Introduction. While opioid medications are commonly prescribed for management of neuropathic pain (NP), long-term use has been associated with increased risk for overdose, drug interactions and addiction. New strategies are necessary to better manage chronic pain, thereby reducing need for opioid medications and their associated adverse consequences. N-acetyl-L-cysteine (NAC), an over-the-counter supplement, has shown promise in the treatment of psychiatric and addictive disorders. In addition, NAC has shown promise for reducing physiological signs of NP in laboratory rat models, prompting this study. Purpose. The present study was an open-label clinical trial of NAC as an adjuvant to opioid treatment for poorly controlled, chronic NP. It examined whether 1200 mg NAC twice daily for 4 weeks was associated with: lower ratings of patient-reported pain; reductions in PRN opioid medication for breakthrough pain; and improvements in physical and mental health quality of life (QoL). The study also examined whether appraisal of pain impacts response to medication. Method. Participants were N=28 chronic NP patients who consented to study participation. This consisted of 2 baseline assessments, 4 weeks of NAC and 1 post-trial follow-up visit. The majority (N=17) dropped out or were excluded during baseline. Of the remaining participants, N = 11 started the study medication and N=10 completed the study, with daily recordings of pain severity ratings and use of PRN opioid medication. Small sample size limited analyses to qualitative case reviews and effect sizes. Results. Over 90% of participants receiving NAC completed the study. Case review found varied results. While 4 of 10 participants showed decrease in average pain ratings during NAC, estimated effect sizes for the whole sample were small, bordering on negligible (ω² from .003 to .027) as were those for PRN opioids (Partial Eta-Squared=.0003). Effect size for mental health QoL was medium (Cohen's d=.421). Conclusions. With N=10, findings must be interpreted with caution. Nonetheless, the study found some albeit small evidence supporting NAC for improving mental health QoL and pain ratings. Several participants reported improvements in pain and mental health domains while taking NAC. NAC was well tolerated with minimal side effects. Lessons from this study will inform design and implementation of future NAC studies.

Doctor of Philosophy / Department of Agronomy / Tesfaye T. Tesso / The lack of effective post-emergence weed control options is often highlighted as one of the major factors behind dwindling acreage under sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) in the United States. The discovery of herbicide resistance sources in wild sorghum population and subsequent efforts to incorporate them into cultivated sorghum was received with much optimism to change weed management practices in sorghum. As the development of the technology advances, especially of the Acetolactate synthase (ALS) resistance, concerns over the temporary interveinal chlorosis and reduced seedling vigor in some of the resistant families became heightened. This thesis research is designed to shed light on the genetic basis of seedling chlorosis and assess its impacts on yield potential. The study has three parts; the first part is focused on identifying the genetic causes and plant mechanisms associated with the chlorotic phenotype. ALS herbicide resistant sister-lines expressing normal and chlorotic phenotypes were analyzed via RNA sequencing at four time points during seedling growth. The study identified several variants of genes coding chloroplast precursors and those that cause epigenetic modifications. Once confirmed, genetic markers can be developed to track these gene variants in the breeding population and eliminate segregates genetically prone to chlorosis/yellowing. The second part of the study focuses on assessing the effect of ALS resistance associated chlorosis on agronomic and nutritional parameters of sorghum inbred lines. A set of ALS resistant lines expressing different levels of the chlorotic phenotype were evaluated in replicated field trials and laboratory methods. Results showed that interveinal chlorosis delays flowering but does not have negative effect on yield and nutritional parameters with and without herbicide treatment. The last part addresses whether there is any yield drag that may be associated with herbicide resistance traits and foliar interveinal chlorosis. For this, we synthesized a large set (182) of hybrids from ALS resistant, ACCase resistant and regular (susceptible) seed and pollinator parents. The hybrids were then evaluated in three sets at multiple locations during the 2014 and 2015 crop seasons along with commercial checks. The results revealed that resistance to both herbicides do not cause any drag to grain yield. The traits also do not have any negative impact on grain and nutritional quality of resistant hybrids.

A parede celular das plantas inclui componentes polissacarídeos complexos, e a sacarificação destes polímeros necessita da ação de conjuntos de enzimas que atuem em sinergia. Enzimas podem formar complexos multi-enzimáticos que possuem mais de uma atividade catalítica derivada de domínios distintos de uma mesma cadeia polipeptídica. O objetivo deste trabalho foi construir uma enzima bifuncional com os domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) para desconstrução de material lignocelulósico de cana-de-açúcar. Para isso, dois diferentes domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) oriundos de Clostridium thermocellum foram fundidas para criar a quimera feruloil esterase/acetil-xilano esterase (FaeAxe). O desenho racional da quimera foi feito utilizando-se de métodos computacionais, que permitiram a criação de um modelo estrutural da enzima. A construção da quimera foi feita por overlap PCR, clonada em vetor pET-SUMO e expressa em Escherichia coli. As duas enzimas parentais (Fae e Axe) foram clonadas em vetor pET28 e expressas em E. coli. Durante a etapa de expressão, observou-se que todas as enzimas foram expressas na forma solúvel. As enzimas feruloil esterase e acetilxilano esterase têm como substrato o polímero arabinoxilano, cuja degradação é uma etapa chave na sacarificação de biomassa. Dessa forma, as atividades da quimera, bem como das enzimas parentais foram testadas contra polímeros arabinoxilano de trigo e arabinoxilano de cana-de-açúcar após a hidrólise pela endoxilanase GH11 de Bacillus Subtilis e analisadas por meio de espectrometria de massas. A atividade desacetilase da enzima parental acetil-xilano esterase e da quimera FaeAxe foram confirmadas, evidenciando que a quimera preservou essa atividade catalítica. A atividade da enzima feruloil esterase e da quimera FaeAxe na remoção de ácido ferúlico dos oligossacarídeos gerados pela endoxilanase GH11 não foi observada / The plant cell wall is comprised of a matrix of polysaccharides and saccharification of these polymers requires the joint action of diverse enzymes. Enzymes may form multi-enzymatic complexes that have more than one catalytic activity derived from different domains of a single polypeptide chain. The aim of this work was to construct a bifunctional enzyme with two catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) for degradation of sugar cane lignocellulosic material. The two different catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) from Clostridium thermocellum were fused to generate a bifunctional chimera feruloyl esterase/acetylxylan esterase (FaeAxe). A molecular model was created by rational design using a 3D-structure guided strategy. The fusion was created using overlap PCR, and the resulting product was cloned into the pETSUMO vector. The chimeric protein and the parental enzymes were expressed in Escherichia coli and purified and the enzymes were expressed in soluble form. Xylanases, feruloyl esterases and acetylxylan esterases degrade arabinoxylan polymers and their activity is a key step in the saccharification of biomass. The catalytic properties of the chimera and of the parental enzymes were tested against wheat and sugarcane arabinoxylan polymers after hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis and analyzed by mass spectroscopy. The deacetylase activity of acetyl-xylan esterase parental enzyme and FaeAxe chimera were confirmed, showing that the chimera kept the deacetylase activity. After hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis the feruloyl esterase and FaeAxe chimera activities on ferulic acid removal were not observed

O dimetilaminoetanol (DMAE) e o acetil hexapeptídeo-3 (AHP) vêm sendo utilizados em formulações dermocosméticas com finalidade antienvelhecimento. No entanto, há poucos trabalhos na literatura referentes aos efeitos dessas substâncias ativas no tecido cutâneo. Assim, o presente estudo tem por objetivos o desenvolvimento, a avaliação da estabilidade física, da segurança e da eficácia clínica de formulações dermocosméticas contendo DMAE e/ou AHP. Para tal, foram preparadas quatro formulações à base de ceras auto-emulsionantes compostas por álcool batílico e lecitina de soja ou ésteres de polietilenoglicol, estabilizadas por polímeros hidrofílicos (hidroxietilcelulose ou polímero de acrilato). Estas formulações foram acrescidas ou não (veículo) de 10% de uma solução a 0,05% de AHP e/ou de 9% de DMAE acetamidobenzoato e submetidas a testes preliminares de estabilidade. A seguir, foram realizados estudos de estabilidade por determinação do comportamento reológico, bem como uma análise sensorial. A formulação composta de ésteres de polietilenoglicol e polímero de acrilato (F4) apresentou melhor estabilidade e melhor sensorial e, assim, foi utilizada como veículo nos testes clínicos. Nesses testes avaliou-se a compatibilidade cutânea após uma única aplicação do produto na região das costas das voluntárias e a eficácia a curto (efeitos imediatos) e a longo prazo. Para a avaliação dos efeitos imediatos, analisou-se a hidratação, as propriedades viscoelásticas e o micro-relevo da pele da região ventral dos antebraços, após 2 horas da aplicação das formulações: veículo (F4) , veículo + DMAE (F4D), veículo + AHP (F4A) e veículo + DMAE + AHP (F4AD). Para analisar os efeitos a longo prazo, as voluntárias aplicaram as formulações diariamente nos antebraços e na face sendo que, após 2 e 4 semanas de tratamento, foram realizadas medidas dos parâmetros acima mencionados e das propriedades mecânicas da pele por determinação de suas características anisotrópicas. Os resultados obtidos no estudo clínico mostraram que todas as formulações estudadas apresentaram compatibilidade cutânea muito boa além de efeitos imediatos aumentando o conteúdo aquoso do estrato córneo. Por outro lado, observou-se que apenas as formulações que continham as substâncias ativas provocaram uma diminuição significativa da perda transepidérmica de água (TEWL), ou seja, mostraram efeito na melhoria da função barreira da pele. A longo prazo, observou-se que todas as formulações provocaram aumento do conteúdo aquoso do estrato córneo na face, o que não ocorreu para o antebraço. No entanto, somente as formulações que continham AHP reduziram a anisotropia da pele da face, ou seja, com o uso de tais formulações ocorreu uma melhora significativa das propriedades mecânicas da pele. Em síntese, de acordo com os dados obtidos, pode-se concluir que as formulações desenvolvidas apresentaram-se estáveis, seguras e eficazes, uma vez que não sofreram alterações em suas propriedades físico-químicas e não causaram irritação na pele. Além disso, as formulações que continham AHP ou DMAE apresentaram efeitos imediatos na diminuição da TEWL e as formulações acrescidas de AHP reduziram a anisotropia da pele após 4 semanas de aplicação, melhorando significativamente o tônus e a firmeza da pele. Assim, o AHP pode ser considerado uma substância eficaz para aplicação em formulações dermocosméticas com finalidade antienvelhecimento. / Dimethylaminoethanol (DMAE) and acetyl hexapeptide-3 (AHP) have been used in dermocosmetic formulations for anti-aging purposes. However, few scientific papers are concerned about the effects of these active substances on cutaneous tissue. Thus, the aim of the present study is the development, evaluation of physical stability, safety and clinical efficacy of dermocosmetic formulations containing DMAE and/or AHP. Four formulations based on self emulsifying wax containing batyl alcohol and lecithin or polyethyleneglycol ester, stabilized by hydrophilic polymers (hydroxyethylcellulose or acrylate polymer) were prepared as vehicles. They were supplemented or not with acetyl hexapeptide-3 solution (0.05%) and DMAE acetamidobenzoate to final concentrations of 10% and 9%, respectively, and submitted to preliminary stability tests, followed by the determination of rheological behavior, as well as, sensorial analysis. The formulation containing polyethyleneglycol ester and acrylate polymer (F4), chosen as vehicle for the clinical trials, showed the best stability and sensorial. In these trials, skin compatibility was evaluated after a single product application on the backs of volunteers, as well as, the short (immediate effects) and long term efficacy. To evaluate the immediate effects, skin hydration, viscoelastic properties and skin microrelief were tested in the ventral forearm region, 2 hours after application of the formulations: vehicle (F4), vehicle + DMAE (F4D), vehicle + AHP (F4A) and vehicle + DMAE + AHP (F4AD). Long term effects of the same formulations were evaluated in volunteers by daily applications on the forearm and face. After 2 and 4 weeks of treatment, the same parameters were measured in addition to the determination of skin mechanical properties by its anisotropic characteristics. The results obtained in the clinical study showed that all formulations tested had a very good skin compatibility besides an immediate effect of increasing the stratum corneum water content. On the other hand, only formulations containing the active substances produced a significant decrease in transepidermal water loss (TEWL), in other words, these formulations improved the skin barrier function. Long term studies demonstrated that all formulations promoted an enhancement of the stratum corneum water content when applied on the face but not in the forearm. However, only formulations containing AHP reduced skin anisotropy in the face, ie, there was a significant improvement of the skin mechanical properties due to the use of these formulations. In summary, according to the results obtained, it can be concluded that the developed formulations were stable, safe and effective, since they did not present alterations in their physicochemical properties and did not cause skin irritation. Moreover, the formulations containing AHP or DMAE presented immediate effects by reducing the TEWL and the ones supplemented with AHP reduced the skin anisotropy after 4 weeks of application, significantly improving the skin tone and firmness. Thus, it is suggested that AHP may be considered an effective substance to be used in cosmetic formulations with anti-aging purposes.

Déficits cognitivos são frequentes em pacientes com esclerose múltipla (EM), especialmente a memória de longo prazo. Por outro lado, estudos de imagem por ressonância magnética têm correlacionado atrofia do hipocampo aos déficits mnésicos destes pacientes. Considerando-se a atrofia um marcador de dano neuronal tardio, justifica-se a investigação da fisiopatologia do dano hipocampal nas fases inicias da doença. Objetivo: Descrever os achados volumétricos e neuroquímicos da formação hipocampal de pacientes com EM recorrente-remitente (EMRR) em suas fases iniciais, comparando-os ao de um grupo de indivíduos saudáveis, e avaliar suas relações com a memória de longo prazo. Material e Métodos: Vinte e nove pacientes (19 mulheres, idade média 31 anos ± 8,7) com EMRR e um grupo controle composto por 26 indivíduos saudáveis (19 mulheres, idade média 30,7 anos ± 8,4) realizaram a 1H-ERM em magneto 3,0T. Foi utilizada técnica single-voxel e sequência PRESS com TR = 1500 ms, TE = 135 ms e dimensões fixas do voxel (6 cm3) localizado ao longo do hipocampo esquerdo para avaliação do N-acetil-aspartato (NAA), Colina (Cho) e Creatina (Cr), sendo a análise feita com o software LC Model. A avaliação volumétrica do encéfalo e da formação hipocampal foi realizada por meio do software FreeSurfer. Os indivíduos foram avaliados cognitivamente tendo sido criado um escore de memória verbal que avalia a evocação tardia (EMV-T), empregando-se a etapa de evocação tardia do Hopkins Verbal Learning Test-Revised e o Teste da Memória Lógica-II. Resultados: Observou-se atrofia em ambos os hipocampos dos pacientes com EM. Além disso, pacientes apresentaram menores níveis de NAA quando comparados aos do grupo de controles (F(1,51) = 4,089; p = 0,048), tendo sido observada correlação positiva entre NAA e o volume da formação hipocampal no grupo de pacientes (r = 0,372; p = 0,047). Por fim, pacientes apresentaram correlação negativa significante entre EMV-T e NAA (r = -0,408; p = 0,031), Cho (r = -0,509; p = 0,006) e Cr (r = -0,402; p = 0,034), enquanto que, nos controles, apenas foi observada leve tendência de correlação na direção oposta. Conclusões: Nossos resultados indicam, nas fases inicias da EM, atrofia e redução dos níveis de NAA na formação hipocampal, secundário à disfunção e/ou perda neuronal. O fato dos pacientes apresentarem relação entre metabólitos hipocampais e memória oposta ao que é esperado, para indivíduos saudáveis, está de acordo com a hipótese da presença de mecanismos compensatórios na função cognitiva de pacientes com EM / Cognitive deficits are common in patients with multiple sclerosis (MS), especially long-term memory. Moreover, magnetic resonance imaging studies have correlated hippocampal atrophy with mnemonic deficits in these patients. Considering atrophy a late marker of neuronal damage, investigation of the pathophysiology of hippocampal damage in the early stages of the disease is justified. Objective: Describe the volumetric and neurochemical findings of the hippocampal formation of early relapsing-remitting MS patients (RRMS), comparing it to a group of healthy subjects, and assess its relationships with long-term memory. Material and Methods: Twenty-nine patients (19 women, mean age 31 years ± 8,7) with RRMS and a control group of 26 healthy individuals (19 women, mean age 30,7 anos ± 8,4) underwent 1H-MRS in 3,0T scanner. Single-voxel PRESS sequence with repetition time of 1500 msec, echo time of 135 msec and fixed dimensions of the voxel (6 cm3) was located along the left hippocampus. Data were processed with LC Model software and the concentration of N-acetyl-aspartate (NAA), Choline (Cho) and Creatine (Cr) was calculated. Brain and hippocampal formation volumes were quantified using FreeSurfer software. Subjects were assessed cognitively and a verbal memory score assessing delayed recall (EMV-T) was developed, using Hopkins Verbal Learning Test-Revised delayed recall and Logical Memory-II test. Results: Atrophy was observed in both hippocampi of MS patients. In addition, MS patients had lower NAA levels compared to the control group (F (1,51) = 4,089, p = 0,048), and positive correlation between NAA and hippocampal formation volume was observed in patient group (r = 0.372, p = 0.047). Finally, patients showed a significant negative correlation between EMV-T and NAA (r = -0.408, p = 0.031), Cho (r = -0.509, p = 0.006) and Cr (r = -0.402, p = 0.034), while only a weak tendency to an association in the opposite direction was observed in the control group. Conclusion: Our results indicate, in early MS, atrophy and reduced levels of NAA in the hippocampal formation, secondary to neuronal loss and/or dysfunction. The fact that the observed relationship between hippocampal metabolites and memory was in the opposite direction as what it is expected for healthy subjects supports the hypothesis that compensatory mechanisms are present in cognitive function of MS patients

Peroxinitrito é um potente agente oxidante, nitrante e nucleofilico formado in vivo pela reação difusional do radical ânion superóxido com óxido nítrico, cuja produção exacerbada em situações de estresse oxidativo e nitrosativo pode resultar em danos a biomoléculas e estruturas sub-celulares. Por outro lado, vários compostos carbonílicos reativos tais como acroleína e compostos α-dicarbonílicos são descritos como citotóxicos e genotóxicos, pois reagem com biomoléculas aminadas resultando em perda de funções nativas, situação esta denominada de \"estresse carbonílico\". Dentre os metabólitos α-dicarbonílicos, altamente suscetíveis a adições nucleofílicas, destacam-se o biacetilo, derivado do metabolismo hepático de etanol e contaminante de alimentos, e metilglioxal e glioxal, ambos catabólitos de glicose, proteínas e lipídios acumulados em doenças relacionadas ao envelhecimento. Neste trabalho, observou-se que, em tampão fosfato normalmente aerado de pH próximo à neutralidade, (i) estes três compostos sofrem adição nucleofílica de peroxinitrito com constantes de velocidade de segunda ordem uma a três ordens de grandeza acima dos valores relatados para compostos monocarbonílicos (k2 ≈ 4-100 M-1s-1); (ii) os sistemas biacetilo ou metilglioxal/peroxinitrito consomem o oxigênio dissolvido com produção de acetato ou acetato e formiato, respectivamente, via radical acetila capaz de acetilar histidina, lisina e 2\'-desoxiguanosina se adicionados à mistura reacional; e (iii) o sistema glioxal/peroxinitrito gera sucessivamente radical formila e radical formilhidroperoxila, cujo desproporcionamento a formiato e gás carbônico é acompanhado da emissão de luz no infra-vermelho próximo (λmax = 1270 nm), atribuída a oxigênio molecular no estado singlete (O21Δg) (Reação de Russell). Estes estudos evidenciam que a reação de metabólitos α-dicarbonílicos com peroxinitrito gera radicais livres e embasam a hipótese de que possam contribuir para a acetilação radicalar, não-enzimática intracelular, de proteínas (epigenética) e DNA, portanto potencialmente implicadas na fisiologia e patologia do envelhecimento e desordens metabólicas, nas quais a participação de espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e compostos carbonílicos foi relatada. Deve-se ainda notar que a descoberta de acetilação radicalar de biomoléculas por metabólitos α-dicarbonilicos e peroxinitrito prepara o caminho para a identificação de novas reações químicas de biomoléculas, não catalisadas por enzimas, que possam eventualmente revelar novos biomarcadores teciduais em doenças adquiridas e inatas. / Peroxynitrite is a strong biological oxidant, nitrating and nucleophilic agent, formed by the diffusion-controlled reaction of the superoxide anion radical with nitric oxide, whose exacerbated production in oxidative and nitrosative stress leads to chemical damage to biomolecules and sub-cellular structures. On the other hand, various reactive carbonyl compounds like acrolein and α-dicarbonyls are reportedly cytotoxic and genotoxic for their ability to react with amino biomolecules resulting in loss of native functions, a situation named \"carbonyl stress\". Among very reactive α-dicarbonyls highly prone to nucleophilic additions, we highlight biacetyl, a hepatic alcohol metabolite and food contaminant, and methylglyoxal and glyoxal, both catabolites of glucose, proteins and lipids that accumulate in ageing-related disorders. Here, we report that, in normally aerated phosphate buffer near the physiological pH, (i) these three dicarbonyls undergo nucleophilic addition of peroxynitrite whose second order rate constants are one to three orders of magnitude than those documented for monocarbonyls (k2 ≈ 4-100 M-1s-1); (ii) the biacetyl or methylglyoxal/peroxynitrite systems consume the dissolved oxygen yielding the acetate anion or acetate plus formate anion, respectively, from acetyl radical intermediate which was found to acetylate added histidine, lysine and 2\'-deoxyguanosine; and (iii) the glyoxal/peroxynitrite system ultimately generate formyl radical and formylperoxyl radical, whose dismutation to formate and carbonic oxide is accompanied by near infrared monomol emission (λmax = 1270 nm) characteristic of singlet molecular oxygen (O21Δg) (Russell reaction). Our studies strongly attest that the reaction of α-dicarbonyls with peroxynitrite release free radicals that can potentially contribute for the radical, non-enzymatic acetylation of proteins (epigenetics) and DNA bases possibly implicated in the ageing physiopathology and metabolic disorders, where participation of reactive oxygen, nitrogen and carbonyl species is well recognized. Also noteworthy is that our findings may pave the way to the discovery of novel biochemical reactions whose products can eventually be useful as biomarkers of acquired and innate maladies.

Diversos são os fatores que estão envolvidos no controle da maturação oocitária e na qualidade e competência do oócito. A melatonina (MEL) é um hormônio que apresenta diversas funções, como atividade antioxidante e antiapoptótica, além de influenciar diferentes vias de sinalização celular. Ainda há poucos estudos sobre o papel da MEL na maturação de oócitos e o camundongo, por sua rápida reprodução e menor custo de manutenção, é um excelente modelo amplamente utilizado para estudos in vitro e, particularmente in vivo. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da MEL sobre a maturação in vivo e in vitro e sua possível ação como protetor celular (antioxidante e/ou antiapoptótico) de complexos cumulus-oócitos (CCOs) murinos. No experimento 1, os animais receberam injeções de MEL nas concentrações de 0 (controle), 10 e 20 mg/kg/i.p./dia por 4 dias. Os CCOs foram maturados in vivo e recuperados 17 horas após a última injeção. No experimento 2, os animais receberam MEL nas mesmas dosagens do experimento anterior, porém por 3 dias. Os CCOs foram coletados 24 horas após a última injeção e maturados in vitro com hormônio folículo estimulante (0,5 µg/mL; FSH). No experimento 3, os CCOs foram maturados in vitro na presença de três diferentes doses de MEL (10-9, 10-6 e 10-3 M) ou em FSH (controle FSH). Por fim, no experimento 4, a melhor concentração de MEL (10-9 M) eleita no experimento 3, foi utilizada sozinha ou em associação com peróxido de hidrogênio (300µM; H2O2). Os CCOs foram maturados como no experimento anterior. Para os quatro experimentos foram avaliados a taxa de maturação mediante a extrusão do primeiro corpúsculo polar (1º CP) e a expressão de genes relacionados à apoptose (Bax e Bcl2l1) e enzimas antioxidantes (Gpx1, Sod1 e Sod2) por qPCR-RT tanto para as células do cumulus (CC), quanto para os oócitos (OO). No experimento 1, o tratamento com 20 mg/kg de MEL apresentou maior taxa de maturação in vivo de 80,3%, seguido do controle (69,4%) e 10 mg/kg de melatonina (62,4%; P>0,05). Para a expressão gênica não houve efeito de nenhum tratamento (P>0,05). No experimento 2, a taxa de maturação variou de 39 a 53,2% entre os tratamentos (P>0,05). Em CC, a expressão gênica foi diminuída de Bcl2l1 e aumentada de Gpx1 tratados com 20 mg/kg de MEL (P<0,05). Já para OO, somente houve aumento da expressão de Gpx1 para ambos os tratamentos com MEL (P<0,05). No experimento 3, a taxa de maturação foi de 48,9%, 53,7%, 56% e 57,3% para 10-3, 10-6, 10-9 M de MEL e FSH, respectivamente (P>0,05). As concentrações de 10-9 e 10-6 M de MEL aumentaram a expressão dos genes Gpx1 e Sod1 em CC (P<0,05). Em OO, somente houve aumento da expressão gênica de Bax na concentração de 10-6 M de MEL (P<0,05). No último experimento, não houve diferença significativa quanto à taxa de maturação, variando de 51,8% para o tratamento com H2O2 a 60% para o controle FSH (P>0,05). Em CC, Gpx1 e Sod1 tiveram suas expressões aumentadas em todos os tratamentos (P<0,05). De maneira contrária, o gene Bcl2l1 teve sua expressão diminuída (P<0,05). Com base nestes dados, conclui-se que a MEL aplicada in vivo não foi capaz de melhorar a taxa de maturação in vivo e in vitro, porém, em condições in vitro induziu a progressão da meiose em oócitos murinos. Além disso, em condições in vitro, genes antioxidantes como Gpx1 e Sod1 foram mais expressos em CC do que em OO em resposta ao tratamento com MEL, indicando a indução de um possível efeito protetor frente à condições de cultivo in vitro. / Many factors are involved in the control of oocyte maturation and developmental competence. Melatonin (MEL) is a hormone showing varied functions including antioxidant and antiapoptotic activities, besides influencing many cell signaling pathways. There are few studies on the role of MEL in oocyte maturation and the mouse, due to its quick reproduction and lower maintencance cost, is an interesting model widely used for in vitro and particularly in vivo studies. The aim of this work was to study the effects of MEL on in vivo and in vitro maturation and its cytoprotective action (antioxidant/antiapoptotic) in murine cumulus-oocyte complexes (CCOs). In experiment one, mice received MEL injections at concentrations of 0 (control), 10 and 20 mg/kg/i.p./day for 4 days. CCOs were in vivo matured and recovered 17 hours after the last injection. In experiment 2, the animals received MEL in the same dosages of the previous experiment, but for 3 days. CCOs were collected 24 hours after the last injection and in vitro matured with follicle stimulating hormone (FSH). In experiment 3, CCOs were in vitro matured with three MEL concentrations (10-9, 10-6 e 10-3 M) or FSH (FSH control). Finally, in the fourth experiment, the best concentration of MEL (10-9 M) selected in experiment 3 was used alone or in association with hydrogen peroxide (300 µM; H2O2). CCOs were matured as in the previous experiment. For all four experiments maturation rates were evaluated by extrusion of the first polar body and the expression of genes related to apoptosis (Bax and Bcl2l1) and antioxidant enzymes (Gpx1, Sod1 and Sod2) by qPCR-RT both cumulus cells (CC), and for the oocytes (OO) were assessed as well. In experiment 1, treatment with 20 mg/kg MEL showed a higher rate of in vivo maturation of 80.3%, followed by the control (69.4%) and 10 mg/kg MEL (62.4%; P>0.05). No effect for gene expression treatments (P>0.05) was observed. In experiment 2, maturation rate ranged from 39 to 53.2% between treatments (P>0.05). In CC, the gene expression was reduced for Bcl2l1 and enhanced for Gpx1 in animals treated with 20 mg/kg MEL (P<0.05). For OO, only Gpx1 expression was increased for both MEL treatments (P<0.05). In experiment 3, the maturation rates were 48.9, 53.7, 56 e 57.3% for MEL 10-3, 10-6, 10-9 M and FSH, respectively (P>0.05). MEL concentrations of 10-6 and 10-9 M increased expression of Gpx1 and Sod1 genes in CC (P<0.05). For OO, only Bax increased the gene expression in 10-6 M MEL concentration (P<0.05). In the last experiment, there was no significant difference in maturation rate, ranging from 51.8 for H2O2 to 60% for FSH control (P>0.05). Gpx1 and Sod1 genes had their expression increased in all the treatments in CC (P<0.05). For Bcl2l1 gene, the expression was decreased in CC as well (P<0.05). Based on these data, we conclude that MEL treatment in vivo was unable to promote maturation rate in vivo and in vitro, but under in vitro conditions it induced meiosis progression in murine oocytes. In addition, Gpx1 and Sod1 antioxidant genes were more expressed in CC than OO in response to MEL treatments in vitro indicating induction of a possible protective effect against in vitro culture conditions.

Técnicas analíticas empregadas para a quantificação do teor de lignina em plantas forrageiras, atualmente em uso, são questionáveis quanto às suas acurácias. O método lignina detergente ácido (LDA), que é um dos métodos mais utilizado em Ciência Animal e Agronomia, apresenta algumas falhas, particularmente devido à parcial solubilização da lignina durante a preparação da fibra em detergente ácido (FDA). A lignina Klason (LK), outro método muito usado, apresenta o inconveniente de mensurar a proteína da parede celular como sendo lignina. Em ambos os procedimentos recomenda-se também mensurar cinzas nos resíduos de lignina. A quantificação da concentração de lignina pelo método espectrofotométrico lignina brometo de acetila (LBA) vem ganhando interesse de pesquisadores no Brasil e no exterior. Nesta metodologia, a lignina da planta contida na preparação parede celular (PC) é solubilizada numa solução a 25% de brometo de acetila em ácido acético e a absorbância mensurada é com luz UV a 280 nm. O valor da absorbância é inserido numa equação de regressão e a concentração de lignina é obtida. Para que esta técnica analítica seja mais aceita pelos pesquisadores, ela deve ser, obviamente, convincente e atrativa. O presente trabalho analisou alguns parâmetros relacionados à LBA em 7 gramíneas e 6 leguminosas, em dois estádios de maturidade. Dentre as diferentes temperaturas de pré-secagem, os resultados indicaram que os procedimentos de 55°C com ventilação e liofilização podem ser utilizados com a mesma eficácia. As temperaturas de 55°C sem ventilação e 80°C sem ventilação não são recomendadas, pois aumentaram os valores de FDA e LDA, possivelmente devido ao surgimento de artefatos de técnica como os compostos de Maillard. No método LBA os valores menores das amostras de leguminosas chamaram a atenção e colocaram em questão se a lignina destas plantas seria menos solúvel no reagente brometo de acetila. Dentre algumas alterações na metodologia da técnica LBA, a utilização do moinho de bolas (para diminuir o tamanho particular) nas amostras de PC não mostrou efeito; a hipótese era melhorar a solubilização da lignina usando partículas menores. O uso de um ultrasonicador, que aumenta a vibração das moléculas e assim, facilitaria a solubilização da lignina no reagente brometo de acetila, melhorou a solubilização da lignina em cerca de 10%, tanto nas gramíneas como nas leguminosas. Foi acoplado um ensaio biológico como referência, a degradabilidade in vitro da matéria seca (DIVMS); e como a lignina está intimamente associada à estrutura fibrosa da parede celular, também foi feito um ensaio de degradabilidade in vitro da fibra em detergente neutro (DIVFDN). Os resultados confirmaram o efeito da maturidade, reduzindo a degradabilidade nas plantas mais maduras, e que o teor de lignina de leguminosas é realmente inferior ao de gramíneas. Os resultados de degradabilidade apresentaram coeficientes de correlação mais elevados com o método LBA, quando foi empregada a técnica do ultrasom; o método LK mostrou os menores coeficientes. Também testou-se, com sucesso, a utilização da FDN, como preparação fibrosa, ao invés de PC. A razão é simples: enquanto que a FDN é amplamente conhecida, a preparação PC não o é. Inquestionável que esta manobra facilitará substancialmente a divulgação desse método, tornando-a mais aceitável pela comunidade científica / Analytical techniques employed to quantify lignin content in forages, currently in use, are questionable as to their accuracies. The method acid detergent lignin (ADL), which is one of the most used method in Animal Science and Agronomy, has some flaws, due to the partial lignin solubilization during the preparation of acid detergent fiber (ADF). The Klason lignin method (KL), another analytical procedure commonly used, has the drawback of measuring the cell wall protein as lignin. In both procedures also are recommended to measure ash content in the lignin residues. Quantification of lignin concentration by the spectrophotometric acetyl bromide lignin method (ABL) has been gaining interest from researchers in Brazil and abroad. In this methodology, the lignin contained in the plant cell wall preparation (CW) is solubilized in a 25% acetyl bromide in acetic acid solution and the absorbance is measured with UV light at 280 nm. The absorbance value is inserted in a regression equation and the concentration of lignin is obtained. For this analytical technique be better accepted by researchers, it must be, obviously, convincing and attractive. This study analyzed some LBA-related parameters in 7 grasses and 6 legumes in two stages of maturity. Among the different temperatures of pre-drying, the results indicated that the procedures at 55°C with ventilation and lyophilization can be used just as effectively. Temperatures of 55 and 80 both without ventilation are not recommended because they increased ADF and ADL values, possibly due to the emergence of technical artifacts such as the compounds of Maillard. The ABL method yielded lower values for legume samples which called into question if the lignin of these plants is less soluble in the acetyl bromide reagent. Among some changes studied in the ABL technique it was the utilization of ball milling in the PC samples, which showed no effect; the hypothesis was to reduce the particle size and thus improve the solubilization of lignin. The use of an ultrasonicator, which increases the vibration of molecules and possibly allowing better solubilization of lignin in the acetyl bromide reagent improved lignin solubilization by about 10%, both in grasses. As a reference, an in vitro dry matter degradability (IVDMD) was conducted. Because lignin is closely linked to the fibrous structure of the cell wall, an in vitro neutral detergent fiber degradability (IVNDFD) test of. Results confirmed the effect of maturity, reducing degradability as the plants matured, and that concentration of lignin is lower in legumes than in grasses. The degradability results showed higher correlation coefficients with the ABL method when the ultrasonicator was used; the KL method showed the lowest coefficients. We also tested, successfully, the use of NDF as a fiber preparation, instead of crude CW. While NDF is widely known, CW preparation is not. This maneuver will substantially facilitate the dissemination of this method, making it more acceptable to the scientific community

Au-delà de sa présence sur les microtubules stables, l'acétylation de l’-tubuline peut être augmentée après exposition des cellules aux UV ou après une carence en nutriments, phénomène que l’on appelle « hyperacétylation ». Cependant, le mécanisme d’induction de cette hyperacétylation est encore inconnu. Dans cette étude, nous montrons que l’hyperacétylation de la tubuline est une réponse générale aux stress cellulaire, et nous avons cherché à caractériser cette réponse, à identifier la voie de signalisation activée par le stress et conduisant à cette réponse, et à étudier la signification biologique de ce phénomène rapide et réversible. Nous avons trouvé que MEC-17/-TAT1, l’acétyltransférease majeure de l’ tubuline, est une enzyme nécessaire à l’induction de l’hyperacétylation en réponse aux stress, et qu'elle est régulée, à l’état basal par une autre acétyltransférase appelée p300. Au cours du stress, nous montrons que l'augmentation de la production des espèces réactives de l'oxygène (ROS), conduit à l'activation de la kinase « AMP-activated protein kinase (AMPK) », qui, à son tour provoque la phosphorylation de MEC-17, et probablement son activation. Enfin, nous montrons que l’hyperacétylation de la tubuline induite par le stress, participe à la survie des cellules dans des conditions de stress et à l'induction de l'autophagie de survie. / Beyond its presence in stable microtubules, -tubulin acetylation can be boosted after UV exposure or after nutrient deprivation but the mechanisms of this hyperacetylation are still unknown. In this study, we show that tubulin hyperacetylation is a general cell stress response, and aimed to characterize this response, to identify the stress-activated signaling pathway leading to its induction and the biological significance of this rapid and reversible phenomenon. We found that the major tubulin acetyltransferase MEC-17/-TAT1 is the main enzyme required for mediating tubulin hyperacetylation upon stress, and that it is regulated under normal conditions by the acetyltransferase p300. Upon stress, we show that the increased production of reactive oxygen species (ROS), leads to the activation of AMP-activated protein kinase (AMPK), which in turn mediates MEC-17 phosphorylation, and probably its subsequent activation. Finally, we show that tubulin hyperacetylation induced upon stress participate in cell survival under stress conditions and in the induction of protective autophagy.

Déficits cognitivos são frequentes em pacientes com esclerose múltipla (EM), especialmente a memória de longo prazo. Por outro lado, estudos de imagem por ressonância magnética têm correlacionado atrofia do hipocampo aos déficits mnésicos destes pacientes. Considerando-se a atrofia um marcador de dano neuronal tardio, justifica-se a investigação da fisiopatologia do dano hipocampal nas fases inicias da doença. Objetivo: Descrever os achados volumétricos e neuroquímicos da formação hipocampal de pacientes com EM recorrente-remitente (EMRR) em suas fases iniciais, comparando-os ao de um grupo de indivíduos saudáveis, e avaliar suas relações com a memória de longo prazo. Material e Métodos: Vinte e nove pacientes (19 mulheres, idade média 31 anos ± 8,7) com EMRR e um grupo controle composto por 26 indivíduos saudáveis (19 mulheres, idade média 30,7 anos ± 8,4) realizaram a 1H-ERM em magneto 3,0T. Foi utilizada técnica single-voxel e sequência PRESS com TR = 1500 ms, TE = 135 ms e dimensões fixas do voxel (6 cm3) localizado ao longo do hipocampo esquerdo para avaliação do N-acetil-aspartato (NAA), Colina (Cho) e Creatina (Cr), sendo a análise feita com o software LC Model. A avaliação volumétrica do encéfalo e da formação hipocampal foi realizada por meio do software FreeSurfer. Os indivíduos foram avaliados cognitivamente tendo sido criado um escore de memória verbal que avalia a evocação tardia (EMV-T), empregando-se a etapa de evocação tardia do Hopkins Verbal Learning Test-Revised e o Teste da Memória Lógica-II. Resultados: Observou-se atrofia em ambos os hipocampos dos pacientes com EM. Além disso, pacientes apresentaram menores níveis de NAA quando comparados aos do grupo de controles (F(1,51) = 4,089; p = 0,048), tendo sido observada correlação positiva entre NAA e o volume da formação hipocampal no grupo de pacientes (r = 0,372; p = 0,047). Por fim, pacientes apresentaram correlação negativa significante entre EMV-T e NAA (r = -0,408; p = 0,031), Cho (r = -0,509; p = 0,006) e Cr (r = -0,402; p = 0,034), enquanto que, nos controles, apenas foi observada leve tendência de correlação na direção oposta. Conclusões: Nossos resultados indicam, nas fases inicias da EM, atrofia e redução dos níveis de NAA na formação hipocampal, secundário à disfunção e/ou perda neuronal. O fato dos pacientes apresentarem relação entre metabólitos hipocampais e memória oposta ao que é esperado, para indivíduos saudáveis, está de acordo com a hipótese da presença de mecanismos compensatórios na função cognitiva de pacientes com EM / Cognitive deficits are common in patients with multiple sclerosis (MS), especially long-term memory. Moreover, magnetic resonance imaging studies have correlated hippocampal atrophy with mnemonic deficits in these patients. Considering atrophy a late marker of neuronal damage, investigation of the pathophysiology of hippocampal damage in the early stages of the disease is justified. Objective: Describe the volumetric and neurochemical findings of the hippocampal formation of early relapsing-remitting MS patients (RRMS), comparing it to a group of healthy subjects, and assess its relationships with long-term memory. Material and Methods: Twenty-nine patients (19 women, mean age 31 years ± 8,7) with RRMS and a control group of 26 healthy individuals (19 women, mean age 30,7 anos ± 8,4) underwent 1H-MRS in 3,0T scanner. Single-voxel PRESS sequence with repetition time of 1500 msec, echo time of 135 msec and fixed dimensions of the voxel (6 cm3) was located along the left hippocampus. Data were processed with LC Model software and the concentration of N-acetyl-aspartate (NAA), Choline (Cho) and Creatine (Cr) was calculated. Brain and hippocampal formation volumes were quantified using FreeSurfer software. Subjects were assessed cognitively and a verbal memory score assessing delayed recall (EMV-T) was developed, using Hopkins Verbal Learning Test-Revised delayed recall and Logical Memory-II test. Results: Atrophy was observed in both hippocampi of MS patients. In addition, MS patients had lower NAA levels compared to the control group (F (1,51) = 4,089, p = 0,048), and positive correlation between NAA and hippocampal formation volume was observed in patient group (r = 0.372, p = 0.047). Finally, patients showed a significant negative correlation between EMV-T and NAA (r = -0.408, p = 0.031), Cho (r = -0.509, p = 0.006) and Cr (r = -0.402, p = 0.034), while only a weak tendency to an association in the opposite direction was observed in the control group. Conclusion: Our results indicate, in early MS, atrophy and reduced levels of NAA in the hippocampal formation, secondary to neuronal loss and/or dysfunction. The fact that the observed relationship between hippocampal metabolites and memory was in the opposite direction as what it is expected for healthy subjects supports the hypothesis that compensatory mechanisms are present in cognitive function of MS patients