Production of xylanase and itaconic acid (IA) from Aspergillus terreus NRRL 1960 from agricultural residues was investigated in this study. Two different media were tested and the medium having itaconic acid inducing capacity was chosen for further studies due to its high xylanase and IA production capacity. The best xylan concentration was found as 2% (w/v). Addition of commercial xylanase to production culture resulted in higher initial simple sugar concentration which increased IA production slightly but decreased xylanase production. Among tested agricultural residues / corn cob, cotton stalk and sunflower stalk, the highest xylanase production was obtained on corn cob. Increasing the corn cob concentration and applying wet heat pretreatment increased the xylanase production level. In a two-step fermentation process, 70000 IU/L xylanase production was achieved in a medium containing 7% wet heat treated corn cob followed by 17 g/L IA production in a medium containing 10% glucose. Molecular weight and isoelectric point of xylanase were found as 19 kDa and pH 9.0, respectively. The enzyme was optimally active at 50&deg / C and pH 6.5-7.0. Kinetic experiments at 50&deg / C and pH 7.0 resulted in apparent Km and Vmax values of 2.5&plusmn / 0.05 mg xylan/mL and 50.2&plusmn / 0.4 IU/&micro / g protein, respectively. The major products of birchwood xylan hydrolysis were determined by thin layer chromatography as xylobiose and xylotriose. These findings indicate that the enzyme could be advantageous for use in different industrial applications due to its low molecular weight and its potential use for xylooligosaccharide production.

Enzyme structure dynamics has recently been revealed to be essential for structure-function relationship. Among various structure dynamics analysis platforms, hydrogen deuterium exchange mass spectrometry stands as an efficient and high-throughput way to analyze protein dynamics upon ligand binding, protein folding, and enzyme catalysis. HDX-MS can be used to study the regional dynamics of proteins based on the m/z value or percentage of deuterium incorporation for the digested peptides in the HDX experiments. Various software packages have been developed to analyze HDX-MS data. However, for the accurate, enhanced, and explicit statistical analysis of HDX-MS data statistical analysis of software was developed as HDXanalyzer. The capability of HDX-MS analysis for the identification of enzyme structure dynamics was tested by using model catalysis endoxylanase A (XYN I) from Trichoderma longibrachiatum. The HDX data of XYN I revealed a highly dynamic personality of XYN I through the interaction with two substrates. The dynamic data which certainly restricts the targeted regions for the protein engineering efforts provided useful knowledge about the essential structural modifications for the catalysis of XYN I. The obtained knowledge was then employed for the engineering studies in order to improve the certain characteristics of XYN I protein. The high level stabilization of XYN I protein was gathered and the two highly active and moderately thermostable XYN I recombinants were developed based on the HDX-MS data which further confirmed the efficiency of the current strategy for the rational designs of catalytic proteins. A differential dynamics analysis of the two structurally similar catalysts was also performed through HDX-MS. The functionally and sequentially different but structurally highly similar XYN I and endoglucanase (Eg1A) enzymes revealed distinct structure dynamic characteristics. Compared to XYN I, Eg1A from Aspergillus niger indicated quite restricted structural motions. The data clearly postulated that the intrinsic dynamic modifications of during the enzymatic catalysis may not be the only driving force in all cases. In summary, the integration of the structure dynamics knowledge to the current biochemical and biophysical data of catalysts may provide novel insights to further enzyme improvement applications.

In this study, 11 bacterial isolates from Salt Lake,Turkey were identified by using fatty acid methyl ester (FAME) analysis. They were screened for production of industrially important enzymes xylanase, cellulase, &amp / #945 / -amylase and protease. These enzymes were characterized in terms of enzyme activity, stability, optimum temperature and optimum pH. One of the isolates was identified as Bacillus pumilus, and two of them were identified as Bacillus subtilis. Other isolates were determined to be Bacillus licheniformis. All the isolates were determined to produce xylanase. Optimum temperatures and optimum pH values of xylanases were 50-55 &deg / C and pH 7.0-8.0. Xylanases were quite stable up to pH 8.0 and 70 &deg / C. Isolates were not significant cellulase producers. Four of the isolates did not produce any cellulase enzyme and the rest produced negligible amounts of cellulase. Therefore, xylanases from the isolates were promising for pulp and paper industry, which requires cellulase free and stable xylanases. All the isolates produced appreciable quantities of &amp / #945 / -amylase. Optimum temperatures and optimum pH values of &amp / #945 / -amylases 60-80 &deg / C and pH 7.0-8.0. &amp / #945 / -Amylases were quite stable up to pH 9.0 and 80 &deg / C. &amp / #945 / -Amylases from the isolates were promising for starch processing industry, which requires &amp / #945 / -amylases stable at high temperatures and for detergent industry, which requires &amp / #945 / -amylases stable at alkaline pH values. Considerable protease productions were achieved by all the isolates. TTG 2 was the best protease producer with 271 U/ml. Optimum temperatures and optimum pH values of proteases were 50-60 &deg / C and pH 7.0-7.4. Proteases were quite stable up to pH 9.0 and 80 &deg / C. Proteases from the isolates were promising for detergent and leather industry, in which proteases must be stable at alkaline pH values.

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O desenvolvimento deste projeto envolveu as seguintes etapas: caracteriza??o centesimal dos res?duos agroindustriais; avalia??o do potencial indutor de cada res?duo agroindustrial sobre a produ??o enzim?tica de holocelulases por cada uma das linhagens f?ngicas pesquisadas; otimiza??o da produ??o das hidrolases de interesse com o uso da linhagem f?ngica e do res?duo agroindustrial que se destacaram; caracteriza??o do extrato enzim?tico obtido na condi??o otimizada; e avalia??o da aplica??o do extrato enzim?tico obtido na condi??o otimizada na sacarifica??o de biomassas lignocelul?sicas. Cinco linhagens de fungos filamentosos, Aspergillus niger INCQS:40065, Aspergillus tubingensis AN1257, Fusarium oxysporum INCQS:40144, Penicillium oxalicum INCQS:40103 e Trichoderma reesei CCT2768, e seis res?duos agroindustriais, tortas de caro?o de algod?o, dend?, girassol, maca?ba, mamona e pinh?o manso, usados como fontes de carbono, foram avaliados para a produ??o das enzimas de interesse. Dentre as linhagens testadas, Aspergillus tubingensis AN1257 foi a que se destacou para a produ??o de enzimas celulol?ticas e xilanol?ticas, especialmente quando combinado com a torta de caro?o de algod?o. A otimiza??o de processo conduzida com A. tubingensis e a torta de caro?o de algod?o para a produ??o das atividades de CMCase, FPase, ?-glucosidase e xilanase apontou a raz?o s?lido:l?quido (S/L) de 35%, a fonte de nitrog?nio de 1,30 g de (NH4)2SO4 /100g torta, e o tamanho do in?culo de 1,00 x 107 con?dios/g de torta, como determinantes para a condi??o fermentativa otimizada. Nesta condi??o fermentativa otimizada foram obtidos valores de atividade aproximados de 20 U/g para CMCase, 50U/g para FPase, 300 U/g para ?-glucosidase e 1300 U/g para xilanase, ap?s 8 dias de fermenta??o. Os efeitos combinados da temperatura e do pH sobre as atividades das enzimas holocelulol?ticas produzidas por A. tubingensis AN1257 denotam uma boa aplicabilidade destas enzimas sob temperaturas entre 40 e 60?C, e pH em torno de 4,0 a 5,0. O extrato enzim?tico produzido por A. tubingensis AN1257 na condi??o fermentativa otimizada mostrou-se eficiente na sacarifica??o das pr?prias tortas vegetais usadas inicialmente como fontes de carbono, sobretudo quando aplicado em processo de sacarifica??o e fermenta??o simult?nea da torta de girassol pr?-tratada. Este processo resultou na produ??o de 16 g de etanol por 100g de torta de caro?o de algod?o e um mosto fermentado com a concentra??o de 20g/L de etanol. O conjunto dos resultados obtidos nesta tese aponta como promissor o uso de alguns res?duos agroindustriais e fungos filamentosos selecionados para a produ??o de enzimas holocelulol?ticas com potencial aplica??o para a produ??o de bioetanol de 2? gera??o. Palavras / Programa de P?s-gradua??o em Biocombust?veis, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2015. / The demand for hollocelulolytic enzymes has increased in recent years, driven mainly by the newly established market for 2ndgeneration ethanol. The potential of selected filamentous fungi and derivatives of agro-industrial waste oil, used here as carbon sources for the production of cellulolytic and xylan-degrading enzymes, was evaluated. The development of the project involved the following steps: partial characterization of agro-industrial waste; the inducing potential of each agroindustrial residue on enzyme production by each filamentous fungus strain was investigated; optimization of the production of the hydrolases by the fungal strain and the agro-industrial waste that showed the greatest potential; characterization of the enzyme extract obtained under the optimum conditions; and evaluation of the implementation of the enzymatic extract obtained under the optimum condition for saccharification of lignocellulosic biomass. Five strains of filamentous fungi - Aspergillus niger INCQS: 40065, Aspergillus tubingensis AN1257, Fusarium oxysporum INCQS:40144, Penicillium oxalicum INCQS:40103 and Trichoderma reesei CCT2768 -- and six agro-industrial wastes -- cottonseed, palm, sunflower, maca?ba, castor and jatropha cakes, used as carbon sources -- were assessed for production of the enzymatic activities of interest. Among the strains tested, Aspergillus tubingensis AN1257 was most noteworthy for the production of cellulolytic and xylanase enzymes, especially when combined with cottonseed cake. The optimization conducted with A. tubingensis and cottonseed cake for the production of CMCase, FPase, ?-glucosidase and xylanase activities indicated that the conditions for an optimum fermentation were a solid/liquid (S/L) ratio of 35%, 1.30 g (NH4)2SO4/100 g cake as the source of nitrogen, and an inoculum size of 1.00 x 107 conidia/g of cake. Activity values of approximately 20 U/g for CMCase, 50 U/g for FPase, 300 U/g for ?-glucosidase and 1300 U/g for xylanase were obtained after 8 days of fermentation under optimized fermentation conditions. The combined effects of temperature and pH on the activities of the holocellulolytic enzymes produced by A. tubingensis AN1257 indicated that these enzymes were most efficient at temperatures between 40 and 60 ?C and pH between 4.0 and 5.0. The enzyme extract produced by A. tubingensis under optimized fermentation conditions was efficient in the saccharification of the same vegetable cakes initially used as carbon sources, especially when applied to the simultaneous saccharification and fermentation of pretreated sunflower cake. This process resulted in the production of 16 g of ethanol per 100 g of cottonseed cake and a fermented must with a concentration of 20 g/L of ethanol. Thus, the use of some agro-industrial wastes and selected filamentous fungi for the production of holocelulol?ticas enzymes with potential application for the production of 2nd generation bioethanol was shown to be very promising.

O pão é um dos alimentos mais consumidos na dieta humana, estando presente na mesa de diferentes povos e classes sociais. Além do seu aspecto apetitoso, o pão apresenta importante valor nutricional, uma vez que é fonte de carboidratos, proteínas, vitaminas e sais minerais. Na medida em que a panificação se estendeu do processo artesanal para a escala industrial, a utilização de agentes melhoradores de farinha vem se ampliando em função da necessidade de melhorar as características de processo e a vida útil dos produtos obtidos. Durante décadas, enzimas foram adicionadas à farinha na produção de pães com a finalidade de melhorar seu volume, sabor, aroma, estrutura da casca e do miolo, maciez e vida-deprateleira. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência da adição de enzimas na qualidade de pães brancos e pães ricos em fibras através do uso de associações enzimáticas de transglutaminase, xilanase e amilase. Foram preparadas 17 formulações para cada tipo de pão, com diferentes concentrações das enzimas, de acordo com o planejamento experimental 23 e para análise foi utilizada a metodologia de superfície de resposta. As etapas básicas da produção dos pães foram: pesagem e amassamento; divisão, boleamento e descanso; modelagem; fermentação; forneamento e resfriamento. As farinhas com a adição da associação enzimática e padrão foram submetidas às análises de umidade, cinzas, teor de glúten, cor, absorção de água, estabilidade, elasticidade e extensibilidade. Todas as 17 formulações e a formulação padrão para pão branco e pão rico em fibra foram analisadas sensorialmente, através da Análise Descritiva Quantitativa (ADQ), e físico-quimicamente, através das análises de umidade, cinzas, textura, cor, altura das fatias e volume específico. Os resultados obtidos no presente trabalho mostraram que a adição destas enzimas não é necessária para se ter um pão com boa qualidade e com características exigidas pelos consumidores. Observou-se que o efeito da associação das três enzimas testadas não foi significativo, pois na maioria das características avaliadas o melhor resultado foi o apresentado na amostra padrão, sem adição de enzimas. / Bread is one of the most consumed foods in the human diet. It is found on the table of people from different cultures and social classes. Besides its appetizing aspect, bread also presents important nutritional value, since it is a source of carbohydrates, proteins, vitamins and mineral salts. As bread-making has gone from the handmade process to the industrial scale, the usage of bread enhancements has increased in order to attend the necessity of improving process’s characteristics and lifespan of the obtained product. Throughout many decades, enzymes were added to the flour during bread’s production with the objective of increasing its volume, taste, aroma, crust’s and crumb’s structure, softness and lifespan. The present work is proposed to evaluate how the addition of enzymes can influence on the quality of white and wholemeal bread through the use of enzymatic associations of transglutaminase, xylanase and amylase. 17 formulations have been prepared for each type of bread, each one with different enzyme concentrations, according to the experimental planning 2³. The methodology used for the analysis was the Response Surface Methodology – RSM. The basic steps of production were: weighing and kneading; dividing, ball making and resting; molding; fermenting; baking and cooling. Both the standard flours and the ones with the addition of enzymatic associations were submitted to humidity, ashes, gluten level, color, water absorption, stability, elasticity, and extensibility analysis. All 17 formulations and the standard formulation for white bread and wholemeal bread have been submitted to sensorial evaluation using Quantitative Descriptive Analysis. They have also been physically and chemically tested through the analysis of humidity, ashes, texture, color, height of the slices and specific volume. The results obtained from this research proved that the addition of those enzymes is not necessary in order to make good quality bread with characteristics demanded by its consumers. It has been observed that the effect of the association of the 3 tested enzymes was not significant. The standard sample - free of enzyme addition - presented the best results for most of the evaluated characteristics.

Esta tese foi conduzida para avaliar os efeitos da suplementação de diferentes enzimas exógenas e suas combinações em dietas milho e farelo de soja para frangos de corte. Dois experimentos (Exp.) de digestibilidade e um experimento de desempenho foram conduzidos utilizando um total de 2616 frangos de corte, machos Cobb 500. No Exp. 1, as aves foram alimentadas com uma ração basal milho-farelo de soja ou uma dieta com 60% da ração basal milho-soja + 40% de milho. Ambas dietas foram suplementadas com níveis crescentes de beta-xilanase [0, 50, 100, 150 e 200 unidades de β- xilanase fúngica (FXU)/kg de ração], distribuídas em 10 tratamentos com 8 repetições e 6 aves cada. O Exp. 2 consistiu do fornecimento de dietas milhosoja, formuladas com ou sem fitase [1000 unidades de fitase fúngica (FYT)/kg] e suplementadas com amilase [80 kilo-Novo unidades (KNU) de alfaamilase/ kg], xilanase (100 FXU/kg) ou a combinação de amilase + xilanase, em 6 tratamentos com 8 repetições e 7 aves cada. Nestes dois estudos foi utilizada a mesma formulação da ração basal milho-soja, mesmo milho e metodologia de análises. As aves foram avaliadas dos 14 aos 25 d, com coleta de excretas de 21 a 24 d e coleta de conteúdo ileal aos 25 d. Por fim, o Exp. 3 foi realizado para avaliar o desempenho de frangos de corte e a biodisponibilidade da energia até 40 d. Foram utilizados os mesmos produtos enzimáticos, e estes foram suplementados na mesma quantidade dos estudos anteriores. Não foram observadas interações entre xilanase e as dietas no Exp. 1 ou entre carboidrases e fitase no Exp. 2. A utilização da energia e a digestibilidade da proteína bruta e matéria seca aumentaram (P < 0,05) com a suplementação de 100 FXU/kg de xilanase em dietas milho-soja. Frangos de corte alimentados dos 14 aos 25 d com dietas formuladas com fitase ou suplementadas com amilase + xilanase tiveram maior ganho de peso (P < 0,05) e menor conversão alimentar (P < 0,05), quando comparados aos frangos que receberam dietas sem carboidrases de 14 a 25 d. A EMAn e a digestibilidade do amido no jejuno e no ileo aumentaram (P < 0,05), respectivamente, em 99 kcal/kg, 3,5% e 2,4% quando os frangos receberam dietas suplementadas com amilase + xilanase. No Exp. 3, no período de 1 a 40 d, a EMAn estimada para GP foi 99, 83 e 136 kcal/kg e para CA foi 40, 26 e 42 kcal/kg, respectivamente para amilase, xilanase e amilase + xilanase. Resultados destes experimentos mostraram que dietas milho-soja formuladas com fitase e suplementadas com xilanase, amilase e amilase + xilanase resultaram em melhor desempenho produtivo e maior EMAn e digestibilidade do amido para frangos de corte. / This thesis was conducted to evaluate effects of different exogenous enzyme supplementation and its combinations in corn-soybean meal diets for broilers. Two experiments (Exp.) of digestibility and one experiment of performance were done using a total of 2,616 Cobb 500 male broiler chickens. In Exp. 1, birds were fed a corn-soy basal diet or a diet with 60% corn-soy basal + 40% corn. Both diets were supplemented with increasing levels of beta-xylanase [0, 50, 100, 150, and 200 fungal β-xylanase units (FXU)/kg of feed], distributed in 10 treatments with 8 replications and 6 birds each. The Exp. 2 consisted of corn-soy diets formulated without or with phytase [1,000 fungal phytase units (FYT/kg)] and supplemented with amylase [80 kilo- Novo α-amylase units (KNU)/kg] or the combination of amylase + xylanase, to 6 treatments with 8 replications and 7 birds each. In these two studies, the same corn-soy basal diet was formulated and the same corn and methodology analysis were used. Birds were evaluated from 14 to 25 d, with excreta collection from 21 to 24 d and ileal content collection at 25 d. Finally, the Exp. 3 was done to evaluate broiler growth performance and energy equivalency until 40 d. The same enzyme products supplemented at the same amount of earlier studies were used. No interactions were found between xylanase and diets in Exp. 1 or between carbohydrases and phytase in Exp. 2. Energy utilization and digestibility of crude protein and dry matter increased (P < 0.05) with 100 FXU/kg xylanase supplementation in corn-soy diets. Broilers fed diets from 14 to 25 d formulated whit phytase or supplemented with amylase + xylanase had higher body weight gain (P < 0.05) and lower feed conversion rate (P < 0.05) when compared to broilers fed diets without carbohydrases. The AMEn and starch digestibility in jejum and ileum increased (P < 0.05), respectively by 99 kcal/kg, 3.5% and 2.4% when broilers were fed diets supplemented with amylase + xylanase. In Exp. 3, from 1 to 40 d, AMEn estimated for BWG was 99, 83, and 136 kcal/kg and for FCR was 40, 26, and 42 kcal/kg, respectively for amylase, xylanase, and amylase + xylanase. Results from these experiments show that corn-soy diets having phytase and supplemented with xylanase, amylase, and amylase + xylanase led to improved growth performance, and increased AMEn and starch digestibility in broiler chickens.

O processamento da uva para produção de suco e vinho engloba diferentes processos tecnológicos, como por exemplo, o tratamento enzimático, onde usualmente são utilizadas preparações de enzimas comerciais, buscando-se aprimorar processos como clarificação e extração. Entretanto, esse é um tratamento que demanda elevado tempo de processamento, sendo relevante a busca por novas tecnologias a fim de apurar o processo. O ultrassom pode ser utilizado como uma alternativa para reduzir o tempo de processamento e acrescer qualidade ao produto, pois além de ser uma técnica sustentável, pode proporcionar benefícios no uso combinado com enzimas, favorecendo as reações em decorrência de seus efeitos. Neste trabalho, o uso em conjunto de tratamento enzimático (ET), ultrassom (US), e agitação mecânica (MS) foi avaliado na extração do mosto da uva Cabernet Sauvignon, a fim de compreender os efeitos das técnicas combinadas. Inicialmente, nove preparados enzimáticos comerciais foram caracterizados segundo suas atividades enzimáticas e aplicados para extração do mosto, avaliando a variação de temperatura (40, 50 e 60 °C), tempo (15 e 30 min), e concentração de enzima (0,01 a 2,0 U.g-1). Os melhores resultados foram obtidos com o preparado Zimopec PX5® nas condições de 1,0 U.g-1 de pectinase a 50 °C por 30 min. A extração do mosto apresentou aumento significativo nos parâmetros de qualidade avaliados (cor, sólidos solúveis totais, rendimento de extração, capacidade antioxidante, antocianinas totais) quando os três métodos de extração (US, MS e ET) foram combinados, principalmente na presença do ultrassom. Tendo em vista o efeito sinérgico obtido entre a aplicação enzimática e o ultrassom na extração do mosto, um novo estudo foi conduzido buscando investigar a influência da sonicação na eficiência catalítica das enzimas pectinase (PE), xilanase (XLN) e celulase (CE). Para isso, as atividades enzimáticas foram avaliadas em diferentes pHs e em amostras de enzima e substratos submetidas a um tratamento prévio de sonicação por tempos determinados (0 – 30 min). Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos foram estimados, apresentando um efeito positivo do US na atividade das enzimas. A sonicação prévia do substrato contribuiu significativamente para o aumento da atividade de XLN, enquanto a sonicação prévia da enzima melhorou a atividade da CE e PE. Os resultados apresentaram um aumento na velocidade de hidrólise das enzimas com o uso do US, assim como um aumento da eficiência catalítica (Vmax/Km), mostrando o potencial da aplicação do US para ativação das enzimas. De acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o ultrassom proporcionou melhorias na extração do mosto, podendo ser utilizado como uma técnica alternativa de processo, bem como apresentou efeitos benéficos sobre as atividades enzimáticas. / Grape processing for juice and wine production encompasses different technological processes, such as enzymatic treatment, that usually uses commercial enzyme preparations to improve clarification and extraction processes. However, this is a treatment that demands high processing time, being relevant the search for new technologies in order to improve the whole process. Ultrasound (US) can be used as an alternative to reduce the processing time and improve the quality of the product, moreover, it can provide benefits in the combined use with enzymes, favoring the enzymatic reactions. In this work, the combined use of enzymatic treatment (ET), ultrasound (US), and mechanical agitation (MS) was studied in order to understand the effects of the techniques on Cabernet Sauvignon must extraction. Initially, nine commercial enzyme preparations were characterized according to their enzymatic activities and applied to must extraction, evaluating temperature (40, 50 and 60 °C), time (15 and 30 min), and enzyme concentration (0.01 to 2.0 Ug-1). The best results were obtained for the preparation Zimopec PX5® under conditions of 1.0 U.g-1 of pectinase at 50 °C for 30 min. A significant increase on quality parameters (color, °Brix, yield, antioxidant capacity, total anthocyanins) was obtained to extraction combining the three methods (US, MS and ET), mainly when US were applied. Based on these previous results, a new study was conducted to investigate the influence of sonication on the catalytic efficiency of the enzymes pectinase (PE), xylanase (XLN) and cellulase (CE). The enzymatic activities were evaluated at different pH and in samples of enzyme and substrates submitted to a previous treatment of sonication by determined times (0 - 30 min). The kinetic and thermodynamic parameters were estimated, showing a positive effect of the ultrasonic treatment on the enzymatic activity. Previous sonication of the substrate contributed significantly to the increase in XLN activity, whereas the previous sonication of the enzyme improved the activity of CE and PE. This research showed the potential benefits of ultrasound treatment on reaction rate and catalytic efficiency (Vmax/Km) improvement of enzymes, attesting that US can be used to increase the catalytic efficiency of pectinase, xylanase and cellulase enzymes. According to the obtained results, it can be affirmed that ultrasound improved the extraction process, and can be applied as an alternative technique, as well as provided beneficial effects on the enzymatic activity.

A fibra de soja (FS) é um resíduo agroindustrial lignocelulósico proveniente do processamento da soja, que, apesar de apresentar potencial para aproveitamento em bioprocessos, é empregado em produtos com baixo valor agregado, como ração animal. A fibra apresenta composição rica em hemicelulose e baixa concentração de lignina, o que destaca ainda mais seu potencial como substrato em bioprocessos. Tendo em vista o presente contexto, este trabalho teve como objetivo o aproveitamento da fibra de soja na produção das enzimas hemicelulolíticas xilanase e arabinofuranosidase por meio do cultivo em estado sólido de duas linhagens de Aspergillus nidulans recombinantes, e a subsequente aplicação dessas enzimas na produção de xilo-oligossacarídeos (XOS). A produção das enzimas foi realizada em três etapas avaliando-se os seguintes fatores: umidade, onde quatro diferentes níveis de umidade foram testados (53 %, 68 %, 76 % e 81 %), adição ou não de tampão HEPES e presença de maltose em duas concentrações (2% e 6 %). As maiores atividades enzimáticas ocorreram em cultivo com umidade de 68 %, presença do tampão HEPES (100 mM), ausência de maltose e em tempos de cultivo de 72 h para xilanase e 96 h para arabinofuranosidase. A produção de XOS foi obtida a partir da aplicação dos extratos enzimáticos brutos obtidos na etapa anterior tendo como substrato a fibra de soja. As produções de xilobiose (X2), xilotriose (X3) e xilotetraose (X4) foram otimizadas por planejamento composto central (DCCR), gerando uma superfície de resposta a partir das variáveis temperatura e concentração de xilanase. A melhor condição obtida (50 °C e 117 U·g-1 de FS) foi utilizada para avaliar a produção de XOS pela adição em conjunto do extrato bruto contendo xilanase com o extrato bruto contendo diferentes concentrações de arabinofuranosidase. O rendimento na produção de XOS neste trabalho foi de 28,8 % (p/p), sendo 138,36 mg·g-1 de xilana a concentração de xilobiose, 96,96 mg·g- 1 de xilana a concentração de xilotriose e 53,04 mg·g-1 de xilana a concentração de xilotetraose, todas em 9 h de reação. A fibra de soja demonstrou ser um substrato adequado para a produção de xilanase e arabinofuranosidase, sendo produzidas altas concentrações de ambas as enzimas. Através da aplicação dessas enzimas obteve-se alta conversão de xilana em diferentes XOS, principalmente aqueles com baixo grau de polimerização, utilizados industrialmente como ingrediente alimentar. / Soybean fiber (SF) is a lignocellulosic agroindustrial residue from the processing of soybean, which, despite having potential in bioprocesses, is used in products with low added value. The fiber is rich in hemicellulose and low concentrations of lignin, which further highlights its potential as a bioprocesses substrate. Considering present context, this work had as objective the use of soybean fiber in production of hemicellulolytic enzymes xylanase and arabinofuranosidase under solid state cultivation of two strains of recombinant Aspergillus nidulans, and the subsequent application of these enzymes in the production of xylooligosaccharides (XOS). Enzyme production was performed in three stages, with the following factors: moisture, where four different moisture levels were tested (53 %, 68 %, 76 % and 81 %), addition or absence of HEPES buffer and presence of maltose in two concentrations (2 % and 6 %). The major enzymatic activities occurred in cultures with moisture of 68 %, presence of HEPES buffer (100 mM), absence of maltose and at 72 h culture times for xylanase and 96 h for arabinofuranosidase. The production of XOS was obtained from the application of the crude enzymatic extracts obtained in the previous step with soybean fiber as the substrate. The production of xylobiose (X2), xylotriose (X3), and xylotetraose (X4) was optimized by central composite design (CCD), generating a response surface from the temperature and xylanase concentration variables. The best condition obtained (50 °C and 117 U·g-1 of SF) Was used to evaluate XOS production by the addition of the crude xylanase-containing crude extract containing the crude extract containing different concentrations of arabinofuranosidase. The yield of XOS in this work was 28.8 % (w/w), being the concentration of xylobiose 138.36 mg·g-1 of xylan, xylotriose concentration 96.96 mg·g-1 of xylan, and xylotetraose concentration 53.04 mg·g-1 of xylan in 9 h of reaction. Soybean fiber has been shown to be a suitable substrate for the production of xylanase and arabinofuranosidase, with high concentrations of both enzymes produced. Through the application of these enzymes, high conversion of xylan to different XOS was achieved, especially those with low degree of polymerization, used industrially as a food ingredient.

Xilooligossacarídeos (XOS) são produzidos a partir materiais lignocelulósicos contendo xilanos através de métodos químicos, hidrólise enzimática direta de um substrato susceptível à ação de xilanases e outras enzimas líticas, ou uma combinação de tratamentos químicos e enzimáticos. Os XOS são reconhecidos por trazerem benefício a saúde e são considerados ingredientes prebióticos. A utilização de resíduos agro-industriais produzidos no Rio Grande do Sul, tais como a casca de arroz, a casca de soja e o extrato de malte proveniente de cervejarias tornam-se substratos com grande potencial para a produção da enzima xilanase, principalmente em cultivo em estado sólido. Neste trabalho, foram analisados o potencial de diversos fungos selvagens e de um fungo recombinante na produção da enzima xilanase e outras enzimas importantes para a hidrólise de biomassa lignocelulósica, e a aplicação destes microrganismos para a produção de XOS em cultivos em estado sólido. Através de uma seleção de fungos foi possível definir o Aspergillus brasiliensis BLf1 como maior produtor de xilanase em cultivo sobre casca de arroz, obtendo atividade de 120,5 U.g-1 substrato. Nesta seleção foram analisadas também as enzimas celulase, β-glicosidase e β-xilosidase Um planejamento experimental fracionário 2(5-1) deste fungo selecionado e do fungo recombinante Aspergillus nidulans XynC A773 determinaram variáveis que influenciam a produção da enzima xilanase, chegando a uma atividade máxima de 230,7 U.g-1 para A. brasiliensis BLf1 e 187,9 U.g-1 para A. nidulans XynC A773. Posteriormente, estas preparações enzimáticas foram aplicadas à casca de arroz para hidrolisar sua estrutura hemicelulósica polimérica e obter xilolossacarídeos (37,25 mg de XOS.g-1 de substrato e 75,92 mg de XOS.g-1 de substrato, respectivamente). Por fim, foi avaliado o potencial prebiótico de XOS obtidos. Os resultados deste estudo revelaram o crescimento de L. plantarum BL011 e B. lactis BB-12 em XOS, com um aumento de massa celular seca de até 1,7 g.L-1 em 120h. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que é possível a obtenção de XOS a partir de resíduos abundantes no Estado e que os mesmos possuem potencial para serem utilizados como prebióticos, podendo, portanto, ser usados em aplicações relacionadas aos alimentos funcionais. / Xylooligosaccharides (XOS) are produced from lignocellulosic materials containing xylan by chemical methods, direct enzymatic hydrolysis of susceptible substrates using xylanases and other lytic enzymes, or a combination of chemical and enzymatic treatments. XOS are recognized for bringing benefit to health of the host and are considered prebiotic ingredients. The use of lignocellulosic residues produced in Rio Grande do Sul, such as rice husk, soybean hulls, and spent malt from brewery hold potential for the production of xylanase enzyme, especially under solid-state cultivation. In this work, several wild strains of fungi and one recombinant strain were tested for their potential of producing xylanase and their application in solid-state cultivation to obtain XOS. It was possible to define the Aspergillus brasiliensis BLf1 as the best producer of xylanase on rice husk, obtaining an activity of 120.5 U.g-1. Other important lytic enzymes were also analyzed: cellulase, β-glucosidase, and β-xylosidase The statistical experiment fractional factorial design 2(5-1) of cultures of this fungus and of the recombinant strain Aspergillus nidulans XynC A773 defined the variables that influenced the production of xylanase, showing maximal activities of 230.7 U.g-1 for A. brasiliensis BLf1 and 187.9 U.g-1 for A. nidulans XynC A773. Subsequently, these enzymatic preparations were applied to rice husk to hydrolyse its polymeric hemicellulosic structure and obtain xylooligosaccharides (37.25 mg XOS.g-1 substrate and 75.92 mg XOS.g-1 substrate, respectively). Finally, the prebiotic potential of XOS was evaluated by using them to grow L. plantarum BL011 and B. lactis BB-12, showing an increase in the dry cell mass of 1.7 g.L-1 at 120 hours. The results obtained in this research suggest that it is possible to obtain XOS from agro industrial residues of local production and they have the potential to be used as prebiotics, and could be used in food related applications.

Submitted by Ranieri Bueno Melati (ranierimelati@hotmail.com) on 2018-10-01T20:46:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final Ranieri_repositório.pdf: 1999040 bytes, checksum: 357cdd1de14cffcd6b19407c4e4e94db (MD5) / Rejected by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br), reason: Prezado Ranieri, O documento enviado para a coleção Campus Unesp Rio Claro foi recusado pelo(s) seguinte(s) motivo(s): - Falta a folha de aprovação, que deve ser solicitada à Seção de Pós-Graduação e deve ser inserida após a ficha catalográfica. - Agradecimentos: A Portaria nº 206, de 04/09/2018 Dispõe sobre obrigatoriedade de citação da CAPES nos agradecimentos da seguinte forma: "Art. 3º Deverão ser usadas as seguintes expressões, no idioma do trabalho: "O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001" Agradecemos a compreensão e aguardamos o envio do novo arquivo. Atenciosamente, Biblioteca Campus Rio Claro Repositório Institucional UNESP https://repositorio.unesp.br on 2018-10-02T11:50:17Z (GMT) / Submitted by Ranieri Bueno Melati (ranierimelati@hotmail.com) on 2018-10-03T04:14:22Z No. of bitstreams: 1 Ranieri_repositório.pdf: 2561662 bytes, checksum: 7233103c86de2f8eb883ce95a2389b87 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-10-03T13:55:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 melati_rb_me_rcla.pdf: 2561662 bytes, checksum: 7233103c86de2f8eb883ce95a2389b87 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-03T13:55:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 melati_rb_me_rcla.pdf: 2561662 bytes, checksum: 7233103c86de2f8eb883ce95a2389b87 (MD5) Previous issue date: 2018-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Materiais como o bagaço de cana-de-açúcar, são fartos na natureza e representam fontes renováveis para a extração de moléculas de interesse econômico, como as hemiceluloses. Entretanto, os métodos de extração dessas macromoléculas precisam ser melhor desenvolvidos para aplicação industrial. Deste modo, o objetivo principal do trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologia de extração de hemicelulose com alto rendimento e pureza utilizando frações da biomassa de cana-de-açúcar: folha e colmo: entrenó, nó e fração externa. Foram avaliadas duas estratégias: uma prévia deslignificação da biomassa; e deslignificação da hemicelulose extraída de material não deslignificado. As hemicelulose extraídas foram avaliadas como substrato para determinação de atividade enzimática de xilanase. O método de extração de hemicelulose empregou 10g de cada biomassa tratadas com peróxido de hidrogênio em concentrações de 3 e 6% (m/v), em volume reacional de 200mL, por 4h, a 75 rpm, a 25˚C. Após a reação, o pH foi corrigido com HCl 6 mols/L até 6, e cerca de 4 lavagens com etanol foram aplicadas. As reações de deslignificação das biomassas ocorreram em condições específicas para cada reagente: clorito de sódio (5, 10 e 20% m/m a 80°C/1 a 3h), peróxido de hidrogênio (5, 10 e 20% m/m a 25°C/4h) e sulfito de sódio (5,10 e 20% m/m a 121°C/30 min). A deslignificação da hemicelulose seguiu a mesma metodologia da deslignificação da biomassa, no entanto com concentração de 10% do reagente de deslignificação. A atividade enzimática de xilanase, foi realizada com extrato comercial utilizando as hemiceluloses extraídas e deslignificadas como substrato. As hemiceluloses extraídas foram monitoradas quanto a sua solubilidade e condutividade em solução. Os resultados de extração com 3 e 6% de peróxido mostraram valores entre 7 a 29% de rendimento. Os teores de lignina residual se mostraram coerentes com a literatura, ficando entre 4 a 10%. A deslignificação da biomassa previamente a extração de hemicelulose apresentou melhores resultados, rendendo entre 26,22% a 47,09%, com teor de lignina residual de 0,6% a 17,09%. A deslignificação da hemicelulose apresentou melhores resultados com o emprego de peróxido de hidrogênio, com redução de 58,44% do teor inicial de lignina. As maiores atividades enzimáticas foram obtidas com as hemicelulose provenientes da biomassa deslignificada com peróxido de hidrogênio 5 e 10% (174,97 e 166,12 UI mL-1). Os testes de solubilidade e pureza (baixa presença de sal) apontam que as hemiceluloses extraídas apresentaram características semelhante ou melhor que a xilana comercial. Na deslignificação das biomassas, o peróxido de hidrogênio foi o reagente que apresentou melhor resultado ao rendimento, pureza e solubilidade da hemicelulose. Este reagente também foi melhor na deslignificação das hemiceluloses, resultando menor teor de lignina residual. Para produzir um substrato para atividade enzimática a estratégia de deslignificação da biomassa previamente a extração de hemicelulose foi mais adequada, apresentando maior atividade enzimática. / Materials such as sugarcane bagasse are abundant in nature and represent renewable sources for the extraction of molecules of economic interest, such as hemicelluloses. However, the extraction methods for these macromolecules need to be better developed for industrial application. Thus, the main objective of the work has been the development of a hemicellulose extraction method with high yield and purity using fractions of sugarcane biomass: leaf and stem: internode, node, and external fraction. Two strategies have been evaluated: a prior delignification of the biomass, and the delignification of the hemicellulose extracted from nondelignified material. The extracted hemicellulose has been evaluated as a substrate for the determination of enzymatic activity of xylanase. The hemicellulose extraction method has employed 10g of each biomass treated with hydrogen peroxide in concentrations of 3 and 6% (m/v), in a reaction with volume of 200mL, for 4h, at 75 rpm, at 25ºC. After the reaction, the pH has been corrected with HCl 6 mol/L to 6, and about 4 washes with ethanol have been applied. The biomass delignification reactions have occurred under specific conditions for each reagent: sodium chlorite (5, 10, and 20% w/w 80 °C / 1 to 3h), hydrogen peroxide (5, 10, and 20% w/w 25°C/4h), and sodium sulfite (5.10 and 20% w/w 121°C/30 min). The delignification of the hemicellulose has followed the same methodology of delignification of the biomass, however with a concentration of 10% of the delignification reagent. The enzymatic activity of xylanase has been performed with commercial extract using hemicellulose extracted and delignified as substrate. The extracted hemicelluloses have been monitored for their solubility and conductivity in solution. The results of extraction with 3 and 6% peroxide have shown yield values between 7 and 29%. The residual lignin contents have been consistent with the literature, ranging from 4 to 10%. The delignification of the biomass prior to the extraction of hemicellulose presented better results, yielding between 26.22% and 47.09%, with residual lignin contents of 0.6% to 17.09%. The delignification of hemicellulose has presented better results with use of hydrogen peroxide, with reduction of 58.44% of the initial lignin content. The highest enzymatic activities have been obtained with the hemicellulose from the biomass delignified with hydrogen peroxide 5 and 10% (174.97 and 166.12 IU mL-1). The solubility and purity tests (low salt content) indicate that the extracted hemicelluloses have presented characteristics similar to or better than commercial xylan. In the delignification of the biomasses the hydrogen peroxide has been the reagent that has presented better results referring to yield, purity, and solubility of the hemicellulose. This reagent has also been better in the delignification of the hemicelluloses, resulting in lower residual lignin content. To produce a substrate for enzymatic activity the strategy of delignification of the biomass prior to hemicellulose extraction has been more adequate, presenting higher enzymatic activity. / CAPES: 1642526.