Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est une cause majeure d'affection hépatique chronique, notamment la cirrhose et le cancer du foie. On estime que 170 millions de personnes dans le monde sont des porteurs chroniques du VHC et que 3 à 4 millions de personnes sont infectées chaque année. Un des handicaps majeurs de la recherche sur le VHC est l'absence de systèmes de culture in vitro efficaces et de modèles animaux. Nous avons ainsi choisi une approche recombinante pour l'étude de protéines E1, E2 et p7 du VHC.Les protéines E1, E2 et p7 qui sont impliquées dans des étapes essentielles du cycle viral sont des protéines membranaires. Cependant, l'expression recombinante de cette classe de protéine est extrêmement complexe. En effet, la surexpression des protéines membranaires est souvent toxique pour les cellules hôtes. Ce phénomène est provoqué par l'agrégation ou la dégradation des protéines dans le cytoplasme dû à un manque de membrane disponible pour assurer leur intégration sur la cellule hôte. De plus, la surexpression de protéines membranaires induit la saturation de la machinerie cellulaire liée aux protéines membranaires. Ce détournement empêche le déroulement d'un cycle cellulaire normal et est ainsi fatal pour la cellule hôte. La forte concentration de protéines membranaires ou encore le fait que celles-ci soient hétérologues peut également provoquer la déstabilisation de la membrane de la cellule hôte et de son homéostasie. Afin de nous affranchir de ces limitations, nous avons utilisé une méthode de production des protéines membranaires sous forme native par un système acellulaire en présence de liposomes ; une technologie brevetée par l'université Joseph Fourier et exploitée par la société Synthelis. Dans un premier temps, nous avons procédé à la mise en place du système de production exploitant un lysat bactérien d'E. coli et d'un mélange énergétique complémentaire. Nous avons ensuite utilisé ce system pour étudier la viroporine p7. Cette protéine est essentielle pour la production de particules virales infectieuses et est impliquée dans l'assemblage viral ce qui en fait une cible thérapeutique intéressante. La production de protéoliposomes p7 en grande quantité nous a permis la caractérisation de la protéine par des techniques biochimiques et biophysiques. Nous avons mis en évidence l'inhibition de l'oligomérisation de p7 par le HMA qui ainsi inhibe sa fonction canal ionique. Grâce à la flexibilité du système d'expression acellulaire nous avons caractérisé la structure de la viroporine dans la membrane par réflectivité de neutron et avons confirmé la forme en entonnoir du complexe protéique. Des résultats préliminaires sur les proéoliposomes E1E2 quant à eux permettent d'espérer la production prochaine de particules virales mimant le VHC afin de mieux l'étudier et de lutter contre cette épidémie.L'ensemble de ces résultats confirment la pertinence de l'expression de protéines membranaires sous formes natives en système acellulaire en présence de liposomes. Les protéoliposomes produits constituent des nouveaux outils pour l'étude du VHC et permettent d'envisager de très grandes applications thérapeutiques ainsi que le développement de biomédicaments basés sur l'utilisation de protéines membranaires recombinantes. / The Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease, including cirrhosis and liver cancer. An estimated 170 million people worldwide are chronically infected with HCV and 3 to 4 million people are infected each year. One of the major handicaps of the HCV research is the lack of effective in vitro culture systems and animal models. To adress this issue, we chose a recombinant approach to study the E1, E2 and p7 proteins of HCV.The E1, E2 and p7 proteins are involved in critical steps of the viral cycle. They are membrane proteins, a class of protein that is extremely complex to express. Indeed, overexpression of membrane proteins is often toxic to the host cells. This phenomenon is caused by protein aggregation or degradation in the cytoplasm due to a lack of available membrane space for their integration into the host cell. Moreover, overexpression of membrane proteins induces saturation of the cellular machinery linked to membrane proteins. This diversion prevents the flow of a normal cell cycle and is fatal to the host cell. Destabilization of the host cell's membrane and its homeostatis may also be caused by the high concentration of membrane proteins or their heterologous nature. To circumvent these limitations, we used a method for producing membrane proteins in their native form by a cell-free system in the presence of liposomes; a technology patented by the University Joseph Fourier and licenced by the startup company Synthelis. First, we have set up the cell-free production system using a bacterial lysate from E. coli and a complementary energy mix. We then used this system to study the p7 viroporine. This protein is essential for the production of infectious virus particles and is involved in viral assembly making it an attractive therapeutic target. The production of a large quantity of p7 proteoliposomes allowed us to characterize the protein by biochemical and biophysical techniques. We have demonstrated the inhibition of oligomerization of p7 by HMA, which thereby inhibits its ion channel function. Thanks to the flexibility of the cell-free expression system we have characterized the structure of the viroporine within the membrane in a neutron reflectivity assay and have confirmed the funnel shape of the protein complex. Preliminary results on proteoliposomes E1E2 offer hope for the production viral particles mimicking the hepatitis C virus in order to better study the virus and fight against this epidemic.Together, these results confirm the suitability of the expression of membrane proteins in native forms using a cell-free system in the presence of liposomes. Proteoliposomes products are a new tool for the study of HCV and consideration for very broad therapeutic applications and the development of biopharmaceuticals based on the use of recombinant membrane proteins.

L’estimation de l’âge au décès d’individus découverts en contexte médico-légal ou ar-chéologique est un sujet fondamental. La cémentochronologie fondée sur le dépôt annuel de cément acellulaire est une technique parmi les plus performantes dont l’exactitude est appréciée dans de nombreuses publications. Cependant, le manque de standardisation ralentit l’adoption de cette méthode et freine l’étude de la précision qui demeure méconnue tout comme l’impact des conditions taphonomiques sur sa fiabilité. Le premier objectif de ce travail est de mesurer la concordance des estimations effectuées, donc la précision, puis d’évaluer l’exactitude, donc la qualité de l’accord entre l’âge estimé et l’âge chronologique, en appliquant un protocole standardisé et certifié ISO-9001 pour s’affranchir des biais inhérents à la préparation. Le second objectif est d’apprécier l’impact des affections taphonomiques trop souvent négligées. La collecte des données à partir de préparations histologiques dentaires représente une opération coûteuse en temps et constitue un obstacle majeur pour conduire des études cémentochronologiques. Nous nous fixons comme autre objectif d’expérimenter un logiciel de comptage semi-automatique, fruit d’une collaboration entre anthropologues (UTML) et développeurs (FEI Visualization Sciences Group). Pour atteindre ces buts, l’étude porte sur 2000 lames histologiques réalisées à partir de 400 canines. 200 canines sont issues de collections de référence dont l’âge, le sexe, l’intervalle postmortem et la durée d’inhumation des sujets sont connus. Afin d’apprécier l’influence de la taphonomie sur la lisibilité et la précision et d’étudier l’applicabilité de la méthode à du matériel ancien, 200 canines extraites de sujets archéologiques datés entre le XIIe et le XVIIIe siècle sont intégrées à l’étude. Précision et exactitude sont approchées pour chaque classe d’âge et en tenant compte des intervalles post-mortem et des affections taphonomiques, mettant ainsi en évidence une fiabilité qui est fonction de l’âge du sujet, mais aussi de l’état de conservation des tissus. Ce travail vise, sur un échantillon standardisé conséquent, à amener une discussion sur les performances de la cémentochronologie à l’échelle individuelle et populationnelle, à apporter des recommandations et proposer un modèle de prédiction pour minimiser les différences entre âge estimé et âge chronologique. / Age at death estimation is a fundamental component of creating a biological profile in forensic and bioarchaeological contexts. Cementochronology based on annual deposition of acellular cementum is one of the most effective ageing techniques, and its accuracy, i.e. the agreement between estimated age and chronological age, is acknowledged in many publications. However, the lack of standardization slows down the adoption of this method and hinders the evaluation of its precision that remains unknown as well as the impact of taphonomical processes. The first objective of this thesis is to measure the agreement between cementum estimates, i.e. the precision, and then to assess the accuracy through the evaluation of the quality of the accordance between chronological age and estimates based on a standardized and ISO-9001 certified protocol to overcome bias due to sample preparation. The second objective is to gauge the impact of taphonomical effects too often neglected. Counting cementum increments on histological preparations is time-consuming and represents a major difficulty to perform cementochronological studies. Another goal is to experiment a semi-automatic program resulting from a col-laboration between anthropologists (UTML) and software developers (FEI Visualization Sciences Group). To achieve these goals, our study is based on 2000 histological sections from 400 canines. 200 canines are derived from reference collections with documented age, sex, postmortem interval and burial duration. In order to grasp the influence of taphonomy on slices readability and on precision and to investigate the applicability of this method on ancient material, 200 canines extracted from archaeological assemblages dated between the XIIth century and XVIIIth century are included in the study. Accuracy and precision are assessed for each age group in considering post-mortem intervals and taphonomical conditions and show a reliability influenced by age but also by tissue preservation. This work aims, on a large standardized sample, to discuss cementochronology’s performance for individual and population approaches, to provide recommen-dations and to propose a prediction model to reduce differences between estimated age and chronological age.

Ces travaux de thèse concernent le développement d'une biopuce à membranes permettant de réincorporer de manière fonctionnelle une protéine transmembranaire de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), CXCR4, dans une bicouche lipidique attachée et espacée sur un substrat d'or par pilotis peptidiques (pep-tBLM), sous un format miniaturisé et parallélisé. Le peptide pilotis utilisé, P19-4H, possède une cystéine en position N-terminale pour son greffage covalent sur la surface d'or et quatre résidus Histidine en position C-terminale pour l'attachement par chélation, en présence de Nickel, de protéoliposomes réintégrant CXCR4. La synthèse de cette protéine s'effectue par expression acellulaire sous forme de protéoliposomes, dans une composition lipidique adaptée et en présence d'un lipide chélatant, le DOGS-NTA, à 2% de la quantité molaire totale des lipides. Le peptide AH, un peptide fusogène, est utilisé dans une dernière étape pour fusionner les protéoliposomes attachés. La caractérisation approfondie des protéoliposomes et l'optimisation des conditions expérimentales ont permis d'aboutir à l'attachement robuste des protéoliposomes avec une densité lipidique suffisante pour leur fusion par le peptide AH et la formation d'une pep-tBLM réintégrant CXCR4. Des études de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré que la pep-tBLM réinsérant CXCR4 était fluide, homogène et continue, avec un coefficient de diffusion de 2.10-7 cm2/s. Des études d'interaction entre CXCR4 et un ligand antagoniste, le T22, ont révélé que la protéine s'insère dans la pep-tBLM de manière fonctionnelle et orientée. Le processus de formation de la pep-tBLM a été miniaturisé par microstructuration du support consistant à recouvrir la surface d'or de polystyrène puis à former des micropuits exposant la surface d'or en leur fond. Le peptide P19-4H a été déposé de manière contrôlée dans les micropuits à l'aide d'un robot de dépôt pour former des plots de pep-tBLM intégrant CXCR4. La fonctionnalité de CXCR4 réinsérée dans ces plots de membranes a été attestée par des études d'interaction avec son ligand T22. L'ensemble des étapes de formation, d'optimisation et de miniaturisation des pep-tBLM a été suivi, visualisé et caractérisé en temps réel et sans marquage par la technique d'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi). La technologie « TransMembraChip » développée au cours de cette thèse représente une méthode de choix pour la réincorporation et l'étude fonctionnelle de protéines transmembranaires dans une composition lipidique adaptée. Les protéines transmembranaires, en particulier les RCPG, représentent des cibles thérapeutiques intéressantes. Ainsi, dans le cadre de la recherche de candidats médicaments pour le traitement de pathologies impliquant des protéines transmembranaires, cette nouvelle génération de biopuce à membranes constitue un outil prometteur adapté au criblage de ligands agonistes ou antagonistes de ces protéines / This thesis presents the development of a membrane biochip allowing to functionally reincorporate a transmembrane protein of the G-protein coupled receptor (GPCR) family, CXCR4, in a peptide-tethered bilayer lipid membrane (pep-tBLM), in a miniaturized and parallelized format. The peptide tether used, P19-4H, possesses a cysteine in its N-terminal extremity for covalent grafting onto the gold surface and four Histidine residues in its C-terminal extremity for attachment of proteoliposomes integrating CXCR4 by metal-chelate interaction in the presence of nickel. The synthesis of CXCR4 was carried out by cell-free expression in the form of proteoliposomes, in a suitable lipid composition and in the presence of a chelating lipid, DOGS-NTA, at 2% molar ratio. The AH peptide, a fusogenic peptide, was employed in a last step to fuse the attached proteoliposomes. The thorough characterization of proteoliposomes and the optimization of experimental conditions led to the robust attachment of proteoliposomes with sufficient lipid density to perform their fusion by the AH peptide and the formation of a pep-tBLM integrating CXCR4. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) studies have shown that the pep-tBLM reinserting CXCR4 was fluid, homogeneous and continuous, with a diffusion coefficient of 2 x 10-7 cm2/s. Ligand binding studies between CXCR4 and T22, an antagonist, revealed that the protein was functional and well-oriented in the peptBLM. The formation process of the pep-tBLM was miniaturized by support microstructuration, consisting in covering the gold surface with polystyrene and then, forming microwells exposing the gold surface at their bottom. The P19-4H peptide was spotted in a controlled manner into the microwells to form microspots of pep-tBLM incorporating CXCR4. The functionality of CXCR4 reinserted into these membrane microspots was confirmed by T22 ligand binding studies. All the steps of formation, optimization and miniaturization of the pep-tBLM were monitored, visualized and characterized by surface plasmon resonance imaging (SPRi), a real time and label-free technique for the detection of interactions. The "TransMembraChip" technology developed in this work represents a method of choice for the reincorporation and functional study of transmembrane proteins in a suitable lipid composition. Transmembrane proteins, particularly GPCRs, form interesting therapeutic targets. Thus, in the context of pharmaceutical research of drug candidates for the treatment of pathologies involving transmembrane proteins, this new generation of membrane biochip is a promising tool for screening agonist or antagonist ligands of these proteins

Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité cellulaire (transports d’ions et de nutriments, transduction de signal, interaction cellule-cellule). Afin de les étudier, ces protéines doivent être produites in vitro. La production classique de ces protéines membranaires intégrales dans des microorganismes présente de nombreuses difficultés liées à leur structure complexe mais aussi à des problèmes de toxicité, empêchant la production de nombre d’entre elles. En outre, pour être produites efficacement, ces protéines ont besoin d’un environnement amphiphile. Dans cette thèse, afin de pallier à ces difficultés, nous avons d’une part utilisé un système d’expression protéique acellulaire, non affecté par la physiologie des cellules vivantes. En outre, nous avons choisi de les intégrer dans des bicouches lipidiques planes reconstituées artificiellement. Dans une première partie, nous avons mis au point l’intégration d’une protéine membranaire intégrale formant un pore, l’alpha hémolysine, dans une bicouche lipidique supportée. Certaines protéines nécessitant un espace plus important de part etd’autre de la membrane, nous avons, dans une seconde partie, développé une bicouche lipidique espacée et ancrée par fusion de liposomes sur des surfaces d’or. Nous démontrons qu’il est possible d’y incorporer des protéines membranaires de type Aquaporine Z sous certaines conditions. Dans une troisième partie, dédiée à la formation de membranes biomimétiques utilisant des molécules lipidiques provenant d’Escherichia coli, nous montrons que la modification de la composition membranaire ne semble pas avoir d’incidence sur l’incorporation de protéines. Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des premiers essais d’insertion de protéines membranaires, de type alpha hémolysine, dans des bicouches suspendues afin de montrer que ces protéines produites par le système d’expression acellulaire sont fonctionnelles. / Integral membrane proteins play an essential role in the cell integrity preservation (transport of nutrients and ions, signal transduction, cell-cell interaction). In order to study these proteins, they have to be produced in vitro. Classical production of integral membrane proteins in microorganisms present many difficulties associated with their complex structure and also toxicity problems, preventing production of many of them. Moreover, to be efficiently produced, these proteins require an amphiphilic environment. In order to overcome these difficulties, we used a cell-free protein expression system, unaffected by the physiology ofliving cells. In addition, we chose to integrate them into artificial planar lipid bilayers. In a first part, we have developed the integration of an integral membrane protein forming a pore, the alpha hemolysin, in a supported lipid bilayer. Some proteins require more space on each side of the membrane, therefore in a second part, we have developed a tethered lipid bilayer membrane by liposome fusion on gold surfaces. We demonstrate that it is possible to incorporate membrane protein Aquaporin Z under certain conditions. The third part is dedicated to the formation of biomimetic membranes using lipid molecules from Escherichiacoli, we show that the membrane composition do not affect the protein incorporation. Finally, we have tested alpha hemolysin membrane proteins insertion in suspended lipid bilayers membranes to show that these proteins produced by the cell-free expression system are functional.

La production hétérologue des protéines membranaires reste difficile, peut-être parce que l’insertion dans la membrane de la cellule hôte constitue une étape limitante de la production. Afin de tourner cette difficulté, deux modes de synthèse ont été envisagés: la synthèse de protéines dans un système a-cellulaire, en l’absence de membrane mais en présence de détergent, ou l’adressage forcé de la protéine vers les corps d’inclusion dans le cas d’une expression plus classique en bactérie entière. La réalisation des deux stratégies repose sur l’utilisation de protéines de fusion possédant une séquence d’entraînement en amont du gène d’intérêt, soit qu’elles améliorent la traduction du transcrit en limitant le repliement spatial de ce dernier, soit qu’elles favorisent la production de la protéine d’intérêt en corps d’inclusion. La porine OmpX et le peptide T7 ont été choisis en cas d’expression dans les systèmes bactériens. La protéine SUMO est utilisée pour la production dans un lysat eucaryote. Les différentes approches ont été testées sur la production de la pannexine1 humaine (Px1).Si les séquences d’entraînement OmpX et le peptide T7 sont correctement produites in vitro, aucune des deux, en revanche, ne favorise la production de la Px1. Seul l’entraîneur SUMO est efficace. En effet, nous avons observé que cette protéine augmente la production de la Px1 dans un lysat eucaryote de germe de blé. Par ailleurs OmpX, connue pour être largement produite in vivo dans les corps d’inclusion, n’entraîne pas la localisation de la Px1 dans ces structures. Contre toute attente, l’étiquette T7 dirige la Px1 dans les corps d’inclusion. L’étude électrophysiologique de la Px1 a donc été effectuée à partir de la protéine produite in vivo (T7his-Px1) après renaturation, ou produite sous forme soluble in vitro (his6-Px1) dans le lysat eucaryote. Dans le cas de la protéine T7his-Px1 renaturée, une activité canal qui rappelle celle qui est observée après expression dans l’ovocyte de Xénope, a été détectée en patch-clamp, mais dans trois cas seulement. Dans le cas de la protéine his6-Px1, aucune activité canal n’est clairement détectée. Dans une deuxième partie de ce travail on examine le rôle de la boucle périplasmique dans la sensibilité à la pression du MscL, un canal mécanosensible bactérien devenu un système modèle dans l’étude de la mécanosensibilité. Presque toutes les études fonctionnelles sur ce canal ont été réalisées sur le canal de E.coli, alors que la structure a été obtenue à partir de l’homologue de M. tuberculosis. Une étude fonctionnelle a montré que le MscL de M. tuberculosis est difficile à ouvrir : son ouverture requiert l’application d’une pression double de celle qui est nécessaire chez E.coli. Les deux homologues diffèrent principalement par la longueur de leur unique boucle périplasmique. De manière à examiner le rôle de la boucle, on a comparé l’activité du canal MscL de E.coli, celle du canal de M. tuberculosis et celle d’une protéine chimère constituée de la protéine de M. tuberculosis dans laquelle la boucle a été changée pour celle de la protéine de E.coli. De manière inattendue, nous avons constaté que les canaux de E.coli et de M. tuberculosis ont la même sensibilité à la pression. La protéine chimère n’avait pas d’activité canal. Si ce travail ne permet pas de conclure quant au rôle de la boucle, il montre sans ambigüité que contrairement à ce qui a été rapporté les canaux MscL de E.coli et de M. tuberculosis ne diffèrent pas sensiblement sur le plan fonctionnel / The production of heterologous membrane protein is notoriously difficult; this might be due to the fact that insertion of the protein in the membrane host is a limiting step. To by-pass this difficulty, two modes of synthesis were tested: 1) production in a cell-free system devoid of biological membrane but supplemented with detergent or liposomes, 2) production in bacteria, with targeting of the membrane protein to inclusion bodies. Both strategies were tested for the production of the human pannexin 1 channel (Px1). The gene coding the protein was fused with an “enhancer” sequence resulting in the addition of a peptide or short protein at the N terminus of the protein of interest. This enhancer sequence which is well produced in vitro or in vivo is supposed to facilitate the translation of the protein of interest. Three enhancer sequences were chosen: 1) the small porin OmpX of E. coli, which, in addition, should target the protein to inclusion bodies when the protein is expressed in bacteria 2) a peptide of phage T7 for expression in E.coli lysate or E.coli cells 3) the small protein SUMO for production in a wheat germ cell-free system. In a bacterial cell-free system, neither OmpX nor T7 promoted Px1 production. Px1 is only produced when the SUMO enhancer sequence is used in the wheat germ system. In bacteria, OmpX, known to form inclusions bodies did not promote the targeting of the fusion protein to inclusion bodies. Unexpectedly, the peptide T7 was able to do it.Px1 obtained from inclusion bodies (T7his-Px1) was renatured and reconstituted in liposomes. Similarly his6-Px1 produced in wheat germ system was reconstituted in liposomes. Both preparations were used for electrophysiological studies (patch-clamp and planar bilayers). With the refolded T7his-Px1, channel activity reminiscent of that observed with Px1 expressed in Xenope oocyte (Bao et al., 2004) could be detected, but only in three cases. In the case of his6-Px1, no clear channel activity could be observed. The second part of this work deals with the involvement of the periplasmic loop of the bacterial mechanosensitive channel MscL in its sensitivity to pressure. Mscl has become a model system for the investigation of mechanosensisity. Nearly all functional studies have been performed on MscL from E.coli while the structure of the protein has been obtained from the Mycobacterium tuberculosis homologue. In one functional study it was shown that MscL from M. tuberculosis is extremely difficult to open, gating at twice the pressure needed for E.coli MscL The periplasmic loop is the most variable sequence between the two homologues, being longer in E.coli than in M. tuberculosis. In order to assess the role of the periplamic loop in the sensitivity to pressure, we compared the activity of the E.coli and M. tuberculosis MscL and of a chimeric protein made of the M. tuberculosis protein in which the periplasmic loop has been exchanged for that of the E. coli channel. Unexpectedly, M. tuberculosis and E .coli MscL were observed to gate at a similar applied pressure. The chimeric protein had no functional activity. In conclusion, this study does not allow any conclusion as to the role of the loop in the sensitivity to pressure, but it shows clearly that, in contrast to the results of a previous study, there is no functional difference between E. coli and M. tuberculosis MscL.

Alors que 30% du génome code pour des protéines membranaires, moins de 3% des structures protéiques dans la Protein Data Bank correspondent à ces protéines. En raison de leur nature hydrophobe, les protéines membranaires sont en effet très difficiles à produire dans des systèmes d'expression classique en cellules, notamment en bactéries. L'étude structurale des protéines membranaires du virus de l'hépatite C (VHC) sous forme entière et native a donc été pendant longtemps entravée. Le VHC est un virus à ARN positif dont le complexe de réplication est basé sur un réarrangement spécifique des membranes induit par l'action concertée de plusieurs protéines non structurales du virus dont NS2, NS4B et NS5A. La structure tridimensionnelle et le rôle de ces protéines dans la réplication virale sont encore mal connus. Pour surmonter les limitations qui empêchent leurs études structurales et fonctionnelles, un système d'expression acellulaire à base d'extrait de germe de blé a été développé avec succès, permettant la production des protéines NS2, NS4B et NS5A entières directement sous une forme solubilisée en présence de détergent. Ces protéines membranaires sont produites et purifiées par chromatographie d'affinité dans des quantités de l'ordre du milligramme. Des analyses par filtration sur gel indiquent que les échantillons obtenus sont homogènes. De plus, des analyses structurales par dichroïsme circulaire montrent que les protéines produites dans ce système sont bien repliées. Leur reconstitution dans des lipides est en cours d'optimisation. Le but ultime est en effet de déterminer leur structure par RMN du solide dans un environnement lipidique mimant l'environnement natif / While 30% of the genome encodes for membrane proteins, less than 3% of protein structures in the Protein Data Bank correspond to such proteins. Due to their hydrophobic nature, membrane proteins are indeed notoriously difficult to express in classical cell-based protein expression systems. The structural study of the membrane proteins of hepatitis C virus (HCV) in their full-length and native form has therefore been for long time hampered. HCV is a positive-strand RNA virus building its replication complex on a specific membrane rearrangement (membranous web), which serves as a scaffold for the HCV replicase, and is induced by the concerted action of several HCV non-structural proteins including NS2, NS4B and NSSA. The knowledge of the three- dimensional structure of these proteins and their role in virus replication is still limited. To overcome the limitations that prevent the structural and functional studies of these proteins, a wheat germ cell-free protein expression system has been developed. A production protocol was designed which allows us to directly obtain membrane proteins in a soluble form by adding detergent during the in vitro protein synthesis. A large number of mainly viral proteins were successfully expressed, and full protocols were developed for the full-length NS2, NS4B and NSSA proteins. These membrane proteins were produced and purified by affinity chromatography using a Strep-tag II in the milligram range. These protein samples are homogenous, as shown by gel filtration analysis. Moreover, structural analyses by circular dichroism showed that the proteins produced in the wheat germ cell-free system are well folded. Reconstitution of these proteins in lipids is currently under optimization. The ultimate goal is to determine their structure by solid-state NMR in a native-like membrane lipids environment