Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Mário Roberto Hatayde / Banca: Adriana Coelho de Souza / Banca: Pamela Rodrigues Reina Moreira / Banca: Daniel Cortes Beretta / Resumo: A intoxicação por plantas invasoras de pastagens causa enormes prejuízos na pecuária brasileira, pois geralmente ocorre o consumo espontâneo da planta em pastagens de qualidade ruim, devido a seca, geada ou queimadas. Os animais também podem intoxicar-se acidentalmente, pela contaminação de grãos utilizados na dieta de animais de grande porte com sementes destas plantas. Plantas do gênero Crotalaria sp. possuem um princípio ativo que induz cirrose hepática em animais e suas sementes comumente misturam-se a grãos durante a colheita mecanizada. Existem várias pesquisas relacionando a proliferação das células estreladas hepáticas com fibrose hepática no homem. Nenhum estudo foi feito com animais de companhia relacionando a qualidade da ração oferecida aos mesmos e seus efeitos deletérios. Portanto, avaliar a susceptibilidade do cão como modelo experimental para um quadro de intoxicação por sementes de Crotalaria spectabilis, bem como, verificar se ocorre fibrose hepática e proliferação de células estreladas hepáticas em fígados de cães que receberam diferentes concentrações de sementes da planta (G1 - 0,2%, G2 - 0,4% e G3 - 0,6%), nos tempos zero (controle basal), T14 dias e T28 dias foram os objetivos deste estudo. As amostras de fígado foram colhidas por biopsia guiada por ultrassom, com os animais sob anestesia. A fibrose foi avaliada por métodos histoquímicos (Gordon e Sweet; Tricrômio de Masson e Picrosirius) e a densidade de células estreladas hepáticas foi avaliada por imuno-histoquímica. Os fígados de animais dos grupos G1 e G2 não apresentaram aumento de fibras reticulares ou de fibras colágenas em T14 e T28. No grupo G3 verificou-se discreta fibrose, predominantemente em T28. Conclui-se que na intoxicação experimental de cães por sementes de Crotalaria spectabilis ocorre uma proliferação de células estreladas hepáticas na fase inicial, seguida por ... / Abstract: The poisoning of pasture weeds cause huge losses in Brazilian cattle, usually occurs because the spontaneous ingestion of the plant in pastures of poor quality due to drought, frost or fire. Animals can also become contaminated accidentally by contamination of grain used in the diet of large animals. Plants of the genus Crotalaria sp. have an active ingredient that induces liver cirrhosis in animals and their seeds commonly blend the grains during mechanical harvesting. No study has been done with pets relating the quality of feed offered to them. The susceptibility of experimental dog model as a framework to poisoning Crotalaria spectabilis seeds, as well as to verify whether proliferation of hepatic fibrosis and hepatic stellate cells in the liver of dogs receiving different concentrations of plant seeds (G1 - 0, 2 % , G2 - 0.4 % and G3 - 0.6 % ) , in zero time (baseline control ), T14 days and T28 days were the goals of these studies . The liver samples were obtained by biopsy guided by ultrasound, with the animals under anesthesia. Fibrosis was evaluated by histochemical methods (Gordon and Sweet, Masson Trichrome and Picrosirius) and the density of hepatic stellate cells was evaluated by immunohistochemistry. The livers of animals in groups G1 and G2 showed no increase in reticulin or collagen fibers in T14 and T28. In G3 showed mild fibrosis, predominantly in T28. We conclude that the experimental poisoning of dogs by Crotalaria spectabilis seeds a proliferation of hepatic stellate cells in the initial phase occurs, followed by fibrosis and reduction in this cell population, confirming the role of these cells in repair of liver tissue / Doutor

A pesquisa de substâncias biologicamente ativas, advinda principalmente de plantas, tem levado a descoberta de moléculas clinicamente benéficas. A família Amaryllidaceae é conhecida por sintetizar alcalóides biologicamente ativos, principalmente do grupo tetraisoquinolínico. Estudos têm demonstrado que a atividade biológica destes vegetais está relacionada com a presença deste grupo de metabólitos secundários. No Rio Grande do Sul, é encontrado o gênero Hippeastrum, pertencente a família Amaryllidaceae. Neste trabalho, realizou-se a investigação preliminar de alcalóides dos extratos de Hippeastrum papilio, coletada na região serrana do estado. Foram isoladas 12 substâncias, nas quais 9 apresentam carcaterísticas químicas de alcalóides de Amaryllidaceae. Estudos preliminares de CLAE-EM e CG-EM apontam para a existência de alcalóides de núcleos licorina e haemantamina, além de núcleo galantamina, em menor quantidade. Estas análises também mostram a possibilidade de estruturas inéditas. Os extratos enriquecidos em alcalóides de Hippeastrum papilio demonstraram uma grande capacidade de inibição da enzima acetilcolinesterase, pelo método da bioutografia em cromatoplaca. Além disso, foi realizada a análise comportamental do alcalóide montanina, previamente isolada de Hippeastrum vittatum Este alcalóide foi avaliado na tarefa de reconhecimento de objeto, com administração intrahipocampal, testado 24 horas pós-treino (memória de longa duração). Obteve-se curva dose-resposta para o alcalóide, com dose pró-cognitiva estatisticamente significante de 1μg/μl. Esta mesma dose foi avaliada na mesma tarefa para obtenção de curva temporal. Montanina demonstrou atividade pró-cognitiva na mesma tarefa e testada 24 horas pós-treino, em administração imediatamente pós-treino, 180 minutos pós-treino, mas não em 360 min pós-treino. O alcalóide montanina também foi avaliado quanto ao perfil de inibição da enzima acetilcolinesterase, utilizando método de ultravioleta. Obteve-se inibição da enzima em concentrações de 10 μM, 100 μM e 1 mM. Os resultados obtidos neste trabalho apontam para a necessidade de continuação da investigação química de Hippeastrum papilio, motivada pelo grande potencial de inibição da enzima acetilcolinesterase e por possibilidade de isolamento de estruturas inéditas. Além disso, foi confirmado um grande potencial pró-cognitivo do alcalóide montanina, demonstrado comportamentalmente, além de inibir a enzima acetilcolinesterase, atividade esta necessária e importante para que uma substância seja candidata à terapia da Doença de Alzheimer. / A search for biologically active substances in plants has led to the discovery of clinically beneficial molecules. The family Amaryllidaceae is known to synthesize biologically active alkaloids, principally of the tetraisoquinolinic group. Studies have shown that the biological activity of these plants is due to the presence of these secondary metabolites. The Hippeastrum genus, belonging to the Amaryllidaceae family, is found in Rio Grande do Sul. A preliminary investigation of alkaloids from extracts of Hippeastrum papilio, collected in the mountain region of the Rio Grande do Sul was done in this work. Twelve substances were isolated, in which nine have chemical profile of Amaryllidaceae alkaloids. Preliminary studies with HPLC-MS and GC-MS showed the existence of lycorine and haemantamine type alkaloids, as well as galantamine type alkaloids in a lower quantity. These analysis also showed a possibile presence of unknown structures. The extracts, enriched in alkaloids of Hippeastrum papilio, demonstrated a great ability to inhibit the acetylcholinesterase enzyme by a rapid thin layer chromatography bioautographic method. Furthermore, it was done a behavior analysis of montanine, previously isolated from Hippeastrum vittatum This alkaloid was evaluated in recognition object task with intrahippocampal administration and tested for 24 hours postrainig (long term memory). There was found a doseeffect curve of montanine with cognitive-enhanced dose at 1μg/μl. This dose was evaluated in the same task for temporal-curve. Montanine showed procognitive activity in immediately postraining administration and 180 minutes postraining but not with 360 min postraining in the same task. The acetylcholinesterase inhibition profile of montanine alkaloid was also evaluated by a ultraviolet method. The enzyme was inhibited in concentrations of 10 μM, 100 μM and 1 mM of montanine. The results obtained in the present study show a need for further chemical investigation on Hippeastrum papilio due to its large potential for inhibition of the acetylcholinesterase and isolation of potentially new structures. Moreover, these results confirm the great pro-cognitive potential of montanine, behaviorally demonstrated, as well as its ability to inhibit the acetylcholinesterase enzime, which makes the alkaloid a candidate substance for the treatment of Alzheimer's Disease.

Orientador: Fernando A. S. Coelho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-07T08:40:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_ElizandraCristianedaSilva_D.pdf: 18553862 bytes, checksum: dbef893ceb01815274e951f3c7109ca5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Os alcalóides isolados de plantas da família Amaryllidaceae são conhecidos desde a antiguidade e vem sendo utilizados na medicina popular para o tratamento de várias enfermidades. Esses alcalóides constituem uma importante classe de produtos naturais a serem exploradas e como possuem uma grande variedade e complexidade estrutural, apresentam diferentes propriedades biológicas, dentre as quais destacamos: atividades antiviral, anticolinérgica, antineoplásica, antiintlamatória, analgésica, citotóxica, antimalarial e ativadora do sistema nervoso central. A (+)-Plicamina (10), um alcalóide membro da família Amaryllidaceae foi isolado de plantas da espécie Galanthus plicatus subsp. byzantinus por Hesse e col. em 1999. Esse alcalóide apresenta na estrutura o sistema 2-benzopirano[3,4-c]-hidroindolano, policíclico, de relativa complexidade (Figura 1). Em 2002, Ley e col. descreveram a primeira síntese total e assimétrica do alcalóide (+)-Plicamina (10), empregando como estratégia reagentes suportados em fase sólida. Este trabalho tem o objetivo de estabelecer uma nova abordagem para a síntese total e/ou formal do alcalóide (±)-Plicamina (10), explorando a potencialidade sintética de adutos de Bayllis-HilIman, como matéria-prima simples, de fácil obtenção, baixo custo e elevada versatilidade. Os resultados alcançados, que levaram à síntese estereosseletiva do fragmento isoquinolínico presente nesse alcalóide, estão resumidos no Esquema 1. O intermediário diidroisoquinoIínico N-alquilado (±)-164 foi obtido a partir do aduto de Baylis-HilIman 90, que mediante a reação de hidroboração de um éter de silício bis-alílico, forneceu o intermediário (±)-101, com boa diastereosseletividade dependendo da borana empregada. A seqüência de oxidações forneceu o ácido carboxílico (±)-107, transformado na amina (±)-126, através de um rearranjo de Curtius. A reação de N-alquilação de (±)-126 formou (±)-161, que após acilação e tratamento com t-BuLi forneceu a isoquinolinona substituída (±)-164, através de uma ciclização intramolecular promovida pela troca halogênio-metal, em 12 etapas e 6% de rendimento global, a partir do aduto 90. Tomando por base nossa proposta retrossintética, o intermediário (±)-164, tem em sua estrutura todos os grupos funcionais que poderão permitir a finalização da síntese do alcalóide (±)-Plicamina (10), em sua forma racêmica (Esquema 1). / Abstract: The alkaloids isolated from plants of the Amaryllidaceae family are well known since the ancient times and are used in folk medicine for the treatment of several diseases. Due to the great structural complexity exhibited by these alkaloids, they could show a great diversity of biological effects. Among them we can cite the following: antiviral, anticholinergic, antineoplasic, antiinflammatory, analgesic, citotoxic, anti malarial and central nervous system activating. (+)-Plicamine (10), an alkaloid belonging to this botanic family, has been isolated fram plants of the specie Galanthus plicatus subsp. byzantinus by Hesse et aI. in 1999. This compound exhibits a relatively complex 2-benzopyran[3,4-c]-hydroindolane system in its structure (Figure 1). Ley et al. have described the first asymmetric total synthesis of (+)-Plicamine (10), in 2002, employing a strategy based on the utilization of solid-phase supported reagents only. This work has as a main purpose to establish a new approach for the racemic total synthesis of the (±)-Plicamine (10), based on the exploration of the synthetic potentiality of BaylisHillman adducts, which could be considered as a simples and cheap starting material. Besides, these adducts are easy to obtain and show a highly synthetic versatility. The results obtained in the development of this work, which culminated with the stereoselective synthesis of the isoquinolinic fragment of our target, are depicted in Scheme 1. The N-alkylated dihydroisoquinolinic (±)-164, a key intermediate for the preparation of (±)-Plicamine (10), was prepared from the Baylis-Hillman adduct 90. Then, the alIylic alcohol fragment of adduct 90 was treated with silicon reagents to afford the corresponding silylated ethers, which are used as substrate for the reaction with DIBAL-H. The resulting alcohol was protected to furnish the silylated alIylic diol, which in turn was used as substrate for the hydroboration reaction to provide the intermediate (±)-101. Depending on the borane used the diastereoselectivity of this step can be very good. A sequence of oxidations gave the carboxylic acid (±)-107, which was transformed into the (±)-126, via a Curtius rearrangement. The N-alkylation reaction of (±)-126 provided (±)-161, which was acylated and treated with t-BuLi to afford the (±)-164, by an intramolecular cyclization reaction mediated by a halogen-metal exchange, in 12 steps and an overalI yield of 6%. Based on our synthetic retrosynthetic analysis, the intermediate (±)-164 bears in its structure alI the functional groups, which could permit us to accomplish the total synthesis of (±)-Plicamine, in its racemic form (Scheme 1). / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Quimica

Orientador: Raquel Marques Braga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T19:20:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MariadoSocorroSousada_D.pdf: 6344706 bytes, checksum: 853a78239ffebd4d2b672cd61eb26a66 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Nosso trabalho tem por objetivo o estudo dos alcalóides das espécies Amacrinum (híbrido Amaryllis x Crinum), Ismene festalis e três variedades de Amaryllis (¿sidney¿, ¿desire¿ e ¿belladonna¿) todas pertencentes a família Amaryllidaceae. As espécies desta família são fontes de alcalóides, e estes apresentam diversas atividades biológicas, entre elas a inibição da enzima acetilcolinesterase. O material utilizado nesse estudo (bulbos) foi adquirido de um produtor de plantas ornamentais da cidade de Holambra/SP. Os extratos EtOH e CH2Cl2 foram submetidos à extração ácido-base. Os extratos CHCl3 II de Amacrinum e Ismene festalis foram submetidos a purificações em cromatografia em coluna a pressão reduzida e cromatografia em camada semipreparativa e preparativa. Isolamos e identificamos nove alcalóides no extrato CHCl3 II de Amacrinum: beladina, N-desmetil-beladina, crinina, bufanidrina,1-O-acetil-licorina, 11-O-acetilambelina, undulatina, ambelina, bufanisina e dois alcalóides tazetina e haemantidina do extrato CHCl3 de I. festalis. Os extratos das três variedades de Amaryllis foram analisados por Cromatografia em fase Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM), resultando na detecção dos alcalóides: montanina, hipeastrina, 1,2-diidro-clidantina, licorina e nerinina. Estes dados foram comparados aos obtidos em nosso estudo sobre Amacrinum e aos literários, permitindo-nos concluir que o híbrido Amacrinum possui em sua composição principalmente alcalóides que têm larga distribuição no gênero Crinum; sendo que undulatina e ambelina, também são observados na espécie A. belladonna. A avaliação qualitativa para inibição da acetilcolinesterase (AChE) por CCD (Métodos de Rhee e Marston) mostrou resultados positivos para o extrato CHCl3 de Amacrinum e para os alcalóides bufanisina, 1-O-acetil- licorina e undulatina. A avaliação quantitativa para inibição da AChE, pelo método colorimétrico baseado na metodologia de Rhee, mostrou que os alcalóides possuem IC50 maiores que os padrões galantamina e fisostigmina. A interação dos alcalóides fisostigmina, crinina e ambelina com a AChE foram avaliadas por RMN-H, onde observou-se que as interações mais fortes são com os hidrogênios aromáticos dos alcalóides / Abstract: The alkaloids from Amacrinum (a hybrid Amaryllis x Crinum), Ismene festalis and three varieties of Amaryllis (¿sidney¿, ¿desire¿, ¿belladonna¿) of the family Amaryllidaceae were isolated and characterized. The species of this family are sources of alkaloids with a wide range of interesting physiological effects, including inhibition of acetylcholinesterase. The bulbs were obtained in the city of Holambra, São Paulo, Brazil. The EtOH and CH2Cl2 extracts were submitted to acid-base extraction. The CHCl3 extracts of Amacrinum and Ismene festalis were submitted to repeated fractionation using flash-chromatography CC and preparative TLC on silica gel. We isolated and identified nine alkaloids in the CHCl3 extract of Amacrium: belladine, N-demethyl- belladine, crinine, buphanidrine, 1-O-acetyl-lycorine, 11-O-acetyl-ambelline, undulatine, ambelline, and buphanisine; and two alkaloids in the CHCl3 extract of I. festalis: tazetine and haemathidine. The extracts of the three varieties of Amaryllis were analyzed by gas chromatography coupled-mass spectrometry (GC-MS), resulting in detection of the alkaloids: montanine, hippeastrine, 1,2-dihydroclidantine, lycorine, and nerinine. Comparing these data with those obtained for the Amacrinum hybrid and literature data, we concluded that the Amacrinum hybrid contains mainly alkaloids that are widely distributed in the genus Crinum. The CHCl3 extract of Amacrinum and buphanisine, undulatine, and 1-O-acetyllycorine alkaloids showed a positive result for the evaluation of the inhibition of acetylcholinesterase by CCD (the Rhee and Marston method). The acetylcholinesterase inhibitory activity of the extracts and alkaloids of Amaryllidaceae was evaluated by the colorimetric method in a microplate reader. The majority of the extracts gave good results. The IC50 values for the Amacrinum alkaloids were lower that those determined for physostigmine and galanthamine. Interactions of physostigmine, crinine, and ambelline alkaloids with AChE were evaluated by RMN-H, which showed that the interactions were stronger with the aromatic hydrogens of alkaloids / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciencias Quimicas

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-03T16:24:00Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcelo Augusto Pereira Januário - 2015.pdf: 5612013 bytes, checksum: 21d62fb31c78a1c5f8c42dd6e193dade (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-04T09:28:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcelo Augusto Pereira Januário - 2015.pdf: 5612013 bytes, checksum: 21d62fb31c78a1c5f8c42dd6e193dade (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T09:28:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcelo Augusto Pereira Januário - 2015.pdf: 5612013 bytes, checksum: 21d62fb31c78a1c5f8c42dd6e193dade (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-05-04 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Rubiaceae Juss. family is the fourth largest of angiosperms, with about 10,700 species and 640 genera distributed throughout the tropical regions around the world.The genus Psychotria L. is the largest of the family, comprising about 2000 species. The single most important secondary metabolites of genus are alkaloids, representing over 60% from isolated compounds and structurally characterized reported until 2013. To these compounds is attributed wide variety of pharmacological activities such as antifungal, anti-inflammatory, anticonvulsant and inhibitory monoaminooxidases enzymes A and B, related to diseases such as Parkinson's disease. Psychotria goyazensis Müll Arg. is a species of Rubiaceae family, genus Psychotria L., commonly found in brazilian midwestern. The fractionation of the crude extracts from leaves, twigs and fruits yielded two know alkaloids: calychantine (Pgfr 1) and strictosidinic acid (Pgf 1) and it led to identify the harmane (Pgf 7) and also, a novel quinoline alkaloid named hydroxy-calychantine (Pgfr 2a).The triterpenes ursolic and oleanolic acid (Pgf 2) and steroids sitosterol and stigmasterol free (Pgf 5) and glycosylated (Pgf 3) were identified in mixtures. Also, the phytochemical study of P. goyazensis allowed to the isolation of a phenolic compounds, the coumarin isoescopoletin (Pgg 1) and pointed out an interesting aspect of this plant, since there are no reports in literature on the simultaneous isolation of both types of alkaloid of the same species of the genus. / A família Rubiaceae Juss. é a quarta maior família das Angiospermas com cerca de 13000 espécies e 650 gêneros distribuídos pelas regiões tropicais ao redor do mundo. O gênero Psychotria L. é considerado o maior da família, compreendendo cerca de 2000 espécies. Os metabólitos secundários mais importantes no gênero são os alcaloides, representativos de mais de 60% de todos os compostos isolados e caracterizados estruturalmente até 2013. A esses compostos é atribuída grande variedade de atividades farmacológicas, como antifúngica, antiinflamatória, anticonvulsivante e inibidora das enzimas monoaminooxidases A e B, relacionadas a doenças como Mal de Parkinson. Psychotria goyazensis Müll Arg. é uma espécie da família Rubiaceae, gênero Psychotria L., comumente encontrada no Cerrado e Amazônia. O fracionamento fitoquímico dos extratos brutos das folhas, galhos e frutos de P. goyazensis resultou no isolamento de dois alcaloides conhecidos, o quinolínico calicantina (Pgfr 1) e o indolmonoterpênico ácido estrictosidínico (Pgf 1), além de possibilitar a identificação do alcaloide harmano (Pgf 7) e de outro alcaloide inédito, a hidroxi-calicantina (Pgfr 2a) em misturas. Por outro lado, foram identificados também em misturas os triterpenos ácido ursólico e oleanólico (Pgf 2) bem como os esteroides sitosterol e estigmasterol nas formas livre (Pgf 5) e glicosilada (Pgf 3). O estudo fitoquímico de Psychotria goyazensis permitiu ainda o isolamento de um composto fenólico, a cumarina isoescopoletina (Pgg 1) e apontou um aspecto interessante desta planta, uma vez que não existe na literatura relato do isolamento simultâneo dos dois tipos de alcaloide (indolmonoterpênico e quinolínico) de uma mesma espécie do gênero.

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-07-03T13:42:27Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Jeffeson Araujo de Morais.pdf: 2060043 bytes, checksum: b9d3c15f32e3cf6df972ecfe5a083b5d (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-13T15:22:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Jeffeson Araujo de Morais.pdf: 2060043 bytes, checksum: b9d3c15f32e3cf6df972ecfe5a083b5d (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-13T15:26:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Jeffeson Araujo de Morais.pdf: 2060043 bytes, checksum: b9d3c15f32e3cf6df972ecfe5a083b5d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-13T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Jeffeson Araujo de Morais.pdf: 2060043 bytes, checksum: b9d3c15f32e3cf6df972ecfe5a083b5d (MD5) Previous issue date: 2012-06-27 / Não Informada / Geissospermum argenteum Woodson (Apocynaceae), known as “acariquara-branca” is popularly used to treat malaria, gastrointestinal disorders and as curare. Considering that there are no published data reporting the pharmacological activities of this species, the aim of this work was to study the cardiovascular effects of Amazonian G. argenteum in rodents. The bark was extracted with ethanol in Soxhlet apparatus generating the hydroalcoholic extract (EHA). The EHA was partitioned with chloroform in different pH, yielding the chloroform fraction (FCHCl3); further partition yielded the total alkaloids fraction (TAF). FCHCl3 purification in silica gel column chromatography (CC) yielded thirteen fractions. FAT standardization in HPLC showed nine major peaks with retention times from 3.5 to 23.5 min. FAT oral administration did not indicate a central nervous system action, however, curare-like effect was observed after i.p. and i.v. injections. This action was confirmed in vitro. FAT (10, 30 and 100 μg/mL) blocked rat diaphragm contractions induced by phrenic nerve electrical stimulation. The neuromuscular blockade was proportional to the concentrations and was reverted by washing, but not by neostigmine (10-5M). On the same concentrations, contractions induced by direct electrical stimulation were potentiated in rat diaphragm. In anesthetized rats under mechanical respiration, FAT intravenous injection (0.3; 1.0 and 3.0 mg/kg) produced fast and reversible hypotension, not blocked by atropine (1.0 mg/kg). In anesthetized animals treated with the nicotinic ganglion blocker hexamethonium, hypertension induced by FAT was not changed by previous prazosin (1.0 mg/kg) injection, indicating that FAT hypertensive effect is not caused by an increase in noradrenaline (Nor) release by ganglion stimulation. FAT did not alter Nor or acetylcholine (ACh) effects on the blood pressure, indicating that there was not an apparent interaction among the alkaloids and α1, M2 or M3 receptors. On another protocol, FAT inhibited the hypertension induced by the ganglion stimulant DMPP; this effect could due to ganglion blockade and decreased Nor release at sympathetic nerve terminals which could also explain bradycardia and hypotension induced by FAT. In rat isolated atria, FAT (10, 30 and 100 μg/mL), caused negative chronotropism and positive inotropism. In rat papillary muscle, the effective refractory period was not altered, indicating that FAT did not interfere with the cardiac action potential. In rat isolated aorta, FAT (1.0; 3.0 and 10 μg/mL) produced endothelium- independent vasodilatation and shifted Nor cumulative concentration-response curve to the right, without inhibiting the agonist maximal response. This effect indicated α1-adrenergic receptors competitive blockade. Blockade of L-type calcium channel by FAT was not confirmed in cultured cardiac and uterus cells using the FURA-4 method to measure calcium influx. In rat vas deferens (DDR), FAT (10, 30 and 100 μg/mL) shifted Nor and ACh cumulative concentration-response curves to the right and potentiated the maximal effects. The results indicated many different activities of the total alkaloid fraction of G. argenteum: competitive α1-adrenergic receptors blockade and a non-competitive muscular nicotinic receptor blockade; positive inotropism and diaphragm twitch potentiation unrelated to potassium channel blockade during the muscle fiber repolarization, no inhibition of the muscle Ca+2-ATPase activity; potentiation of the rat vas deferens maximal responses to agonists is probably caused by intracellular second-messengers (IP3, DAG, PKC) activation, although no direct data confirm this possibility. / Geissospermum argenteum Woodson (Apocynaceae), conhecida como acariquara-branca, é utilizada popularmente para tratar malária, desordens gastrintestinais e como curare. Considerando o reduzido número de publicações científicas relatando a atividade farmacológica da espécie, o objetivo desse trabalho foi estudar os efeitos cardiovasculares de G. argenteum da Amazônia em roedores. O pó das cascas do caule foi extraído em Soxhlet obtendo-se o extrato hidroalcoólico (EHA). O EHA foi particionado com clorofórmio em diferentes pH, dando origem à fração clorofórmica (FCHCl3), e esta, à fração contendo os alcaloides totais (FAT). A purificação da FCHCl3 por cromatografia em coluna (CC), gerou 13 frações semipurificadas. A padronização da FAT em CLAE a 260 nm mostrou 9 picos principais com tempos de retenção que variaram de 3,5 a 23,5 min. A administração oral da FAT (10 a 100 mg/kg) não indicou ação central, no entanto, foram observados efeitos indicativos de ação curarizante quando administrados por via i.p. e e.v. Essa ação foi confirmada in vitro. A FAT (10 a 100 μg/mL) bloqueou as contrações do diafragma de rato induzidas por estímulo elétrico do nervo frênico. O bloqueio neuromuscular foi proporcional às concentrações e revertido após lavagem, mas não pela neostigmina (10-5 M). Nas mesmas concentrações, as contrações induzidas por estimulação direta das fibras do diafragma foram potenciadas. Em ratos anestesiados e sob respiração artificial, a injeção endovenosa da FAT (0,3 a 3,0 mg/kg) produziu hipotensão rápida e reversível, não bloqueada pela atropina (1,0 mg/kg). Em animais anestesiados e tratados com hexametônio, a hipertensão produzida pela FAT (2,0 mg/kg) não foi alterada pelo prazosin (1,0 mg/kg), indicando que o efeito hipertensor da FAT não é pelo aumento na liberação de noradrenalina (Nor) por estimulação ganglionar. A FAT (1,0 mg/kg) também não alterou os efeitos pressóricos produzidos pela Nor ou acetilcolina (ACh), indicando que não houve interação aparente dos alcaloides com receptores α1 dos vasos e, muscarínicos do coração (M2) e vasos (M3). Em outro protocolo, a FAT inibiu a hipertensão produzida pela maior dose do DMPP, que pode ter sido por redução na liberação da Nor por um bloqueio nicotínico ganglionar da FAT. Esse efeito também poderia explicar a bradicardia produzida simultaneamente ao efeito hipotensor da FAT. Em átrios isolados de rato, a FAT (10 a 100 μg/mL) produziu cronotropismo negativo e inotropismo positivo. Em músculo papilar de rato, o período refratário efetivo não foi alterado, indicando que a FAT não interfere com o potencial de ação cardíaco. Na aorta isolada de rato, a FAT (1,0 a 10 μg/mL) produziu vasodilatação independente do endotélio vascular e deslocamento da curva-cumulativa de Nor para a direita, sem diminuição do efeito máximo, indicando bloqueio competitivo dos receptores α1-adrenérgicos ou bloqueio do influxo de cálcio por canais do tipo L. No entanto, a FAT não inibiu o influxo de cálcio em culturas celulares com o método do Fura-4. Em ducto deferente de rato (DDR), a FAT (10 a 100 μg/mL) deslocou a curva-cumulativa de Nor para a direita e potenciou o efeito contrátil máximo produzido pela Nor e ACh. Os resultados obtidos mostraram muitos efeitos diferentes produzidos pela FAT da G. argenteum: bloqueio competitivo de receptores α1-adrenérgicos não-competitivo de receptores nicotínicos musculares; aumento do inotropismo e potenciação da contração do diafragma, não explicados por um bloqueio de canais de potássio durante a repolarização celular, nem por inibição da atividade da Ca+2-ATPase muscular. A potenciação do efeito máximo dos agonistas no DDR parece ser por ativação de segundos mensageiros intracelulares (talvez IP3, DAG ou PKC), mas não existem dados comprobatórios dessa ação.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-14T19:25:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Suzana da Silva de Oliveira Martins.pdf: 3091328 bytes, checksum: 58c100aa7ab48882d71d14441b2e071c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-16T17:42:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Suzana da Silva de Oliveira Martins.pdf: 3091328 bytes, checksum: 58c100aa7ab48882d71d14441b2e071c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-16T17:52:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Suzana da Silva de Oliveira Martins.pdf: 3091328 bytes, checksum: 58c100aa7ab48882d71d14441b2e071c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-16T17:52:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Suzana da Silva de Oliveira Martins.pdf: 3091328 bytes, checksum: 58c100aa7ab48882d71d14441b2e071c (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Geissospermum urceolatum is an Apocynaceae popularly known as acariquara-branca, acariquara, quinarana, acariubarana, acarirana, pereira, pau-pereira and pau-forquilha. Besides the quality of its wood, the bitter bark infusion is commonly used in the folk medicine of the Amazonian region to treat stomachache, fever and malaria. There are no scientific reports of this species confirming these actions. This work shows the effects of Geissospermum urceolatum alkaloids in the arterial blood pressure and in rats smooth mucle contraction. The dried and powdered bark was extracted obtaining the aqueous extract (AE) by infusion (2,5%), the ethanolic extract (EETOH) by maceration with ethanol 50% at room temperature, the hydro-alcoholic extract (HAE) by extraction in the Soxhlet apparatus with ethanol 80%; the extracts were filtrated and concentrated. The HAE was re-suspended in chloroform and partitioned with acidic water generating the total alkaloids fraction (TAF). The importance of the popular indication as anti-malarial guided the TAF preliminary test in rodents infected with Plasmodium chabaudi. The TAF purification by HPLC yielded 14 fractions referent to the main peaks (>1% of chromatogram total area), possible chemical markers of the extract after identification and pharmacological evaluation. In the immediate chemical standardization performed to the pharmacological studies, 6 major components were chosen, they are still in identification process. The studies with the standardized extracts were planned for the experimental detection of a wide spectrum of the pharmacological actions, from general tests in vivo with oral administration of the extracts until the study of the purified fractions in isolated preparations in vitro. The pharmacological screening was initiated with the observation test, or Hippocratic test. The oral administration of EETOH (1,0 g/kg) did not produce evident signs of pharmacological activity in the animals. However, the systemic administration by intra-peritoneal pathway reduced the motility, the respiratory rate and produced cyanosis with occurrence and intensity proportional to the doses. These effects were faster and more intense with TAF, confirming the higher concentration of the compounds in this fraction. In anesthetized rats blood pressure, TAF induced fast and temporary hypotension without affecting the hypertensive effect of noradrenalin or the hypotension induced by acetylcholine. Higher doses produced irregular responses with late reversion to the basal level. In rats atrium and papillary muscle, TAF inhibited the pacemaker excitability, but facilitated the excitation-contraction coupling, potentiating the papillary muscle contraction. In rat aortic rings with intact endothelium, TAF relaxed the muscular tonus induced by noradrenalin, but with NOS blockade by the previous incubation of L-NAME, the effect was only 40%, indicating a NO independent mechanism in the TAF relaxant activity. This possibility was confirmed when TAF also relaxed the endothelium deprived aortic rings preparations. In depolarized rat portal vein, TAF reduced the maximum contraction produced by CaCl2 addition, indicating the calcium channel blockade by the alkaloids. In rat vas deferens, TAF potentiated the maximum contraction induced by noradrenalin and reduced the drug affinity to the α1-adrenergic receptors; the acethylcholine action was not changed. These results showed that TAF potentiated the second-messengers of the adrenergic pathway, but did not potentiate the contraction when the second-messengers were activated by the muscarinic receptors stimulation. The study of the purified alkaloids will be essential to understand the mechanisms of action of the effects until now observed. The present work show results with vasorelaxation that may be explained by two mechanisms: indirect, via endothelial NOS activation and direct in the smooth muscle, apparently by blocking the calcium ion influx. This action, however, is not so clear because in the vas deferens, at the same time that the noradrenalin EC50 was increased in the presence of TAF, the maximum contractile effect of the agonist was potentiated, as if sensitization of the contractile myofibrils had been produced. The purification and isolation of the TAF constituents may permit the dissociation of the effects observed and the determination of the mechanisms of action, mainly of the poorly known effect that potentiated the maximum contraction of the total agonist noradrenalin. / Geissospermum urceolatum é uma Apocynaceae conhecida popularmente como acariquara-branca, acariquara, quinarana, acariubarana, acarirana, pereira, pau-pereira e pau-forquilha. Além da qualidade de suas madeiras, a casca da espécie possui um gosto amargo sendo utilizada comumente na forma de infusões pela medicina popular da Região Amazônica para tratamento de dores no estômago, tontura, febre e malária. Esta espécie não conta com trabalhos científicos confirmando essas ações. Este trabalho mostra os efeitos dos alcalóides de Geissospermum urceolatum A.H. Gentry (acariquara-branca) na pressão arterial e na contração do músculo liso de ratos. Cascas secas à sombra em temperatura ambiente e depois moídas foram extraídas; o extrato aquoso (EA) foi obtido por infusão a 2,5 %; o extrato etanólico (EETOH) foi obtido por agitação do pó a 2,5 % com etanol 50 % à temperatura ambiente; o extrato hidroalcoólico (EHA) à quente foi obtido em Soxhlet com etanol 80%. Os extratos foram filtrados e concentrados em rota evaporador. O EHA foi retomado em clorofórmio e extraído com água ácida, originando a fração alcalóides totais (FAT). A importância da informação popular do uso em malária orientou o teste preliminar da FAT em roedores infectados com Plasmodium chabaudi. A purificação da FAT em CLAE mostrou 14 frações referentes aos picos majoritários (>1% da área total do cromatograma), possíveis marcadores químicos do extrato depois de identificados e avaliados farmacologicamente. Na padronização química imediata realizada para o estudo farmacológico, foram considerados os 6 componentes químicos com os maiores picos, que encontram-se em processo de identificação. Os estudos com extratos padronizados foram planejados para a detecção experimental de um grande espectro de ação farmacológica, desde testes gerais in vivo por administração oral dos extratos, até o estudo das frações purificadas em preparações isoladas in vitro. A triagem geral da atividade farmacológica foi iniciada com o método de observação, ou Teste hipocrático. A administração oral, do EETOH (1,0 g/kg), não produziu sinais evidentes de atividade farmacológica nos animais. Com a administração sistêmica por via intraperitoneal, no entanto, o extrato diminuiu a motilidade, a frequência respiratória e produziu cianose nos animais, sendo todos os efeitos de aparecimento e intensidades proporcionais à dose. Com a FAT os efeitos foram mais rápidos e intensos confirmando a maior concentração dos compostos na fração. Na pressão arterial em ratos anestesiados, a FAT produziu uma hipotensão rápida e passageira, sem alterar o efeito hipertensor da noradrenalina, ou a hipotensão produzida pela acetilcolina. Doses maiores produziram respostas irregulares com reversão demorada. Em átrio e músculo papilar de rato, a FAT inibiu a excitabilidade do marca-passo, mas facilitou o acoplamento excitação-contração, potenciando a contração do músculo papilar; na aorta de rato com endotélio, a FAT relaxou o tônus muscular produzido pela noradrenalina, mas após o bloqueio da NOS com L-NAME, o relaxamento foi reduzido de apenas 40%, indicando um outro mecanismo independente de NO na ação relaxante da FAT. Esta possibilidade foi confirmada quando a FAT também relaxou a aorta desprovida de endotélio. Na veia porta despolarizada, a FAT reduziu a contração máxima produzida pela adição de CaCl2, indicando bloqueio dos canais de cálcio pelos alcalóides. Nos estudos em ducto deferente de rato, a FAT potenciou a contração máxima produzida pela incubação de noradrenalina, e diminuiu a afinidade da droga pelos receptores α1-adrenérgicos. A ação da acetilcolina não foi potenciada. Estes resultados mostraram que a FAT potenciou a ação de segundos-mensageiros da via adrenérgica, mas não potenciou a contração quando os segundos-mensageiros foram ativados pela estimulação dos receptores muscarínicos. O estudo dos alcalóides purificados será essencial para o entendimento dos mecanismos das ações até agora evidenciadas. O presente trabalho apresentou resultados que mostram ação vasodilatadora que pode ser explicada por dois mecanismos: indireto, via ativação de NOS endotelial e direto na musculatura lisa, aparentemente por bloquear o influxo de íons cálcio. Esta ação, no entanto, não é tão clara, pois na musculatura do ducto deferente, ao mesmo tempo em que a CE50 da noradrenalina é aumentada na presença da FAT, o efeito contrátil máximo do agonista foi potenciado, aparentando uma sensibilização das miofibrilas contráteis. A purificação e o isolamento dos constituintes deverá permitir a dissociação dos efeitos observados e a determinação dos mecanismos de ação, principalmente do efeito pouco conhecido que potenciou a contração máxima do agonista total noradrenalina.

Mesmo antes do advento da escrita, o homem já buscava na natureza a cura para suas doenças. Dentre as diferentes classes de produtos naturais usados para esse fim, destaca-se a dos alcalóides, por exibir relevante diversidade estrutural e farmacológica, e que tem como fonte importante o gênero Aspidosperma, do qual foram isolados alcalóides que têm sido usados nas terapias atuais. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo investigar os alcalóides obtidos a partir de diferentes partes de duas espécies ainda pouco exploradas: Aspidosperma ramiflorum e Aspidosperma tomentosum quanto à sua composição e atividades antifúngica, antimicrobiana e antitumoral. Foram identificados através de Cromatografia à Gás acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) e Ressonância Magnetica Nuclear os alcalóides beta-ioimbina, nos pericarpos e arilos de A. ramiflorum, uleína, nas folhas, ramos e sementes de A. tomentosum, além de quebrachamina e razinilama, nos arilos e sementes dessa espécie. Adicionalmente, com base na literatura e nos resultados das análises por CG-EM verificou-se em A. tomentosum a presença de desmetileno-oxa-uleína, nas folhas, de eburnamonin-19-ona nos ramos e de di-hidro-razinilama, de aspidospermidina e também de di-hidro-razinilama e de 1-acetil-17-metóxi-aspidospermidina nas sementes e arilos dessa mesma espécie. Nenhum dos extratos de alcalóides totais ou alcalóides isolados apresentou atividade antibacteriana relevante. Verificou-se atividade antitumoral em extratos de alcalóides dos pericarpos de A. ramiflorum e dos ramos, folhas e arilos de A. tomentosum. Observou-se ainda atividade antifúngica em todos os extratos de alcalóides ensaiados, além de atividade específica contra isolados de Criptococcus neoformans resistentes ao fluconazol para os alcalóides quebrachamina e beta-ioimbina. O extrato de alcalóides totais das folhas de A. tomentosum, além da atividade frente a essas leveduras, também se mostrou ativo frente a duas espécies de Candida (C. krusei e C. parapsilosis). Concluiu-se a partir dos resultados obtidos que as duas espécies estudadas podem ser consideradas fontes promissoras de alcalóides que poderão ser utilizados como modelos para novos fármacos antifúngicos e antitumorais. / Even before the advent of writing, man already searched the nature for the cure of his illnesses. Among the different classes of natural products used for this purpose, monoterpenoid indole alkaloids exhibit large structural and pharmacological diversities and these compounds are commonly found in the Aspidosperma genus. In this context, the present work had as main goals to investigate the alkaloids from different parts of two poorly studied species, Aspidosperma ramiflorum and Aspidosperma tomentosum, regarding their composition and antibacterial, antifungal, and antitumoral activities. Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC-MS) and Nuclear Magnetic Ressonance analysis allowed the identification of the following alkaloids: beta-yohimbine, in the pericarp and arils of A. ramiflorum; uleine, in leaves, branches and seeds of A. tomentosum; quebrachamine and rhazinilam, in the arils and seeds of the same species. Moreover, based on literature data and the results of the GC-MS analysis was characterized in A. tomentosum the presence of oxo-uleine, in the leaves and stems, eburnamonine, in the stems, and rhazinilam, aspidospermidine, dihydrorhazinilam and 1-acetyl-17-methoxy-aspidospermidine like alkaloids in the seeds and arils. Neither crude alkaloid extracts nor isolated alkaloids presented a relevant antibacterial activity. An antitumoral activity could be detected in crude alkaloids extracts from pericarps of A. ramiflorum and from stems, leaves and arils of A. tomentosum. On the other hand, antifungal activity was observed in all crude alkaloid extracts assayed, besides a specific activity of the alkaloids quebrachamine and beta-yohimbine against fluconazol resistant Criptococcus neoformans. Additionally, it was observed that crude alkaloid extract from leaves of A. tomentosum was also active against two Candida species (C. krusei e C. parapsilosis), as well as to the C. neoformans isolate. From these results we can conclude that the two studied species has to be considerated as promising sources for antifungal and antitumor alkaloids to be used as models to design new drugs.

Annona crassiflora é uma espécie nativa do cerrado brasileiro, conhecida pelo uso popular como alimento e na etnofarmacologia para o tratamento de parasitas do couro cabeludo e de transtornos menstruais. Quimicamente, Annonaceae é conhecida pela produção de acetogeninas e alcaloides benzilisoquinolínicos, dentro dos quais o gênero Annona apresenta a maior diversidade de compostos aporfínicos. O objetivo central deste trabalho foi avaliar potenciais atividades biológicas para Annona crassiflora, relacionadas a sua composição alcaloídica. A análise do extrato foliar de A. crassiflora através de técnicas cromatográficas, espectrométricas e por ressonância magnética nuclear levou a detecção de oito compostos nitrogenados, sendo sete deles identificados: anonaina, annoretina, estefalagina e xilopina, já previamente descritos na espécie, litseglutina B e tetrahidropalmatrubina, identificados pela primeira vez no gênero, e um alcaloide aporfínico inédito proposto como crassiflorina, em homenagem a espécie. A partir das amostras obtidas, foram desenvolvidos diversos ensaios de atividades biológicas, sendo testado o potencial fitotóxico, a atividade antimicrobiana frente as bactérias (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis), a inibição de atividade enzimática (acetilcolinesterase e transcriptase-reversa do HIV1) e a atividade antiparasitária (amastigotas e tripomastigotas de Trypanosoma cruzi). Somente dois dos alcaloides identificados, estefalagina e xilopina, foram isolados em quantidades suficientes para alguns bioensaios. De maneira geral, a estefalagina apresentou maior efeito inibitório no alongamento dos coleóptilos de trigo, além de melhores resultados nos ensaios de inibição de atividade enzimática (acetilcolinesterase e HIV1-RT). A xilopina foi mais eficiente nos ensaios fitotóxicos com braquiária (Urochloa decumbens) e com o parasita causador da doença de Chagas (Trypanossoma cruzi). Resultados interessantes com a fração enriquecida em alcaloides também foram obtidos para os ensaios fitotóxicos com espécies-alvo (Lactuca sativa e Lycopersicon esculentum) e antimicrobianos. Estes resultados reforçam o grande potencial biológico dos alcaloides produzidos por Annona crassiflora, sendo, a maioria das atividades descritas neste trabalho, inéditas para estas subtâncias / Annona crassiflora is a native species of Brazilian cerrado, used as food for local people and for treatment of scalp parasites and menstrual disorders in folk medicine. Chemically, Annonaceae is known for the production of acetogenins and benzylisoquinoline alkaloids, within which the Annona genus presents the greatest diversity of aporphine compounds. The aim of this work was to evaluate potential biological activities for Annona crassiflora, related to its alkaloid composition. The analysis of the foliar extract of A. crassiflora by chromatographic, spectrometric and nuclear magnetic resonance techniques led to the detection of eight nitrogen compounds. Seven of which were identified: anonaine, annoretine, stephalagine and xylopine, previously described in the species, litseglutine B and tetrahydropalmatrubine, as first report for the genus, and an unpublished aporphic alkaloid proposed as crassiflorine, in honor of the species. From the obtained samples, several biological assays were developed, being tested the phytotoxic potential, the antimicrobial activity against three bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis), the inhibition of enzymatic activity (acetylcholinesterase and transcriptase-reverse of HIV1) and the antiparasitic activity (amastigotes and trypomastigotes of Trypanosoma cruzi). Only two of the identified alkaloids, stephalagine and xylopine, were isolated in sufficient amounts for some bioassays. In general, stephalagine had significant inhibitory effect on wheat coleoptile elongation, as well as strong results in inhibition of enzymatic activity (acetylcholinesterase and HIV1-RT). Xylopine was more efficient in phytotoxic trials with Urochloa decumbens, and with the parasite that causes Chagas disease (Trypanosoma cruzi). Interesting results with an alkaloid enriched fraction were also obtained for the phytotoxic assays with target species (Lactuca sativa and Lycopersicon esculentum) and antimicrobials. These results reinforce the great biological potential of the alkaloids produced by Annona crassiflora. As the best of our knowledge, most of the activities described in this work are unpublished for these compounds

Orientador: Paulo Mazzafera / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Schimpl_FlaviaCamila_M.pdf: 3074978 bytes, checksum: 589ce5b09a9c5f294c4bd4eaaff896b1 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Alguns grupos de plantas caracterizam-se por acumularem cafeína. Chá, café e guaraná, que acumulam cafeína, são algumas dessas plantas. As sementes de guaraná possuem o maior teor de cafeína já descrito em plantas, entre 2,5 e 6%. A popularização dos produtos a base de guaraná e a alta demanda por cafeína natural (obtida por descafeinação de plantas) destacam o interesse comercial pela espécie. A biossíntese de cafeína em plantas foi extensivamente estudada em café e chá e ambas espécies têm as mesmas vias chave da biossíntese da cafeína. O terceiro passo da via ocorre na presença de teobromina sintase (TS), enzima com atividade específica na conversão de 7-metilxantina em teobromina, e/ou dependendo da espécie, na presença de cafeína sintase (CS), uma enzima bifuncional que atua nos dois últimos passo da síntese de cafeína, na conversão da 7-metilxantina para teobromina e posteriormente desta para cafeína. O objetivo desta tese foi caracterizar os níveis de metilxantinas, atividade e expressão de CS em frutos de guaraná, sendo que para isto foram realizadas análises bioquímicas e moleculares nos tecidos de cinco cultivares (BRS-Amazonas, BRS-CG372, BRS-CG611, BRS-Maués, BRS-Luzéia). Teobromina acumulou preferencialmente em folhas (estádios jovem, intermediária e madura), caule (porção apical e basal), inflorescência, pericarpo de frutos nos estádio verde, intermediário e maduro. Nas sementes, a cafeína foi o alcaloide que acumulou em maior quantidade e atingiu níveis entre 3,3 e 5,8%. Nos tecidos analisados, seja teobromina ou cafeína, a maior concentração do alcaloide foi em tecidos novos, reduzindo com o desenvolvimento. Enquanto que teofilina foi encontrada em quantidades baixas em todos os materiais. A maior concentração de cafeína em frutos imaturos foi confirmada pela maior atividade de CS e maior expressão de PcCS. A busca do gene da CS de guaraná no banco de sequências EST Realgene gerou uma sequencia de nucleotídeos (PcCS) com 1080 pb, que apresenta semelhança filogenética com proteínas de CS de cacau (BCS1) e chá (TCS1 e TCS2). A produção da proteína recombinante permitiu a caracterização funcional de PcCS como uma CS bifuncional, capaz de catalisar os dois últimos passos de metilação da biossíntese de cafeína. PcCS mostrou afinidade para 7-metilxantina e teobromina (maior afinidade), diferindo das CS descritas para outras espécies acumuladoras de cafeína, que possuem maior afinidade por paraxantina. Provavelmente isto se deve aos resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo da proteína predita, quando comparada com a de café / Abstract: Some plants are characterized by presenting high contents of caffeine. Tea, coffee and guarana, which accumulate the alkaloid caffeine, are some of these plants. Guarana seeds have the highest caffeine content (2.5 and 6%) among plants accumulating methylxanthine alkaloids. The increase in popularity of products made from guarana and the high demand for natural caffeine (obtained by decaffeination plant) justify the commercial interest for this species. The biosynthesis of caffeine in plants has been extensively studied in coffee and tea and both species present high similarity regarding the caffeine biosynthesis pathway. The third step of the pathway occurs in the presence of the enzyme theobromine synthase (TS), which converts 7-methylxanthine to theobromine but depending on the species, this step is also mediated by caffeine synthase (CS), an bifunctional enzyme that in addition to convert 7-methylxanthine to theobromine, also convert the later to caffeine. The aim of this study was to characterize the levels of methylxanthine alkaloids, activity and expression of caffeine synthase in the guarana fruit, and for this biochemical and molecular analyses were carried out in tissues of five cultivars of guarana (BRS-Amazonas, BRS-CG372, CG611-BRS, Maués-BRS, BRS-Luzéia). Theobromine was preferentially accumulated in the leaves (young, intermediate and mature stages), stems (apical and basal sections), inflorescence, and pericarp of fruits (green, intermediate and mature stages). However caffeine accumulated in the seeds as the main alkaloid and reached levels between 3.3 and 5.8%. In all tissues analyzed, whether theobromine or caffeine, the alkaloid concentration was higher in new tissues, reducing with the development/maturation. While theophylline was found in low amounts in all materials. The highest concentration of caffeine in immature fruits was confirmed by the highest activity of CS and highest expression of PcCS. The search for the CS gene of guarana in the EST guarana database Realgene generated a sequence of nucleotides (PcCS) with 1080 bp, which presented phylogenetic similarity with proteins of caffeine synthase from cocoa (BCS1) and tea (TCS1 and TCS2). The production of the PcCS recombinant protein allowed the functional characterization of the enzyme as a bifunctional CS, able to catalyze the two last methylation steps in the biosynthesis of caffeine. PcCS showed affinity for 7-methylxanthine and theobromine (highest), differing from the CS described for other species accumulating caffeine, which have highest affinity paraxanthine. This is probably due to the amino acid residues present in the active site of the predicted protein when compared to coffee / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestra em Biologia Vegetal