A destruição funcional das vias de controle do ciclo celular constituem um evento comuns em todos os tumores humanos. Muitos estudos associam mutações em p53 com mau prognostico no tratamento do câncer. Nesse trabalho, visamos a geração e caracterização de linhagens isogênicas portando diferentes mutantes de p53 como modelo de estudo para remediação simultânea de p53 e p16 na presença de mutantes hotspots específicos. Os mutantes R175H e R248Q não geraram alterações na cinética de proliferação da linhagem H358, mas levaram a um aumento de 27,5% na eficiência de plaqueamento e, no caso de R248Q, ao dobro de eficiência na formação de colônias em suspensão. Os resultados do tratamento das linhagens isogênicas com adenovírus Adp16 e Adp53 mostraram que os mutantes não interferiram no parada do ciclo celular em G1 induzida por p16. / Alterations of the cell cycle pathway are a common event in all human tumors. Several studies have shown a correlation between hotspot mutations and an unfavorable profile for cancer therapies. Hence, this study aims the generation and characterization of isogenic cell lines, harboring p53 mutants, as model to investigate the replacement of p53 and p16 genes on these mutant H358 cell lines. Our data identified that neither p53R175H nor p53R248Q mutants accelerated cell cycle progression. However, both leads to a 27,5% increased plate efficiency while R248Q leads to a two-fold increases in the number of colonies formed in soft agar. Our data also showed that the mutants did not affect the efficiency of p16 replacement.

O melanoma maligno é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à falta de tratamentos eficazes e à sua tendência de formar metástases. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores anti-tumorais e, inicialmente, foi construído um vetor adenoviral, AdPG, no qual a expressão do transgene é controlada por p53, um supressor de tumor e fator de transcrição. Sendo que aproximadamente 90% dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, foi proposto que isto pudesse ser utilizado como uma ferramenta para dirigir a expressão do transgene codificado pelo vetor AdPG, um mecanismo apoiado por resultados anteriores de nosso grupo. Por exemplo, a transdução de células B16 (melanoma de camundongo, p53-selvagem, deleção de p19Arf) com vetores AdPG portadores de p19Arf ou interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resultou em morte celular maciça enquanto a transferência de apenas um destes fatores isolados não causou o mesmo efeito. O trabalho descrito aqui inclui dois avanços tecnológicos críticos em comparação com trabalhos anteriores do grupo. Primeiramente, os transgenes de interesse (eGFP, p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b) foram inseridos num vetor adenoviral que apresenta o tripetídeo RGD na sua proteína fibra. Essa modificação no vetor permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células alvos sem a dependência do receptor viral do adenovírus selvagem, CAR. Além disso, foi construído um vetor bicistrônico, que contém a combinação de ambos os genes terapêuticos, como forma de garantir a transferência dos dois fatores ao mesmo tempo para as células-alvo. A inclusão de p19Arf, um supressor de tumor e inibidor de MDM2, como um gene terapêutico deve complementar as atividades do p53 celular endógeno e, como consequência, atuar na promoção da expressão a partir do vetor e também na inibição da proliferação das células tumorais. Porém, a transferência de p19Arf sozinho acarretaria efeito somente nas células que foram transduzidas e, então, seu efeito seria limitado. Por este motivo, descreve-se, além do p19Arf, a utilização de IFN<font face=\"Symbol\">b, uma proteína secretada com funções anti-tumorais, incluindo inibição de angiogênese, indução de apoptose e ativação da resposta imunológica. A estratégia do projeto contemplou vários níveis relacionados ao mecanismo do processo de transferência, incluindo a eficiência da transdução, o mecanismo de controle da expressão dos transgenes e as atividades dos transgenes. Assim, foi proposto que a combinação de p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b pudesse ser uma estratégia interessante para induzir morte no tumor primário e uma resposta imunológica contra as células metastáticas. Com este projeto, foi iniciada a construção destes novos vetores aprimorados para transferência gênica nas células de melanoma. / Malignant melanoma is a type of cancer with high death rates, in part, because of a lack of efficient treatments and its tendency to generate metastases. Our group has developed viral vectors for the gene transfer of anticancer factors and, initially, we constructed an adenoviral vector, AdPG, in which transgene expression is controlled by p53, a tumor suppressor and transcription factor. As 90% of melanoma cases maintain wild-type p53, it was proposed that this could be used as a tool to drive transgene expression encoded by the AdPG vector, as evidenced by previous studies from our group. For example, transduction of B16 cells (mouse melanoma, wild-type p53, p19Arf-null) with vectors encoding p19Arf or interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resulted in massive death cell, while transfer of just one of these factors alone did not cause the same effect. The work described here includes two critical technologic advances in comparison with our previous work. First, transgenes of interest (eGFP, p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b) were inserted into an adenoviral vector which presents the RGD tripeptide in its fiber. This vector modification allows efficient transduction in a wide range of target cells without dependence on the wild type adenovirus receptor, CAR. In addition, a bicistronic vector was constructed which contains the combination of both therapeutic genes, ensuring the transfer of both factors to the target cells at the same time. Use of p19Arf, a tumor suppressor and MDM2 inhibitor, as a therapeutic gene should complement endogenous p53 activities and, as a consequence, promote expression from the AdPG vector and inhibit tumor cell proliferation. However, p19Arf gene transfer alone should have an effect only in transduced cells and, therefore, its effect would be limited. For this reason, we describe, in addition to p19Arf, the application IFN<font face=\"Symbol\">b, a secreted protein with antitumor functions, including inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis and activation of immunologic response. This strategy involves several mechanistic levels related with the gene transfer process, including transduction efficiency, control over transgene expression and transgene activity. Therefore, it was proposed that the combination of p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b could be an interesting strategy to induce primary tumor death and an immunologic response against metastatic cells. In this project, the construction of new vectors optimized for gene transfer in melanoma cells was initiated.

O melanoma representa menos de 5% de todos os cânceres de pele, porém, quando em estádio metastático possui prognóstico ruim. Entretanto, o genótipo dos melanomas pode prover uma oportunidade para intervenção terapêutica pelo fato de 90% dos casos de melanoma possuem p53 selvagem e grande parte destes possuem deleção na região cromossômica codificadora de interferon beta. Em prévios estudos, desenvolvemos o vetor adenoviral AdRGD-PG que fornece expressão do transgene em resposta à p53 através do promotor PG e ainda o tripeptídeo RGD, que possibilita que o adenovírus transduza uma maior gama de células pela alteração de seu mecanismo de entrada. Temos utilizado este vetor para entrega da versão murina de interferon beta em modelos de terapia gênica e imunoterapia de melanoma murino, revelando uma significativa habilidade do interferon beta em inibir a proliferação celular in vitro e in vivo e promover resposta imune antitumoral. No presente trabalho, os esforços se aplicam em adaptar essa estratégia em modelo de melanoma humano para observar se a mesma interação é encontrada. O vetor AdRGD-PGhIbeta, portador do cDNA de interferon beta humano (hIbeta) foi construído e expressão do transgene observada após transdução das linhagens estabelecidas de melanoma humano SK-MEL-05 e SK-MEL-147 (ambas p53 selvagem). Foi observado um robusto efeito antitumoral in vitro onde transferência de hIbeta promoveu acumulo de células hipodiploides (mais que 80% da população celular 96 horas após transdução) e evidências de morte por apoptose (exposição de fosfatidilserina e atividade de caspases 3/7) em ambas as linhagens. Nas duas linhagens, o efeito bystander foi demonstrado quando a presença de poucas células transduzidas (ex., 10%) foi suficiente para promover o acumulo significativo de células hipodiploides (mais que 40% neste exemplo). Em modelo de terapia gênica in situ utilizando células SK-MEL-147, também foi observado forte efeito antitumoral da hIbeta com total remissão do tumor de todos os animais tratados sem recidiva durante noventa dias. A presença de hIbeta na circulação dos animais foi confirmada 48h após o tratamento com AdRGD-PG hbeta mas presente em somente dois de sete animais 90 dias após o tratamento, sugerindo que o tratamento inicial e não um efeito off target foi responsável pela resposta. Com a finalidade de investigar efeitos colaterais do sequestro do vetor adenoviral pelo fígado, observamos a concentração circulante das enzimas aminotransferase de aspartate e aminotransferase de alanine (AST e ALT, respectivamente), que se mostrou não alterada quando comparadas entre animais que receberam injeção do vetor tratamento, vetor controle e solução salina. Com nossos resultados concluímos que vetores adenovirais carreando interferon-beta humano são capazes de transduzir a linhagem de melanoma SK-MEL-147 in vitro e in vivo, promovendo efeito bystander e remissão tumoral sem indução de efeitos adversos / Melanoma represents less than 5% of all cases of skin cancer, although, when metastatic, prognosis is dire. However, the genotype of melanomas might provide an opportunity for therapeutic intervention since 90% of melanoma cases possess wild-type p53 and a great portion of these possess deletion of the chromosomal region encoding interferon beta. In previous studies, we developed the adenoviral vector AdRGD-PG that supplies expression of the transgene in response to p53 through the PG promoter and that utilizes the RGD tripeptide, allowing the adenovirus to transduce a wider range of cells due to the alterated mechanism of entrance. We have used this vector to deliver the murine version of interferon beta in murine models of melanoma gene therapy and immunotherapy, revealing a significant ability of interferon beta to inhibit cellular proliferation in vitro and in vivo and promote an anti-tumor immune response. In the present project, we aimed to adapt this strategy for a human melanoma model in order to reveal if the same impact will be observed. The AdRGD-PGhIbeta vector encoding the human interferon beta (hIbeta) cDNA was constructed and expression of the transgene confirmed after transduction of the established human melanoma cell lines SK-MEL-05 and SK-MEL-147 (both wild-type p53). A striking anti-tumor effect was observed in vitro where the transfer of hIbeta promoted an accumulation of hypodiploid cells (over 80% of the cellular population 96 hours after transduction) and evidence of death by apoptosis (exposure of phosphatidylserine and activity of caspases 3/7) in both cell lines. In these cell lines, a bystander effect was demonstrated when the presence of few transduced cells (ex., 10%) was enough to promote significant accumulation of hypodiploid cells (over 40% in this example). In a model of in situ gene therapy using SK-MEL-147 cells, hIbeta induced a strong anti-tumor effect including total tumor remission in all treated animals without relapse during ninety days. The presence of hIbeta in the circulation of the animals was confirmed 48h after treatment with AdRGD-PGhIbeta, but was present in only two of the seven animals 90 days post-treatment, suggesting that the initial treatment, not off target effects, was responsible for the response. With the goal of investigating collateral effects of adenoviral sequestration by the liver, we assayed the circulating concentration of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase (AST and ALT, respectively), which showed no alteration when compared with animals that received the treatment with a control vector or saline solution. We conclude that our adenoviral vector carrying human interferon-beta is capable of transducing the human melanoma cell line SK-MEL-147 in vitro and in vivo, promoting a bystander effect and tumor remission without inducing adverse effects

Objetivos: Os objetivos deste estudo foram: 1) determinar a eficácia da transferência gênica do vetor de adenovírus sorotipo 5, carreando o gene do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) solúvel humano (sVEGFR1) para a glândula lacrimal (GL); 2) investigar se a expressão de sVEGFR1 interfere na neovascularização da córnea (NVC), induzida por queimadura alcalina; 3) avaliar a segurança do procedimento. Métodos: Trinta e dois ratos Wistar foram submetidos à queimadura central da córnea direita com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M. Os animais foram divididos em três grupos e injetados diretamente em sua GL direita 25 ?l de vetores virais AdVEGFR1 (1x1010 pfu) (12 animais), 25 ?l do vetor AdNull (1x1010pfu) (10 animais), ou 25 ?l de solução salina (Controle). Após sete dias, a NVC foi observada e fotografada na lâmpada de fenda. A secreção lacrimal foi medida com fenol. A presença do sVEGFR1 na GL foi testada por qPCR (quantitative polymerase chain reaction) e a coloração, por imunofluorescência. O qPCR foi também utilizado para comparar o RNA mensageiro (RNAm) de ilterleucina-1beta (IL-1?), ilterleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-?) na GL e no gânglio do trigêmeo (GT). Resultados: O vetor AdVEGFR1 transfectou 83% dos ratos. O sVEGFR1 estava presente nas células acinares da GL. A NVC foi prevenida em nove de doze animais do grupo AdVEGFR1, em comparação com o grupo Ad-Null (3:10) e o grupo Controle (1:10) (p=0,0317). A secreção lacrimal e o RNAm das citocinas na GL e no GT foram semelhantes nos três grupos (p>0,05). Conclusões: A transferência gênica do vetor adenoviral para a GL demonstrou expressão local do sVEGFR1 humano, e evitou a NVC na maioria dos olhos expostos a queimaduras alcalinas, se mostrando seguro para a estrutura e função da GL. / Purpose: The aims of this study were: 1) to determine the efficacy of adenovirus vector serotype 5 (Ad) encoding human soluble VEGF receptor 1 (sVEGFR1) gene transfer to the lacrimal gland (LG); 2) to investigate whether expression of sVEGFR1 acts in corneal neovascularization (CNV), induced by alkali burn and; 3) to evaluate the safety of the procedure. Methods: AdVEGFR1viral vectors (25 ?l, 1x1010pfu) were injected in the right LG of rats and compared with AdNull vector (25 ?l, 1x1010pfu) or 25?l saline (Control) before cornea alkali burn with 1 M NaOH. After seven days, CNV was observed and photographed in the slit lamp. Tear secretion was measured with phenol red thread. The animals were tested for human VEGFR1 mRNA and protein in the LG by qPCR and immunofluorescence staining, respectively. qPCR was also used to compare the mRNA of IL-1?, IL-6, and TNF-? in LG and ipsilateral trigeminal ganglion (TG). Results: Ad-VEGFR1 transfected 83% of the rats. VEGFR1 was present in LG acinar cells. CNV was prevented in 9 of 12 animals of Ad-VEGFR1 group, compared to Ad-Null (3:10) and Control (1:10) (p=0.0317). The tear secretion and the cytokines mRNA in LG and TG were similar all three groups (p>0.05). Conclusion: Adenoviral vector gene transfer to LG as the has shown local expression of human sVEGFR1, as It prevented CNV in most of the eyes exposed to alkali burn and was safe for LG structure and function.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:30Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:30Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:30Z : No. of bitstreams: 3 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5) Publico-00376c.pdf: 1815310 bytes, checksum: ed9fd0e797e536bfb039209f57c2ba21 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:30Z : No. of bitstreams: 4 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5) Publico-00376c.pdf: 1815310 bytes, checksum: ed9fd0e797e536bfb039209f57c2ba21 (MD5) Publico-00376d.pdf: 1673355 bytes, checksum: 0f8e3c112d9bf024a9c7e52fb4859991 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:31Z : No. of bitstreams: 5 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5) Publico-00376c.pdf: 1815310 bytes, checksum: ed9fd0e797e536bfb039209f57c2ba21 (MD5) Publico-00376d.pdf: 1673355 bytes, checksum: 0f8e3c112d9bf024a9c7e52fb4859991 (MD5) Publico-00376e.pdf: 1965795 bytes, checksum: 373c9589bb7d477fe5d31f7838237e5b (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:31Z : No. of bitstreams: 6 Publico-00376a.pdf: 1954101 bytes, checksum: ab9812845158d2c4c296f255d1304dac (MD5) Publico-00376b.pdf: 1910033 bytes, checksum: 3104d18a155b521c486f36410aae2b4c (MD5) Publico-00376c.pdf: 1815310 bytes, checksum: ed9fd0e797e536bfb039209f57c2ba21 (MD5) Publico-00376d.pdf: 1673355 bytes, checksum: 0f8e3c112d9bf024a9c7e52fb4859991 (MD5) Publico-00376e.pdf: 1965795 bytes, checksum: 373c9589bb7d477fe5d31f7838237e5b (MD5) Publico-00376f.pdf: 1677823 bytes, checksum: d93d3b40f2c273e474e7fef525f351c8 (MD5) / E2F1 pertence a uma família de fatores de transcrição e possui papel central no controle da expressão de genes relacionados à regulação da proliferação celular, pois ativa genes que participam da síntese de DNA. A atividade de E2F1 é regulada por meio da proteína pRB que, quando fosforilada por quinases associadas à ciclinas (Ciclinas/CDK) libera este fator de transcrição, promovendo assim a proliferação. A disfunção da complexa via de regulação da divisão celular pode acarretar em proliferação exacerbada, sendo a superexpressão de E2F1 bastante comum em diferentes tipos de tumores. Este fenômeno pode ser o principal fator para a alta proliferação de células tumorais. Desta forma, a inibição da atividade de E2F1 através de RNA de interferência (RNAi) pode ser promissora como tratamento para a diminuição da proliferação de células de melanoma. Assim sendo, objetiva-se neste trabalho inativar por RNAi o gene E2f1 em células B16mCAR, derivadas de melanoma de C57BL/6 e que superexpressam o receptor CAR, e averiguar os efeitos de sua ausência na proliferação celular, tanto in vitro como in vivo. / E2F1 belongs to a family of transcription factors and plays a central role in controlling the expression of genes related to regulation of the cell-cycle progression, since it activates genes involved in DNA synthesis. The activity of E2F1 is regulated by pRB protein, that when phosphorylated by cyclin-dependent kinases cyclins (Cyclins/CDK) releases this transcription factor, thereby promoting proliferation. The dysfunction of the complex regulatory pathway of cell division can lead to excessive proliferation, which overexpression of E2F1 is quite common in different types of tumors. This phenomenon may be the main factor for the high proliferation of tumor cells. Thus, inhibition of E2F1 activity by RNA interference (RNAi) may be promising as a treatment for decreased proliferation of melanoma cells. Therefore, the purpose of this work is the inactivation of the E2f1 gene through RNAi in B16mCAR cells, derived from C57BL/6’s melanoma and overexpresses the CAR receptor, and also verifies the effects of its absence on cell proliferation in vitro and in vivo. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-29T11:10:52Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Hugo César Pereira Santos - 2015.pdf: 3535564 bytes, checksum: 4fc7d88b1da6008bc42c01f46e4f8d7a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-29T11:20:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Hugo César Pereira Santos - 2015.pdf: 3535564 bytes, checksum: 4fc7d88b1da6008bc42c01f46e4f8d7a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T11:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Hugo César Pereira Santos - 2015.pdf: 3535564 bytes, checksum: 4fc7d88b1da6008bc42c01f46e4f8d7a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The human adenoviruses (HAdV) infect people of all ages worldwide, causing a wide range of clinical syndromes, depending on the viral type. In immunocompromised hosts, as transplanted patients, HAdV infection can result in a bad prognosis. Some aspects of viral pathogenesis, such as the association between viremia and/or viral load with disseminated disease and the optimal moment to start the therapy, are still not well established in adult patients that have undergone allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (ASCT). Therefore, the main objective of this study was to monitor ASCT recipients for HAdV occurrence, and also correlate viral positivity, viral load and molecular variant with clinical symptoms and patients’ prognosis. For this, stool and serum from 21 patients were monitored in a 2 years period (from October/2012 to October/2014). Serum and fecal samples were screened by Nested-PCR, using primers targeting a partial region of the hexon gene (143bp). Fecal samples were further screened by a commercial enzyme immunoassay (EIA). In total, 57% of the patients had at least one positive sample (serum or stool) for HAdV. Patients presented high viral load (varying from 7,7x103 to 2x108 copies/mL), with a higher viral load in stool when compared to serum. Positive samples were submitted to genomic sequencing, revealing the occurrence of HAdV from C, D and F species. The main clinical symptom presented by infected patients was diarrhea, and graft-versus-host disease was the main intercurrence; however it was not possible to directly associate viral positivity to cause of death. We hope to contribute for a better understanding of the HAdV infection pattern in patients submitted to ASCT. Our data highlights the importance of the inclusion of HAdV testing in the routine laboratory exams of this group of patients. / Os adenovírus humanos (HAdV) podem infectar pessoas de todas as idades, causando uma ampla gama de quadros clínicos. Em pacientes imunocomprometidos, como os indivíduos que receberam transplante, a infecção por esses vírus pode resultar em pior prognóstico para o paciente. Determinados aspectos da patogenia viral, como a associação entre viremia e/ou carga viral com a doença disseminada, bem como o melhor momento para o início da terapia, não estão ainda bem esclarecidos em pacientes que foram submetidos ao transplante de células progenitoras hematopoiéticas (TACPH), principalmente em indivíduos adultos. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi realizar o monitoramento da infecção por HAdV e a caracterização molecular das variantes virais em pacientes submetidos ao TACPH, bem como determinar a carga viral e correlacionar a infecção com o quadro clínico e prognóstico dos pacientes. Foram analisadas amostras de soro e fezes de 21 pacientes submetidos ao TACPH no período de dois anos (de outubro/2012 a outubro/2014). As amostras de fezes foram triadas por ensaio imunoenzimático e por Nested-PCR, enquanto as amostras de soro foram triadas somente por Nested-PCR de uma região parcial do gene hexon (produto esperado de 143 pb). Foram detectadas amostras positivas de soro e/ou fezes de 57% dos pacientes. De forma geral, os pacientes do presente estudo apresentaram elevadas cargas virais (variando de 7,7x103 à 2x108 CG/mL), que foram mais elevadas nas fezes. As amostras positivas foram submetidas ao sequenciamento genômico e resultados revelaram a ocorrência de adenovírus das espécies C, D e F. O principal quadro clínico apresentado pelos pacientes foi a diarreia e a principal intercorrência observada, a doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Dez pacientes foram a óbito durante o período de estudo, entretanto, não foi possível associar a infecção por HAdV diretamente à causa mortis. Esperamos que os dados obtidos possam auxiliar no melhor entendimento do padrão da infecção dos HAdVs em pacientes submetidos ao TACPH, de forma a contribuir para que a pesquisa de adenovírus seja incluída na rotina de exames desses pacientes.

O melanoma representa menos de 5% de todos os cânceres de pele, porém, quando em estádio metastático possui prognóstico ruim. Entretanto, o genótipo dos melanomas pode prover uma oportunidade para intervenção terapêutica pelo fato de 90% dos casos de melanoma possuem p53 selvagem e grande parte destes possuem deleção na região cromossômica codificadora de interferon beta. Em prévios estudos, desenvolvemos o vetor adenoviral AdRGD-PG que fornece expressão do transgene em resposta à p53 através do promotor PG e ainda o tripeptídeo RGD, que possibilita que o adenovírus transduza uma maior gama de células pela alteração de seu mecanismo de entrada. Temos utilizado este vetor para entrega da versão murina de interferon beta em modelos de terapia gênica e imunoterapia de melanoma murino, revelando uma significativa habilidade do interferon beta em inibir a proliferação celular in vitro e in vivo e promover resposta imune antitumoral. No presente trabalho, os esforços se aplicam em adaptar essa estratégia em modelo de melanoma humano para observar se a mesma interação é encontrada. O vetor AdRGD-PGhIbeta, portador do cDNA de interferon beta humano (hIbeta) foi construído e expressão do transgene observada após transdução das linhagens estabelecidas de melanoma humano SK-MEL-05 e SK-MEL-147 (ambas p53 selvagem). Foi observado um robusto efeito antitumoral in vitro onde transferência de hIbeta promoveu acumulo de células hipodiploides (mais que 80% da população celular 96 horas após transdução) e evidências de morte por apoptose (exposição de fosfatidilserina e atividade de caspases 3/7) em ambas as linhagens. Nas duas linhagens, o efeito bystander foi demonstrado quando a presença de poucas células transduzidas (ex., 10%) foi suficiente para promover o acumulo significativo de células hipodiploides (mais que 40% neste exemplo). Em modelo de terapia gênica in situ utilizando células SK-MEL-147, também foi observado forte efeito antitumoral da hIbeta com total remissão do tumor de todos os animais tratados sem recidiva durante noventa dias. A presença de hIbeta na circulação dos animais foi confirmada 48h após o tratamento com AdRGD-PG hbeta mas presente em somente dois de sete animais 90 dias após o tratamento, sugerindo que o tratamento inicial e não um efeito off target foi responsável pela resposta. Com a finalidade de investigar efeitos colaterais do sequestro do vetor adenoviral pelo fígado, observamos a concentração circulante das enzimas aminotransferase de aspartate e aminotransferase de alanine (AST e ALT, respectivamente), que se mostrou não alterada quando comparadas entre animais que receberam injeção do vetor tratamento, vetor controle e solução salina. Com nossos resultados concluímos que vetores adenovirais carreando interferon-beta humano são capazes de transduzir a linhagem de melanoma SK-MEL-147 in vitro e in vivo, promovendo efeito bystander e remissão tumoral sem indução de efeitos adversos / Melanoma represents less than 5% of all cases of skin cancer, although, when metastatic, prognosis is dire. However, the genotype of melanomas might provide an opportunity for therapeutic intervention since 90% of melanoma cases possess wild-type p53 and a great portion of these possess deletion of the chromosomal region encoding interferon beta. In previous studies, we developed the adenoviral vector AdRGD-PG that supplies expression of the transgene in response to p53 through the PG promoter and that utilizes the RGD tripeptide, allowing the adenovirus to transduce a wider range of cells due to the alterated mechanism of entrance. We have used this vector to deliver the murine version of interferon beta in murine models of melanoma gene therapy and immunotherapy, revealing a significant ability of interferon beta to inhibit cellular proliferation in vitro and in vivo and promote an anti-tumor immune response. In the present project, we aimed to adapt this strategy for a human melanoma model in order to reveal if the same impact will be observed. The AdRGD-PGhIbeta vector encoding the human interferon beta (hIbeta) cDNA was constructed and expression of the transgene confirmed after transduction of the established human melanoma cell lines SK-MEL-05 and SK-MEL-147 (both wild-type p53). A striking anti-tumor effect was observed in vitro where the transfer of hIbeta promoted an accumulation of hypodiploid cells (over 80% of the cellular population 96 hours after transduction) and evidence of death by apoptosis (exposure of phosphatidylserine and activity of caspases 3/7) in both cell lines. In these cell lines, a bystander effect was demonstrated when the presence of few transduced cells (ex., 10%) was enough to promote significant accumulation of hypodiploid cells (over 40% in this example). In a model of in situ gene therapy using SK-MEL-147 cells, hIbeta induced a strong anti-tumor effect including total tumor remission in all treated animals without relapse during ninety days. The presence of hIbeta in the circulation of the animals was confirmed 48h after treatment with AdRGD-PGhIbeta, but was present in only two of the seven animals 90 days post-treatment, suggesting that the initial treatment, not off target effects, was responsible for the response. With the goal of investigating collateral effects of adenoviral sequestration by the liver, we assayed the circulating concentration of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase (AST and ALT, respectively), which showed no alteration when compared with animals that received the treatment with a control vector or saline solution. We conclude that our adenoviral vector carrying human interferon-beta is capable of transducing the human melanoma cell line SK-MEL-147 in vitro and in vivo, promoting a bystander effect and tumor remission without inducing adverse effects

Objetivos: Os objetivos deste estudo foram: 1) determinar a eficácia da transferência gênica do vetor de adenovírus sorotipo 5, carreando o gene do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) solúvel humano (sVEGFR1) para a glândula lacrimal (GL); 2) investigar se a expressão de sVEGFR1 interfere na neovascularização da córnea (NVC), induzida por queimadura alcalina; 3) avaliar a segurança do procedimento. Métodos: Trinta e dois ratos Wistar foram submetidos à queimadura central da córnea direita com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M. Os animais foram divididos em três grupos e injetados diretamente em sua GL direita 25 ?l de vetores virais AdVEGFR1 (1x1010 pfu) (12 animais), 25 ?l do vetor AdNull (1x1010pfu) (10 animais), ou 25 ?l de solução salina (Controle). Após sete dias, a NVC foi observada e fotografada na lâmpada de fenda. A secreção lacrimal foi medida com fenol. A presença do sVEGFR1 na GL foi testada por qPCR (quantitative polymerase chain reaction) e a coloração, por imunofluorescência. O qPCR foi também utilizado para comparar o RNA mensageiro (RNAm) de ilterleucina-1beta (IL-1?), ilterleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-?) na GL e no gânglio do trigêmeo (GT). Resultados: O vetor AdVEGFR1 transfectou 83% dos ratos. O sVEGFR1 estava presente nas células acinares da GL. A NVC foi prevenida em nove de doze animais do grupo AdVEGFR1, em comparação com o grupo Ad-Null (3:10) e o grupo Controle (1:10) (p=0,0317). A secreção lacrimal e o RNAm das citocinas na GL e no GT foram semelhantes nos três grupos (p>0,05). Conclusões: A transferência gênica do vetor adenoviral para a GL demonstrou expressão local do sVEGFR1 humano, e evitou a NVC na maioria dos olhos expostos a queimaduras alcalinas, se mostrando seguro para a estrutura e função da GL. / Purpose: The aims of this study were: 1) to determine the efficacy of adenovirus vector serotype 5 (Ad) encoding human soluble VEGF receptor 1 (sVEGFR1) gene transfer to the lacrimal gland (LG); 2) to investigate whether expression of sVEGFR1 acts in corneal neovascularization (CNV), induced by alkali burn and; 3) to evaluate the safety of the procedure. Methods: AdVEGFR1viral vectors (25 ?l, 1x1010pfu) were injected in the right LG of rats and compared with AdNull vector (25 ?l, 1x1010pfu) or 25?l saline (Control) before cornea alkali burn with 1 M NaOH. After seven days, CNV was observed and photographed in the slit lamp. Tear secretion was measured with phenol red thread. The animals were tested for human VEGFR1 mRNA and protein in the LG by qPCR and immunofluorescence staining, respectively. qPCR was also used to compare the mRNA of IL-1?, IL-6, and TNF-? in LG and ipsilateral trigeminal ganglion (TG). Results: Ad-VEGFR1 transfected 83% of the rats. VEGFR1 was present in LG acinar cells. CNV was prevented in 9 of 12 animals of Ad-VEGFR1 group, compared to Ad-Null (3:10) and Control (1:10) (p=0.0317). The tear secretion and the cytokines mRNA in LG and TG were similar all three groups (p>0.05). Conclusion: Adenoviral vector gene transfer to LG as the has shown local expression of human sVEGFR1, as It prevented CNV in most of the eyes exposed to alkali burn and was safe for LG structure and function.

Viruses are etiologic agents of a great number of diseases of human beings and animals. However, there are only a little amount antiviral medicines available that is almost exclusively used in human health. Several studies have demonstrated that propolis has biological activities against virus, bacteria and fungi. Its chemical composition is diverse varying according to season, plants available and collection. The antiviral activity of ethanolic extracts of propolis have already been described for some human viruses. The aim of this study was to evaluate the antiviral activity of propolis ethanolic extracts against two viruses causing respiratory disease in small animals, the feline calicivirus (FCV) and canine adenovirus 2 (CAV-2), and also the bovine diarrheal disease virus (BVDV).Two samples of ethanolic extracts of propolis were used; one obtained in the lab and another obtained commercially. In order to perform the experiments the MTT test ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) was used to determine the 50% cytotoxic concentration (CC50), the 50% inhibitory concentration (IC50) and, the terapeuthic index (TI=IC50/CC50). The propolis extracts were added to the cell cultures in different moments of the viral infection. They were included before virus inoculation, after virus inoculation, and before and after virus inoculation. The two propolis samples showed similarities in the qualitative analysis but they had small differences in the quantitative analysis. The CC50 of the extracts varied among 251 and 343μg/ml and the commercial extract showed less toxicity. Both extracts demonstrated better antiviral activity when added before virus inoculation and the ITs varied from 6 to 13. The best results were obtained with the propolis extracted in the lab. The BVD was the virus showing the greater sensitivity to the ethanolic extracts in the conditions applied. Taken all the data together, it can be concluded that the ethanolic extract of propolis has a potential for future use as a medicine in the therapy of respiratory disease caused by CAV-2, and, also, that the action mechanisms on BVDV should be better evaluated in detail regarding the hepatitis C virus (HCV). / Os vírus são os agentes etiológicos de um grande número de enfermidades em seres humanos e animais, no entanto, há um pequeno número de fármacos antivirais disponíveis para o uso que é feito quase exclusivamente na medicina humana. Estudos demonstram que a própolis apresenta variada atividade biológica frente a vírus, bactérias e fungos. Sua composição química é bastante diversa, podendo variar conforme a época, vegetação e área de coleta. A atividade antiviral de extratos aquosos e etanólicos de própolis já foi descrita para alguns vírus humanos. O presente trabalho tem como objetivo avaliar a atividade antiviral do extrato de própolis frente a dois vírus causadores de doença respiratória em pequenos animais, o calicivírus felino (FCV) e o adenovírus canino tipo 2 (CAV-2), e também ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV). Foram testadas neste experimento duas amostras de extrato etanólico de própolis, uma delas obtida comercialmente e a outra extraída no laboratório. Para realizar este estudo utilizou-se o método colorimétrico do MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo), através do qual determinou-se a concentração citotóxica a 50% (CC50), concentração inibitória a 50% (IC50) e o índice terapêutico (IT=IC50/CC50). Os extratos de própolis foram adicionados ao cultivo celular em diferentes momentos da infecção viral. Estes foram incluídos antes da inoculação viral, depois da inoculação viral, e antes e depois da inoculação viral. As duas amostras de própolis apresentaram similaridades na análise qualitativa e pequenas diferenças na análise quantitativa. A CC50 destes extratos variou de 251 a 343μg/ml sendo que o extrato comercial apresentou-se ligeiramente menos tóxico. Ambos os extratos demonstraram melhor atividade antiviral quando adicionados anteriormente à inoculação viral apresentando ITs que variaram de 6 a 13. Os melhores resultados foram obtidos com o própolis extraído no laboratório. O BVDV foi o vírus que demonstrou maior sensibilidade ao extrato etanólico de própolis nas condições experimentais aplicadas. Levando-se em consideração os resultados obtidos, pode-se concluir que o extrato etanólico de própolis apresenta potencial para futura utilização como fármaco no tratamento de doenças respiratórias causadas pelo CAV2 e que o mecanismo de ação sobre o BVDV deve ser avaliado com maiores detalhes com vistas ao vírus da hepatite C (HCV).

A destruição funcional das vias de controle do ciclo celular constituem um evento comuns em todos os tumores humanos. Muitos estudos associam mutações em p53 com mau prognostico no tratamento do câncer. Nesse trabalho, visamos a geração e caracterização de linhagens isogênicas portando diferentes mutantes de p53 como modelo de estudo para remediação simultânea de p53 e p16 na presença de mutantes hotspots específicos. Os mutantes R175H e R248Q não geraram alterações na cinética de proliferação da linhagem H358, mas levaram a um aumento de 27,5% na eficiência de plaqueamento e, no caso de R248Q, ao dobro de eficiência na formação de colônias em suspensão. Os resultados do tratamento das linhagens isogênicas com adenovírus Adp16 e Adp53 mostraram que os mutantes não interferiram no parada do ciclo celular em G1 induzida por p16. / Alterations of the cell cycle pathway are a common event in all human tumors. Several studies have shown a correlation between hotspot mutations and an unfavorable profile for cancer therapies. Hence, this study aims the generation and characterization of isogenic cell lines, harboring p53 mutants, as model to investigate the replacement of p53 and p16 genes on these mutant H358 cell lines. Our data identified that neither p53R175H nor p53R248Q mutants accelerated cell cycle progression. However, both leads to a 27,5% increased plate efficiency while R248Q leads to a two-fold increases in the number of colonies formed in soft agar. Our data also showed that the mutants did not affect the efficiency of p16 replacement.