy and the necessity to promote sustainable development has focused on renewable fuels. Within the available biofuels, 2G or second generation, has the aim of releasing the energy contained in plant biomass. Many microorganisms are able to secret enzymes capable of breaking down lignocellulose, the main component of plant cell walls, into fermentable sugars. The objectives of this project was to select filamentous fungi that produce enzymes that degrade biomass and optimize the growth conditions for them. Four isolates and two standards strains were tested for the production of cellulases and identified by ITS (Internal Transcribed Spacer) sequencing. After initial characterization, three strains were selected and tested in different sources of nitrogen and carbon, and buffering agents for optimal growth. The ideal conditions were chosen based on the criteria of enzymatic activity, total proteins released and pH. After the ideal condition for each strain were established, cell free extracts from each culture were lyophilized and the total protein content determined. This extract was tested for FPA (Filter Paper Activity), &beta;- glucosidase and xylanase activity and the hydrolysis assays were carried out using pretreated biomass. The selected strains were identified as Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) and the standard strain Trichoderma reesei QM9414. The best combination of nitrogen sources was the ratio 4:3:3; 5:3:2 and 6:3:1 (ammonium sulfate, urea and yeast extract) for F88, F811 and T. reesei, respectively. Citric acid was selected as buffering agent for F88 and T. reesei, and PIPES for F811. Steam exploded bagasse, as a carbon source, was the best to induce the cellulase and xylanase production for F88 e F811, while, Solka-floc&reg; was better for T. reesei. The activities of &beta;-glucosidase and xylanase were higher for F811 than for T. reesei. However, for FPA, T. reesei showed the best yield. In the hydrolysis assays, conversions of glucan and xylan were similar for both strains, even though there was an accumulation of celobiose in the T. reesei\'s assay. Comparing the data obteined for both strains, a wild type and an industrial reference, F811 showed as a promising strain to produce hydrolytic enzymes and as consequence, break down biomass into fermentable sugars.