Thesis (Ph. D.)--Miami University, Dept. of Microbiology, 2006. / Title from second page of PDF document. Includes bibliographical references (p. 123-144).

Tierärztliche Hochsch., Diss., 2005--Hannover.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-12T17:02:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2714432 bytes, checksum: b2433146284f70c56705fc1be093c259 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T17:02:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2714432 bytes, checksum: b2433146284f70c56705fc1be093c259 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma doença respiratória severa que resulta em significantes perdas econômicas no setor da suinocultura. Atualmente, A. pleuropneumoniae é classificado em 16 sorotipos diferentes que podem causar a doença com virulência distinta entre eles. Em Minas Gerais, Brasil, A. pleuropneumoniae é encontrado nas granjas e a maior distribuição é do sorotipo 8, sendo este até pouco tempo negligenciado em estudos de epidemiologia devido a problemas de identificação. Da mesma forma, atualmente é aceito que este sorotipo é também o de maior distribuição nos Estados Unidos, Canadá, Reino Unido além do Brasil. Até recentemente, não havia disponibilidade de genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 em banco de dados, por isso não existem informações genômicas específicas para este sorotipo, especialmente provenientes de isolados clínicos recentemente circulantes nas granjas. Neste contexto, somente a partir de 2015 os primeiros genomas foram disponibilizados para serem analisados, sendo assim sete genomas de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 estão hoje disponíveis e estes foram analisados neste estudo. A partir das sequências genômicas dos isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 foi proposto um modelo de proteoma referência desse sorotipo com um total de 2.396 proteínas categorizadas nas diferentes classes de grupos de ortólogos. Na análise comparativa realizada entre genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 e demais sorotipos foi observado um padrão de conservação na organização do genoma entre esses. No entanto, foram identificadas algumas diferenças pontuais e dois segmentos genômicos diferenciais entre os genomas analisados com rearranjos e /ou inversões de 42,2 Kb e 59,6 Kb. O primeiro segmento foi encontrado nos genomas dos sorotipos 5 (L20), 7 (AP76) e em quatro dos isolados clínicos do sorotipo 8 investigados, sendo eles MV518, MV780, MV1022 e MV5651 contendo sequências de profago. O segundo segmento diferencial foi identificado apenas no genoma de A. pleuropneumoniae sorotipo 7 (AP76) e contém sequências como transposases caracterizando a presença de uma sequência de inserção no segmento. De acordo com a análise dos códons preferenciais de todos os sorotipos investigados, não foram observadas diferenças marcantes entre eles. Na análise comparativa dos proteomas, a maioria das sequências do proteoma referência de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 que apresentaram baixa similaridade com os demais sorotipos foram caracterizadas como hipotéticas, não tendo sua função conhecida. Nessa porção diferencial específica foram relatadas sequências codificadoras relacionadas à plasmídeos o que caracteriza possíveis eventos de transferência horizontal de genes (THG) ao longo da história evolutiva do genoma e fatores de resistência a antibióticos como cloranfenicol, sulfonamida e tetraciclina. Na análise de similaridade entre os proteomas houve maior similaridade das proteínas do proteoma referência do sorotipo 8 com as proteínas do sorotipo 6, o que pode estar associado à dificuldade em separar esses sorotipos nas técnicas de sorotipagem. Com as análises comparativas e a caracterização das diferenças entre os sorotipos e isolados será possível compreender os mecanismos de virulência dos isolados de A. pleuropneumoniae e identificar potenciais candidatos vacinais mais eficientes. / Actinobacillus pleurapneumoniae is the causative agent of porcine pleuropneumonia, a severe respiratory illness that it results in significant economic losses in the swine industry. Currently, A. pleuropneumoniae is classified into 16 different serotypes that it can cause disease with distinct virulence between them. In Minas Gerais, Brazil, A. pleuropneumoniae is found on the farms and the largest distribution is of serotype 8, which, until shortly time, it was neglected in epidemiological studies because of the identification problems. Similarly, it is currently accepted that this serotype is also the most widely distributed in the United States of America, Canada, the United Kingdom as well as Brazil. Until recently, there was no availability of genomes of A. pleuropneumoniae serotype 8 in the database, because of this, there are no specific genomic information for this serotype, especially from of the clinical isolates that, recently, it are circulating on the farms. In this context, only from 2015, the first genomes were available to be analysed, so, today there are seven genomes of clinical isolates of A. pleuropneumoniae serotype 8 available and these were analyzed in this study. From the genomic sequences of clinical isolates of A. pleuropneumoniae serotype 8 was proposed a model of proteome which it is reference for this serotype with a total of 2.396 proteins categorized into different classes of orthologous groups. In a comparative analysis of genomes of A. pleuropneumoniae serotype 8 and other serotypes, it was observed a pattern of conservation in the organization of the genome between these. However, it were identified some specific differences and two genomic segments differentials between the genomes analyzed with rearrangements and/or reversals of 42.2 Kb and 59.6 Kb. The first segment was found in the genome of the serotype 5 (L20), 7 (AP76) and in four of the clinical isolates of serotype 8 that it were investigated: MV518, MV780, MV1022 and MV5651, which it containing prophage sequences. The second differential segment was identified only in the genome of A. pleuropneumoniae serotype 7 (AP76) and it contains sequences as transposases that it characterizes the presence of an insertion sequence in the segment. Regarding the use and the preference of codons between the serotypes investigated, there were no significant differences among them. In the comparative analysis of proteomes, the sequences of the reference proteome of A. pleuropneumoniae serotype 8, which it showed low similarity with the remaining serotypes, it were identified as hypothetical, it does not having its known function. In this specific differential portion, coding sequences associated to plasmids were described, that it characterize possible events by horizontal transfers of genes (HTG) throughout the evolutionary history of the genome and antibiotic resistance factors, such as chloramphenicol, tetracycline and sulfonamide. In the similarity analysis between the proteomes, there was greater similarity of the proteome reference of serotype 8 with the proteins of the serotype 6, which it may be associated on difficulty to separate these serotypes in the serotyping techniques. With the comparative analysis and the characterization of the differences between the serotypes and the isolates, it will be possible to understand the virulence mechanisms of the isolates of A. pleuropneumoniae and to identify vaccine candidate potential more effective.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A DNA probe was developed for the identification of the periodontal pathogen, Actinobacillus actinomycetemcomitans. Chromosomal DNA was extracted from A. actinomycetemcomitans, digested with a restriction enzyme, Sau3A, ligated to plasmid DNA (pUC18) and transformed into JM109 cells to give a partial A. actinomycetemcomitans library. The library was screened using Southern blot analysis. Out of the nine inserts tested, one was found to be species specific as it did not cross-hybridise to Haemophilus aphrophilus, a closely related organism which occurs in the normal oral microflora, nor did it cross-hybridise with 7 species of Bacteroides tested. A level of detection of 104 cells or 50ng of A. actinomycetemcomitans was obtained. The probe has a length of 779bp and out of 30 restriction enzymes tested, only SspI was found to have a restriction site in the insert. The probe was tested on clinical specimens obtained from five different periodontitis patient groups and was shown to correlate with culture results in eighteen out of twenty-two cases in detecting A. actinomycetemcomitans.

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A infecção por Actinobacillus pleuropneumoniae, doença conhecida como pleuropneumonia suína, assumiu grande importância na suinocultura moderna devido à alta ocorrência observada nos rebanhos. O impacto da doença está relacionado à capacidade do agente em causar pneumonia severa, levando os animais a óbito ou doença crônica, resultando em graves prejuízos zootécnicos. Diante desse cenário, o controle e monitoramento do agente se faz importante por meio da identificação dos diferentes sorotipos, da análise genética e da determinação dos perfis de resistência aos antimicrobianos. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotípica e genotípicamente estirpes de Actinobacillus pleuropneumoniae isoladas a partir de quadros de pneumonia em suínos. Um total de 85 estipes de A. pleuropneumoniae foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para identificação e sorotipagem, determinação da concentração inibitória mínima de antimicrobianos, polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP) e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Os sorotipos mais frequentes foram: 5 (38,8%), 10 (29,4%), 7 (5,9%), 8 (5,9%) e 6 (3,5%), sendo que 14 (16,5%) estirpes foram não tipáveis. Foi observada alta heterogeneidade de perfil genético entre as estirpes analisadas, tanto pelo AFLP quanto pelo PFGE, e o índice discriminatório para cada técnica foi 0,97 e 0,84, respectivamente. Todas as estirpes foram sensíveis ao ceftiofur, gentamicina, tulatromicina e tilmicosina, sendo que 98,8% das estirpes foram resistentes à tilosina e altas taxas de resistência foram observadas ainda para as tetraciclinas, clindamicina e sulfadimetoxina. / Infection by Actinobacillus pleuropneumoniae, a disease known as swine pleuropneumonia, has gained greater relevance to modern pig farming due to the high recurrence rate observed in herds. The impact of the disease relates to the capacity of the agent to cause severe pneumonia, leading to animal death or chronic conditions, thus resulting in severe zootechnical losses. In view thereof, the control and monitoring of the agent is key, being performed through the identification of different serotypes, genetic analysis and determination of antimicrobial resistance profiles. The objective of this study was to characterize phenotypically and genotypically Actinobacillus pleuropneumoniae strains isolated from swine with clinical presentation of pneumonia. A total of 85 strains of A. pleuropneumoniae were subject to polymerase chain reaction (PCR) for identification and serotyping, determination of the minimal inhibitory concentration, amplified fragment length polymorphism (AFLP) and pulsed field gel electrophoresis typing techniques (PFGE). Most recurring serotypes were: 5 (38.8%), 10 (29.4%), 7 (5.9%), 8 (5.9%) and 6 (3.5%), of which 14 (16.5%) strains were nontypeable. High genetic heterogeneity was observed for both AFLP and PFGE, and the discriminatory index for each technique was 0.97 and 0.84, respectively. All 85 strains were susceptible to ceftiofur, gentamicin, tulatromicin and tilmicosin, 84 of which were resistant to tylosin, and high resistance rates were also observed for clindamycin, tetracyclines and sulfadimethoxine.

A infecção por Actinobacillus pleuropneumoniae, doença conhecida como pleuropneumonia suína, assumiu grande importância na suinocultura moderna devido à alta ocorrência observada nos rebanhos. O impacto da doença está relacionado à capacidade do agente em causar pneumonia severa, levando os animais a óbito ou doença crônica, resultando em graves prejuízos zootécnicos. Diante desse cenário, o controle e monitoramento do agente se faz importante por meio da identificação dos diferentes sorotipos, da análise genética e da determinação dos perfis de resistência aos antimicrobianos. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotípica e genotípicamente estirpes de Actinobacillus pleuropneumoniae isoladas a partir de quadros de pneumonia em suínos. Um total de 85 estipes de A. pleuropneumoniae foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para identificação e sorotipagem, determinação da concentração inibitória mínima de antimicrobianos, polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP) e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Os sorotipos mais frequentes foram: 5 (38,8%), 10 (29,4%), 7 (5,9%), 8 (5,9%) e 6 (3,5%), sendo que 14 (16,5%) estirpes foram não tipáveis. Foi observada alta heterogeneidade de perfil genético entre as estirpes analisadas, tanto pelo AFLP quanto pelo PFGE, e o índice discriminatório para cada técnica foi 0,97 e 0,84, respectivamente. Todas as estirpes foram sensíveis ao ceftiofur, gentamicina, tulatromicina e tilmicosina, sendo que 98,8% das estirpes foram resistentes à tilosina e altas taxas de resistência foram observadas ainda para as tetraciclinas, clindamicina e sulfadimetoxina. / Infection by Actinobacillus pleuropneumoniae, a disease known as swine pleuropneumonia, has gained greater relevance to modern pig farming due to the high recurrence rate observed in herds. The impact of the disease relates to the capacity of the agent to cause severe pneumonia, leading to animal death or chronic conditions, thus resulting in severe zootechnical losses. In view thereof, the control and monitoring of the agent is key, being performed through the identification of different serotypes, genetic analysis and determination of antimicrobial resistance profiles. The objective of this study was to characterize phenotypically and genotypically Actinobacillus pleuropneumoniae strains isolated from swine with clinical presentation of pneumonia. A total of 85 strains of A. pleuropneumoniae were subject to polymerase chain reaction (PCR) for identification and serotyping, determination of the minimal inhibitory concentration, amplified fragment length polymorphism (AFLP) and pulsed field gel electrophoresis typing techniques (PFGE). Most recurring serotypes were: 5 (38.8%), 10 (29.4%), 7 (5.9%), 8 (5.9%) and 6 (3.5%), of which 14 (16.5%) strains were nontypeable. High genetic heterogeneity was observed for both AFLP and PFGE, and the discriminatory index for each technique was 0.97 and 0.84, respectively. All 85 strains were susceptible to ceftiofur, gentamicin, tulatromicin and tilmicosin, 84 of which were resistant to tylosin, and high resistance rates were also observed for clindamycin, tetracyclines and sulfadimethoxine.

Estudos indicam que indivíduos com lesões periodontais severas apresentam maior probabilidade de serem colonizados por aggregatibacter actinomycetemcomitans de máxima leucotoxicidade (max LTX), enquanto, clones de mínima leucotoxicidade (min LTX) se associam a indivíduos com reduzida perda de inserção conjuntiva e óssea alveolar. Além disso, a severidade da doença periodontal pode se relacionar com a expressão de antígenos sorotipos-específicos de A. actinomycetemcomitans. Objetivo: Assim, este estudo transversal avaliou a prevalência de A. actinomycetemcomitans, a expressão de max LTX e min LTX leucotoxicidade e seus sorotipos a, b, c, d, e e f nas amostras positivas de A. actinomycetemcomitans oriundas desta população. Método: Foram alocados no presente estudo 764 indivíduos adultos diagnosticados com periodontite incipiente, periodontite crônica 1, 2 e 3 e periodontite agressiva. Após detalhada anamnese, profundidade de sondagem, nível clínico de inserção, Índice de Placa e Índice Gengival foram mensurados e amostras subgengivais foram coletadas dos primeiros molares e incisivos centrais. O procedimento de identificação dos genótipos e sorotipos foi realizado por meio da reação em cadeia da polimerase. Teste Qui-quadrado (P<0,05) foi utilizado para comparar as médias dos valores clínicos em relação aos microbianos. Resultados: A prevalência do microrganismo para a população em geral foi de 15,18%. Cepas de min LTX foram mais prevalentes do que as de max LTX (p<0,05) em toda população estudada. Indivíduos diagnosticados com periodontite agressiva apresentaram somente cepas de min LTX. O sorotipo b mostrou-se mais prevalente em indivíduos diagnosticados com periodontite agressiva enquanto os sorotipos a e c estiveram associados com indivíduos diagnosticados com periodontite crônica. Conclusões: Os dados obtidos neste estudo mostram similaridade com os estudos de prevalência de A. actinomycetemcomitans em diferentes países. Cepas de max LTX nem sempre estão relacionadas com indivíduos diagnosticados com periodontite agressiva. Nossos dados confirmaram ainda a relação dos sorotipo b com periodontite agressiva, e os fatores idade e gênero não foram associados com leucotoxicidade e sorotipos. / Previous studies suggest that individuals with advanced periodontal lesions harbor significantly more highly leucotoxic Aggregatibacter actinomycetemcomitans than minimally leucotoxic A.actinomycetemcomitans, while, minimally leucotoxic A. actinomycetemcomitans samples are related to less severe periodontal disease. In addition, some authors have also implicated the serotype-specific antigens of A. actinomycetemcomitans with the severity of disease. Aim: Thus, the aim of the present study was to consider the prevalence of A. actinomycetemcomitans, the expression of higly leucotoxic A. actinomycetemcomitans and minimally leucotoxic of A. actinomycetemcomitans and the presence of serotype-specific a, b, c, d, e and f antigens from positive samples of A. actinomycetemcomitans. Methods: A total of 764 adult individuals diagnosed early onset periodontitis, chronic periodontitis 1, 2 and 3 and also aggressive periodontitis will be enrolled in this survey. After anamnese, all of the patients will receive clinical examinations such as: periodontal pocket deep; clinical attachment loss; plaque and gingival indexes. Subgingival samples from first molars and central incisors were collected to microbial analysis. The genomic and serotype-specific DNA of A. actinomycetemcomitans were provided by polymerase chain reaction (PCR). Chi-square test (P<0.05) was provided to compare the mean values of clinical data according to microbial results. Results: Our results showed that the prevalence of positive samples of A. actinomycetemcomitans reached 18.4%. In general, minimally leucotoxic A.actinomycetemcomitans were statistically significantly more prevalent than highly leucotoxic A. actinomycetemcomitans (p<0.05). Subjects diagnosed aggressive periodontitis showed only samples of minimally leucotoxic of A. actinomycetemcomitans, however, these patients harbored more serotype-specific b when we compared with chronic periodontitis subjects. On the other hand, serotypes-specific a and c were associated with chronic periodontitis subjects. Conclusions: Our prevalent data was similar with several prevalent studies with different populations around the world. Very few samples of higly leucotoxic A. actinomycetemcomitans were detected. This particular condition not allowed to associate higly leucotoxic A. actinomycetemcomitans with severity of disease and also with serotype-specific. We observed a positive relationship between serotype b and aggressive periodontitis subjects. The risk factors, age and gender were not associated with leucotoxic or serotypes of A. actinomycetemcomitans.

RTX (Repeat in ToXin) superfamily consists of many proteins divided into several groups according to their different functions and characteristics: toxins, metalloproteases, lipases, proteins of the S-layer, bacteriocins and proteins with unknown function. However, all of them can be characterized by the following features: i) they contain tandemly repeated (6-50) nonapeptide glycine-rich calcium-binding consensus sequences GGXGXDX[L/I/V/W/Y/F]X (where X is any amino acid residue) in the C-terminal part of the protein. The presence of these repeats is a sine qua non condition for RTX protein family membership; ii) secretion from the cell occurs without a periplasmic intermediate by a mechanism which involves recognition of a signal sequence at the C-terminus of the protein by membrane-associated proteins that export the toxin across a channel spanning the entire bacterial envelope directly to the outside of the cell (Type I Secretion System); iii) the genes for protein synthesis, activation and secretion are mostly grouped together on the chromosome and form rtx operons. RTX toxins are the largest protein group of the RTX family. To this group belong mostly the proteins with molecular weight ranging from 100 to 200 kDa, with posttranslational fatty acid acylation mediated by a specific activating...