Orientador: Francisco Maugeri Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T15:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_FelipeBastos_M.pdf: 972824 bytes, checksum: a462e688ab46d2def7974c05146d274b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A endo-1,4-ß-xilanase (E.C. 3.2.1.8), comumente chamada de xilanase, possui grande aplicação em diferentes tipos de indústrias tais como a de ração animal, alimentos, têxteis, de papel, de produção de etanol a partir de biomassa, entre outras. Isso se deve ao fato de que esta enzima atua na hidrólise da xilana, o segundo mais abundante polissacarídeo encontrado na natureza, que está presente ligado a hemicelulose da parece celular de plantas. O objetivo deste trabalho foi selecionar, através do método de screening em placas de Petri, e avaliar a atividade enzimática de leveduras silvestres isoladas de diversas regiões do Brasil (Mata Atlântica, Floresta Amazônica, Cerrado e Pantanal) quanto à produção de xilanase. Para o screening em placas, utilizou-se um meio de cultura no qual a única fonte de carbono era a xilana para induzir a produção da enzima. De um total de 349 microrganismos analisados, foram obtidas 84 cepas produtoras, porém somente 37 possuíam um índice de relação enzimática (diâmetro do halo descolorido / diâmetro da colônia) maior que 2,5. Em função deste resultado prosseguiu-se com a seleção dos melhores microrganismos para a produção da enzima em meio líquido. Após observações preliminares apenas 9 cepas obtiveram um crescimento satisfatório em meio líquido a 30ºC e 150 rpm. Estes foram avaliados em dois meios de culturas diferentes em relação à atividade enzimática do caldo enzimático à 50ºC por 5 min em shaker. Dentre estes, os microrganismos AAD5 e AY10 se destacaram por apresentarem a atividade enzimática em torno de 2 µmol/mL.min . Posteriormente, foi realizada a caracterização das enzimas produzidas, sendo que a proveniente do microrganismo AAD5 possui condições ótimas na faixa de 57,5 ¿ 67,5 ºC e pH entre 4,7 ¿ 5,5, além de meia vida de 21,33 horas a 52ºC e pH 5,3, com vmax de 1,77 µmol/mL.min e Km de 0,44 g/L. Já a enzima produzida pela cepa AY10 possui condições ótimas na faixa de pH entre 4,8 ¿ 4,1 à temperatura de 80°C, além de meia vida de 11,21 horas a 72ºC e pH 5,3, com vmax de 5,47 µmol/mL.min e Km de 1,37 g/L. Estes resultados demonstram o potencial de aplicação de leveduras na produção de xilanase, porém, para as cepas estudadas, há a necessidade de purificação das enzimas produzidas para que estas sejam aplicadas industrialmente / Abstract: Endo-1,4-ß-xylanase (E.C. 3.2.1.8), commonly called xylanase, has great application in different types of industries such as feed, food, textiles, paper, ethanol from biomass, among others. These enzymes act in hydrolysis of the xylan, one of the most abundant polysaccharides found in the nature, present in cell plants linked to the hemicelullose. The main goal of this work was to select, through a screening method using Petri dishes, and to evaluate the enzymatic activity of isolated wild yeasts from several brazilian regions (Atlantic Forest, Amazonian Forest, Cerrado and Pantanal) about the production of xylanase. For the screening in Petri dishes, the culture medium used has xylan as the only carbon source to induce the production of the enzyme. From 349 evaluated microorganisms, 84 could produce xylanase, although only 37 showed an enzymatic ration (diameter of the undye halo/diameter of the colony) higher than 2.5. And, after initial assays in submerged method, 9 strains showed a satisfactory growth at 30ºC and 150 rpm. Among them, the microorganisms AAD5 and AY10 presented a higher potential, with the enzymatic activity above 2 µmol/mL.min. The characterization of the produced enzymes was carried out and the one produced by the strain AAD5 has, as optimal conditions, temperature between 57.5 ¿ 67.5 ºC and pH 4.7 ¿ 5.5. Also, it was shown 21.33 hours of half-life at 52ºC and pH 5.3, with vmax of 1.77 µmol/mL.min and Km of 0.44 g/L. The enzyme produced by the strain AY10 has, as optimal conditions, pH between 4.8 ¿ 4.1 and temperature around 80ºC. The half-life of the enzyme was 11.21 hours at 72ºC and pH 5.3, with vmax of 5.47 µmol/mL.min and Km of 1.37 g/L. These results demonstrate the potential application of the yeasts for xylanase production, although, for those enzymes, further works are necessary to establish the actual industrial and technical potentialities / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós–Graduação em Oceanografia Biológica, Instituto de Oceanografia, 2011. / Submitted by Cristiane Gomides (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2013-12-16T13:10:23Z No. of bitstreams: 1 rubens.pdf: 37071078 bytes, checksum: e7a36c0d198f25aa295e0031caf953d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Sabrina Andrade (sabrinabeatriz@ibest.com.br) on 2013-12-18T18:04:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rubens.pdf: 37071078 bytes, checksum: e7a36c0d198f25aa295e0031caf953d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-18T18:04:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rubens.pdf: 37071078 bytes, checksum: e7a36c0d198f25aa295e0031caf953d7 (MD5) Previous issue date: 2011 / No estuário da Lagoa dos Patos são escassos os trabalhos sobre a comunidade fúngica. O objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência de leveduras em duas áreas de marismas e os fatores abióticos que afetam sua distribuição espacial e temporal. O estudo foi realizado durante o inverno (Agosto) de 2009 e o verão (Fevereiro) de 2010 em duas enseadas rasas no estuário da Lagoa dos Patos, com diferentes níveis de eutrofização. As amostras foram coletadas em marismas dominadas por duas espécies macrófitas emersas: Juncus kraussii e Scirpus olneyi. Nos locais de coleta foram analisados os parâmetros abióticos e coletadas amostras de sedimento, água intersticial e de vegetação. Foi realizado o isolamento das leveduras do sedimento através de diluição em meio de cultivo. A identificação dos isolados foi feita através da análise de caracteres morfológicos e testes fenotípicos de metabolismo através do Sistema Vitek II. Foram isoladas 73 leveduras classificadas em 09 gêneros, com predominância de Ascomycotas. Entretanto, 10 destes isolados de leveduras não identificados e 02 isolados leveduriformes foram identificados como microalgas do gênero Prototheca. Dentre os gêneros de leveduras encontrados, houve uma predominância de leveduras do gênero Candida (n=20), seguidos por Rhodotorula (n=14), Yarrowia (n=07), Cryptococcus (n=06), Clavispora (n=04), Issatchenkia (n=03), Pichia (n=03), Torulaspora (n=03) e Kluyveromyces (n=01). O maior número de leveduras foi isolado em temperatura mais alta, no ambiente menos eutrofizado, em condições com maiores concentrações de nutrientes dissolvidos e no sedimento dominado por detrito de J. kraussii. / In the Patos Lagoon estuary few studies have been conducted on the fungal community. The aim of this study was to determine the occurrence of yeasts and the environments factors that affect their spatial and temporal distribution. The study was conducted during the winter (August) of 2009 and summer (February) 0f 2010 in two shallow bays of the Patos Lagoon estuary with different eutrophication level. The samples were collected in salt marsh areas dominated by two emerged macrophytes species: Juncus kraussii and Scirpus olneyi. Abiotic parameters were analyzed in the field and sediment samples, interstitial water and vegetation were collected. Yeasts were isolated from the sediment by dilution using the culture medium method. The identification of isolates was performed according to morphological characteristics and through metabolic tests using the Vitek II system. Seventy and three yeasts were isolated and classified in 09 genera with the predominance of Ascomycota. However, 10 of these isolated yeasts were unidentified and 02 yeast-like organisms, were identified as microalgae of the genera Prototheca. Among the identified genera of yeasts, there was a predominance of the genera Candida (n=20), followed by Rhodotorula (n=14), Yarrowia (n=07), Cryptococcus (n=06), Clavispora (n=04), Issatchenkia (n=03), Pichia (n=03), Torulaspora (n=03) e Kluyveromyces (n=01). Highest number of isolates was found in higher temperature, less polluted environment, in water with higher dissolved nutrient concentrations and in sediment dominated by detritus of Juncus kraussii. Key-words:

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade EStadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T07:34:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zeidler_AneFernandaBeraldi_M.pdf: 15352916 bytes, checksum: 8a3454e1ab7cf3b1ea1dded67030f592 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A demanda por processos alternativos para produção de compostos químicos tem aumentado nas ultimas décadas em decorrência da necessidade da utilização de fontes renováveis e do desenvolvimento de processos menos agressivos ao meio ambiente. Nesse contexto os processos de fermentação microbiana são cada vez mais considerados passiveis de serem empregados industrialmente. A produção de monômeros petroquímicos por via biológica tem sido tema de diversos estudos e, dentre os compostos produzidos por fermentação, ácidos e alcoóis de três e quatro carbonos estão entre as moléculas mais promissoras. O glicerol, alem de ser utilizado na fabricação de diversos produtos, tem tido sua utilização estudada como substrato para biotransformação em compostos mais reduzidos e de maior valor agregado, como precursores de polímeros. A produção de glicerol por via fermentativa em leveduras já foi estudada, entretanto, sempre são utilizados organismos de laboratório, mais suscetíveis a estresses. A utilização de leveduras selvagens, mais robustas, isoladas de processos industriais de fabricação de etanol, pode resultar em maiores rendimentos de glicerol e maior adaptabilidade ao processo industrial. Com o intuito de aumentar a produção de glicerol foram deletados os genes: ADH1 e TPI1 na linhagem industrial de S. cerevisiae PE-2 (JAY270). Essas deleções foram realizadas por recombinação homologa em linhagens haplóides de diferentes mating-type. Essas linhagens foram cruzadas gerando mutantes diplóides para cada um dos genes e para o duplo mutante. Alem disso, a complementação do gene ADH1, estudada através da construção e inserção de um plasmídeo, foi bem sucedida: apos a complementação, os mutantes ?adh1 alcançaram um rendimento em etanol significativamente igual ao da linhagem selvagem. As deleções dos genes ADH1 e TPI1 geraram os resultados esperados, aumentando a produção de glicerol e diminuindo a de etanol, modificando assim o perfil de produção de metabolitos das linhagens. As linhagens selvagens apresentaram rendimentos em glicerol ao redor de 0,01 g glicerol/g glucose, rendimento esperado para linhagens de levedura produtoras de etanol. As linhagens ?adh1 apresentaram um aumento de aproximadamente 10 vezes no rendimento em glicerol, chegando a 0,24 gramas de glicerol por grama de glucose. A linhagem que apresentou maior rendimento foi a AZY773, linhagem industrial com os genes ADH1 e TPI1 deletados, atingindo um rendimento de 0,38 gramas de glicerol por grama de glucose. A linhagem de laboratório com a mesma modificação teve um rendimento de 0,31 gramas de glicerol por grama de glucose, significativamente menor que o rendimento da linhagem industrial. Demonstrou-se neste trabalho, portanto, que a produção de glicerol metabólico com altos rendimentos para bioconversão em compostos mais reduzidos pode ser conseguida através de modificações metabólicas e do uso de organismos robustos. / Abstract: In the past few decades the demand for alternative processes for the production of chemical compounds has increased due to the need for utilization of renewable resources and development of less harming processes to the environment. In this context, large scale microbial fermentative processes are being considered as a viable alternative. The production of petrochemical monomers through biological pathways has been a major research theme and, among the compounds produced by fermentation, three and four carbon acids and alcohols are among the most promising molecules. Glycerol, besides being used for the manufacture of several products, has had its utilization studied as substrate for biotransformation into more reduced and higher added value compounds, e. q. polymers precursors. Glycerol production by yeast fermentation has already been studied, but, only in laboratory strains, which are more stress sensitive. The utilization of wild yeasts, more robust, isolated from the fuel ethanol production process, may result in higher glycerol yields and better adaptability to industrial processes. Aiming to increase glycerol production the ADH1 and TPI1 genes from PE-2 (industrial strain of S. cerevisiae) were deleted through homologue recombination in haploid strains of different mating-types. These strains were mated generating diploid mutants for ?adh1, ?tpi and ?adh1?tpi1 deletions. Complementation of ADH1 gene, carried out through the construction of a plasmid, was successful in allowing the ?adh1 strains to reach ethanol yields as high as the one reached by wild strains. ADH1 and TPI1 deletion increased glycerol and decreased ethanol production, modifying the strains'metabolite production profile, as expected. The wild strains presented glycerol yields of 0,01 g of glycerol per g of glucose, which is a regular yield for ethanol producing yeasts. ?adh1 strains presented a tenfold increase in glycerol yield, reaching 0,24 g of glycerol per g of glucose. AZY773 strain, industrial strain with both ADH1 and TPI1 genes deleted, presented the highest glycerol yield, reaching 0,38 g of glycerol per g of glucose. The laboratory strain with the same genetic modification yielded 0.3 g of glycerol per g of glucose, significantly lower than the industrial strain. This work demonstrated that metabolic glycerol production with high yields for bioconversion in more reduced compounds may be reached through metabolic modification and utilization of robust organisms. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Jose Francisco Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-08T12:53:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anibal_PaulaCristina_M.pdf: 2168298 bytes, checksum: 97eb6e5c3daa9ef33ad620dedafac901 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A cavidade oral abriga uma complexa comunidade de microrganismos que podem estar aderidos aos dentes, à mucosa epitelial ou formando biofilme. A maioria desses microrganismos são comensais, com uma minoria causando infecções oportunistas. Dentre esses microrganismos, encontramos as leveduras do gênero Candida, principalmente em indivíduos imunocomprometidos; o principal agente etiológico da cárie dental Streptococcus mutans e, apesar da presença controversa, o patógeno oportunista Staphylococcus aureus. Diante do desenvolvimento de resistência aos antimicrobianos, há uma grande preocupação relacionada a qual tipo de tratamento utilizar no combate às infecções provocadas por esses microrganismos. O emprego de extratos brutos de plantas tem merecido a atenção de pesquisadores de vários países, já que podem inibir o crescimento bacteriano e fúngico por diferentes mecanismos quando comparados aos antimicrobianos, justificando a pesquisa em questão. As plantas utilizadas nesta pesquisa foram a Mentha piperita, Rosmarinus officinalis, Tabebuia avellanedae, Arrabidaea chica, Syzygium cumini e Punica granatum, extraídas com os solventes diclorometano e metanol, os quais foram eliminados em rotaevaporador, para a obtenção dos extratos brutos, a fim de se avaliar sua concentração inibitória mínima (CIM) frente a essas cepas de microrganismos. Os resultados obtidos revelaram-se promissores com as espécies de Candida testadas, principalmente com o extrato metanólico, cuja inibição apresentou atividade com alta sensibilidade das leveduras, porém essa mesma atividade não ocorreu entre as bactérias. Esses dados indicam a necessidade da ampliação do conhecimento sobre as espécies de plantas com potencial antimicrobiano, além de se testar extratos mais purificados e com propriedades farmacológicas ativas contra organismos microbianos. De qualquer forma, estes resultados nos levam a considerar esses extratos vegetais como fontes valiosas para a descoberta de novas moléculas bioativas empregadas para o tratamento alternativo no combate aos agentes microbianos, principalmente àqueles resistentes às drogas antifúngicas e antibacterianas convencionais / Abstract: The oral cavity is a source of a complex microorganisms community that may adhere to teeth, epithelial mucosa or form biofilms. Most of these strains are thought to be commensal, and a small number cause opportunistic infections. Among these microorganisms Candida yeast is the most commom in immunocompromised patients; Sretptococcus mutans is regarded as the primary etiologic agent of dental caries and, although considered controversial the presence, Staphylococcus aureus is also mentioned as an opportunistic pathogen in the oral cavity. Considering the frequent use of antifungal and antibiotics as antimicrobial agents, the development of resistance to these drugs has become an important and worrying factor for the treatment of the infections caused by these microorganisms. The use of crude plants extracts has been a researcherâ?¿s concern from all over the world, since they may inhibit the bacteria and fungi growing by different mechanisms present in the conventional antimicrobials, becoming an important source of investigation. The plants used in this research were Mentha piperita, Rosmarinus officinalis, Tabebuia avellanedae, Arrabidaea chica, Syzygium cumini and Punica granatum, extracted with dichloromethane and methanol solvents, followed by a minimal inhibitory concentration (MIC) evaluation. The data obtained with Candida strains were promising, specially with the methanolic extract that showed activity in a higher sensibility, but the same activity did not occur among the bacterias. This information increases our knowledge of the crude plants extracts effect against microbial organisms. Nevertheless, the results of this study indicated that these extracts are a promising source for the alternative treatment against the microbial agents, specially for those resistant to the conventional antimicrobial agents / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este trabalho teve como objetivo avaliar algumas características biotecnológicas de leveduras isoladas de solos da Estação Ecológica de Maracá e do Parque Nacional do Viruá, em Roraima. Os ensaios enzimáticos realizados incluíram a hidrólise de óleo de oliva extra virgem, gelatina, Tween 80, carboximetilcelulose e amido solúvel, visando avaliar a habilidade das cepas de leveduras em produzir e secretar, respectivamente, lipases, proteases, esterases, celulases e amilases, a 25C, 37C e 45C. Foram avaliadas, em média, 397 linhagens de leveduras / The present work, as its objective, aims at assessing some biotechnological characteristics of yeasts isolated from soils of Maracá Ecological Station and Viruá National Park, in Roraima. The assays included hydrolysis of olive oil, gelatin, Tween 80, Carboximetylcellulose and soluble starch in order to assess the ability of strains to produce lipases, proteases, esterases, cellulases, and amylases respectively at 25C, 37C and 45C. It was assessed an average of 397 strains

Microrganismos geneticamente modificados (OGMs), obtidos através das técnicas de biologia molecular são amplamente utilizados para as mais diversas finalidades, atingindo o ambiente, solo, águas, animais e até mesmo o Homem. Contudo, o comportamento e o destino destes microrganismos no ambiente, depois que sua função tenha sido completada, e onde estes não podem ser controlados, tem sido objeto de preocupação. Para diminuir os riscos potenciais associados à liberação (acidental ou intencional) dos OGMs no ambiente pesquisadores desenvolveram sistemas de contenção de microrganismos geneticamente engenheirados, baseados na clonagem de genes que codificam proteínas tóxicas, sob regulação de promotores indutíveis (para revisão ver Molin et aI., 1993). Estes sistemas permitem o controle da morte celular em tempo pré-determinado, com a indução do promotor que regula o gene que codifica a proteína tóxica. Contudo, embora as leveduras sejam tão importantes e úteis quanto as bactérias, não existem sistemas suicidas usados para contenção destes microrganismos. No presente trabalho, construímos um sistema suicida para a levedura Saccharomyces cerevisiae o qual apresenta o gene da nuclease de Serratia marcescens clonado sob controle do promotor ADH2GAPDH, que é reprimido por glicose. Desde que a nuclease é capaz de destruir DNA e RNA, tal sistema não permitirá que o material genético do OGM em questão, seja transferido para outros microrganismos, após a morte celular. A atividade da nuclease foi detectada in vivo, através da diminuição da viabilidade dos transformantes de levedura, após o consumo da glicose. Quando leveduras mutantes rad52 foram usadas como células hospedeiras, o efeito letal do plasmídeo foi dramaticamente aumentado. Por outro lado, a atividade da nuclease produzida nos tranformantes de levedura foi analisada in vitro, através da incubação de extratos celulares com DNA plasmidiano mostrando a completa degradação deste em gel de agarose. Além disso, em ensaio de microcosmos, a viabilidade das leveduras portadoras do plasmídeo suicida no ambiente diminuiu drasticamente quando comparada com células controles. Estes resultados mostram que a nuclease de Serratía marcescens é expressa de forma ativa em S. cerevísíae sendo capaz de evitar a permanência dos transformantes de leveduras no ambiente, em laboratório, ou em condições simulando o ambiente, sem a necessidade de um indutor adicional. / Genetic Engineered Microorganisms (GEMs), obtained by molecular biology techniques, are becoming of widespread use for different purposes thus reaching the environment, including soil, water, plants, animais and Man. However, the behavior and fate of these microorganisms after their function has been completed in environments where they cannot be physically contained is a matter of concern. To minimize the potential risks associated with the release (deliberate or accidental) of GEMs in the environment, researchers have developed biological containment systems for bacteria which are based on the cloning of genes coding for toxic proteins, under the regulation of regulatable promoters (for review, see Molin et al., 1993). Such suicide systems allow the predetermined control of cell death from the moment the promoter of the killer gene is switched on. However, even if yeasts are as useful and important in biotechnological processes as bacteria, there is no suicide system described so far for the containment of these microorganisms. In the present work, we constructed a suicide system for the yeast Saccharomyces cerevisiae, consisting of the Serratia marcescens nuclease gene, cloned under the control of the yeast AOH2GAPOH promoter, which is repressed by glucose. Since this nuclease is able to destroy DNA and RNA, such suicide system does not allow the genetic material of the GEM to be transferred to other microorganisms upon cell death. The nuclease activity in S. cerevisiae was detected in vivo, through the decrease in cell viability of the yeast transformants, upon glucose consumption. When yeast rad52 mutants were used as the host cells, the lethal effect of the suicide plasmid was dramatically increased. On the other hand, the activity of the nuclease produced in yeast transformants was analyzed in vitro, by incubation of cell-free extracts with plasmid DNA, showing complete degradation on agarose gels. Furthermore, in microcosmos assays, the viability of the yeast cells carrying the suicide plasmid decreased drastically when compared to control cells. These results showed that the S. marcescens nuclease is expressed in an active form in S. cerevisiae, being able to avoid the maintenance of the yeast transformants, either in the laboratory, or in conditions simulating the environment, without the need of adding any inducer.

O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da inclusão de doses de S. cerevisiae na dieta sobre a digestibilidade da fibra, o consumo de matéria seca, a cinética e o ambiente ruminal de bovinos Nelore alimentados com feno de Tifton-85 (Cynodon spp.), recebendo ou não suplementação energética. Foram utilizados 36 novilhos Nelore canulados no rúmen, com aproximadamente 24 meses de idade e 400 kg de peso corporal (PC) ao início do experimento, em delineamento experimental de blocos casualizados, com seis repetições por tratamento. Os tratamentos foram obtidos em arranjo fatorial 3x2, a partir da combinação de três níveis de inclusão de S. cerevisiae (0, 8 e 40 x109 UFC/animal/dia; CNCM I-1077, Lallemand®) em duas dietas a base de feno de Tifton-85, com ou sem suplementação energética (0 e 0,8% do PC). Foram realizadas coletas de líquido ruminal para mensuração de pH, ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e N-amoniacal, além de esvaziamento total de conteúdo ruminal para determinação do volume, massa total e tamanho do compartimento ruminal. Amostras das fases líquida e sólida da digesta ruminal foram retiradas para as análises dos componentes da digesta e população de microrganismos ruminais através da técnica de PCR em tempo real. A inclusão de levedura aumentou linearmente o consumo de matéria seca (P = 0,03) e de FDN (P = 0,01), no entanto não houve efeito sobre o pH ruminal (P = 0,30). A suplementação energética aumentou a concentração ruminal de AGCC totais (P < 0,01). Em relação à digestibilidade in situ da FDN, a inclusão de levedura promoveu aumento linear para as quatro forrageiras após 24 h de incubação (P = 0,02). A inclusão também aumentou a massa ruminal de MS (P = 0,02) e FDN (P = 0,02), mas não a de FDN indigestível (P = 0,33). Não houve efeito da levedura sobre a população das bactérias celulolíticas mais abundantes no rúmen (F. succinogenes, R. flavefaciens e R. albus) (P = 0,72). Como conclusão, a inclusão de levedura na dieta de bovinos Nelore aumenta a digestibilidade ruminal da fibra, porém o aumento da digestibilidade da fibra não pôde ser explicado por mudanças na população de bactérias celulolíticas no rúmen. / The objective of the study was to evaluate the effect of inclusion of dietary S. cerevisiae on fiber digestion, dry matter intake, kinetics and ruminal environment of Nellore cattle fed with Tifton-85 hay (Cynodon spp.), receiving or not energetic supplementation. Thirty-six rumen cannulated Nellore steers, approximately 24 months old and 400 kg body weight (BW) were used at the beginning of the experiment, in a randomized complete block design with six replicates per treatment. The treatments were obtained in a 3x2 factorial arrangement, by combining three inclusion levels of S. cerevisiae (0, 8 and 40 x109 CFU/animal/day; CNCM I-1077, Lallemand®) in two diets based on Tifton-85 hay, with or without energetic supplementation (0 and 0.8% of BW). Ruminal fluid samples were collected to measure pH, short chain fatty acids (SCFA) and ammonia nitrogen, as well as the rumen evacuation to determine the volume, total mass and size of the rumen compartment. Samples of the solid and liquid phases of the rumen digesta were taken for analysis of the digesta components and population of ruminal microorganisms through the real-time PCR technique. The yeast inclusion linearly increased the dry matter intake (P = 0.03) and NDF (P = 0.01), however with no effects on rumen pH (P = 0.30). Energy supplementation increased the rumen concentration of total SCFA (P < 0.01). The yeast inclusion linearly increased in situ digestibility of NDF of the four forages after 24 h of incubation (P = 0.02). The yeast inclusion also increased the ruminal mass of DM (P = 0.02) and NDF (P = 0.02), but not the indigestible NDF (P = 0.33). There was no yeast effect on a population of the most abundant cellulolytic bacteria in the rumen (F. succinogenes, R. flavefaciens and R. albus) (P = 0.72). In conclusion, the inclusion of yeast in the diet of Nelore cattle increases the rumen digestibility of the fiber, however, it could not be explained by changes in the population of cellulolytic bacteria in the rumen.

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ohara_Andre_M.pdf: 6935792 bytes, checksum: 553cf8492d7af096c35b5c595ec6e3a1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A bioprospecção de micro-organismos representa um grande potencial tecnológico para produção de biocompostos de interesse comercial. Dentre estes compostos estão as enzimas lipolíticas, como as lipases (triacilglicerol acil-hidrolases EC 3.1.1.3) que apresentam um enorme potencial para aplicações biotecnológicas. Outro tipo de biocomposto de relevante interesse comercial são as vitaminas do complexo B, as quais possuem função essencial na atividade de enzimas que regulam reações do metabolismo. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi isolar e selecionar linhagens de leveduras do solo de diferentes biomas do Estado de São Paulo com potencial para produção de lipase e de vitaminas do complexo B (biotina e riboflavina). Para tanto, foram isoladas 132 leveduras de amostras de solos provenientes da Mata Atlântica e da região de transição (Mata Atlântica e Cerrado). Essas linhagens foram depositadas na coleção de micro-organismos do laboratório de Bioquímica de Alimentos da FEA-UNICAMP, que já contava com 300 leveduras provenientes da região de Cerrado. As 432 linhagens presentes na coleção foram então avaliadas quanto ao potencial para a produção de lipase extracelular através de seleção em meio sólido diferencial e cultivo em meio líquido, sendo a atividade de lipase determinada no sobrenadante por titulometria de neutralização. O potencial para a produção de biotina e riboflavina extracelular foi avaliada por meio de seleção em meio de cultivo líquido, sendo as concentrações das vitaminas determinadas no sobrenadante por espectrofotometria e fluorimetria. Desta forma 33 leveduras apresentaram potencial para produção de lipase alcançando valores de atividade enzimática que variaram de 6,51 U/mL a 21,44 U/mL. Em relação à produção das vitaminas do complexo B, 38 linhagens apresentaram concentrações de biotina no sobrenadante do cultivo que variaram de 0,28 µg/mL a 18,61 µg/mL e 64 linhagens apresentaram concentrações de riboflavina que variaram de 0,03 µg/mL a 0,77 µg/mL. A linhagem RP.C153 apresentou potencial para produção de lipase e riboflavina, enquanto a linhagem RP.J1308 para produção de lipase e biotina. A linhagem RP.C153 foi classificada como Pichia caribbica e a linhagem RP.J1308 como Candida oleophila / Abstract: The bioprospection of microorganisms represents a great technological potential for the production of biocompounds of commercial interest. Among these compounds are the lipolytic enzymes, such as lipases (triacilglicerol acilhidrolases EC 3.1.1.3) which have currently a huge potential for biotechnological applications. B vitamins are another type of biocompound with relevant commercial interest, which have essential role in the activity of enzymes that regulate metabolic reactions in living organisms. Therefore, the aim of this work was to isolate and select strains of yeasts from the soil of different biomes present in the State of São Paulo for the biotechnological production of lipase and B vitamins (biotin and riboflavin). Thus, 132 yeasts were isolated from soil samples of the Atlantic Forest (Ilha Bela - SP) and the transition region between the Atlantic Forest and Savanna (Campinas - SP). These strains were deposited in the collection of microorganisms of the Food Biochemistry Laboratory FEA - UNICAMP, which already had 300 yeasts from the Savanna region (Ribeirão Preto - SP). Therefore 432 strains present in the collection were then evaluated for their potential to produce extracellular lipase by selection on solid selective differential and liquid medium culture, and the enzyme activity in the supernatant was determined by neutralization titration. The potential production of extracellular biotin and riboflavin was assessed by selection in medium liquid culture, and the concentrations of those vitamins were measured in the supernatant by spectrophotometry and fluorimetry. Therefore 33 yeasts demonstrated potential for the production of lipase, reaching values of enzymatic activity ranging from 6.51 U/mL to 21.44 U/mL. In relation to the production of B vitamins, 38 strains presented concentrations of biotin in the supernatant culture ranging from 0.28 µg/mL to 18.61 µg/mL and 64 strains demonstrated concentrations of riboflavin ranging from 0.03 µg/mL to 0.77 µg/mL. The strain RP.C153 presented potential for production of lipase and riboflavin, while strain RP.J1308 for production of lipase and biotin. The RP.C153 strain was classified as Pichia caribbica and RP.J1308 strain as Candida oleophila / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientadores: Gustavo Henrique Goldman, Juliana Velasco de Castro Oliveira / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T07:09:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_ThuannyAndrade_M.pdf: 7098529 bytes, checksum: 5b56fca196314bf7920ad2d7b03aefc7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A completa utilização da biomassa lignocelulósica é um dos pré-requisitos para tornar o processo do etanol de segunda geração economicamente competitivo. Entretanto, a fermentação dos açúcares disponíveis na biomassa celulósica apresenta um desafio único em decorrência da presença de outros açúcares, além da glicose, tais como xilose e arabinose, os quais não são fermentáveis por Saccharomyces cerevisiae, a principal levedura utilizada na indústria. Em leveduras, a conversão de D-xilose a D-xilulose ocorre em duas etapas: inicialmente D-xilose é reduzida a D-xilitol pela enzima xilose redutase (XR); em seguida, D-xilitol é oxidado a D-xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (XDH). Em S. cerevisiae, essas duas enzimas possuem cofatores distintos, provocando assim um desequilíbrio redox na célula, impedindo a utilização anaeróbica de pentoses. Uma alternativa para que S. cerevisiae possa produzir etanol através destes açúcares é modificá-la geneticamente com genes provenientes de micro-organismos que naturalmente realizem esta conversão. Dessa forma, este projeto isolou e caracterizou as leveduras Rhodotorula dairenensis TAB01 e Pseudozyma brasiliensis sp.nov. GHG001, a partir do intestino de insetos parasitas da cana-de-açúcar, através da análise de expressão dos genes xyl1 e xyl2 que codificam, respectivamente, as enzimas XR e XDH. Adicionalmente, foi avaliada a hiper-expressão destes na cepa industrial de S. cerevisiae PE-2 e na cepa PE-2 super-expressando o gene XKS1 de S. cerevisiae (PE-XKS), o qual codifica a enzima xilulose quinase (XK). P. brasiliensis GHG001 e R. dairenensis TAB01 mostraram-se promissoras para o estudo. Estas duas espécies são ótimas assimiladoras de xilose e seus genes de XR e XDH foram expressos heterologamente em S. cerevisiae, gerando as cepas PE Rd, PE Pb, PE-XKS Rd e PE-XKS Pb, que foram testadas quanto a capacidade de utilizar xilose para crescimento. Porém, essas cepas recombinantes não conseguiram utilizar xilose como única fonte de carbono, o que evidencia o quão importante é o desbalanço de cofatores das enzimas no metabolismo de xilose. Além disso, devido a uma notável importância biotecnológica, também foi caracterizada uma enzima xilanolítica produzida por P. brasiliensis GHG001 a qual apresentou uma alta atividade xilanolítica. Essa xilanase, pertencente à família GH11, apresentou pH e temperatura ótimos iguais a 4 e 55°C, respectivamente, sendo sua estrutura secundária constituída de folhas beta. A sua atividade enzimática é influenciada por alguns íons como Ca2+ e os resultados de sua cinética indicaram um comportamento sigmoidal característico de enzimas alostéricas. Usando xilano como substrato, esta xilanase produz xilooligossacarídeos que podem ser usados industrialmente como prébióticos, que junto a outras aplicabilidades desta enzima na indústria, demonstram seu alto potencial biotecnológico / Abstract: Full utilization of lignocellulosic biomass is one of the prerequisites to make the process of second generation ethanol economically competitive. However, the fermentation of sugars available in cellulosic biomass presents a unique challenge due to the presence of other sugars besides glucose, such as xylose and arabinose, which are not fermentable by Saccharomyces cerevisiae, the main yeast used in the industry. In yeasts, the conversion of D-xylose to D-xylulose occurs in two steps: first D-xylose is reduced to xylitol by the enzyme D-xylose reductase (XR), and then D-xylitol is oxidized to D-xylulose by the enzyme xylitol dehydrogenase (XDH). In S. cerevisiae, these two enzymes have different cofactors, thereby causing a redox imbalance in the cell, preventing the use of pentoses anaerobically. An alternative to S. cerevisiae can produce ethanol by these sugars is genetically modifying it with genes derived from microorganisms that naturally carry out this conversion. Thus, this project characterized the yeasts Rhodotorula dairenensis TAB01 and Pseudozyma brasiliensis GHG001, isolated from the gut of insects pests of sugarcane, through the analysis of genes expression of xyl1 and xyl2 which encoding respectively, the XR and XDH enzymes and measured the enzymatic activity of the same. Additionally, was evaluated the overexpression of these in S. cerevisiae industrial strains PE-2 and PE-2 XKS1 overexpressing xks1 gene of S. cerevisiae, which encodes the enzyme xylulokinase (XK). P. brasiliensis GHG001 and R. dairenensis TAB01 shown promise for this study as they are great xylose assimilators and their assimilating xylose genes are expressed in the presence of this sugar. XR and XDH were heterologously expressed in S. cerevisiae, generating strains Rd PE, PE Pb, PE-XKS Rd and PE-XKS Pb, which were tested for the ability to utilize xylose for growth. However, these recombinant strains were unable to utilize xylose as sole carbon source, which shows how important is the imbalance of cofactors of the metabolize xylose enzymes. Moreover, due to a remarkable biotechnological importance, has also been characterized a xylanolytic enzyme produced by P. brasiliensis GHG001 which showed a high activity, yet unreported by other eukaryotic microorganism. This xylanase belonging to family GH11, showed pH and temperature optima equal to 4 and 55°C, respectively, and its secondary structure consists of ?-sheets. This enzyme has influence of some ions such as Ca2+ and showed a sigmoidal kinetic behavior, characteristic of allosteric enzymes. From xylan, the xylanase produces xylooligosacharides which can be used industrially as prebiotics, which together with other applicability of this enzyme in the industry, demonstrate their high biotechnological potential / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Les extraits polysaccharidiques totaux (EPS) produits par LOCA-1 et LOCA-2, deux souches de levures isolées de la peau de raisin en Champagne viticole, ont été isolés en vue de leur caractérisation tant biochimique que fonctionnelle. La caractérisation structurale par GC démontre que ces EPS sont des hétéropolymères complexes de haut poids moléculaires (~2.106 g/mol) et sont composés de monomères de mannose, glucose, xylose et d’acide glucuronique, et deux types de substituants mis en évidence par analyse MALDI (sulfate et phosphate). L’élucidation de l’enchaînement structural des résidus osidiques au sein de ces EPS, sur la base des analyses GC/MS et RMN, a mis en évidence la présence d’une ossature principale linéaire constituée d’unités α-(1→3)-D-mannopyranosyles. Toutefois, des différences sont notables entre ces deux souches du même genre. Pour la souche LOCA-1, de courtes chaines latérales de β-(1,2)-xyloses (2-5 résidus) se ramifient à la chaine principale sur ses positions C-2 et/ou C-6. A l’opposé, la chaine mannosidique principale, plus longue chez la souche LOCA-2 (˃40 unités), est substituée en ses positions 2 et/ou 4 par des antennes de xylomannanes. Les caractéristiques structurales de ces EPS n’avaient jamais été observées auparavant chez d’autres microorganismes. La seconde partie de ce travail de thèse est dédiée aux propriétés fonctionnelles (pouvoirs moussant, gélifiant, viscosifiant) de ces EPS. Des propriétés viscosifiantes et moussantes tout à fait exceptionnelles ont été observées à l’issue d’une analyse comparative avec des biopolymères industriels commercialisés.Les propriétés intrinsèques des polymères naturels produits par ces souches indigènes de baies de raisin, en font des candidats potentiels pour une exploitation dans divers domaines d’applications biotechnologiques, et notamment oenologique. / The total polysaccharide extracts (EPS) produced by LOCA-1 and LOCA-2, two yeast strains collected from grape skin in Champagne, were isolated for both their biochemical and functional characterization. Their structural characterization by GC analysis show that EPS were complex heteropolymers with high molecular weight (~2.106 g/mol), and were composed of mannose, glucose, xylose and glucuronic acid as monosaccharide constituents, and 2 types of substituents (sulphate and phosphate) evidenced by MALDI analysis. Elucidation of the structural enchainment of these EPS carbohydrates based on GC-MS and NMR analyses revealed in both studied cases, a linear main backbone built up of α-(1→3)-D-mannopyranosyl residues. However differences have been noted between these two strains. For LOCA-1 EPS, some short side chains of β-(1→2)-xyloses (2-5 residues) are branched to the main linear backbone on its C-2 and/or C-6 positions. In contrast, the LOCA-2 main backbone that is more extended (˃40 units) than the former, is substituted on its C-2 and/or C-4 positions by xylomannan antennas. This is the first report of these yeasts’ polysaccharides with such structural characteristics. The second part of this thesis is devoted to the functional properties (foaming, gelling, and viscosifying abilities) of the EPS. Very exceptional viscosifying and foaming properties were observed after a comparative analysis with some marketed industrial biopolymers.The intrinsic properties of these natural polymers produced by these grape berries indigenous yeast strains, make them potential candidates for operating in various fields of biotechnology applications, especially enology.