Embryonic stem cells (ESCs) are derived from the inner cell mass (ICM) of the embryo that have great potential for regenerative therapies because of their ability to self-renew and differentiate into almost all cell types. However, this developmental potential is influenced by the local cellular microenvironment, including cell surface bound ligands. In this study, we synthesized an artificial stem cell niche wherein vascular endothelial growth factor A (VEGFA) was functionally immobilized in an agarose hydrogel. Immobilized VEGFA treatments were able to upregulate mesodermal markers, brachyury and VEGF receptor 2, by day 4 and were CD34+CD41+ by day seven. Subsequently, VEGFA immobilized treatments were able to generate colony forming cells by day fourteen. This work demonstrates our ability to use functionalized hydrogels to guide ESCs toward blood progenitor cells and serves as a useful tool to replicate aspects of the embryonic microenvironment.

A aplicação de métodos de tipificação baseados na caracterização fenotípica e genotípica em vários pontos da cadeia de produção de suínos pode ser uma importante ferramenta para identificar a principal fonte de contaminação por Salmonella sp. A partir disso, o trabalho propôs tipificar uma coleção de 97 amostras de Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium (ST) isolada de suínos levados ao abate em três diferentes frigoríficos no Rio Grande do Sul, por meio de fagotipificação, hibridização com IS200, resistência a antimicrobianos, amplificação da região spvR, amplificação de sequências repetitivas (rep-PCR) e PFGE. Paralelamente, os isolados de ST foram avaliados frente a dois desinfetantes (amônia quaternária e iodofor) pela técnica da diluição em tubo. Os isolados foram classificados em 12 fagotipos distintos, sendo o DT177 o mais freqüentemente identificado. Houve o predomínio de um padrão único de hibridização com o IS200 e em apenas três isolados, a região spvR foi detectada. Um alto número de amostras resistentes à tetraciclina, sulfonamida e estreptomicina foi encontrado, sendo o perfil de resistência relacionado ao frigorífico de origem dos isolados. No rep-PCR, usando seqüências iniciadoras para REP e ERIC, um único padrão de bandas foi gerado entre os isolados de ST. A análise por PFGE mostrou doze diferentes padrões de bandas. Sessenta e quatro isolados apresentaram um padrão idêntico no PFGE. Todas amostras foram inibidas pelo composto quaternário de amônio, na concentração recomendada pelo fabricante e numa concentração inferior à indicada. Frente ao iodofor, quatro amostras mostraram-se resistentes na concentração indicada e 59 na sub-concentração. A combinação da fagotipificação e do perfil de PFGE permitiu alcançar uma melhor discriminação das amostras, sendo essas técnicas consideradas as mais adequadas. Por outro lado, a presença de linhagens clonais parecem estar presentes na região, indicando possíveis pontos comuns de infecção.

A aplicação de métodos de tipificação baseados na caracterização fenotípica e genotípica em vários pontos da cadeia de produção de suínos pode ser uma importante ferramenta para identificar a principal fonte de contaminação por Salmonella sp. A partir disso, o trabalho propôs tipificar uma coleção de 97 amostras de Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium (ST) isolada de suínos levados ao abate em três diferentes frigoríficos no Rio Grande do Sul, por meio de fagotipificação, hibridização com IS200, resistência a antimicrobianos, amplificação da região spvR, amplificação de sequências repetitivas (rep-PCR) e PFGE. Paralelamente, os isolados de ST foram avaliados frente a dois desinfetantes (amônia quaternária e iodofor) pela técnica da diluição em tubo. Os isolados foram classificados em 12 fagotipos distintos, sendo o DT177 o mais freqüentemente identificado. Houve o predomínio de um padrão único de hibridização com o IS200 e em apenas três isolados, a região spvR foi detectada. Um alto número de amostras resistentes à tetraciclina, sulfonamida e estreptomicina foi encontrado, sendo o perfil de resistência relacionado ao frigorífico de origem dos isolados. No rep-PCR, usando seqüências iniciadoras para REP e ERIC, um único padrão de bandas foi gerado entre os isolados de ST. A análise por PFGE mostrou doze diferentes padrões de bandas. Sessenta e quatro isolados apresentaram um padrão idêntico no PFGE. Todas amostras foram inibidas pelo composto quaternário de amônio, na concentração recomendada pelo fabricante e numa concentração inferior à indicada. Frente ao iodofor, quatro amostras mostraram-se resistentes na concentração indicada e 59 na sub-concentração. A combinação da fagotipificação e do perfil de PFGE permitiu alcançar uma melhor discriminação das amostras, sendo essas técnicas consideradas as mais adequadas. Por outro lado, a presença de linhagens clonais parecem estar presentes na região, indicando possíveis pontos comuns de infecção.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutPWT.pdf: 1538718 bytes, checksum: a2cfebb6aac530f7f09069137eaebc60 (MD5) Previous issue date: 2003-08-22 / Universidade Federal de Minas Gerais / High value food protein hydrolysates can be obtained by sequential hydrolysis of proteins with trypsin, chymotrypsin, carboxypeptidase A (CPA) and Alcalase® (commercial preparation of subtilisin). For the process to be economically feasible, immobilized and stabilized enzymes should be used, and the kinetics of the reactions with this kind of biocatalyst must be known. To contribute to the development of such a process, this work focused on preparing stable CPA and Alcalase® derivatives, and on studying the kinetics of hydrolysis of polypeptides. These polypeptides were produced after the sequential hydrolysis of cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin. Cross-linked agarose beads (6% w/w for CPA, and 10% w/w for Alcalase®) were used as immobilization support, and different methods of activation and immobilization conditions were studied. A highly activated glyoxyl-agarose support (75 and 210 µeqv of aldehyde groups per milliliter of support, respectively for CPA and Alcalase®), 25oC, pH 10.05, and longer contact time (48 hours for CPA and 96 hours for Alcalase®), provided the best derivatives. CPA-glyoxyl agarose-6% and Alcalase®-glyoxyl agarose-10% derivatives were ca. 213- and 515-fold more stable than the soluble enzymes. These stabilized derivatives retained 42% (for CPA-glyoxyl agarose- 6%) and 54% (for Alcalase®-glyoxyl agarose-10%) of the immobilized activity, assessed with small substrates (hippuryl-L-Phe for CPA, and Boc-Ala-ONp for Alcalase®) and large substrates (Phe carboxy-terminal polypeptides for CPA, and casein for Alcalase®). These results showed that all activity losses were caused by the distortion of the immobilized enzyme molecule, due to the enzyme-support multi-interaction. Derivatives prepared using glutaraldehyde-agarose presented spatial hindrances when hydrolysis of macromolecular substrates was taking place. The amino acid analysis of acid hydrolysates of the soluble and immobilized enzymes (for the more stable derivatives) showed that ca. 30 and 40%, for CPA and Alcalase®, of the lysine residues were linked to the support, suggesting that there is intense multi-point interactions between enzyme and support, through covalent linkages. The temperatures for maximum hydrolysis rates, using respectively stabilized CPA and Alcalase® derivatives, were 20oC and 10oC higher than the ones obtained using soluble enzymes. The most stable CPA-glyoxyl derivative could efficiently be used for polypeptides (cheese whey proteins hydrolyzed with trypsin and chymotrypsin) hydrolysis at high temperatures (e.g., 60oC), releasing ca. 2-fold more aromatic amino acids (Tyr, Phe and Trp) than the soluble enzyme, under the same operational conditions. The casein degree of hydrolysis, at 80oC, obtained using the most stable Alcalase®-glyoxyl derivative, was 2-fold higher than the one obtained with the soluble enzyme. Hence, the produced derivatives allow the design of a continuous process for the production of protein hydrolysates, which are composed of small peptides and have a low concentration of aromatic amino acids. This process can use higher temperature, avoiding microbial growth in the reaction medium. The C-terminal residues hydrolysis at 45oC (pH 7.0), catalyzed by CPA-glyoxyl, could be adequately represented by Michaelis-Menten kinetics, with substrate and product inhibition. The kinetic model was expressed in terms of C-terminal peptide bonds that can be hydrolyzed by CPA, regardless of the amino acid released. The concentration of each released amino acid as a function of the time of reaction could be well fitted by empirical models (hyperbolic or exponential decay). Hence, from the kinetics of total hydrolysis, it is possible to estimate the concentration of each amino acid as function of time. The hydrolysis catalyzed by the highly-loaded CPA-glyoxyl agarose-6% derivative was not limited by intra-particle diffusion resistance. The hydrolysis of peptides (long-time batch) at 50oC (pH 9.5), catalyzed by Alcalase®-glyoxyl agarose-10% derivative, could be adequately represented by Michaelis-Menten kinetics with product inhibition, and the kinetic parameters Vmax, KM e KI were correlated against the substrate initial degree of hydrolysis (total degree of hydrolysis obtained by previous action of trypsin and chymotrypsin on cheese whey proteins). Long-time batch hydrolyses, catalyzed by highly-loaded Alcalase-glyoxyl agarose-10% derivative, presented diffusion effects, with effectiveness coefficient, ηI, of ca. 0.5. / Hidrolisados protéicos de alto valor agregado podem ser obtidos através da hidrólise seqüencial de proteínas com tripsina, quimotripsina, carboxipeptidase A (CPA) e Alcalase® (preparação comercial de subtilisina). A viabilidade econômica do processo requer a utilização de enzimas imobilizadas e estabilizadas e o conhecimento da cinética das reações catalisadas com esse tipo de biocatalisador. Visando contribuir para o desenvolvimento de tal processo, os objetivos deste trabalho foram preparar derivados estáveis de CPA e Alcalase® e estudar a cinética da hidrólise de polipeptídios. Esses polipeptídios foram produzidos por hidrólise seqüencial de proteínas do soro de queijo com tripsina e quimotripsina. Utilizandose agarose entrecruzada (6% p/p para CPA e 10% p/p para Alcalase®) como suporte de imobilização, foram estudados diferentes métodos de ativação e condições de imobilização. Suportes glioxil-agarose altamente ativados (75 e 210 µeqv de grupos aldeídos por mililitro de suporte, respectivamente para CPA e Alcalase®) 25oC, pH 10,05 e tempo prolongado de contato (48 horas para CPA e 96 horas para Alcalase®) produziram os melhores derivados. Os derivados CPA-glioxil agarose-6% e Alcalase®-glioxil agarose-10% eram aproximadamente 213 e 515 vezes mais estáveis que as respectivas enzimas na forma solúvel. Esses derivados estabilizados retiveram 42% (para CPA-glioxil agarose-6%) e 54% (para Alcalase®-glioxil agarose-10%) da atividade imobilizada, medidas com substratos de menor massa molecular (hipuril-L-Phe para CPA, e Boc-Ala-ONp para Alcalase®) e substratos de maior massa molecular (polipeptídios com Phe carboxi-terminal para CPA, e caseína para Alcalase®). Esses resultados mostraram que toda a perda de atividade estava associada à distorção da molécula de enzima imobilizada, devido a multi-interação enzima-suporte. Derivados preparados em glutaraldeído-agarose-6% apresentaram impedimentos estéricos na hidrólise de substratos macromoleculares. A análise de aminoácidos de hidrolisados ácidos das enzimas solúveis e imobilizadas (para os derivados mais estáveis) mostrou que aproximadamente 30 e 40%, para CPA e Alcalase®, dos resíduos de lisina ligaram-se no suporte, sugerindo a existência de uma intensa ligação covalente multipontual entre a enzima e o suporte. As temperaturas de máximas taxas de hidrólise, usando respectivamente os derivados estabilizados de CPA e Alcalase®, foram 20oC e 10oC mais elevadas que aquelas obtidas para as respectivas enzimas solúveis. O derivado CPA-glioxil mais estável pôde ser eficientemente utilizado na hidrólise de polipeptídios (proteínas do soro de queijo hidrolisadas com tripsina e quimotripsina) a altas temperaturas (por exemplo, 60oC), liberando duas vezes mais aminoácidos aromáticos (Tyr, Phe e Trp) do que a enzima solúvel, sob as mesmas condições operacionais. O grau de hidrólise de caseína, a 80oC, obtido com o derivado Alcalase®-glioxil mais estável, foi duas vezes maior que aquele obtido com a enzima solúvel. Assim, os derivados produzidos permitem o projeto de um processo contínuo para a produção de hidrolisados protéicos, compostos de pequenos peptídios e com uma baixa concentração de aminoácidos aromáticos. Esse processo pode ser conduzido a alta temperatura, evitando-se assim problemas de contaminação microbiana do meio reacional. A hidrólise de resíduos carboxi-terminais a 45oC (pH 7,0), catalisada pelo derivado CPA-glioxil, pôde ser adequadamente representada por cinética de Michaelis-Menten, com inibição pelo substrato e produto. O modelo cinético foi representado em termos de ligações peptídicas carboxiterminais hidrolisáveis pela CPA, sem considerar-se a natureza do resíduo a ser liberado. A concentração de cada aminoácido liberado em função do tempo de hidrólise pôde ser ajustada por modelos empíricos (hiperbólico e decaimento exponencial). Assim, a partir da cinética de hidrólise total, é possível estimar-se a concentração de cada aminoácido em função do tempo de hidrólise. A hidrólise catalisada pelo derivado CPA-glioxil agarose-6%, com alta carga enzimática imobilizada, não foi limitada pela resistência difusional intrapartícula. A hidrólise de peptídios (bateladas de longa duração) a 50oC (pH 9,5), catalisada pelo derivado Alcalase®-glioxil agarose-10%, pôde ser adequadamente representada por cinética de Michaelis-Menten com inibição pelo produto, e os parâmetros cinéticos Vmax, KM e KI foram correlacionados com o grau de hidrólise inicial do substrato (grau de hidrólise total obtido pela prévia ação de tripsina e quimotripsina sobre as proteínas do soro de queijo). Hidrólises em batelada de longa duração, catalisadas por Alcalase®-glioxil agarose-10% com alta carga enzimática imobilizada, apresentaram efeitos de difusão, com um fator de efetividade, ηI, de aproximadamente 0,5.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-03-20T19:31:23Z No. of bitstreams: 1 RogerioPereiraDeQueiroz_DISSERT.pdf: 2044372 bytes, checksum: 84f05f3061b292c5a47b28fb9bdebc12 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-03-22T00:05:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 RogerioPereiraDeQueiroz_DISSERT.pdf: 2044372 bytes, checksum: 84f05f3061b292c5a47b28fb9bdebc12 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T00:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RogerioPereiraDeQueiroz_DISSERT.pdf: 2044372 bytes, checksum: 84f05f3061b292c5a47b28fb9bdebc12 (MD5) Previous issue date: 2016-08-22 / A agarose ? um pol?mero natural extra?do de algas que possui a propriedade de formar g?is f?sicos, quando retirado calor do sistema. Essa propriedade possui grande aplicabilidade nas ind?strias aliment?cia e farmac?utica, principalmente em an?lises de DNA. Para esse trabalho, foram preparadas solu??es aquosas em concentra??es diferentes de agarose. Medidas de espalhamento din?mico de luz foram feitas, enquanto se alterava a temperatura do sistema, a fim de obter estruturas mais ou menos organizadas das macromol?culas. Para as medidas de espalhamento, a equa??o Kohrausch-William-Watts (KWW) foi ajustada aos dados, de modo a obter a taxa de relaxa??o m?dia do processo. Adicionalmente, foram feitos testes de reologia das amostras, tamb?m com a varia??o da temperatura. Para ambas as t?cnicas, foram feitos ajustes matem?ticos, com a inten??o de estudar a transi??o h?lice-novelo das cadeias polim?ricas no decorrer da altera??o da temperatura, relacionando-as atrav?s do c?lculo da energia de ativa??o aparente do processo. Nas duas abordagens foi constatado que a energia tende a diminuir para solu??es dilu?das e para altas temperaturas. / The agarose is a natural polymer extract from red algae (Rhodophyceae). This polysaccharide can form physical gels when is removed heat from the system. This property has great applicability in the food and pharmaceutical industries, particularly in DNA analysis. For this work we prepared aqueous solutions at different concentrations of agarose. Measures of Dynamic Light Scattering (DLS) were made while the system temperature was altered so as to obtain structures more or less organized of macromolecules. For DLS measurements, the Kohrausch-William-Watts equation (KWW) was fitted to the data to obtain the average of relaxation rate of the process. Additionally rheometry tests were made also with the temperature variation. For both techniques, were made mathematical adjustments with the intention of studying the helix-coil transition of the polymer chains during the temperature change, relating them by calculating the apparent activation energy. In both approaches it was found that energy tends to decrease for dilute solutions and higher temperatures.

A aplicação de métodos de tipificação baseados na caracterização fenotípica e genotípica em vários pontos da cadeia de produção de suínos pode ser uma importante ferramenta para identificar a principal fonte de contaminação por Salmonella sp. A partir disso, o trabalho propôs tipificar uma coleção de 97 amostras de Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium (ST) isolada de suínos levados ao abate em três diferentes frigoríficos no Rio Grande do Sul, por meio de fagotipificação, hibridização com IS200, resistência a antimicrobianos, amplificação da região spvR, amplificação de sequências repetitivas (rep-PCR) e PFGE. Paralelamente, os isolados de ST foram avaliados frente a dois desinfetantes (amônia quaternária e iodofor) pela técnica da diluição em tubo. Os isolados foram classificados em 12 fagotipos distintos, sendo o DT177 o mais freqüentemente identificado. Houve o predomínio de um padrão único de hibridização com o IS200 e em apenas três isolados, a região spvR foi detectada. Um alto número de amostras resistentes à tetraciclina, sulfonamida e estreptomicina foi encontrado, sendo o perfil de resistência relacionado ao frigorífico de origem dos isolados. No rep-PCR, usando seqüências iniciadoras para REP e ERIC, um único padrão de bandas foi gerado entre os isolados de ST. A análise por PFGE mostrou doze diferentes padrões de bandas. Sessenta e quatro isolados apresentaram um padrão idêntico no PFGE. Todas amostras foram inibidas pelo composto quaternário de amônio, na concentração recomendada pelo fabricante e numa concentração inferior à indicada. Frente ao iodofor, quatro amostras mostraram-se resistentes na concentração indicada e 59 na sub-concentração. A combinação da fagotipificação e do perfil de PFGE permitiu alcançar uma melhor discriminação das amostras, sendo essas técnicas consideradas as mais adequadas. Por outro lado, a presença de linhagens clonais parecem estar presentes na região, indicando possíveis pontos comuns de infecção.

Over the last decade, microfluidics has emerged as a distinct new field with promising applications for diverse research areas. The ability to precisely control fluids at the microscale allows the execution of a variety of programmable semi-automatic operations on the same device, effectively forming a lab-on-a-chip. In particular, droplet-based microfluidic systems – which reliably generate highly uniform microdroplets at a high throughput – enable the controlled compartmentalization of biological material and have the potential to influence mainstream biomedical research. In this thesis, a microfluidic platform is presented that allows the encapsulation of viable cells in agarose microcapsules for applications in cell–based therapy. As an improvement to pre-existing methods of cell encapsulation, the proposed system combines continuous high throughput cell-encapsulation with on-chip microcapsule gelation and purification.

This master's thesis was focused on the study of interaction of some organic azo dyes (model diffusion probes) with cationic biopolymer chitosan. This interactions were realized via diffusion processes in hydrogel media based on thermoreversible agarose. The main aim was study of influence of pH of solution on the diffusion process. Interactions of used dyes are based on electrostatic character. The aminogroup of chitosan interacts with the functional group of chosen dyes (anionic sulfonic group) and thus affects the process of diffusion. The model diffusion compounds were chosen organic anionic dyes Chicago sky blue 6B (C.I. 24 410), Sirius red (C.I. 35 780) and Reactive blue 49 (C.I. 621 526). The important content of this diffusion method is a monitoring of the time progression of diffusion profile by UV-VIS spectrophotometry. The presented work follows the bachelor thesis and shows comprehensive view of the reactivity of chitosan and its behavior in different systems. Unsteady diffusion in cuvettes appears to be a universal method for the study of reactivity of biopolymers and for the study of transport processes in hydrogel media. The diffusion method is universal, easy and cheap.

This diploma thesis was focused on the system of agarose hydrogels with micellar domains. Polysaccharide agarose was used for the preparation of hydrogel matrices. Septonex was chosen as a surfactant. The release of solubilizate from the agarose hydrogel matrix was studied with a hydrophobic dye Sudan III in order to obtain a model system of hydrophobic solubilized drugs. Sudan III was solubilized via surfactant´s micels. Subsequently, this micellar aqueous solution with the dissolved dye was used to prepare the agarose hydrogel. The system was prepared in the environment of deionized water and physiologic solution. The gradual release of the dye into deionized water and physiologic solution was studied for 22 days using the UV-VIS spectrophotometry method. It was found that after 14 days the concentration of the releasing dyes into the deionized water was decreased. The cause is that after 14 and 22 days there was a slight degradation of gels, which was detected using the rheology method. Using the rheology method it was also found that Septonex does not affect the gel formation process.

Most of the bio-applications of semiconductor quantum dots (QDs) show and utilize their superior optical properties over organic fluorophores. An estimated 3-35% of all cancer deaths could be avoided through early detection, therefore, there is a critical need to develop sensitive probes. The objectives of this work are: Research the phenomena of "blue" photoluminescence (PL) spectral shift on the dried bioconjugated QDs and develop the relevant mechanism; Develop a methodology that will allow successful confirmation of the bioconjugation reaction between biomolecules and QDs; Propose a modification of an existent method or approach to employ the "blue" spectral shift of bioconjugated QDs for early cancer detection. Results indicated that the "blue" spectral shift, observed for dried on the silicon substrates bioconjugated QDs, is increased with the time of storage and reaches 30-40nm in 14 days. It is accelerated at elevated temperatures and slowed down at lower temperatures. Larger size QDs generate spectral shifts of larger magnitudes, and the spectral shift is positively correlated with the biomolecule's size/weight. This phenomenon is explained by elastic and compression stress due to nonhomogenious drying of the QD droplet and the reaction with the solid surface. Agarose gel electrophoresis technique, optimized with organic dye fluorescamine, is suitable for bioconjugation verification. The optimal running parameters were found to be 2% agarose gel, 1.5V working voltage, 0.5X TBE as a running buffer, and about 120 mins running time. The spectral shift was implemented for improving the sensitivity of Prostate Specific Antigen (PSA) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). It was found that QD ELISA could be as much, as 100 times more sensitive than the regular commercial ELISA, based on the enzymatic detection. The results of this work show that QDs may be very useful for early detection of several types of cancers, including prostate cancer in men and breast/ovarian/uterine cancers in women.