The class Cyanidiophyceae (the "cyanidia") includes three genera, the walled Cyanidium and Galdieria and the "naked" Cyandioschyzon. All of these algae are unicellular and asexual and live at high temperature and low pH. The cyanidia grow optimally at a pH of 2-3 but can tolerate a higher pH and lower their surrounding pH if it is above the optimal level. They can also tolerate high concentrations of potential toxins that are often found in their natural environments. This thesis shows that strains of cyanidia from Yellowstone National Park and other geographic locations have differing abilities to lower their surrounding pH and tolerate environmental toxins that are found in many environments in which they live. These unique characteristics of this class of algae allow them to be optimally adapted for life in extreme environments with few competitors. This thesis includes unpublished co-authored material.

Les bactéries acidophiles du genre Acidithiobacillus joue un rôle important dans les activités industrielles de récupération des métaux au sein des sites miniers. Dans cette thèse, la séquence du génome de la bactérie psychro-tolerante Acidithiobacillus ferrivorans CF27 a été re-séquencée. L’analyse comparative du génome de CF27 et des autres bactéries du genre Acidithiobacillus a permis de montrer: (i) une synthénie conservée entre 2 clusters de tRNAs trouvés dans les génomes de At. ferrivorans CF27 et At. ferrooxidans ATCC 23270, et qui ont contribué à la redondance génique des tRNAs chez ces 2 organismes. Notre analyse in silico à grande échelle de ces clusters de tRNAs au sein des génomes procaryotes a montré que les clusters de tRNAs sont présents dans très peu de phyla bactériens; (ii) la présence d’une importante proportion de gènes spécifiques chez CF27 et SS3, ce qui indique la très grande variabilité du contenu génique dans les génomes d’Acidithiobacillus et ainsi la nature unique de chaque groupe d’espèces. L’expression de ces gènes spécifiques a été confirmée chez CF27 cultivés en présence de Fer et soufre; et (iii) une composition taxonomique chimérique des génomes de la classe des Acidithiobacillia, confirmant ainsi que ce groupe appartient à une classe taxonomique particulière. Ces résultats apporte de nouvelles connaissances sur l’adaptation de CF27 à son environnement, ainsi que la nature chimérique des génomes de la classe taxonomique Acidithiobacillia. J’ai participé au projet ‘Thioredoxine réductase (TR)’ dont l’objectif est de définir la fonction biochimique, la structure moléculaire, ainsi que l’histoire évolutive de TRi, une réductase atypique. / The acidophilic Acidithiobacillus bacteria play an important role in industrial biomining operations for metal recovery. In this thesis, the genome sequence of a psychrotolerant Acidithiobacillus ferrivorans CF27 were first refined. The comparative genome analysis between CF27 and the closely related Acidithiobacillus genomes revealed: (i) a syntenic conservation of two tRNA array units which are only present in At. ferrivorans CF27 and At. ferrooxidans ATCC 23270 genomes and mainly contribute to the tRNA gene redundancy in both organisms. Moreover, our large-scale genome survey of the tRNA array units in prokaryotic organisms showed that tRNA arrays appear in few phyla; (ii) a high proportion of species-specific genes in CF27 and SS3 strains indicated the high variability of gene content in Acidithiobacillus genomes and therefore the unique nature of each group of species. Given that mRNA expression of some CF27 specific genes were confirmed in Fe(II)-grown cells and sulfur attached cells in CF27, these results highlighted the functional importance of specific genes for CF27 lifestyle; and (iii) the mosaic taxonomic composition of members of the Acidithiobacillia class, and thus confirmed that this group belongs to a particular taxonomic class, distinct to other proteobacterial groups. Taken together, our results provide insights into At. ferrivorans lifestyle as well as the chimeric genome nature of the Acidithiobacillus organisms. In addition, I also participated to the ‘Thioredoxin reductase’ project which aims to define the biochemical function, molecular structure and evolution of TRi, an atypical thioredoxin reductase.

Zwei Glykosylhydrolasen des acidothermophilen Bakteriums Alicyclobacillus acidocaldarius konnten charakterisiert werden. Die jeweiligen Gene wurden kloniert und sequenziert. Das intrazelluläre Enzym CelA und das extrazelluläre Enzym CelB könnten zusammen eine tragende Rolle im Abbau von beta-1,4-verknüpften Polysacchariden spielen. Ein Gen, welches für eine beta-1,4-Endoglucanase (CelA) kodiert, wurde kloniert und überexpremiert. Das Enzym wurde gereinigt. Das Protein besitzt eine Immunoglobulin-ähnliche Domäne, jedoch keine Cellulosebindedomäne. Zusammen mit den Sequenzähnlichkeiten der katalytischen Domäne zeigen diese Merkmale, daß das Protein zur Familie 9, Untergruppe E1 der Glykosylhydrolasen gehört. CelA zeigte höchste Aktivität gegenüber beta-1,4-Glucanen, besaß jedoch auch Aktivität gegen Haferspelzenxylan. Das Enzym hatte ein pH optimum von 5.5 und ein Temperaturoptimum von 70 °C. Im Protein waren zwei Zink- und zwei Calcium-Ionen gebunden, die wahrscheinlich wichtig für die Temperaturstabilität sind. Gegenüber p-Nitrophenylglykosiden ergab sich ein überraschendes Hydrolysemuster: Höchste Aktivität wurde auf dem Cellobiosidderivat gefunden, eine niedrigere Aktivität fand sich auf dem Cellotetraosederivat, wohingegen keine Aktivität auf den Glucose- und Cellotriosederivaten gemessen wurden. Das Hydrolysemuster führte zu dem Schluß, daß in CelA die Bindung von beta-1,4-Glucanen entweder auf der nicht reduzierenden Seite der -2 Substratunterbindestelle sterisch verhindert wird, oder alternativ zwei starke Substratunterbindestellen -1 und -2 vorhanden sind. Es wurde kein Signalpeptid zur Markierung des Proteins für die Translokation über die Membran gefunden. Zusammen mit der hohen Aktivität gegenüber Oligosacchariden, dem fast neutralen pH Optimum und der Inaktivierung bei niedrigem pH, deutet dies auf eine Rolle des Proteins als cytoplasmatisches Enzym zum Abbau importierter Oligosaccharide hin. Ein zweites Enzym mit Xylanase- und Cellulaseaktivität wurde zunächst aus A. acidocaldarius Kulturen gereinigt. CelB besaß eine molekulare Masse von 100 kDa und konnte nur mit Hilfe von Detergenz von den Zellen abgelöst werden. Klonierung und Sequenzanalyse des entsprechenden Gens ergaben einen offenen Leserahmen, welches für ein Präprotein kodierte, das ein typisches Sec-abhängiges Signalpeptid besaß. Gereinigtes, rekombinantes CelB und eine verkürzte Variante, der die letzten 203 Aminosäuren fehlten, zeigten Enzymaktivitäten, die dem Wildtypprotein ähnlich waren. Ein niedriges pH-Optimum von 4 wurde bestimmt. Auch die Stabilität war bei niedrigem pH hoch, wobei das Enzym nach Inkubation über nacht bei pH 1.5 bis 7 eine Restaktivität von 80 % aufwies. Das Temperaturoptimum betrug 80 °C. Bei dieser Temperatur war das Enzym auch stabil und zeigte nach 1 h 60 % Restaktivität. CelB hatte die Spezifität eines Endoenzyms, jedoch wurden nach längeren Inkubationszeiten Cellobiose und Xylobiose aus Cellulose bzw. Xylan freigesetzt. Das Enzym gehörte zur Familie 51 der Glykosylhydrolasen, aber es war erst der zweite Eintrag dieser Familie mit typischer Endoglucanaseaktivität. CelB hatte höchste Sequenzähnlichkeit mit der zweiten Endoglucanase, EGF aus Fibrobacter succinogenes, wobei diese beiden Proteine eine markante Gruppe im phylogenetischen Baum dieser Familie bildeten. Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung der katalytischen Domänen ergab, daß CelB in Übereinstimmung mit der Anpassung an einen niedrigen pH-Wert, weniger geladene Aminosäuren als die neutrophilen Enzyme der gleichen Familie besitzt. Wildtyp-CelB und unverkürztes, rekombinantes CelB waren nur in Anwesenheit von Detergenz löslich. Dagegen war das verkürzte CelB Protein vollständig in Wasser löslich. Daher wird eine Rolle der C-terminalen Region bei der Zellassoziation nahegelegt. Dieser hydrophobe Bereich zeigte lokale Übereinstimmungen der Aminosäuresequenz mit einer hydrophoben Region einer Amylase aus dem gleichen Organismus. / Two glycoside hydrolases from the thermoacidophilic bacterium Alicyclobacillus acidocaldarius were characterized and the corresponding genes cloned and sequenced. Together the intracellular enzyme CelA and the extracellular enzyme CelB may play a major role in the degradation of beta-1,4-linked polysaccharides. A gene encoding a beta-1,4-endoglucanase (CelA) was cloned and the enzyme overexpressed and purified. The protein contained an immunoglobulin-like domain but lacked a cellulose-binding domain. In conjunction with sequence similarities of the catalytic domain these features demonsrated the protein to be a member of glycoside hydrolase family 9, subgroup E1. CelA was most active against substrates containing beta-1,4-linked glucans, but also exhibited activity against oat spelt xylan. It displayed a pH optimum of 5.5 and a temperature optimum of 70 °C. The protein was found to contain one zinc and two calcium ions, likely to be important for temperature stability. It showed a striking pattern of hydrolysis on p-nitrophenyl glycosides, with highest activity on the cellobioside derivative, some on the cellotetraoside derivative and none on the glucoside and trioside derivatives. The hydrolysis patterns led to the conclusion that CelA contained a steric block for beta-1,4-linked glucans on the non reducing side of subsite -2 or, alternatively, two strong binding sites -1 and -2. No signal peptide for transport of CelA across the membrane was detected. This, together with high activity on oligosaccharides, a near neutral pH optimum, and inactivation at low pH, suggests a role for the protein as a cytoplasmic enzyme for the degradation of imported oligosaccharides. A second enzyme with xylanase and cellulase activity was purified from A. acidocaldarius cultures. CelB displayed a molecular mass of 100 kDa and could only be removed from cells with the help of detergent. Cloning and sequence analysis of the corresponding gene revealed an ORF encoding a preprotein with a typical sec-dependent signal peptide. Purified recombinant CelB and a truncated varient lacking the C-terminal 203 amino acid residues displayed enzymatic properties similar to the wild-type protein. A low pH optimum of 4 was found. Stability was also high at low pH, the enzyme retaining 80 % of activity after incubation over night from pH 1.5 to 7. The temperature optimum was 80 °C, a temperature at which the enzyme was also stable, showing 60 % residual activity after 1 h. CelB displayed an endo mode of action, but release of cellobiose and xylobiose from cellulose and xylan, respectively, was observed after prelonged periods of incubation. CelB belonged to glycoside hydrolase family 51, but it was only the second entry in this family with activity typical of an endoglucanase. Highest sequence similarity was found towards the other endoglucanase, EGF from Fibrobacter succinogenes, the two forming a distinct group in the phylogenetic tree of this family. Analysis of the amino acid composition of the catalytic domains demonstrated that CelB contains fewer charged amino acids than its neutrophilic counterparts, which is in line with adaptation to low pH. Wild-type and full-length recombinant CelB were soluble only in detergent. In contrast, truncated CelB was completely water soluble, suggesting a role of the C-terminal region in cell association. This C-terminal hydrophobic region displayed local sequence similarities to a hydrophobic region of an amylase from the same organism.

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<p>Binding proteins are present both in gram-negative and gram-positive bacteria. They are the recognition components of the ABC transport systems that transport different nutrients into the cell, and are in some cases also involved in chemotaxis. In gram-negative bacteria, they are present in the periplasm between the inner and the porous outer membrane. Here, these highly specific proteins can bind to a certain ligand such as ions, sugars and amino acids. The protein-ligand complex can then interact with permeases bound to the inner membrane that transport the nutrient into the cell. Gram-positive bacteria lack an outer membrane and the binding protein must therefore be anchored to the cell membrane.</p><p>In this thesis different aspects of three members of the super-family of the periplasmic binding proteins have been studied. In the case of the allose-binding protein (ALBP) from <i>E. coli</i> we focused on the movement of the protein when ligand is bound and released. This protein was also compared with the ribose-binding protein (RBP) which belongs to the same structural cluster and from which both open and closed structures are available. The leucine-binding protein (LBP) from <i>E. coli</i> was studied with regards to the structural basis of its specificity for different ligands as well as its conformational changes. The leucine-isoleucine-valine protein has 80% sequence identity with LBP but still exhibits a different preference for ligands. The structure of the maltose-binding protein (MBP) was obtained from a gram-positive thermoacidophile, <i>A. acidocaldarius. </i>Here, our goal was to study acid-stability of proteins. Since little is known about this and structures of the mesophilic counterpart in <i>E. coli</i> are available, as well as structures from two hyperthermophiles, we had an opportunity to study differences in their structural properties that could explain their differing stabilities.</p>

Binding proteins are present both in gram-negative and gram-positive bacteria. They are the recognition components of the ABC transport systems that transport different nutrients into the cell, and are in some cases also involved in chemotaxis. In gram-negative bacteria, they are present in the periplasm between the inner and the porous outer membrane. Here, these highly specific proteins can bind to a certain ligand such as ions, sugars and amino acids. The protein-ligand complex can then interact with permeases bound to the inner membrane that transport the nutrient into the cell. Gram-positive bacteria lack an outer membrane and the binding protein must therefore be anchored to the cell membrane. In this thesis different aspects of three members of the super-family of the periplasmic binding proteins have been studied. In the case of the allose-binding protein (ALBP) from E. coli we focused on the movement of the protein when ligand is bound and released. This protein was also compared with the ribose-binding protein (RBP) which belongs to the same structural cluster and from which both open and closed structures are available. The leucine-binding protein (LBP) from E. coli was studied with regards to the structural basis of its specificity for different ligands as well as its conformational changes. The leucine-isoleucine-valine protein has 80% sequence identity with LBP but still exhibits a different preference for ligands. The structure of the maltose-binding protein (MBP) was obtained from a gram-positive thermoacidophile, A. acidocaldarius. Here, our goal was to study acid-stability of proteins. Since little is known about this and structures of the mesophilic counterpart in E. coli are available, as well as structures from two hyperthermophiles, we had an opportunity to study differences in their structural properties that could explain their differing stabilities.

Beim Bergbau werden bestehende Ökosysteme in großem Maße beeinflusst. Im ehemaligen Uranbergwerk Königstein (Sachsen) wurde die Umwelt durch den Einsatz von chemischen Säuren zur Lösung des Urans aus dem Erz (Laugung) in Folge der Verschiebung des pH-Wertes zusätzlich belastet. Durch diesen Prozess entstand eine Umgebung, die einen niedrigen pH-Wert und hohe Konzentrationen an gelösten Schwermetall-Ionen aufweist. Die komplexe mikrobielle Lebensgemeinschaft verschob sich daraufhin, indem sich bevorzugt säuretolerante und Schwermetall-tolerante Mikroorganismen durchsetzten. Diese Mikroorganismen wurden durch die Flutung der unter Tage Schächte im Jahr 2010 in ihrer Zusammensetzung erneut beeinflusst. In dieser Arbeit wurde die mikrobielle Biozönose nach Flutung der unter Tage Schächte des ehemaligen Uranbergwerkes Königstein charakterisiert und mit den Ergebnissen der mikrobiellen Diversität vor dem Flutungsprozess verglichen. Hierfür kam ein breites Spektrum an Methoden zum Einsatz, das klassische mikrobiologische Methoden und molekularbiologische Techniken umfasste. Die Analysen erfolgten dabei über mehrere Jahre hinweg, um die Variabilität der mikrobiellen Population im Grubenwasser planktonisch und im Biofilm zu erfassen.

7 SUMMARY This thesis is divided into two separate portions. The first part covers my own lichen floristic exploration of the Károvské údolí locality stretching out along the southern limits of Prague near Zbraslav. The location is formed by relatively steep slopes with orientation to North and South. Natural conditions are characterised by communities of xerothermic steppes and oak groves with alder clumps and hornbeams prevailing in lower parts along the Károvský potok stream. Geologically, the parent rock consists of shale rocks of acid chemical composition. Duting my search, I recorded 116 lichen species. Among them, saxicolous and terricolous lichens characteristic of acid rock outcrops and xerotherm steppes prevail. During exploration, I found also the critically endangered (CR) species Peltigera elisabethae, endangered species (EN) Flavoparmelia caperata and representatives of the genus Verrucaria, tolerant of long-term freshwater flooding - V. cf. andesiatica, V. aquatilis and V. funckii. One of species discovered, Pertusaria flavicans, has not been recorded in the Czech Republic todate. This locality is home to a summer house resort which has expanded the list of lichens by basophilic species which inhabit anthropogenic substrata. My master thesis is the first thorough research of the lichen flora...

Beim Bergbau werden bestehende Ökosysteme in großem Maße beeinflusst. Im ehemaligen Uranbergwerk Königstein (Sachsen) wurde die Umwelt durch den Einsatz von chemischen Säuren zur Lösung des Urans aus dem Erz (Laugung) in Folge der Verschiebung des pH-Wertes zusätzlich belastet. Durch diesen Prozess entstand eine Umgebung, die einen niedrigen pH-Wert und hohe Konzentrationen an gelösten Schwermetall-Ionen aufweist. Die komplexe mikrobielle Lebensgemeinschaft verschob sich daraufhin, indem sich bevorzugt säuretolerante und Schwermetall-tolerante Mikroorganismen durchsetzten. Diese Mikroorganismen wurden durch die Flutung der unter Tage Schächte im Jahr 2010 in ihrer Zusammensetzung erneut beeinflusst. In dieser Arbeit wurde die mikrobielle Biozönose nach Flutung der unter Tage Schächte des ehemaligen Uranbergwerkes Königstein charakterisiert und mit den Ergebnissen der mikrobiellen Diversität vor dem Flutungsprozess verglichen. Hierfür kam ein breites Spektrum an Methoden zum Einsatz, das klassische mikrobiologische Methoden und molekularbiologische Techniken umfasste. Die Analysen erfolgten dabei über mehrere Jahre hinweg, um die Variabilität der mikrobiellen Population im Grubenwasser planktonisch und im Biofilm zu erfassen.

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