A fosfatase alcalina é uma fosfomonohidrolase inespecífica, capaz de hidrolisar monoésteres de fosfato, pirofosfato, diésteres de fosfato, bem como catalisar reações de transfosforilação, e é denominada \"alcalina\" por sua habilidade de efetuar estas reações mais eficientemente em pH acima do neutro (pH 8-11). O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia para a obtenção de uma fração de membrana rica em fosfatase alcalina a partir de culturas de células osteoblásticas, provenientes de medula óssea de rato, sem a utilização de solventes orgânicos, colagenase ou outras proteases. O procedimento padronizado é simples e reprodutível, com a vantagem da considerável redução do tempo necessário para se obter esta fração de membrana, o que contribui para um menor efeito desnaturante sobre a enzima. A fosfatase alcalina é inserida à membrana plasmática por uma âncora GPI e foi solubilizada tanto com polidocanol (1%, p/v) quanto com PIPLC (0,2 U/mL), hidrolisando diversos substratos (PNFF, ATP, PPi, ADP, ?-glicerofosfato, glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato) e sendo inibida por inibidores clássicos deste grupo de enzimas (levanisol, teofilina, ZnCl2, vanadato, fosfato e arsenato). Os efeitos de lipossomos constituídos por DPPC, DPPC:DPPS (9:1 e 8:2, razão molar) e DPPC:DODAB (9:1 e 8:2, razão molar) na habilidade tanto de inserção da enzima nos sistemas vesiculares, bem como de modulação da atividade da enzima reconstituída, também foram avaliados. A reconstituição da fosfatase alcalina nos lipossomos mistos constituídos de DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) e DPPC:DODAB (8:2) proporcionou máxima incorporação da atividade PNFFase da enzima (cerca de 90%, 75% e 90%, respectivamente) após 4 horas, 5 horas e 40 minutos, respectivamente, de incubação dos diversos lipossomos com a proteína. No entanto, utilizando lipossomos de DPPC:DODAB (9:1), apenas cerca de 50% da atividade PNFFase da enzima foi incorporada aos sistemas mesmo após 5 horas de incubação. Para os lipossomos com carga positiva, uma maior proporção de DODAB nos sistemas de DPPC favoreceu a inserção da fosfatase alcalina aos sistemas após um curto período de incubação. Para os lipossomos com carga negativa, as diferentes proporções de DPPS utilizadas não exerceram grande influência tanto na velocidade de incorporação quanto na quantidade de enzima incorporada aos sistemas. Para todos os sistemas utilizados, o processo de incorporação é tempo dependente. A eletroforese dos proteolipossomos de DPPC revelou a presença de uma única banda protéica bem intensa, com massa molecular ao redor de 60 kDa (quando desnaturada), que apresentou atividade de fosfomonohidrolase em condição não-desnaturante, com massa molecular de 120 kDa. Assim, com esta estratégia, foi possível obter proteolipossomos ricos em fosfatase alcalina devido à inserção preferencial da âncora de GPI às bicamadas lipídicas, em detrimento das outras proteínas que não interagem favoravelmente com os sistemas vesiculares, comprovando que a metodologia de reconstituição padronizada pode ser usada eficientemente na obtenção de sistemas de proteolipossomos sem a necessidade de uma etapa de purificação prévia da enzima solubilizada, de modo a se obter um máximo de incorporação da enzima às vesículas com mínima perda em atividade. A reconstituição da enzima empregando-se células ghost resseladas foi obtida incubando-se volumes iguais de enzima (23 ?g/mL) e células ghost (0,22 mg/mL), por 2 horas, a 25ºC, com cerca de 40% da atividade PNFFase da fosfatase alcalina incorporada às vesículas. Para verificar o efeito do microambiente da membrana sobre a atividade da enzima reconstituída, foram determinados os parâmetros cinéticos de hidrólise para diferentes substratos (ATP, PPi e PNFF). Para todos os substratos, uma única classe de sítios de hidrólise foi observada, com valores de K0,5 que variaram de 0,14 a 2,7 mM. Excesso de PPi e ATP no meio reacional inibiu as atividades PPase e ATPase da enzima reconstituída, respectivamente, em todos os sistemas estudados. A hidrólise de PPi apresentou efeitos cooperativos positivos para todos os sistemas, enquanto que para a hidrólise de ATP, uma pequena cooperatividade positiva foi observada apenas para os sistemas constituídos de DPPC e contendo DPPS em sua composição. Assim, a enzima não perdeu a habilidade de hidrolisar nenhum dos substratos quando reconstituída nos diferentes sistemas vesiculares, e todos os dados obtidos reforçam a hipótese de que a composição lipídica do microambiente onde a fosfatase alcalina se encontra exerce grande influência na modulação tanto da atividade da enzima quanto da interação da mesma com os sistemas vesiculares. Assim, os resultados obtidos fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão dos mecanismos de interação da fosfatase alcalina com a membrana, quanto para estudos da função da enzima durante o processo de biomineralização. / Alkaline phosphatase is a multifunctional enzyme, capable of hydrolyzing phosphate monoesters, pyrophosphate, phosphodiesters, as well as catalyzing transphosphorylation reactions, and it is named \"alkaline\" due to its ability to perform these reactions more efficiently in pH above the neutral (pH 8-11). The aim of this work was to standardize a methodology to obtain a membrane fraction rich in alkaline phosphatase from osteoblastic cells cultures, originated from rat bone marrow, without the use of organic solvents, collagenase or others proteases. The standardized procedure is simple and easy to reproduce, with the advantage of considerable reduction in the time needed to obtain this membrane fraction, which contributes to a smaller denaturing effect on the enzyme. Alkaline phosphatase is a membrane-bound enzyme attached to the cell membrane via a GPI anchor and was solubilized with both polidocanol (1%, w/v) and PIPLC (0,2 U/mL), hydrolyzing several substrates (PNPP, ATP, PPi, ADP, beta-glycerophosphate, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate) and being inhibited by some classical inhibitors of this group of enzymes (levamisole, theophylline, ZnCl2, vanadate, phosphate and arsenate). The effect of liposomes constituted by DPPC, DPPC:DPPS (9:1 and 8:2, molar ratio) and DPPC:DODAB (9:1 and 8:2, molar ratio) on the enzyme insertion ability in the vesicular systems and activity modulation of the reconstituted enzyme were also evaluated. The alkaline phosphatase reconstitution in the mixed liposomes constituted by DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) and DPPC:DODAB (8:2) presented maximum incorporation of the PNPPase enzyme activity (about 90%, 75% and 90%, respectively) after 4 hours, 5 hours and 40 minutes, respectively, of incubation of the several liposomes with the protein. However, using DPPC:DODAB (9:1) liposomes, only about 50% of the PNPPase enzyme activity was incorporated in the systems, even after 5 hours of incubation. For positive charged liposomes, a higher proportion of DODAB in the DPPC systems favored the alkaline phosphatase insertion into it after a short period of incubation. For negative charged liposomes, the different proportions of DPPS used did not have a big influence in both, incorporation velocity and quantity of incorporated enzyme into the systems. For all the systems used, the incorporation process is time dependent. SDS-PAGE of the DPPC proteoliposomes revealed only a single protein band, with molecular mass of about 60 kDa (when denaturated), which presented phosphomonohydrolase activity under non-denaturing conditions, with molecular mass of about 120 kDa. Thus, using this strategy, it was possible to obtain proteoliposomes rich in alkaline phosphatase due to the preferential insertion of the GPI anchor in the lipid bilayers, since the other proteins do not interact favorably with the vesicular systems. This proves that the standardized methodology for reconstitution can be used efficiently to obtain proteoliposomes systems without prior purification of the solubilized enzyme, with its maximum incorporation in the vesicles and a minimum loss of activity. The reconstitution of the enzyme using resealed ghost cells was obtained by incubating equal volumes of enzyme (23 microg/mL) and ghost cells (0,22 mg/mL), for 2 hours, at 25ºC, with about 40% of the alkaline phosphatase PNPPase activity being incorporated into the vesicles. To verify the effect of the membrane microenvironment on the activity of the reconstituted enzyme, the kinetic parameters for the hydrolysis of different substrates (ATP, PPi and PNPP) were determined. For all the substrates, only one class of hydrolysis sites was observed, with K0,5 values that varied from 0,14 to 2,7 mM. Excess of PPi and ATP in the reaction medium inhibited the PPase and ATPase activities of the reconstituted enzyme, respectively, in all systems studied. PPi hydrolysis presented positive cooperative effects for all systems, while for ATP hydrolysis a small positive cooperativity was observed only for the systems constituted by DPPC and containing DPPS in its composition. Thus, the enzyme did not lose the ability to hydrolyse any of the studied substrates when reconstituted in the different vesicular systems and all the data obtained strengthen the hypothesis that the lipid composition of the microenvironment where the alkaline phosphatase is located plays a great influence on the modulation of both enzyme activity and enzyme interaction with the vesicular systems. Thus, the results obtained provide new information that could contribute to the comprehension of the interaction mechanisms of the alkaline phosphatase with the membrane, as well as to studies of the enzyme function during the biomineralization process.

Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

Dentre os diversos processos de formação de mineral em organismos vivos, a formação do tecido ósseo é um exemplo particular, uma vez que fosfatos de cálcio, na forma de hidroxiapatita, são produzidos em meio a fibrilas de colágeno na matriz extracelular de células osteogênicas; processo este regulado por um complexo enzimático. A fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) desempenha um papel fundamental na histogênese óssea, responsável principalmente pela produção de fosfato inorgânico necessário para a formação dos minerais. Diversas abordagens experimentais permitem a reconstituição desta enzima em sistemas miméticos de membrana celular, dentre os quais, os filmes Langmuir-Blodgett (LB), que possibilitam a formação de materiais com propriedades osteoindutoras. No presente estudo, foi investigada a imobilização desta enzima em filmes LB sobre suportes de Ti. O ácido dimiristoil fosfatídico foi o fosfolipídeo utilizado na confecção dos filmes LB, obtendo um regime de deposição linear de massa em função do número de camadas depositadas em subfases de CaCl2. A TNAP foi imobilizada nos filmes através de duas metodologias: a partir da adsorção física da enzima aos filmes LB pré-transferidos a um suporte sólido, ou ainda por meio da construção do filme a partir de uma monocamada mista de DMPA/Ca2+/TNAP. Em ambas as metodologias adotadas, foi obtida uma diminuição drástica da atividade fosfohidrolítica da forma imobilizada da enzima, em relação à sua atividade obtida em meio homogêneo. Ao expor suportes de Ti modificados com os filmes LB em uma solução contendo íons Ca2+ e ATP como fonte de fosfato inorgânico, foi observada a formação de uma maior quantidade de mineral para as amostras contendo a TNAP imobilizada; atribuída a uma maior supersaturação local de íons fosfato devido a maior hidrólise de ATP na presença da enzima, demonstrando a capacidade desta em conferir à superfície modificada uma maior capacidade na indução de formação de mineral. Após este ensaio de mineralização in vitro, foi obtida uma maior hidrofilicidade das superfícies recobertas com os filmes LB na presença da TNAP, tornando estas superfícies modificadas mais bioativas. A presença dos filmes LB mistos de lipídeo/TNAP nas superfícies permitiram a adesão, proliferação e recobrimento homogêneo de células osteogênicas, que posteriormente promoveram o extravasamento de fibrilas proteicas e a formação de nódulos de mineralização. Estes resultados são importantes na confecção de materiais que acelerem o processo de osteoindução. / Among all the processes of mineral formation in living organisms, the osseous tissue formation is a particular example, since that calcium phosphates as hydroxyapatite are produced among collagen fibrils at the extracellular matrix of osteogenic cells, being this process regulated by an enzymatic complex. The tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) plays a central role on the osseous histogenesis, responsible mainly for the inorganic phosphate production necessary for mineral formation. Various experimental approaches allows this enzyme reconstitution in cellular membrane mimetic systems, among which, the Langmuir-Blodgett films (LB), that allows the formation of materials with osteoinductive properties. With that in mind, the immobilization of that enzyme in titanium supports modified with LB films was investigated. The dimyristoyl phosphatidic acid was the phospholipid used in the LB film construction, obtaining a linear deposition-layer numbers relation in CaCl2 subphases. The TNAP was immobilized at the films through two main methodologies: from the physical adsorption of the enzyme to the LB film pre-constructed on a solid support, or through the film construction from the mixed DMPA/Ca2+/TNAP monolayer. At both the adopted methodologies, it was obtained a diminishment at the phosphohidrolytic activity of the immobilized enzyme, comparing to its activity at homogeneous media. Exposing the Ti supports with the LB films in a solution containing Ca2+ ions and ATP as a phosphate source, it was observed a higeher mineral formation to the samples containing the immobilized TNAP, possibly due to a higher phosphate ions supersaturation from the higher ATP hydrolysis at the presence of the enzyme, demonstrating the capacity of the TNAP in promoting a higher mineral formation induction to the modified surface. After this in vitro mineralization assay, it was obtained surfaces more hydrophilic at presence of the LB films containing TNAP, making those modified surfaces more bioactive. The mixed LB films presence at the surfaces allowed the adhesion, proliferation and homogeneous covering of osteogenic cells, that posteriorly promoted the production of proteic fibrils and mineralization nodules. Those results are important in order to construct materials more osteointegrative.

A organização da membrana biológica em microdomínios tem um papel chave em vários processos celulares semelhante a receptores protéicos e a transdução de sinal. A existência de microdomínios, também denominados de rafts tem sido explicada pela separação das membranas lipídicas em duas fases: liquida cristalina (L) e fase liquida ordenada (Lo) rica em colesterol e esfingolipídeos. Assim, o enfoque deste projeto foi correlacionar mecanismos de controle da atividade da fosfatase alcalina (TNAP) com a organização intermolecular e o estado de fase de alguns lipídios que compõem as vesículas da matrix. Foi estudada a modulação da atividade da enzima e sua inserção à sistemas de lipossomos constituídos com diferentes composições lipídicas (Dipalmitoilfosfatidilcolina, Colesterol, Esfingomielina e Gangliosídeo) como um mecanismo de regulação e transdução entre enzimas que não compartilham intermediários metabólicos comuns. Isto é, verificar como mudanças de organização molecular, induzida por colesterol e/ou outros lipídios, podem modular a atividade de enzimas regulando a produção de mensageiros lipídicos secundários e/ou processos de fusão e recombinação topológica da bicamada lipídica, modulando concomitantemente a atividade da fosfatase alcalina. Com tal propósito, a TNAP foi reconstituída em lipossomos constituídos de DPPC e lipossomos mistos formando sistemas binários DPPC:Chol, DPPC:SM e DPPC:GM1 com razões molares de (9:1); sistemas terciários DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 e DPPC:SM:GM1 com razões molares de (8:1:1) e por fim sistemas quaternários constituídos de DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). Estes sistemas foram propostos com o intuito de mimetizarmos os lipid rafts existentes nas membranas biológicas, porém utilizando lipídios que já foram identificados e quantificados nas vesículas da matrix. Foram avaliados os efeitos da composição lipídica dos lipossomos na inserção da enzima aos sistemas vesiculares. Além disso, foram realizados estudos biofísicos de calorimetria analisando como os parâmetros termodinâmicos são afetados com as diferentes composições lipídicas e pela presença da enzima ancorada aos sistemas. A reconstituição da enzima a lipossomos constituídos de DPPC proporcionou uma incorporação em torno de 80% da atividade enzimática. Estudos termodinâmicos dos proteolipossomos formados evidenciaram uma queda significativa nos valores de variação de entalpia em relação aos sistemas de lipossomos (de 7,63 a 1,88 kcal.mol-1). Lipossomos binários constituídos de DPPC:Chol em concentrações crescentes (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 razão molar) foram estudados tanto pelos parâmetros biofísicos como pela habilidade de inserção da enzima a tais sistemas. Foi observado um significativo decréscimo nos valores de variação entalpia com o aumento da proporção de colesterol no lipossomo. Além disso, a presença do colesterol proporcionou uma redução na inserção da atividade catalítica em até 42%, quando utilizada a composição lipídica de 9:5 DPPC:Chol. Dos sistemas binários formados com razões molares 9:1, o que apresentou maior porcentagem de reconstituição da TNAP foi o sistemas DPPC:Chol, apresentando em torno de 62% de incorporação da enzima. Os sistemas terciários apresentaram ao redor de 30% de incorporação da atividade catalítica e o sistema quaternário em torno de 25%. Além dos ensaios de atividade enzimática, a incorporação da enzima aos sistemas vesiculares também pôde ser comprovada pelas mudanças nos parâmetros termodinâmicas detectados por DSC. Nos estudos de calorimetria de todos os sistemas de proteolipossomos formados, foram observadas significativas diminuições nos valores de variação de entalpia quando comparados aos sistemas de lipossomos correspondentes. Deste modo, os resultados aqui apresentados fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão do comportamento da atividade da fosfatase alcalina na presença de diferentes composições lipídicas dos microdomínios existente membrana, quanto para o entendimento dos processos de regulação da enzima durante o processo de biomineralização. / The organization of the biological membrane in microdomains has a key roll in many cellular processes similar to proteic receptors and signal transduction. The existence of microdomains, also called rafts, has been explained by the lipid membrane separation in two phases: crystalline phase (L) and ordinate liquid phase (Lo), rich in cholesterol and sphingolipids. The focus of this Project was to correlate activity control mechanisms of the alkaline phosphatase (TNAP) with the intermolecular organization and the phase stat of some lipids that comprise the matrix vesicles. The enzyme activity modulation and its insertion into liposomes systems, constituted by different lipid compositions (DPPC, Chol, SM e GM1) as a regulation and transduction mechanism between enzymes that do not share common intermediary metabolites, was studied. That is, to verify how molecular organization changes, induced by cholesterol and/or other lipids, can modulate the enzyme activity regulating the production of secondary lipid messengers and/or fusion processes and topological recombination of the lipidic bilayer, concomitantly modeling the alkaline phosphatase activity. TNAP was then reconstituted in liposomes constituted by DPPC and mixed liposomes forming binary systems DPPC:Chol , DPPC:SM , DPPC: Chol:GM1 with (9:1) molar rates; tertiary systems DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 and DPPC:SM:GM1 with (8:1:1) molar rates and finally quaternary system constituted by DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). These systems were proposed aiming the mimetization of lipid rafts existent in biological membranes, but using lipids that had already been identified and quantified in the matrix vesicles. The effects of liposome lipid composition in the enzyme insertion to the vesicular systems were assayed. Besides that, calorimetry biophysical studies were done analyzing how the thermodynamic parameters are affected by the different lipid compositions e by the presence of the systems anchored enzyme. The enzyme reconstruction to the DPPC constituted liposomes has provided an incorporation of around 80% of the enzyme activity. Thermodynamic studies of the proteoliposomes formed have shown a significant decrease in the H values in relation to the liposomes systems (from 7.63 to 1.88 kcal.mol-1). Binary liposomes constituted of DPPC:Chol in increasing concentrations (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 molar ratio) were studied by the biophysical parameters as well as by the insertion ability of the enzyme into those systems. A significant decrease in the enthalpy values with the increase of the cholesterol proportion in the liposome was observed. Besides that, the presence of cholesterol has allowed a reduction in the insertion of the catalytic activity in up to 42% when the lipid composition 9:5 DPPPC:Chol was used. Among the binary systems formed with molar ratios of 9:1, the one which showed the highest percentage of TNAP reconstitution was the DPPC:Chol system, with around 62% enzyme incorporation. The tertiary systems had around 30% incorporation of the catalytic activity, and the quaternary system around 25%. Besides the enzymatic activity assays, the enzyme incorporation to the vesicular systems can also be verified by the thermodynamic parameters change detected by DSC. In the calorimetry studies of all the proteoliposomes formed, significant decreases in the enthalpy values were observed when compared to the corresponding liposomes systems. Thereby, the results presented here provide new information that can contribute to understand the alkaline phosphatase behavior in the presence of different microdomain lipid compositions existent in the membrane, as well as understanding the regulation processes of the enzyme during the biomineralization process.

Eletrocatalisadores Pt/C, Pd/C, PtAu/C, PtIr/C, PdAu/C, PdIr/C, PtAuIr/C e PdAuIr/C foram preparados via redução por borohidreto de sódio em diferentes proporções atômicas, com 20% em massa de metal e suportados em carbono Vulcan XC72 de alta área superficial. Os materiais foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX), análise de difração de raios-X (DRX) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A oxidação eletroquímica do etanol foi estudada por voltametria cíclica (VC) e cronoamperometria, utilizando a técnica do eletrodo de camada fina porosa e o estudo da oxidação eletroquímica de etanol \"in situ\" utilizando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Posteriormente os materiais foram testados em células à combustível alcalinas alimentadas diretamente com etanol. Os resultados demonstraram que houve formação de ligas, com tamanho médio de nanopartículas entre 4,0 - 10 nm. De acordo com os experimentos eletroquímicos os eletrocatalisadores ternários apresentaram maior atividade eletrocatalítica e os estudos em FTIR indicaram que o produto principal da oxidação eletroquímica de etanol em meio alcalino para todos eletrocatalisadores sintetizados foi o acetato, sugerindo que a oxidação ocorre de forma incompleta pelo mecanismo indireto. Os testes em célula mostraram os melhores resultados para PdAuIr/C (50:40:10) com o qual obteve-se potencial de circuito aberto de aproximadamente 0,78 V e densidade de potência máxima de aproximadamente 15 mW cm-2, cerca de 333% superior a Pd/C. / Pt/C, Pd/C, PtAu/C, PtIr/C, PdAu/C, PdIr/C, PtAuIr/C and PdAuIr/C electrocatalysts, were prepared by the sodium borohydride reduction process in different atomic proportions, with 20 wt.% of metal loading and supported on Vulcan XC72 carbon with high surface area. The materials were characterized by X-ray dispersive energy spectroscopy (EDX), X-ray diffraction analysis (XRD) and transmission electron microscopy (TEM). The ethanol electrochemical oxidation was studied by cyclic voltammetry (CV), chronoamperometry and in situ using Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) using the thin porous coating technique, Afterwards the materials were tested on direct ethanol alkaline fuel cells. The results suggest alloys formation, with the mean nanoparticles sizes are from 4 - 10 nm. According to the electrochemical experiments the ternary electrocatalysts presented higher electrocatalytic activity, while that the FTIR studies indicated that the main product of the electrochemical oxidation of ethanol in alkaline medium for all synthesized electrocatalysts was acetate, also suggesting that the oxidation occurs incompletely by the indirect mechanism. The fuel cell experiments showed the best results for PdAuIr/C (50:40:10), where these materials had an open circuit potential of approximately 0,78 V and maximum power density of about 15 mW cm-2, about 333% higher than Pd/C.

O fenômeno da bio- e quimiluminescência tem atraído o interesse da comunidade científica nas últimas décadas não só pelo seu inerente interesse acadêmico, mas também devido as incontáveis aplicações analíticas que dele têm surgido. A maior parte do trabalho acadêmico que tem sido desenvolvido está relacionado ao estudo do mecanismo de geração de estados excitados e a eficiência de desativação radiativa. Por outro lado, do ponto de vista das aplicações tecnológicas, as metodologias para análise de enzimas, drogas e metabólitos, aplicadas à imunologia, microbiologia, medicina forense, etc., que se baseiam em quimiluminescência, estão entre as mais utilizadas em procedimentos de rotina em laboratórios. O desenvolvimento de substratos e, conseqüentemente, novas técnicas quimiluminescentes tem se tornado cada vez mais importante devido a alta sensibilidade desses ensaios, tipicamente equivalente ou melhor do que aqueles que utilizam rótulos radioativos. Esta tese apresenta o desenvolvimento de novas metodologias quimiluminescentes para a determinação de atividade enzimática. O princípio químico é a geração de peróxidos cíclicos instáveis, conhecidos como 1,2-dioxetanos, após a hidrólise de substratos específicos, catalisada pela enzima objeto de estudo. Anéis dioxetânicos são conhecidos pela sua propriedade de gerar produtos em estados eletronicamente excitados quando decompostos. A emissão de luz pode ser relacionada à atividade enzimática. Foi desenvolvido o substrato (fosfato dissódico de 2-metil-1-propenila, NA-MPP) (I)), capaz de produzir o composto 2-metil-1-propen-1-ol quando hidrolisado via a ação catalítica das enzimas fosfatase alcalina (ALP) ou fosfatase ácida (ACP). Este enol é oxidado, sob ação catalítica da enzima peroxidase de raiz forte (HRP), gerando acetona em estado excitado triplete. A emissão de luz direta ou sensibilizada da acetona excitada pode ser correlacionada a atividade enzimatica da ALP ou ACP. A determinação da atividade dessas enzimas livres ou ligadas em anticorpos (conjugados ALP-IgG) tem grande aplicação em tecnologias de diagnóstico, seja como um marcador de diversas doenças, seja como uma sonda em ensaios imuno-enzimáticos (EIA). A sensibilidade alcançada com este substrato foi de 10-15 mols de ALP, 0,0027 unid. de ACP e diluições de até 300.000 de um conjugado (ALP-IgG) por ensaio. Também foi possível correlacionar a atividade de ALP à velocidade de consumo do oxigênio dissolvido no meio de reação, que é uma característica dessa oxidação. Partindo do mesmo princípio delineado no parágrafo anterior, desenvolveu-se um composto para determinação de proteases. Para isso, o composto N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida (II) foi preparado, pois a clivagem de sua ligação amídica geraria uma enamina, que também pode ser oxidada pela ação catalítica da HRP. No entanto, nossos estudos mostraram que este composto não é reconhecido como substrato das proteases. Tomando como base a bem conhecida característica de gerar uma fraca emissão de luz quando derivados indólicos são oxidados por agentes oxidantes clássicos, como KMnO4, K2S2O4, etc., foi estudado o potencial quimiluminescente de alguns derivados indólicos quando submetidos ao sistema HRP/H2O2/O2. Como era esperado, detectou-se quimiluminescência de baixa intensidade para a maioria dos derivados indólicos. Também neste caso a clivagem do anel indólico, via um intermediário dioxetânico, parece ser a responsável pela emissão observada na maioria dos compostos testados. Além disso, a oxidação do composto 2-metilindol (III) mostrou uma eficiência de quimiluminescência com cerca de 3 ordens de grandeza maior que os demais derivados. Verificou-se que o comportamento diferenciado desse composto estava relacionado à exclusiva formação de um composto secundário. A estrutura desse composto foi parcialmente atribuída ao 2,2\'-dimetil-2,2\'-diindoxil. Então, utilizando o 2-metilindol como substrato, desenvolveu-se uma metodologia analítica para determinação de HRP livre ou ligada em anticorpos (conjugados HRP-IgG). Assim como no caso da enzima ALP, conjugados do tipo HRP-IgG são largamente utilizados em EIA. Também com base nas características quimiluminescentes de \'alfa\'-hidroperóxi-cetonas quando submetidas a um forte meio alcalino, desenvolveu-se um potencial substrato para análise de esterases. A hidrólise catalisada por esterase de 2-peracetoxiadamantano-2-carboxialdeído (IV) geraria um \'alfa\'-hidroperóxi-aldeído, que por um ataque nucleofílico intramolecular, levaria a um intermediário dioxetânico. Este composto mostrou-se instável, gerando quimiluminescência mesmo na ausência da enzima. Este fato inviabilizou o seu uso como planejado. / The bio- and chemiluminescent phenomena have attracted the scientists attention in the last decades not only because its inherent academic interests, but also due the uncounted analytical applications that it has originated. Most of the academic work was devoted to the study of the mechanism responsible for the generation of the excited states and the efficiency of radiative deactivation. On the other hand, the technological developments pointed to methodologies for enzyme, drug, and metabolite determination applied to immunological, microbiology, forensic science, etc., based on chemiluminescence, which are already among the most applied techniques in routine laboratory procedures. The development of chemiluminescent substrates has become increasingly important due to their high sensitivity, typically equivalent to or better than assays using radioactive labels. This thesis reports the development of new chemiluminescent methodologies for enzymatic activity determination. The chemical basis is the generation of unstable cyclic peroxides, called 1,2-dioxetanes, upon hydrolysis of specific substrates catalyzed by the target enzyme. Dioxetanes rings are known by their properties to generate electronically excited products upon decomposition. The light emission can be related to enzymatic activity. It was developed a substrate (dissodium 2-methyl-1-propenyl phosphate) (Na-MPP) (I) able to produce 2-methyl-1-propen-1-ol when catalytically hydrolyzed by alkaline (ALP) or acid (ACP) phosphatases enzymes. This enol is oxidized, upon horseradish peroxidase (HRP) action, yielding acetone in triplet excited state. The direct or sensitized light emission of the excited acetone can be correlated to enzymatic activity of ALP or ACP. The activity of this enzyme, free or bound to antibody (ALP conjugates), is widely used in diagnostic technologies, either as a direct marker of several diseases or as an enzymatic probe in enzyme immunoassays (EIA). The sensibility reached with this substrate was 10-15 mols to ALP, 0,0027 u/mL to ACP and dilutions up to 300.000 of ALP-IgG per assay. Since the HRP system consumes dissolved oxygen during the oxidation of the enol, ALP quantification may be performed by following the oxygen uptake rate. By applying the same principle above delineated, it was synthesized a compound for proteases activity determination. Thus, the compound N-ethyl-N-(2-methylpropen-1-yl)benzenamide (II) was prepared, since its hydrolysis would lead to an enamine , which is known to be oxidized via HRP with light emission. However, our studies showed that II is not recognized as a substrate by proteases. Owning to the well known weak emission elicited when indole derivatives are oxidized by classical oxidants like KMnO4, K2S2O4, etc., it was studied the chemiluminescent potential when indoles are submitted to the HRP/H2O2/O2 oxidant system. Indeed, weak chemiluminescence was detected for almost all derivatives. Likewise, the oxidation of 2,3-bond of indoles, through a dioxetane intermediate leading to an open-ring product, seems responsible for this emission. Furthermore, the oxidation of 2-methylindole (III) showed a chemiluminescence efficiency about 3 orders of magnitude higher. It was observed that the high chemiluminescent yield was related to exclusive formation of a secundary product. Its structure was partially attributed to 2,2\'-dimethyl-2,2\'-diindoxil. Thus, using 2-methylindole as substrate was possible to develop an analytical procedure to quantify HRP activity, free or bound to antibodies (conjugates HRP-IgG). In EIA the enzymes HRP and ALP are the most important labels. From the also known chemiluminescent characteristics of \'alpha\'-hidroperoxy-ketones, when submitted to strong alkaline medium, it was developed a potential substrate to esterases. The esterase catalyzed hydrolysis of 2-acetylperoxiadamantane-2-carboxaldeyde (IV) would generate an \'alpha\'-hidroperoxy-aldeyde which, by an intramolecular nucleofilic attack, would lead to a dioxetane intermediate. This compound showed to be unstable and it generated chemiluminescence in the absence of the enzyme. This fact impaired its use as planned.

Nanoesferas de sílica contendo fluoróforos encapsulados (o complexo quercetina- Al+3 e o corante rodamina B) foram preparadas com alto controle de tamanho e morfologia, utilizando catálise ácida e básica do tetraetilortossilicato (TEOS). As nanopartículas obtidas apresentaram diâmetro da ordem de 200-300 nm, possuindo maior regularidade quando preparadas em meio alcalino. Nas preparações foram utilizados o método de Stöber e o método caroço-casca. Devido à hidrólise da quercetina em meio básico, as partículas funcionalizadas com o flavonóide ou com o complexo quercetina-Al+3, apresentaram maior intensidade de emissão sob catálise ácida. No caso da catálise básica, as partículas apresentaram emissão significativa quando preparadas utilizando um sol de alumina, porém foram obtidos paralelepípedos nanométricos. Os decaimentos de fluorescência para o sistema quercetina-alumina são biexponenciais, em concordância com os dois complexos quercetina-Al+3 formados no interior da nanopartícula de sílica. No caso da rodamina B, foram realizadas medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência, que mostraram uma relação entre relaxação difusional com tamanho e autoagregação das partículas. / Silica nanospheres doped with quercetin-Al+3 and rhodamine B were synthesized with high size control and morphology, using acid and basic catalysis of tetraethylorthosilicate (TEOS). The nanoparticle diameter obtained was about 200- 300 nm, with higher regularity when synthesized in alkaline media. The Stöber\'s and core-shell methods were used as preparation methods. Because the alkaline hydrolysis of quercetin, the flavonoid or the quercetin-Al+3 complex doped nanoparticles showed higher emission intensity when acid catalysis was used. When basic catalysis was performed, the particles prepared with an alumina-sol showed expressive emission intensity, but nanometric parallelepipeds were obtained. The quercetin-alumina fluorescence decays are biexponential, agreeing with the two types of quercetin-Al+3 complexes formed in the nanoparticles domain. In the case of rhodamine B, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) measurements were performed, showing a relation between diffusion relaxation with size and aggregation behavior.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-13T10:56:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 389280 bytes, checksum: 784eb597be998ef657648639e0e14a0a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-13T10:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 389280 bytes, checksum: 784eb597be998ef657648639e0e14a0a (MD5) Previous issue date: 2004-03-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da madeira, utilizando diferentes clones de eucalipto, na branqueabilidade e estabilidade de alvura de polpas produzidas pelo processo kraft. Foram avaliadas amostras de polpas provenientes de 26 clones de eucalipto de número kappa 16,0 a 17,5. As amostras foram submetidas à deslignificação com oxigênio (pré-O 2), deslignificação com dióxido de cloro seguido de extração alcalina simples (DE) e branqueamento ECF ( isento de cloro elementar) completo, com as seqüências ODEDD e ODEDP, sendo o desempenho desses processos avaliados pela eficiência, pela seletividade, pelo ganho de alvura e pela estabilidade de alvura (no caso da seqüência completa). O impacto da densidade básica da madeira (398,0 a 558,0 kg/m3), do consumo de álcali efetivo do cozimento (14,1 a 18,0%, como NaOH) e do rendimento depurado de polpa (51,2 a 54,5%) no desempenho dos processos de branqueamento foi também utilizado na interpretação dos resultados. Foi verificado que o tipo de madeira tem influência significativa no desempenho da pré-O 2, tratamento DE e do branqueamento completo da polpa. A eficiência, a seletividade e o ganho de alvura da pré-O 2, para as 26 amostras, variaram de 28,6 a 40,8%, 0,1 a 0,7 Ud. kappa/Ud. visc., e 15,5 a 31,3% ISO, respectivamente. Para o tratamento DE, as variações foram de 56,3 a 74,1, 0,8 a 3,6 e 33,4 a 41,3, respectivamente. No branqueamento completo pela seqüência ODEDD, a branqueabilidade, seletividade e estabilidade de alvura das polpas variaram de 0,33 a 0,38 Ud. kappa removidas/kg de cloro ativo, 0,3 a 1,3 Ud. kappa/Ud. visc., e 1,9 a 3,2 % ISO, respectivamente. Já no branqueamento pela seqüência ODEDP, a branqueabilidade, seletividade e estabilidade de alvura das polpas variaram de 0,30 a 0,39, 0,3 a 1,0 e 1,1 a 1,4, respectivamente. O ganho de alvura e a eficiência de deslignificação das polpas no tratamento DE foram afetados negativa e significativamente, a 5% de significância, pela demanda de álcali efetivo do cozimento. A seletividade da pré-O 2 e do tratamento DE foi afetada, positiva e significativamente, a 5% significância, pela densidade básica da madeira. A eficiência de deslignificação no tratamento DE se correlacionou, positiva e significativamente, com o rendimento depurado de polpa. A demanda de álcali efetivo e a densidade básica da madeira se correlacionaram, positiva e significativamente, com as seletividades dos branqueamentos completos com as seqüências ODEDD e ODEDP. O rendimento depurado se correlacionou, negativa e significativamente, com a seletividade do branqueamento pela seqüência ODEDD, a 5% de significância. Polpas branqueadas pela seqüência ODEDP apresentaram maior estabilidade de alvura que as branqueadas pela seqüência ODEDD. A estabilidade de alvura das polpas é influenciada pelos seus conteúdos de grupos carboxilas e carbonilas e, também, pelo residual oxidável (número de permanganato). / The objective of this study was to evaluate the influence of the wood, from different brightness stability eucalyptus kraft clones, pulps. kraft an bleachability and pulps from 26 different eucalyptus wood clones were evaluated. The samples of 16.0 – 17.5 kappa number were delignification with oxygen (Pre-O 2) and chlorine dioxide (DE treatment) and fully bleaching with the ODEDD and ODEDP sequences. There processes were compared based an efficiency, selectivity, brightness gain an brightness stability (fully bleached pulps only). Also evaluated was the impact of wood density (398.0 – 558.0 kg/m3), effective alkali consumption (14.1 – 18.0% as NaOH) and pulp yield (51.2 – 54.5%) on the performance of such processes. It was concluded that wood type significantly affects the performance of Pre-O 2, DE treatment and full pulp bleaching with ODEDD and ODEDP sequences. The values of efficiency, selectivity and brightness gain for the Pre-O 2 of the 26 samples varied in the range of 28.6 – 40.8%, 0.1 – 0.7 Ud. Kappa/Ud. viscosity and 15.5 – 31.3% ISO, respectively. For DE treatment the varieties was in the range of 56.3 – 74.1%, 0.8 – 3.6 Ud. kappa/Ud. viscosity and 33.4 – 41.3% ISO, respectively. In the full bleaching with the sequence ODEDD, the values of bleachability, selectivity and brightness reversion varied in the range of 0.33 – 0.38 Ud. kappa/kg Cl 2 active, 0.3 – 1.3 Ud. kappa/Ud. viscosity and 1.9 – 3.2% ISO, respectively. For the sequence ODEDP these values varied in the range of 0.3 – 0.39, 0.3 – 1.0 and 1.1 – 1.4, respectively. The delignification efficiency and brightness gain in the DE treatment were significantly, affected by pulping effective alkali. The selectivity of pré-O 2 and DE treatment were significantly and positively affected by wood basic density. The delignification efficiency of DE treatment was significantly and positively affected by pulping yield. The selectivity of the full bleaching with the sequences ODEDD and ODEDP was significantly and positively by wood density and pulping effective alkali. The selectivity of ODEDP bleaching correlated significantly and negatively with pulping yield. The was significantly effect of wood type an pulp brightness stability, but no significant correlation was seen between this parameter and wood density, pulping effective alkali and pulping yield. Pulps bleached with the ODEDP sequence showed be the brightness stability them those bleached with the ODEDD sequence. Pulp brightness stability is significantly affected by them contents of carboxyl, carbonyl and oxidizable rendnates (measured by KMnO 4 number). / Não foi localizado o cpf do autor.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-16T17:33:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 766425 bytes, checksum: 899c2ec3bd45320bc04524de45aa5bf1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T17:33:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 766425 bytes, checksum: 899c2ec3bd45320bc04524de45aa5bf1 (MD5) Previous issue date: 2005-12-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nesse estudo foram investigadas as causas e a prevenção da reversão de alvura de polpas kraft de eucalipto. Os resultados estão apresentados em quatro capítulos independentes, a saber: 1) influência da madeira; 2) influência do processo de branqueamento; 3) influência de compostos organoclorados; e 4) influência do branqueamento com ozônio e prováveis mecanismos da reversão. No capítulo 1, foi padronizado o procedimento de medição da reversão e investigada a influência do tipo de madeira na reversão de alvura de polpas branqueadas, provenientes de cozimentos de cavacos de 100 diferentes clones de eucalipto e pré-deslignificadas com oxigênio. Treze amostras mostrando grande variação na demanda de álcali efetivo, rendimento e desempenho no estádio de oxigênio foram selecionadas e branqueadas para estudos de reversão térmica de alvura, utilizando o método Tappi UM 200, que consiste do envelhecimento acelerado das folhas de celulose em estufa à 105 ± 3 o C, por 4 h, após acondicionamento das folhas em sala climatizada, 23 ± 1 o C e 50 ± 2%, por 12 h. Concluiu-se que o teste de reversão deve ser efetuado em folhas de celulose de pH 6-7, contendo umidade de 9 a 10 %, com pelo menos dez repetições. Essas condições foram padronizadas e utilizadas em todos os quatro capítulos desta tese. A reversão de alvura variou de 2,1 a 3,6 e de 0,8 a 1,7 % ISO, dependendo do tipo de madeira, para polpas branqueadas pelas seqüências ODEDD e ODEDP, respectivamente. O conteúdo de grupos redutores da polpa decresceu de 35 para 40% no estádio final de peroxidação, em relação ao estádio final de dioxidação. Os teores de grupos carbonila e carboxila, bem como o número kappa da polpa branqueada correlacionaram-se positivamente com a reversão de alvura. A densidade básica da madeira, o consumo de álcali efetivo e o rendimento do cozimento, a eficiência e seletividade da deslignificação com oxigênio, e o consumo total de oxidantes nas seqüências DEDD e DEDP não se correlacionaram com a reversão de alvura. No capitulo 2, foi avaliada a influência do processo de branqueamento na reversão de alvura de polpas de eucalipto branqueadas (90 a 90,5 % ISO) OD(PO)DD, pelas OD(PO)DP, seqüências OD HT(PO)DD, O(DC)(PO)DD, OD HT(PO)DP, O(DC)(PO)DP, OA/D(PO)DD e OA/D(PO)DP. Concluiu-se que um estádio final de peroxidação aumenta a estabilidade e a alvura da polpa. Alguns grupos oxidados presentes na polpa branqueada foram considerados a principal causa da reversão. Polpa branqueada com a seqüência (DC)(PO)DD apresentou baixa estabilidade apesar do seu baixo conteúdo de ácidos hexenourônicos e de lignina. Os estádios iniciais de ácido/dióxido de cloro a quente aumentaram a estabilidade da alvura, mas somente em seqüências sem o estádio final de peroxidação. O perfil da reversão, através dos estádios de branqueamento, mostrou tendência em aumentar a estabilidade da polpa após estádios alcalinos e de decrescer após estádios ácidos. Nos capítulos 1 e 2 foi demonstrada que as polpas branqueadas com seqüências finalizando com um estádio final de dioxidação apresentaram menor estabilidade de alvura em relação à quelas terminadas com estádio final de peroxidação. Trabalhos preliminares com várias polpas de folhosas indicaram boa correlação entre a reversão de alvura e o conteúdo de organoclorados da polpa. No capitulo 3 foi investigado o efeito do conteúdo de organoclorados da polpa branqueada na sua estabilidade de alvura. Foram produzidas polpas de eucalipto contendo diferentes teores de organoclorados utilizando-se 12 seqüências de branqueamento distintas. Concluiu-se que a reversão de alvura aumentou com a elevação do teor de organoclorados na polpa, mas esta tendência não é universal. Polpas branqueadas com seqüências contendo um segundo estádio alcalino de extração ou estádio final de peroxidação foram menos propensas à reversão, independentemente dos seus conteúdos de organoclorados. Polpas branqueadas por seqüências iniciadas com um estádio de dióxido de cloro em alta temperatura (D HT) foram mais estáveis que as iniciadas com estádio de dióxido de cloro convencional (D 0), em seqüências terminando com estádio final de dioxidação, porém o efeito da temperatura do primeiro estádio desapareceu em seqüências terminadas com estádio final de peroxidação, independentemente do teor de organoclorados da polpa. Relatos vindos da indústria dão conta de que polpas branqueadas com ozônio apresentaram baixa reversão de alvura. No capítulo 4 foi investigado o efeito do ozônio na reversão e, a partir dos resultados de análises finas da polpa por pirólise-CG/EM, foi postulado o provável mecanismo envolvido no processo polpas kraft de eucalipto. Foi verificado que a polpa branqueada pela seqüência OZ/ED(PO) teve a maior estabilidade de alvura dentre todas as avaliadas nos quatro capítulos desta tese, apresentando um número de cor posterior (NCP) de 0,06, que foi, aproximadamente, quatro vezes menor que o da polpa branqueada pela seqüência-referência OD HTD(PO) (0,22). A seqüência OZ/ED(PO) resultou em uma polpa branqueada contendo valores mais baixos de AHex ́s, lignina e número kappa e valores mais altos de grupos carbonilas e carboxilas em relação à seqüência - referência. O perfil de estabilidade de alvura da polpa branqueada pela seqüência OZ/ED(PO) revelou tendência decrescente através de todos os estádios, contrariamente ao observado para a seqüência-referência, que apresentou tendência de aumento da reversão nos estádios ácidos e diminuição nos estádios alcalinos. Quanto à distribuição das dosagens d e dióxido de cloro e ozônio na seqüência OZ/EDP, concluiu-se que deve ser utilizado um mínimo de peróxido de hidrogênio (de 1 a 2 kg/tas) e o máximo possível e necessário de dióxido de cloro; porém, o estádio de peróxido foi absolutamente imprescindível para extrair materiais oxidados por um processo nucleofílico. A análise por pirólise-CG/EM do algodão e das polpas branqueadas mostrou diferentes proporções das áreas dos espectros dos compostos aromáticos presentes nas fibras. Dispostas em ordem de proporções de aromáticos nas fibras estão as amostras de algodão < OD HTEDD < OZ/ED35 < OZ/ED15P10 < OZ/ED5P15. Porém, dispostas em ordem de reversão de alvura medida pelo NCP estão as amostras OZ/ED25P5 < OZ/ED15P10 < OZ/ED5P15 < < < OZ/ED35. Os números em subscrito indicam as dosagens de dióxido de cloro ou peróxido de hidrogênio, em kg/t de polpa seca, empregadas nos vários estádios de branqueamento. Polpas branqueadas com alta carga de dióxido (ex.: 35 kg/t polpa – OZ/ED35) apresentaram baixo teor residual de compostos aromáticos, porém baixa estabilidade de alvura, quando não-tratadas com um estádio final de peróxido alcalino. Sobre o mecanismo da reversão, postulou-se que a alta estabilidade de alvura de polpas branqueadas por seqüências contendo ozônio ocorreu pelo fato de estas demandarem excessiva dosagem de oxidantes para alcançar o resultado final de alvura do 90-91% ISO, eliminado todas as fontes iniciadoras do processo. A alta estabilidade de alvura é obtida a um alto custo, sendo que o ozônio per se não promove a estabilização de alvura. A alta carga de oxidantes utilizada, associada ao estádio final de peroxidação, que sempre existe nas seqüências com ozônio, resultou em alta estabilidade de alvura. O estádio final de peroxidação preveniu a reversão de alvura não por causa do peróxido e sim pela alcalinidade desse estádio. A alcalinidade decresceu a reversão de alvura por deixar a polpa branqueada com caráter fortemente alcalino (íons sódio). Esse caráter alcalino foi comprovado ser necessário para manter a estabilidade de alvura em testes e estabilidade de alvura versus pH ́s da polpa realizados nesse estudo. A condição alcalina minimiza as reações de hidrólise ácida de carboidratos oxidados, contendo certos grupos redutores, que iniciam o processo de reversão de alvura e geraram produtos coloridos de baixo peso molecular que são, usualmente, solúveis em água. / The causes and prevention of brightness reversion of eucalyptus kraft pulps were investigated in this work. The results are presented in four independent chapters, as follows: 1) influence of wood; 2) influence of the bleaching process; 3) influence of organochlorides; and 4) influence of ozone bleaching and likely mechanisms of reversion. In Chapter 1, the procedure of reversion measurement was standardized and the influence of wood type on brightness reversion of bleached pulps originated from the cooking of chips of 100 different eucalyptus clones, pre-delignified with oxygen, was investigated. Thirteen samples showing a great range in effective alkali demand, yield, and oxygen stage performance were selected and bleached for studies on thermal brightness reversion, using the method Tappi UM 200, which consists in accelerated aging of cellulose leaves in the oven at 105 ± 3 o C, for 4 h, after placing the leaves in an acclimatized room, 23± 1C and 50 ± 2%, for 12 h. It was concluded that the reversion test must be performed in cellulose leaves at pH 6-7, containing 9 to 10% humidity, with at least ten repetitions. These conditions were standardized and used in all the four chapters of this thesis. Brightness reversion ranged from 2.1 to 3.6 and from 0.8 to 1.7%ISO, depending on type of wood, for pulps bleached by sequences ODEDD and ODEDP, respectively. The content of the pulp reducing group decreased from 35 to 40% with a final peroxidation stage, in relation to the final dioxidation stage. The contents of the carbonyl ad carboxyl groups, as well as the kappa number of the bleached pulp correlated positively with brightness reversion. Basic wood density, effective alkali requirement and cooking yield, efficiency and selectivity of delignification with oxygen, and total oxidant consumption in the sequences DEDD and DEDP did not correlate with brightness reversion. In Chapter 2, the influence of the bleaching process on brightness reversion of bleached eucalyptus pulp (90 to 90.5% ISO) was analyzed by the sequences O(DC)(PO)DD, O(DC)(PO)DP, OD(PO)DD, OD(PO)DP, OD HT(PO)DD, A/D(PO)DD and OA/D(PO)DP. It was concluded that a final OD HT(PO)DP, O peroxidation stage increases pulp stability and brightness. Some oxidized groups present in the bleached pulp were considered the main cause of reversion. Bleached pulp with the sequence (DC)(PO)DD presented low stability despite its low contents of hexenuronic acid and lignin. The initial stages of hot chlorine acid/dioxide increased brightness stability but only in sequences without a final peroxidation stage. Reversion profile, through the bleaching stages, showed tendency to increase pulp stability after alkaline stages and to decrease it after acid stages. In Chapters 1 and 2 it is demonstrated that the pulps bleached with sequences ending with a final dioxidation stage presented lower brightness stability, compared to those ended with a final peroxidation stage. Preliminary works using various leaf pulps indicated a good correlation between brightness reversion and organochloride content of the pulp. In Chapter 3, the effect of the organochloride content of the bleached pulp on its brightness stability was investigated. Eucalypt pulps containing different organochloride contents were produced using 12 distinct bleaching sequences. It was concluded that brightness reversion increased with the increase of organochloride content in the pulp, but this tendency is not universal. Pulps bleached with sequences containing a second alkaline extraction stage or final peroxidation stages were less inclined to reversion, regardless of their organochloride contents. Pulps bleached by sequences initiated with a chlorine dioxide stage at high temperature (D HT) were more stable than those initiated xxv with conventional chlorine dioxide stage (D 0), in sequences ending with a final dioxidation stage, but the effect of the first stage temperature disappeared in sequences ended with final peroxidation stage, regardless of the organochlorine content of the pulp. Reports from the industry attest that ozone -bleached pulps presented low brightness reversion. In Chapter 4, the effect of ozone on reversion was assessed, and based on the pyrolysis-CG/EM pulp analysis results, the likely mechanism involved in the eucalyptus kraft pulp process was postulated. It was verified that the pulp bleached by sequence OZ/ED (PO) had the highest brightness stability among all those evaluated in the four chapters of this thesis, with a post-color number (PCN) of 0.06, which was approximately four times lower than that of the pulp bleached by the reference sequence OD HTD(PO) (0.22).Sequence OZ/ED(PO) resulted in bleached pulp containing lower values of Ahex’s, lignin and kappa number and higher values of carbonyl and carboxyl groups, in relation to the reference-sequence. Brightness stability profile of the pulp bleached by sequence OZ/ED(PO) showed a decreasing tendency throughout the stages, contrary to what was observed for the reference-sequence, which tended to increase reversion in the acid stages and decrease it in the alkaline stages. Regarding distribution of the chlorine dioxide and ozone dosages in the sequence OZ/EDP, it was concluded that a minimum amount of hydrogen peroxide (from 1 to 2 kg/tas) and maximum possible and necessary amount of chlorine dioxide must be used; however, the peroxide stage was absolutely indispensable to extract materials oxidized by a nucleophylic process. Analysis by pyrolysis-CG/EM of cotton and bleached pulps showed different proportions of the spectra areas of the aromatic compounds present in the fibers. The cotton samples <OD HTEDD < OZ/ED35 < OZ/ED15P10 < OZ/ED5P15 are displayed in order of aromatic compound proportions in the fibers. However, the samples OZ/ED25P5 < OZ/ED15P10 < OZ/ED5P15 < < < OZ/ED35 are displayed in order of brightness reversion measured by NCP. The lower-case numbers indicate the chlorine dioxide or hydrogen peroxide dosages, in kg/t of dry pulp, used in the various bleaching stages. Pulps bleached with a high dioxide load (e.g.: 35 kg/t pulp – OZ/ED35) presented a low residual content of aromatic compounds, but low brightness stability, when not treated with a final alkaline peroxide stage. Regarding the reversion mechanism, it was postulated that high brightness stability of pulps xxvi bleached by ozone-containing sequences occurred due to the fact that these required excessive oxidant dosage in order to reach the final 90-91% ISO brightness result, eliminating all the sources triggering the process. High brightness stability is obtained at a high cost, with ozone per se not promoting brightness stabilization. The high load of oxidants used, associated with final peroxidation stage, which always exists in the ozone sequences, resulted in high brightness stability. The final peroxidation stage prevented brightness reversion not because of peroxide, but rather because of this stage’s alkalinity. Alkalinity reduced brightness reversion by rendering the bleached pulp a strong alkaline character (sodium ions). This alkaline character was proved necessary to maintain brightness stability in tests and brightness stability versus pulp pH carried out in this study. The alkaline condition minimizes the acid hydrolysis reactions of oxidized carbohydrates, containing certain reducing groups that trigger the brightness reversion process, generating colorful products of low molecular weight that are usually soluble in water.

Orientadores: Rubens Maciel Filho, Eduardo Coselli Vasco de Toledo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:49:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Polowski_NataschaVigdis_M.pdf: 4178236 bytes, checksum: 955c3738e418197b8c3759e9d8e7d75f (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Em nível global, a indústria de celulose e papel está começando a experimentar os beneficios dos recentes desenvolvimentos na área de modelagem e controle de processos.Técnicas avançadas de simulação e controle oferecem ferramentas que permitem a análise e o projeto eficiente para processos multivariáveis não lineares e que envolvem o projeto, a inferência, a otimização e o controle automático do processo. A indústria de celulose utiliza cozinhadores, conhecidos como digestores, que são vasos de pressão onde os cavacos de madeira são tratados com licor de cozimento (hidróxido de s ódio e sulfeto de sódio) de composição determinada, a pressão e temperatura estabeleci das, visando a produção de polpa celulósica. Dentro deste contexto, os digestores podem ser classificados como contínuo (Kamyr) e descontínuo (Batch). O objetivo deste trabalho é estudar o processo de obtenção da polpa celulósica a partir da análise dos principais fenômenos fisico - químicos que ocorrem em um digestor kraft descontínuo. As predições a partir do modelo utilizado (Mirams e Nguyen, 1994) permitem a avaliação do comportamento dinâmico e a análise da sensibilidade paramétrica do processo, observando-se quais os parâmetros operacionais e as variáveis do processo que mais influenciam o comportamento do reator. O modelo do digestor descontínuo considera a difusão nos poros da madeira iniciada durante a impregnação dos cavacos. Outra característica do modelo é a sua adaptação de modo a considerar as reações de deslignificação como reações simultâneas de três diferentes tipos de lignina, sendo que a mais reativa reage mais rapidamente. Esta abordagem apresenta um novo ponto de vista para a teoria das três fases da reação, uma vez que seus resultados podem ser interpretados como se a reação de cada lignina fosse responsável por uma fase específica da reação (deslignificação inicial, principal e residual). Com relação à solução do modelo, esta foi baseada no Método das Linhas, a qual consiste na utilização do Método da Colocação Ortogonal para a discretização das equações parciais do modelo. A integração temporal das equações diferenciais ordinárias foi resolvida pelo integrador LSODE, (V asco de Toledo, 1999). Os resultados obtidos pelo modelo reproduziram as principais características dinâmicas do sistema, possibilitando compreender as etapas principais na obtenção da celulose sob determinadas condições operacionais do digestor. Isso permite a sua utilização para estudos de controle, otimização e projeto de reator descontínuos de forma segura e eficiente / Abstract: Global1y, the Kraft pulping process is beginning to get use of the benefits of the recent developments in the modeling area and process control. Advanced techniques of simulation and control offer tools that allow the analysis and efficient design of multivariable non-linear process, involving the optimization and the advanced control of the process. The pulp industry uses some equipment named digesters, which are pressure vessels where the chip of wood are treated with cooking liquor (sodium hydroxide and sodium sulfide) with defined composition, established pressure and temperature, aiming to the cellulosic pulp production. In this context, the digesters can be c1assified as continuous (Kamyr) and discontinuous digester (Batch). The aim of this work is to study the production process of the cellulosic pulp from the analysis of the Physical-Chemical Phenomena that occur in a discontinuous kraft digester. The predictions from the considered model (Mirams e Nguyen, 1994) allow the evaluation of the dynamic behavior and the analysis of the parametric sensitivity of the process, observing which is the operational parameter and variable of process that influence the most reactor behavior. The model for a descontinuous digester considers the diffusion into the wood pores initiated during the impregnation of the chips. Another characteristic of the model is its adaptation in order to consider the delignification reactions as simultaneously reactions with three different types of lignin, with the most reactive lignin reacting more quickly. This approach present a new point of view for the theory of three phases of the reaction, interpreting its results as if the reaction qf each lignin was responsible for a specific phase of the reaction (initial delignification, bulk and residual). Regarding the solution of the model it was based on "Line Method", which consist on usaged of Orthogonal Collocation for discretization of the partial differential equations. The temporal integration of the ordinary differential equations was solved by integrator LSODE (Vasco de Toledo, 1999). The obtained results from the model reproduced the main dynamic characteristics of the system, making possible the knowledge of the main stages in the production of the cellulose under determined operational conditions of the digester. These results can them be used in control, optimization and design studies in a safe and efficient way / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestre em Engenharia Química