O gerenciamento agrícola no âmbito da Agricultura de Precisão visa explorar o potencial da lavoura considerando as diferenças existentes em cada local. Deste modo, é necessário um grande número de informações, como a quantidade produzida ou renda obtida, sendo que estas devem ser coletadas de maneira rápida, automatizada e georreferenciada. No entanto, no caso da cana-de-açúcar, a qualidade ou teor de açúcares também irá influenciar diretamente na renda do produtor. Diversos estudos propõem métodos de automatização da colhedora visando ao monitoramento da produtividade na cultura, mas poucos consideram a análise da qualidade no processo. Dentre os métodos existentes para medição do teor de açúcar o que mais se adequa a esta necessidade é a espectrometria. Deve-se, portanto, avaliar a possibilidade de seu uso e com qual forma de amostragem se obtêm as melhores calibrações. Para isso, espectros obtidos de diferentes formas físicas da amostra (corte, lasca, casca, caldo e fibras) foram correlacionados com resultados laboratoriais com Brix, Pol, ATR, pureza e teor de fibras. Para as correlações, foram utilizadas análises multivariadas do tipo PLSR. Dentre os espectros obtidos diretamente nos colmos, as medições na lasca foram as que resultaram em melhores correlações com o Brix. No entanto, ao se utilizar espectros obtidos diretamente dos colmos para prever resultados vindos de amostras compostas, as diferenças entre os colmos reduzem a capacidade de predição do método. Assim, espectros obtidos das amostras compostas de caldo ou fibras foram as que melhor se correlacionaram com os dados de laboratório. O teor de fibras foi o parâmetro que menos se correlacionou com as medições espectrais. Ressalta-se que foram encontradas diferenças de qualidade entre diferentes alturas no colmo. Foi realizado também o mapeamento da qualidade em um talhão comercial e, neste, observou-se a dependência espacial entre as amostras. A espectrometria foi eficaz em mapear regiões com padrões de qualidade diferentes ao longo do talhão. Obteve-se coeficiente de variação de 5% do teor de qualidade em um talhão de 16,5ha, o que poderia justificar o gerenciamento de ações localizadas. / Site specific farm management aims to explore the potential of the crop considering the differences within the field. Thus, a large amount of information is necessary, as yield or obtained income, this information shall be collected in a fast, automated and georreferenced way. However, in the case of sugarcane, quality, or sugar content will also directly influence farmer\'s income. Several studies suggest harvester automation aiming to monitor yield, but few consider the quality analysis in the process. Among the existing methods for measuring sugar content the one that is best suited to this need is the spectroscopy. Therefore, it is necessary to assess the feasibility of its use and which form of sampling will obtain better calibrations. So, spectra that were obtained from different sample forms (cross sectional surface, transverse sectional surface, skin, juice and fiber) were related to laboratory results of Brix, Pol, ATR, Purity and fiber content. For the correlations, multivariate analyzes using PLSR were used. Among the spectra obtained directly in the stalks, the measurements on the transverse sectional surface were the ones with better correlations with Brix. However, when using spectra directly from the stalks to predict results obtained from composite samples, the differences between the stalks reduce the predictive capacity of the method. So spectra obtained from composite samples like juice or fibers were those with best capacity to predict laboratory data. The fiber content was the parameter that less correlated with spectral measurements. Quality differences were found between different heights in the stem. Quality parameters were also mapped in a commercial field and spatial dependence between samples was found. The spectrometry was effective in mapping regions with different quality levels over the field. A coefficient of variation of 5% was obtained in a 16.5 ha field, which could justify local management actions.

É consenso entre enólogos que o glicerol contribui para o corpo e sabor adocicado dos vinhos, por analogia, propôs-se investigar a presença e o papel do glicerol em aguardentes de cana. O método adaptado para a quantificação de glicerol, que envolveu a derivatização das amostras com cloreto de benzoíla, uma posterior etapa de extração em fase sólida (SPE) para clean-up das amostras e análise via HPLC-DAD, apresentou boa sensibilidade (limites de detecção e quantificação iguais a 0,25 e 0,74 mg L-1, respectivamente), exatidão de 97,5 % e precisão de 93,5 %. A reação de derivatização entre glicerol e o cloreto de benzoíla, estudada por cromatografia líquida hifenada a espectrometria de massas, foi quantitativa com esterificação das três hidroxilas da molécula. Antes de se avaliar a influência do glicerol no sabor doce da cachaça, as concentrações de açúcares totais foram medidas empregando-se o método DNS (limites de detecção e quantificação iguais a 37 e 125 mg L-1, respectivamente). Verificou-se que não houve uma relação entre os teores de glicerol e açúcares totais com a nota doce, determinada a partir de análise sensorial das amostras, para o conjunto de amostras não adoçado. Com base em um teste triangular não houve diferença sensorial significativa entre uma cachaça sem glicerol e outra com glicerol numa concentração de até 35 g L-1. A mediana do teor de glicerol detectado em 51 amostras de cachaça foi de 4,3 mg L-1. A mediana dos teores de açúcares totais para 59 amostras de cachaça não adoçada foi abaixo do limite de quantificação. A mediana dos teores de açúcares totais para 8 amostras de cachaça adoçada foi de 17 g L-1, expressos em glicose. / There is a consensus among enologists that glycerol contributes to the body and sweet taste of wine, by analogy; it was proposed to investigate the presence and role of glycerol in sugar cane spirits. The adapted method for glycerol quantification, which involved the samples derivatization with benzoyl chloride, a further solid phase extraction (SPE) step for samples clean-up and analysis by HPLC-DAD showed good sensitivity (limits of detection and quantification of 0.25 and 0.74 mg L-1, respectively), 97.5 % of accuracy and 93.5 % of precision. The derivatization reaction between glycerol and benzoyl chloride, studied through liquid chromatography hyphenated to mass spectrometry, was quantitative with esterification of the three hydroxyls of the molecule. Before evaluating the influence of glycerol in cachaça\'s sweet taste, total sugar concentrations were measured by DNS method (limits of detection and quantification were 37 and 125 mg L-1, respectively). It was verified that there was no correlation between the contents of glycerol and total sugars with the sweet score, determined by the samples sensory analysis, to the samples which no sugar was added. Based on a triangular test, there was no significant sensory difference between a cachaça without glycerol and another with glycerol concentration up to 35 g L-1. The median glycerol concentration detected in 51 samples of cachaça was 4.3 mg L-1. The median level of total sugars for 59 samples of cachaça without sugar addition was below the limit of quantification. The median level of total sugar for 8 samples of cachaça with sugar addition was 17 g L-1, expressed as glucose.

O álcool, considerado um subproduto de grande importância da cultura de cana-deaçúcar, tem apresentado grande interesse nos últimos anos devido a questões econômicas e ambientais. A estimativa de produção para a safra 2007-2008, de acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), é de 251,59 milhões de toneladas de álcool. Por ser considerada uma fonte de energia alternativa (em substituição aos combustíveis fósseis) e renovável, muitos estudos estão sendo direcionados à cultura da cana-de-açúcar como, por exemplo, o aproveitamento do bagaço considerado um resíduo do setor sucroalcooleiro. O intuito deste trabalho foi o de realizar a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar por meio de enzimas celulolíticas comerciais visando identificar e quantificar açúcares fermentescíveis. Com essa finalidade, primeiramente, foram selecionadas as seguintes enzimas comerciais HPL1800, CL3708, P1250 e P4500; as quais apresentaram maior atividade celulolítica total em papel de filtro. Posteriormente foram testados dois pré-tratamentos do bagaço (ácido ou alcalino) e verificadas a atuação dessas enzimas em cada pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar pelas metodologias do ácido dinitrosalicílico (DNS) e da cromatografia líquida (HPAEC - PAD). Os dados obtidos por ambas as metodologias foram analisados estatisticamente e concluiu-se que a ação conjunta do pré-tratamento ácido 0,5%, autoclave a 121ºC por 30 minutos e a enzima P4500 foram as melhores formas de tratamento para a obtenção de açúcares. / Ethanol is considered an important by-product from sugar cane culture. Nowadays it has been shown great importance in economics and environmental questions. The estimate ethanol production 2007-2008 is about 251.59 millions of tons, according to Companhia Nacional de Abastecimento (Conab). Alcohol is considered an alternative and renewable source of energy; this has lead several new studies on development of sugarcane culture and its derivatives, such as bagasse which is considered a residue from sugarcane industry. The aim of this research is the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse for sugar production and its quantification and identification. The first step consisted at the selection of higher cellulolytic activity commercial enzymes in filter paper. The four enzymes selected were: HPL1800, CL3708, P1250 and P4500. After that, their performances were tested with two different pre-treated (acid and alkali) bagasse. The total sugars presents in the hydrolyzed were measured by dinitrosalicilic acid (DNS) and liquid chromatography (HPAEC - PAD) methodologies. The results were analyzed with statistics program. The datelines showed that joint action of 0.5% acid pre-treatment, 121ºC per 30 minutes and enzyme P4500 were the best treatment to sugars attainment.

Orientador: Mauro Scharf. / Coorientador: Jürgen Andreaus. / Dissertação (Mestrado em Química) - Programa de Pós-Graduação em Química, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Universidade Regional de Blumenau, Blumenau.

Neste trabalho, foram desenvolvidos métodos para determinação de espécies neutras por eletroforese capilar (CE) com detecção condutométrica sem contato (CCD). Estratégias baseadas em eletroforese capilar em solução livre (FSCE) e cromatografia micelar eletrocinética (MEKC) foram utilizadas em três casos: misturas de álcoois alifáticos, misturas de açúcares e salbutamol. Estas substâncias foram escolhidas por apresentarem ampla distribuição de características químicas. Os n-álcoois possuem regiões polares e apoIares distintas ao longo da cadeia carbônica, sendo que em solução aquosa se apresentam invariavelmente como espécies neutras. Os açúcares, apesar das longas cadeias carbônicas, possuem grande número de hidroxilas uniformemente distribuídas e podem ser ionizados a valores elevados de pH. Já o salbutamol, pode ser encontrado como espécie catiônica, neutra ou aniônica, dependendo do pH do meio. A melhor aproximação para os álcoois foi MEKC, que permitiu a separação e detecção da ordem de 10-4 mol·L-1 para cinco isômeros de pentanol. A utilização de eletrólito de corrida com pH 12,1 permitiu a determinação de frutose, glicose, galactose e sacarose da ordem de 10-5 moI&middotL-1 por FSCE em capilares de 20 µm. Salbutamol pode ser detectado como cátion e ânion em FSCE em limites de detecção da ordem de dez vezes menores que aquele obtido para a espécie neutra por MEKC. Como o mecanismo pelo qual ocorre a detecção condutométrica em MEKC não era ainda bem conhecido, foram desenvolvidos experimentos que ajudassem a elucidá-Io. Medidas de condutividade, viscosidade e análise de impedância de soluções tampão com dodecilsulfato de sódio (SDS) com n-álcoois e experimentos com soluções similares em MEKC demonstraram que a resposta observada com CCD é bastante complexa, pois vários fenômenos contribuem para o comportamento da condutividade na região dos analitos. Os principais fenômenos, os quais não estavam sendo devidamente considerados em modelos anteriores, são a dissociação e a ionização provocadas pelos analitos sobre as micelas. Estes fenômenos seriam particularmente significativos para as mobilidades das espécies envolvidas nas micelas, provocando a propagação de vacâncias que seriam então detectadas. / In the present work, analytical methods for determination of neutral species based on capillary electrophoresis (CE) with contactless conductivity detection (CCD) were developed. Free solution capillary electrophoresis (FSCE) and micelar electrokinetic chromatography (MEKC) were applied to three cases: mixtures of aliphatic alcohols, mixtures of sugars, and salbutamol. These substances were selected due to their distinctiveness. The alcohols have well-defined polar and apoIar regions in their carbonic chain and are typical non-ionic species in aqueous medium. The sugars have a great number of hydroxyl groups along the carbonic chain, which give a polar nature and can be ionized at high pH values. The salbutamol is amphoteric. The best approach for the alcohols was MEKC that allowed separation of five pentanol isomers with limit of detection of 10-4 mol·L-1. A running electrolyte with pH 12.1 allowed determination of 10-5 mol·L-1 of fructose, glucose, galactose, and sucrose, using FSCE with 20-µm inner diameter capillary. The sensitivity for the cationic and anionic forms of albuterol in FSCE was about ten times greater than that one achieved by MEKC for the neutral species. Since the conductivity detection in MEKC was not clearly understood, some experiments were carried out in order to improve the knowledge about it. Conductivity and viscosity measurement as well as impedance analysis of buffered sodium dodecyl sulfate solution with n-alcohols and experiments using similar conditions in MEKC showed that CCD response is complex, because several phenomena contribute to the solution conductivity in the region of the analytes. The main phenomena, which are not properly considered in the previous models, are the effects of the analytes on the dissociation and ionization of the micelles. These phenomena would be responsible for the vacancies detected as negative peaks, which would be formed by the augment of the mobilities of the species involved in the micelle formation.

Submitted by MAGNUN ANTONIO PENARIOL DA SILVA null (penariol@fca.unesp.br) on 2017-03-20T14:07:54Z No. of bitstreams: 1 TESE FINAL MAGNUN.pdf: 1184516 bytes, checksum: 33f0c41c91f8f4d05c677615ccd2d145 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-03-22T13:27:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_map_dr_bot.pdf: 1184516 bytes, checksum: 33f0c41c91f8f4d05c677615ccd2d145 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T13:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_map_dr_bot.pdf: 1184516 bytes, checksum: 33f0c41c91f8f4d05c677615ccd2d145 (MD5) Previous issue date: 2016-10-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A cultura do crambe começou a ser estudada no Brasil por apresentar elevado teor de óleo nos grãos. A produção é totalmente mecanizada e de baixo custo por utilizar as ferramentas disponíveis para outras espécies. O crambe é uma cultura de inverno, então se torna também uma excelente opção para o cultivo em safrinha. No entanto a cultivar desenvolvida para a comercialização no país apresenta maturação irregular dos grãos, o que se torna um problema tanto para a colheita quanto para os processos pós-colheita, por não se haver uma época ideal para colheita mecanizada sem que ocorram perdas durante esta etapa, ou ainda durante a secagem e armazenamento. Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi acompanhar o processo de secagem dos grãos de crambe, e ainda o período de 12 meses de armazenamento, relacionando esses processos com a dinâmica de formação de lipídeos dos grãos, os sistemas antioxidantes, o acúmulo de açúcares, lipídeos e proteínas ao longo do desenvolvimento, os estresses ocasionados pela secagem e a pigmentação durante o armazenamento. Para isso, um experimento foi instalado na área de produção da Fazenda Experimental Lageado, onde utilizou-se para semeadura sementes de crambe da cultivar FMS Brilhante (Fundação Mato Grosso do Sul), na qual o processo foi acompanhado semanalmente verificando os teores de água dos grãos (82, 74, 60, 40, 30, 20 e 10%) que foram submetidos à diferentes métodos de secagem (testemunha, natural, secagem em estufa à 30ºC e secagem em estufa à 40ºC). Para melhor entendimento dos dados obtidos este trabalho foi dividido em quatro capítulos. O primeiro capítulo trata-se de uma revisão de literatura a respeito dos processos de desenvolvimento, secagem e armazenamento de grãos de crambe. O segundo capítulo estudou a dinâmica de formação de lipídeos nestes grãos. No terceiro capítulo avaliou-se o acúmulo das principais reservas (proteínas, açúcares e lipídeos) e os danos oxidativos ocasionados pela secagem dos grãos. E no quarto o foco foi verificar se o tempo de armazenamento afeta as reservas, pigmentação e a atividade enzimática dos grãos. Conclui-se que a maior reserva encontrada em grãos de crambe são os lipídeos, seguido por açúcares e proteínas, os grãos de crambe apresentam maior acúmulo de lipídeos aos 49 dias após a floração, a secagem à 80 ºC provoca danos aos grãos e que os grãos de crambe começam aumentar o conteúdo de pigmentos à partir dos 6 meses de armazenamento. / The culture of crambe began to be studied in Brazil by a high oil content in grain. The production is fully mechanized and low cost to use the tools available for other species. It is a winter crop, then it also makes an excellent choice for growing in off-season. However cultivating developed for sale in the country is irregular grain maturity, which becomes a problem for both the harvest time to post-harvest processes, not be an ideal time for mechanized harvesting without incurring losses during this step or during drying and storage. Given the above, the objective of this study was to follow up the development process of crambe grain, and also the steps of drying and storage, linking these processes with the dynamics of grain lipid formation, antioxidant systems, the accumulation of sugars , lipids and proteins throughout the development of the stresses caused by drying and pigmentation during storage. For this, an experiment was conducted in the area of Fazenda Experimental Lageado. We used to cultivate the crambe sowing seeds FMS Brilhante (Fundação Mato Grosso do Sul), in which the process was monitored weekly by checking the water content of grains (82, 74, 60, 40, 30, 20 and 10%) which were subjected to different drying methods (control, natural drying oven at 30 ° C and dried at 40 ° C). For better understanding of the data from this study was divided into four chapters. The first chapter it is a literature review about the development processes, drying and crambe grain storage. The second chapter studied the dynamics of the formation of lipids in these grains. In the third chapter, we evaluated the accumulation of the main reserves (proteins, sugars and lipids) and the oxidative damage caused by the drying of the beans. And in the room the focus was to determine whether the storage time affects the reserves, pigmentation and the enzymatic activity of the grains. It follows that the largest reserve found in crambe grains are lipids, followed by sugars and proteins, crambe grains have higher accumulation of lipids at 49 days after flowering, drying at 80 ° C causes damage to the beans and that crambe grains begin to increase the content of pigments from 6 months of storage. / CNPq: 140263/2013-6

Os carboidratos presentes nos glicoconjugados apresentam alto grau de complexidade e diversidade estrutural, desempenhando um importante papel em diversos processos biológicos. As glucosidases, enzimas responsáveis pela clivagem de ligações O-glicosídicas em oligossacarídeos e glicoconjugados, participam de processos bioquímicos fundamentais do metabolismo e também estão envolvidas na biossíntese de glicoproteínas e glicoesfingolipídeos. Diversos inibidores de glucosidases de origem natural ou sintética têm sido descritos, como por exemplo: acarbose (1), miglitol (2), voglibose (3) e N-butil-desoxi-nojirimicina (4); sendo 1, 2 e 3 indicados para tratamento de diabetes mellitus tipo II e 4 para o controle da doença de Gaucher. Considerando a importância do planejamento e da síntese de novos inibidores de glucosidases, bem como a necessidade de obtenção de modelos tridimensionais para glucosidases, os objetivos deste trabalho foram: i) sintetizar carba-açúcares e pseudodissacarídeos potencialmente anti-glucosidase, ii) avaliar suas atividades inibitórias empregando a enzima ?-D-glucosidase de Saccharomyces cerevisiae e iii) aplicar técnicas de bioinformática e modelagem molecular na construção de um modelo estrutural 3D por homologia da sacarase intestinal de rato e realizar estudos de relação estrutura-atividade baseado no padrão farmacofórico calculado para os inibidores descritos. Neste sentido, a partir do precursor-chave (3/2,4)-2,3,4-tri-O-benzil-5-hidroxi-cicloexanona (12), obtido em 6 etapas, foram sintetizados diferentes carba-açúcares. Adicionalmente, reações de aminação redutiva, rearranjo alílico e \"click chemistry\" foram empregadas na síntese dos pseudodissacarídeos inéditos 3-(2,4-dibenziloxi-fenilamino)-2,4,6-tri-O-benzil-3-desoxi-?-D-glucopiranosídeo de metila (81), 1-(2\',3\',4\'-tri-O-benzil-5\'-oxo-cicloexanil)-4,6-di-O-acetil-2,3-didesoxi-hex-2-enopiranosídeo (89) e 2-{4-[(1H-1,2,3-triazol-4-il)metoxi]-2,4-di-O-benzil-fenila}-1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-desoxi-?-D-glucopiranosídeo (99), respectivamente. O composto (3/2,4)-2,3,4,5-tetraidroxi-cicloexanona (46) foi submetido a estudos de inibição enzimática e apresentou moderada atividade de inibição da enzima ?-D-glucosidase. As simulações de docking com o modelo construído da sacarase de rato bem como a determinação do padrão farmacofórico forneceram novas informações estruturais sobre o sítio ativo desta enzima e do modo de ligação de diferentes inibidores. Portanto, as estratégias sintéticas, os estudos de cinética enzimática e de modelagem molecular realizados durante o trabalho resultaram em contribuições relevantes no que diz respeito à química de carboidratos, permitindo avaliar potenciais inibidores da enzima ?-glucosidase in silico, os quais poderão ser sintetizados e submetidos a novos ensaios enzimáticos. / Carbohydrates of glycoconjugates display high degree of complexity and structural diversity, playing a central role in biological processes. Glucosidases are enzymes that catalyze the cleavage of glycosidic bonds in oligosaccharides or glycoconjugates, being essentials in several metabolic pathways and in the biosynthesis of glycoproteins and glycosfingolipids. Several glucosidase inhibitors from natural and synthetic sources have been described, such as: acarbose (1), miglitol (2), voglibose (3) and N-butyl-desoxy-nojirimycin (4). Compounds 1, 2 and 3 are used in the treatment of type II diabetes mellitus and 4 for patients with Gaucher\'s disease. Concerning to the importance of the design and synthesis of new glucosidase inhibitors, as well as the need of 3D models for glucosidases, the aims of this work were: i) the synthesis of potentially anti-glucosidase carba-sugars and pseudodisaccharides, ii) the evaluation of its inhibitory activities by using ?-D-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae and iii) the use of bioinformatics and molecular modeling techniques for creation of a 3D structural homology model of rat intestinal sucrase to accomplish the structure-activity relationships studies concerning to the pharmacophoric pattern of the reported inhibitors. Thus, starting with the key precursor 12, prepared in six steps, different carba-sugars were synthesized. Additionally, reductive amination reactions, allylic rearrangement and \"click chemistry\" were applied on the synthesis of novel pseudosaccharides 81, 89 and 99, respectively. Compound 46 was assayed for enzymatic inhibition and demonstrated reasonable activity for the inhibition of ?-D-glucosidase. Docking simulations by using the rat sucrase model and the determination of pharmacophoric pattern provided significant information concerning to the enzyme\'s active site and the inhibitor\'s binding pattern. Therefore, the synthetic strategies, enzymatic kinetic assays and molecular modeling studies performed in this work resulted in relevant contributions to the carbohydrate chemistry, making possible for our research group to evaluate potential ?-glucosidase inhibitors in silico, which can be synthesized and assayed for enzymatic activity in the future.

O objetivo do presente trabalho é a elucidação da estrutura cristalográfica da proteína N-acetilglicosamina 6-fosfato desacetilase (desacetilase) da bactéria Escherichia coli. A desacetilase é um tetrãmero de subunidades idênticas de 382 aminoácidos e massa molecular de 41 kDa. Esta é uma enzima da via de catabolismo de açúcares aminados e cataliza a conversão do N-acetilglicosamina 6-fosfato em glicosamina 6-fosfato. Nesta via a bactéria dedica cinco genes organizados em um regulon, o nagE-nagBACD, com propósitos de obtenção de energia e de reciclagem de componentes de parede celular. A reciclagem de componentes de parede celular é a via de maior atividade metabólica de E. coli, na qual aproximadamente 40% dos peptidoglicanos de parede celular são quebrados a cada geração, sendo o N-acetilglicosamina (GlcNAc) reutilizado para a síntese de novo de peptidoglicanos e lipopolissacarídeos de membrana externa. O GlcNAc exerce funções multi-regulatórias na via de catabolismo de aminoaçúcares e a desacetilase é o maior fator controlador da sua concentração intracelular. Foi demonstrado que a desacetilase é a enzima mais importante da via e que sem ela a E. coli não é capaz de reciclar o GlcNAc. A desacetilase é encontrada em outros organismos desempenhando funções igualmente importantes, estando relacionada à captura e o armazenamento de carboidratos em hepatócitos e células sinusiais de fígado de camundongo, à morfogênese e à diminuição da patogenicidade e da adesão da Candida albicans a tecidos endoteliais, chegando também a ser estudada para desenvolvimento de inibidores contra o parasita da malária o Plasmodzum falciparum. Neste trabalho foram descritos os procedimentos desde a subclonagem do gene codificador da desacetilase de E. coli até a interpretação da sua estrutura quaternária, incluindo a expressão, a purificação, a cristalização, a produção de cristas derivados de átomos pesados, a estimativa de fases e a construção e refinamento do modelo cristalográfico. A estrutura foi resolvida por espalhamento anômalo de iodo de baixa resolução (2,9 angstron), em comprimento de onda único, sendo refinada a resolução de 2,0 angstron. Na unidade assimétrica encontram-se dois monômeros relacionados por um eixo de ordem 2 não cristalográfico aproximadamente a 15° da direção do eixo cristalográfico c. A simetria do cristal aplicada à unidade assimétrica leva a formação de um tetrâmero cuja área da superfície de tetramerização é de 5.343 angstron2, correspondente a 18,4% da área do dímero. A área de superfície de acessibilidade da interface dimerização é de 1.053 angstron2, correspondente a 6,8 % da área do monômero. O monômero da desacetilase é constituído por dois domínios: o beta, um pequeno sanduíche beta; e o alfa, um pseudo barril (beta/alfa)8 comum aos membros da super família da Amidohidrolases. O domínio-beta é constituído por duas folhas beta mistas e uma hélice alfa. O domínio- alfa é constituído por 11 hélices alfa e por três folhas beta, uma paralela e as outras duas anti paralelas. No domínio- beta, oito das onze hélices alfa formam ligações cruzadas com as oito fitas da folha beta paralela para formar o \"barril\" onde encontra-se o sítio ativo. No sitio ativo foi observada a presença de um íon fosfato. Os resíduos do sítio ativo que participam da ligação ao fosfato são Gln59, Glu131, His195, His216 e Asp273, dos quais pelo menos uma histidina e um ácido aspártico têm se conservado em membros da super família das Amidohidrolases / The goal of the present work is to elucidate the crystallographic structure of the protein N-acetylglucosamine Bphosphate deacetylase (deacetylase) from Escherichia coli. The deacetylase is a tetramer of identical subunits with 382 aminoacids and molecular weight of 41 kDa. It is an euzyme of the amino sugar catabolism pathway and it catalyzes the conversion of the N-acetylglucosamine Gphosphate in to glucosamine 6-phosphate. In this pathway the bacteria dedicates five genes organized in the nagE-nagBACD regulon for purposes of cell wall component recycling and energy production. The cell wall component recycling is the major E. coli metabolic pathway in which aproximately 40% of the cellular wall peptidoglicans is broken in each generation. Its degradation product, the amino sugar N-acetylglucosamine (GlcNAC) is reused for the peptidoglican and for the lipopolysacharide de novo synthesis. The GlcNAC plays several regulatory roles in the amino sugar catabolism pathway and deacetylase is its major intra cellular concentration controlling factos. It was demonstrated that without the deacetylase, E. coli is uncapable of recycling the GlcNAc. The deacetylase plays important roles in the other organisms in which it has been found. It is related to the carbohydrate up-take and storage in hepatocytes and sinusoidal cells from rat liver and to the Candida albicans morphogenesis, pathogenicity and adherence to the endothelial tissues. Deacetylase has also been studied in the development of inhibitors against the malaria parasite Plasmodzum falciparum. This work describes all the approaches from the nagA subcloning to the crystallographic structure analysis, including deacetylase expression, purification, crystallization, heavy atoms derivatives production, phasing, model building and model refinement. The E. coli deacetylase structure was solved by Single Anomalous Dispersion using low resolution (2,0 angstron) iodine anomalous scattering. The structure was refined to 2,0 angstron resolution. The contends of the asymmetric unit is a dimer related by a non-crystallographic 2-fold symmetry axis about 15° from the crystallographic axis c. The crystallographic symmetry applied to the asymmetric unit produces a tetramer, whose the surface accessibility of the buried area is 5.343 angstron, corresponding to 18.4 % of the dimer total area. The dimer surface accessibility of the buried area is 1.053 angstron2, corresponding to 6.8 % of the monomer total area. The deacetylase monomer folds into two domains, a pseudo (beta/alfa)8 barrel enclosing the catalytic site of the enzyme and a small beta sandwich made up from secondary structure elements contributed by the N and C termini. The beta domain is composed of two mixt beta sheets and one alfa helice. The alfa domain is composed of 11 alfa helices and 3 beta sheets, one of them parallel and the other two anti parallel. In the alfa domain, 8 alfa helices are cross linked to 8 beta strands to form the pseudo barrel which encloses the active site. A phosphate ion was found into the catalytic site. The catalytic residues that bind the phosphate ion are Gln59, Glu131, Hisl95, His216 and Asp273, from which at least one histidine and one aspartic acid are conserved amongst the Amidrohydrolases super family members

Dissertation submitted for obtain the degree of Doctor in Chemical Engineering, at the Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, under supervisory Dr. Alírio Egídio Rodrigues

Submitted by Maria Medeiros (maria.dilva1@ufcg.edu.br) on 2018-10-17T13:56:42Z No. of bitstreams: 1 JOSÉ MARIANO DA SILVA NETO - DISSERTAÇÃO (PPGEQ) 2018.pdf: 2684747 bytes, checksum: fe802948822a1a5d8659189a540f5fba (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-17T13:56:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JOSÉ MARIANO DA SILVA NETO - DISSERTAÇÃO (PPGEQ) 2018.pdf: 2684747 bytes, checksum: fe802948822a1a5d8659189a540f5fba (MD5) Previous issue date: 2018-03-09 / Materiais lignocelulósicos representam uma importante matéria-prima para a produção de biocombustíveis e outros insumos químicos para comódites. Esses materiais quando derivados em celulose, hemicelulose e lignina geram matérias primas e subprodutos com valor agregado maior, a exemplo de acetato de celulose oriundo da celulose. No geral a cana-de-açúcar é a fonte de material lignocelulósico mais usada para obtenção desses derivados e frações. No entanto, alternativo a cana-de-açúcar, o sorgo sacarino tem recebido destaque pelo seu potencial lignocelulósico e por apresentar vantagens tanto do ponto de vista fotossintético como em velocidade de maturação e adaptação na região semiárida. Assim, o presente trabalho teve como principal objetivo o isolamento da celulose e hemicelulose do bagaço do sorgo sacarino e obtenção do acetato de celulose. Inicialmente, foi realizada a caracterização lignocelulósica do bagaço do sorgo sacarino para determinar os teores de celulose, hemicelulose e lignina, e em seguida foi realizado um pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino, visando estudar o efeito da temperatura, concentração de peróxido de hidrogênio e tempo reacional para solubilizar a lignina. A deslignificação gerou um resíduo sólido majoritariamente composto de celulose e um líquido majoritariamente composto de hemicelulose e lignina. A separação do resíduo sólido do líquido foi realizada por filtração, o filtrado submetido à adição de álcool etílico e precipitado em hemicelulose. A caracterização do bagaço in natura e pré-tratado, a celulose, hemicelulose e o acetato de celulose foi realizada através da espectroscopia de infravermelho (FTIR), difração de raios -X (DRX) e análises termogravimétricas (TG/DTG/DSC) e determinação do grau de substituição (GS) por via química para o acetato de celulose, visando a confirmação da acetilação. Por meio de análise estatística dos dados experimentais observou-se que as condições de pré-tratamento que geraram a maior solubilização da lignina (61,98%) e maior rendimento na extração da celulose (39,5%) foi na temperatura de 60°C, concentração de peróxido de 6% e tempo reacional de 4 horas bem como, a condição em que se obteve o maior rendimento para a hemicelulose (7,04%) foi na mesma temperatura e concentração de peróxido de hidrogênio, porém, no tempo reacional de 6h. A celulose obtida na melhor condição de pré-tratamento foi submetida a reação de acetilação homogênea para sintetizar o composto acetato de celulose em que as variáveis estudadas de síntese foram temperatura e tempo reacional de acetilação. O acetato de celulose foi obtido com um grau de substituição de 3,66 a uma temperatura de 25°C e tempo reacional de 24h. Os espectros de FTIR indicaram bandas características idênticas de materiais lignocelulósicos, o que demonstrou a eficiência do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino. Através das análises de DRX observou-se a presença de picos característicos de materiais lignocelulósicos, a presença de regiões parcialmente cristalinas da celulose e amorfas para a hemicelulose. Quanto às análises termogravimétricas de TG e DTG foi possível concluir que os materiais isolados, celulose e hemicelulose, demonstraram perdas de massa semelhantes e que puderam também ser confirmados através das curvas de DSC. / Lignocellulosic materials represent an important raw material for biofuels production and other chemical inputs for comodites. These materials when derived in cellulose, hemicellulose and lignin generate raw materials and by-products with higher added value, such as cellulose acetate derived from cellulose and xylose obtained from hemicellulose. In general sugarcane is the source of lignocellulosic material most used to obtain these derivatives and fractions. However, alternative to sugarcane, saccharine sorghum has been highlighted by its lignocellulosic potential and because it presents advantages from the viewpoint of photosynthesis and maturation speed and adaptation in the semi-arid region. Thus, the main objective of the present work was the isolation of cellulose and hemicellulose from saccharin sorghum bagasse and the production of cellulose acetate. Firstly, the lignocellulosic characterization of saccharin sorghum bagasse was carried out to determine the cellulose, hemicellulose and lignin contents, followed by a pretreatment with alkaline hydrogen peroxide, aiming to study the effect of temperature, peroxide concentration of hydrogen and reaction time to solubilize the lignin. The delignification generated a solid residue mostly composed of cellulose and a liquid mostly composed of hemicellulose and lignin. Separation of the solid residue from the liquid was carried out by filtration, the filtrate submitted to the addition of ethyl alcohol and precipitated into hemicellulose. The bagasse in natura and pre-treated, cellulose and hemicellulose extract and cellulose acetate were characterized by infrared spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction (XRD) and thermogravimetric analysis (TG / DTG / DSC). By means of statistical analysis of the experimental data, it was observed that the pretreatment conditions that generated the highest solubilization of lignin (61.98%) and higher yield in the cellulose extraction (39.5%) were at the temperature of 60 ° C, peroxide concentration of 6% and reaction time of 4 hours, as well as the condition in which the highest yield for hemicellulose (7.04%) was obtained at the same temperature and concentration of hydrogen peroxide, however, the reaction time was 6h. The cellulose obtained in the best pre-treatment condition was submitted to a homogeneous acetylation reaction to synthesize the cellulose acetate compound in which the studied variables of synthesis were temperature and reaction time of acetylation. Cellulose acetate was obtained with a substitution degree of 3.66 at a temperature of 25 °C and reaction time of 24h. The FTIR spectra indicated the efficiency characteristics of identical lignocellulosic materials, which demonstrated the pretreatment efficiency with alkaline hydrogen peroxide. Through the XRD analyzes the presence of characteristic peaks of lignocellulosic materials, the presence of partially crystalline cellulose regions and amorphous to hemicellulose were observed. Regarding the thermo gravimetric analyzes of TG and DTG, it was possible to conclude that the isolated materials, cellulose and hemicellulose, showed similar mass losses and that could also be confirmed through the DSC curves.