Spelling suggestions: "subject:"enc"" "subject:"menc""
1 |
Caracterización de los sistemas de captación de hierro y zinc del patógeno animal Pasteurella multocidaGarrido Ocaña, Ma Elena 11 November 2005 (has links)
El hierro y el zinc son micronutrientes esenciales para el crecimiento normal de la gran mayoría de microorganismos, siendo los mecanismos de captación de estos cationes divalentes elementos fundamentales para que las bacterias patógenas sean capaces de promover un proceso infectivo. Además, las proteínas receptoras de hierro se localizan en la membrana externa de las bacterias Gram negativas, lo cual las hace candidatas a ser empleadas para el diseño de vacunas.En este marco, el objetivo de la presente tesis doctoral ha sido profundizar en el estudio de los mecanismos de captación de cationes divalentes de Pasteurella multocida, una bacteria patógena que afecta a una gran variedad de animales originando importantes pérdidas económicas en el sector ganadero.En este estudio se ha identificado un receptor de hierro de 60 kDa, al que se ha denominado HbpA, que presenta un mecanismo de regulación distinto al utilizado comúnmente por las bacterias, ya que es independiente del sistema Fur, determinándose que su regulación depende de Fe2+, Mn2+ y hemina. Se ha demostrado que el gen que codifica esta proteína presenta un corrimiento programado de lectura que da lugar a un derivado truncado de 40 kDa. Se ha caracterizado así mismo la función de esta proteína, determinándose que une tanto hemina como hemoglobina, y que la capacidad de unión a ambas se mantiene en el derivado truncado de la proteína. Además, se ha estudiado la antigenicidad de la proteína HbpA, así como su efecto inmunogénico, demostrándose que la proteína HbpA y su derivada truncada son antigénicas, pero no se obtiene protección cuando se administra dicha proteína entera en experimentos de enfrentamiento utilizándose un modelo experimental animal de ratón.Por lo que se refiere a los mecanismos de incorporación de zinc de P. multocida, desconocidos hasta el presente, se han caracterizado los genes de captación de zinc de alta afinidad (znuABC), determinándose que existe una separación de 820 kb entre los genes znuA y znuCB y que los genes znuC y znuB forman parte de una misma unidad transcripcional. A diferencia de lo que ocurre en Escherichia coli y en otras bacterias, en las cuales la proteína Zur regula la expresión de este sistema de captación de zinc, en P. multocida no se ha encontrado una proteína homóloga a dicha proteína Zur. No obstante, se ha podido establecer que en este patógeno es la proteína Fur la responsable de la regulación de las unidades transcripcionales znuA y znuCB, juntamente con los iones Zn2+ y Fe2+. Finalmente, mediante la construcción de mutantes znuA y znuC, también se ha demostrado que estos genes son imprescindibles para la virulencia de P. multocida. / Iron and zinc are essential for the normal growth of almost all the microorganisms, being the uptake mechanisms of these cations elemental for the infective process of pathogenic bacterial. Moreover, in Gram negative bacterial, the iron receptor proteins are located in the outer membrane, making them good candidates in the vaccine design.In this framework, the doctoral thesis aim have been to go deeply into the study of divalent cations uptake mechanisms in Pasteurella multocida, a pathogenic bacterial that has an effect on a wide variety of animals, originating important economic losses in the stock sector.In this study it has been identified a 60-kDa iron receptor, named HbpA, which regulation mechanism is different to that used commonly by the bacterial, because it is Fur pathway independent, being its regulation Fe2+, Mn2+ and haemin dependent. It has being demonstrated that the codifying gene of this protein has a programmed translational frameshift giving rise to a 40 kDa protein. The function of this protein has been characterized as well, demonstrating that it binds both haemin and haemoglobin and this union capacity is maintained in the truncated derivate protein. Furthermore, the antigenicity and its potential protective ability have been studied, showing that HbpA and its truncated derivate are antigenic, but there is non-protective effect when this protein is given in challenge experiments using a mouse animal model. In reference to the zinc uptake pathways in P. multocida, unknown until the present, it has been characterized the high affinity uptake system (znuABC) genes, showing that there is a distance of 820 kb between znuA and znuCB genes, and znuC and znuB are part of the same transcriptional unit. Contrary to what happens in Escherichia coli and other bacterial, in which the Zur protein controls the expression of this high affinity uptake system; in P. multocida has not been found a homolog to this Zur protein. Nevertheless, it could be established that, in this pathogen, the responsible protein of the znuA and znuCB control is the Fur protein, joined with the Zn2+ and Fe2+ ions. Finally, using znuA and znuC mutants, it has also been demonstrated that these genes are essential for the virulence in P. multocida.
|
2 |
Estudi de l'efecte de l'entorn i de mutacions en l'estructura i estabilitat del receptor acoblat a proteïna G rodopsinaRamon Portés, Eva 01 January 2005 (has links)
La rodopsina és el fotoreceptor visual responsable de la visió a baixa intensitat lumínica que es troba en les cèl·lules bastó de la retina. Aquesta proteïna és el model per excel·lència de la superfamília de receptors acoblats a proteïna G (GPCR), que estan constituïts per 7 hèlices transmembrana, i que tenen un gran interès farmacològic. La rodopsina és l'únic membre de la superfamília l'estructura del qual s'ha determinat per difracció de Raigs X. El seu estudi és de vital importància per determinar aquells motius estructurals comuns als GPCR, així com per contribuir a l'elucidació dels trets bàsics d'un mecanisme d'activació comú. A més, l'estudi de mutacions en rodopsina associades a malalties de la retina com la retinosi pigmentària (RP) i la ceguesa nocturna congènita (CNC), ha de permetre determinar les bases moleculars d'aquestes patologies. L'objectiu principal d'aquesta tesi és aprofundir en l'estudi dels determinants estructurals de l'estabilitat, així com també contribuir a desxifrar els mecanismes moleculars de la RP i la CNC. Per això s'ha estudiat l'efecte de factors externs, com la unió de cations (en particular del zenc), i l'estat de l'entorn lipídic (alterant la concentració del detergent dodecil maltòsid) en l'estabilitat de diferents estats de la rodopsina i del seu cromòfor. També s'ha determinat com afecten l'estabilitat i la conformació de la rodopsina mutacions puntuals associades a la CNC, T94I, i a la RP, L46R; i a la xarxa electrostàtica present entre la part citoplasmàtica de les hèlices 3 i 6 mitjançant la construcció de mutants senzills, dobles i triples en les posicions 134, 247 i 251, els quals s'ha vist que estan implicats en el canvi conformacional de pas a la forma activa. Els mutants s'han obtingut mitjançant tècniques de DNA recombinant, les proteïnes mutades s'han expressat en cèl·lules COS-1, immunopurificat amb l'anticòs monoclonal Rho-1D4, i caracteritzat per espectrofotometria UV-visible.Els resultats obtinguts demostren que el zenc s'uneix de manera específica a la rodopsina, disminuint la seva estabilitat tèrmica i la seva capacitat d'unir 11-cis-retinal.També s'ha demostrat que la temperatura provoca la isomerització específica de l'11-cis-retinal a tot-trans-retinal quan aquest es troba unit a rodopsina però no quan es troba lliure en solució. Això reforça la idea de la interacció òptima present entre els aminoàcids de la butxaca del retinal i el cromòfor. Pel que fa a l'estudi de l'efecte de l'entorn lipídic en l'estructura i estabilitat de la rodopsina, s'ha mostrat que elevades concentracions de detergent desestabilitzen la conformació activa (Metarodopsina II) però promouen la formació d'un fotointermediari inactiu (Metarodopsina III). El detergent, doncs, juga un paper molt important en el desplaçament de l'equilibri entre els diferents fotointermediaris.En el cas dels mutants associats a malalties de la retina, la mutació T94I disminueix l'estabilitat de la conformació inactiva però estabilitza enormement la conformació activa, indicant un paper rellevant de la T94 en l'estabilització d'una xarxa electrostàtica en l'entorn de la base de Schiff. La mutació L46R en la hèlix 1 i causant de la RP impedeix que la proteïna es processi correctament i arribi a la membrana. Aquest resultat posa èmfasi per primera vegada en la importància de l'hèlix 1 per a l'estructura de la rodopsina i probablement per altres GPCR. L'estudi dels mutants en les posicions 134, 247 i 251 en la part citoplasmàtica de les hèlices 3 i 6 ha confirmat que aquestes posicions són importants per a l'estabilitat de la conformació inactiva de la rodopsina. Es proposa una paper central de la posició 251 en l'estructura i l'estabilitat de la xarxa eletrostàtica que implica aquestes posicions.
|
3 |
Mecanismes de regulació en l'activitat biològica del factor de transcripció SnailDomínguez Solà, David 03 April 2003 (has links)
Els factors de transcripció de la família Snail són fonamentals en la "transició epiteli-mesènquima", procés morfogènic essencial en el desenvolupament embrionari i en els fenòmens metastàsics tumorals.En els mamífers l'activitat d'Snail és modulada per dos mecanismes. (i) En el promotor humà es troben regions definides de resposta a factors repressors, predominants en les cèl·lules epitelials, i elements diferenciats de resposta a inductors de la "transició epiteli-mesènquima". (ii) L'activitat d'Snail és condicionada també per la seva localització subcel·lular, modulada per mecanismes no transcripcionals: la fosforilació d'Snail determina si és o no exclós del nucli. Al citosol no pot actuar com a repressor transcripcional però pot interaccionar amb la xarxa microtubular, que estabilitza i en condiciona el dinamisme. Això coincideix amb l'activació de la GTPasa RhoA i la reorientació dels filaments de vimentina, fets associats a l'adquisició de capacitat migratòria. L'efecte com a repressor transcripcional i la modulació del dinamisme microtubular són possiblement esdeveniments coordinats necessaris per al rol biològic d'Snail en mamífers. / Snail family of transcription factors is fundamental to the "epithelial-mesenchymal transition", morphogenic process essential to embryonic development and metastatic phenomena in tumors.Snail's activity is modulated in two ways in mammals. (i) The human promoter harbors definite regions that respond to repressor factors, which prevail in epithelial cells; and differentiated elements that respond to known inducers of the "epithelial-mesenchymal transition". (ii) Snail's activity is also conditioned by its subcellular localization, mechanism not dependent on its transcriptional control: Snail phosphorylation determines whether Snail is excluded or not from the nucleus. When in the cytosol, Snail is unable to act as a transcriptional repressor, but however binds to the microtubular meshwork, which becomes stabilized and whose dynamism is conditioned as a result. This fact coincides with the activation of the RhoA GTPase and reorientation of vimentin filaments, both phenomena being related to the acquisition of cell motility. The transcriptional repressor and the microtubule dynamics effects are probably two coordinated events necessary to Snail's biological role in mammals.
|
Page generated in 5.7677 seconds