TAR DNA binding protein of 43 kDa (TDP-43) has been implicated in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. Pathologically misfolded and aggregated forms of TDP-43 are found in cytoplasmic inclusion bodies of affected neurons in these diseases. The mechanism by which TDP-43 misfolding causes disease is not well understood. We postulate that the aggregation process plays a major role in pathogenesis, and we hypothesize that oligonucleotide ligands of TDP-43 can stabilize the native functional state of the protein and ameliorate aggregation of this aggregation-prone protein. Using recombinant TDP-43 we were able to examine the extent to which various oligonucleotide molecules affects its aggregation in vitro. We have found that certain natural sequence and de novo designed oligonucleotides bind TDP-43 and prevent its natural tendency to aggregate. The clinical and therapeutic implications of these findings are discussed.

TAR DNA binding protein of 43 kDa (TDP-43) has been implicated in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. Pathologically misfolded and aggregated forms of TDP-43 are found in cytoplasmic inclusion bodies of affected neurons in these diseases. The mechanism by which TDP-43 misfolding causes disease is not well understood. We postulate that the aggregation process plays a major role in pathogenesis, and we hypothesize that oligonucleotide ligands of TDP-43 can stabilize the native functional state of the protein and ameliorate aggregation of this aggregation-prone protein. Using recombinant TDP-43 we were able to examine the extent to which various oligonucleotide molecules affects its aggregation in vitro. We have found that certain natural sequence and de novo designed oligonucleotides bind TDP-43 and prevent its natural tendency to aggregate. The clinical and therapeutic implications of these findings are discussed.

La azitromicina ha mostrado resultados prometedores en el tratamiento de la infección respiratoria crónica por P. aeruginosa. No presenta actividad bactericida frente a este microorganismo en cultivo planctónico, pero se sabe que este macrólido inhibe la formación de biofilms gracias a su capacidad para interferir en el sistema quorum sensing bacteriano. En las infecciones crónicas frecuentemente se seleccionan mutantes que presentan un alto grado de adaptación al nicho ecológico y a los antimicrobianos, como ocurre con el mutante en nfxB, gen regulador negativo de la bomba de expulsión activa MexCD-OprJ. Este fenotipo es frecuentemente aislado en pacientes con fibrosis quística, EPOC y bronquiectasias, y se caracteriza por presentar resistencia a los antimicrobianos que puedan actuar como sustrato y por presentar una marcada hipersensibilidad a antibióticos betalactámicos no sustratos de la bomba y aminoglucósidos. Uno de los objetivos del presente trabajo fue averiguar si durante la exposición prolongada a azitromicina se seleccionan mutantes nfxB tanto en crecimiento planctónico como en forma de biofilm. Se evaluó el impacto de la hiperproducción de alginato y el efecto de la hipermutación sobre el efecto bactericida, sobre la dinámica de desarrollo de resistencias a azitromicina y sobre la posible aparición de resistencias cruzadas. También fue objeto de estudio la caracterización del mutante nfxB, así como la relación entre la hiperexpresión de MexCD-OprJ, la actividad de la cefalosporinasa cromosómica AmpC, y las bombas de expulsión intrínsecas MexAB-OprM y MexXY-OprM. Para llevar a cabo tales objetivos se construyeron mutantes deficientes en el gen mucA, mutS y la combinación de ambos y se evaluó su comportamiento en forma de biofilm al ser tratado con diversas concentraciones de azitromicina durante varios días. Se caracterizaron los mutantes resistentes a azitromicina, se determinó su perfil de sensibilidad, se cuantificó la expresión relativa de mexD mediante PCR a tiempo real y finalmente se secuenció su gen regulador nfxB revelando diversas mutaciones inactivantes. En síntesis, los resultados obtenidos demuestran que durante el tratamiento de los biofilms con azitromicina existe una selección de mutantes nfxB en las cepas salvajes, hiperproductoras de alginato y particularmente en las cepas hipermutadoras. Seguidamente se construyó el mutante nulo nfxB y se evaluaron sus propiedades biológicas, su sensibilidad al complemento del suero humano, la tasa y frecuencia de mutación en rifampicina. Finalmente se analizó su transcriptoma, mostrando que aparentemente no se sobrexpresan genes implicados en la resistencia antimicrobiana, a excepción de los pertenecientes al sistema mexCD-oprJ. Aunque en el perfil de proteínas fijadoras de penicilina no se hallaron diferencias entre el mutante nfxB y la cepa de referencia, el análisis de proteínas de membrana externa reveló una disminución de la expresión de de OprM, responsable de la hipersensibilidad a aminoglucósidos y betalactámicos con la excepción del imipenem. De igual forma, la disminución de la expresión de OprM no justificó la reversión del fenotipo de resistencia a betalactámicos en el mutante nfxB-dacB. Sin embargo, la determinación fraccionada (extracto crudo, periplasma y sobrenadante) de la actividad betalactamasa específica del mutante nfxB y del mutante doble nfxB-dacB reveló un drástico descenso de la actividad periplasmática, a expensas de un aumento de la actividad determinada en el sobrenadante. Nuestros datos revelan que la hipersensibilidad a betalactámicos es debida a la incapacidad para mantener AmpC en el espacio periplásmico, produciéndose una permeabilización al medio extracelular. No obstante un análisis más profundo de este fenómeno nos ha permitido demostrar cómo dicha permeabilización resulta beneficiosa en el seno de un biofilm tratado con betalactámicos, ya que AmpC quedaría recluido en su matriz. Finalmente, los datos preliminares sugieren que la permeabilización que experimenta AmpC en el mutante nfxB ocurre también para otras betalactamasas, particularmente de las clases B y D. Azithromycin has shown promising results in the treatment of P. aeruginosa chronic respiratory infections during the last years. Although it does not show bactericidal activity against planktonic cells, this macrolide is known to inhibit biofilm formation due to its ability to block or interfere with the bacterial quorum sensing. During chronic infections, mutants showing high level of adaptation to the lung environment and antibiotics are often selected, such as mutants in the gene nfxB, which encodes the negative regulator of the efflux pump MexCD-OprJ. This phenotype is frequently isolated in the respiratory tract of Cystic Fibrosis patients, but also in COPD and bronchiectasis, and it is characterized by showing antimicrobial resistance to those antimicrobials that can act as a substrate, and for presenting a marked hypersusceptibility to nonsubstrate beta-lactams and aminoglycosides. Therefore, one of the aims of this work was to assess if these nfxB mutants are selected during prolonged exposure to azithromycin in both planktonic and biofilm growth. Furthermore, we evaluated the effect of alginate overproduction and hypermutation on the bactericidal activity and the dynamics of development of resistance to azithromycin. In this work we have also characterized the nfxB mutant as well as the relationship between MexCD-OprJ overexpression (driven by nfxB inactivation), the activity of the chromosomal beta-lactamase AmpC and the major efflux pumps MexAB-OprM and MexXY-OprM. To carry out these objectives, strains PAO1, its mucA mutant, and their respective mutS-deficient hypermutable derivatives were constructed. The biofilms formed by these strains were treated with different azithromycin concentrations for several days and the dynamics of antibiotic resistance development was evaluated. Azithromycin resistant mutants were characterized, their susceptibility profiles were determined, their relative mexD expression was quantified and finally its regulatory gene nfxB was sequenced, revealing several inactivating mutations. In summary, our results demonstrate that nfxB mutants are readily selected during azithromycin treatment of biofilms in wild-type strains, alginate hyperproducers and particularly in hypermutable strains. Then, the knockout nfxB mutant was constructed and its biological features characterized, the susceptibility to the complement of human serum, its rifampicin resistance mutation rate and finally its whole genome gene expression was analyzed, showing that apparently there are no other overexpressed genes involved in antimicrobial resistance except for those belonging to MexCD-OprJ operon. Although no differences in the penicillin binding protein profile between the nfxB mutant and the reference strain were found, analysis of the outer membrane protein profile revealed a reduced expression of OprM, which is responsible for the hypersensitivity to aminoglycosides and beta-lactams, except imipenem. Likewise, a decrease in the OprM expression did not explain the reversion of the high beta-lactam resistance phenotype in the nfxB-dacB double mutant. However, beta-lactamase activity determination in different cell fractions (crude extract, periplasm, and supernatant) of nfxB and nfxB-dacB mutants revealed a dramatically decreased periplasmic beta-lactamase activity in contrast with an increased activity in supernatant. Then we assessed whether this difference was beneficial in a beta-lactam treated biofilm, showing that in this scenario the nfxB mutant yield higher survival rates than their respective parent strains in both induced and constitutively overexpressed AmpC conditions. Therefore, our data show that hypersusceptibility to beta-lactams is due to a deficient AmpC accumulation in the periplasmic space, resulting in a leakage out of the cell. However a deeper analysis has allowed us to demonstrate how that leakage was protective in biofilm growth, where AmpC could be confined in the extracellular matrix. Finally, preliminary data suggest that the AmpC leakage observed in the nfxB mutant also occurs with other beta-lactamases, particularly in B and D classes. L’azitromicina ha mostrat resultats prometedors en el tractament de la infecció respiratòria crònica per Pseudomones aeruginosa. No presenta activitat bactericida davant aquest microorganisme en cultiu planctònic, però es sap que aquest macròlid la formació de biofilms gràcies a la seva capacitat per interferir en el sistema quòrum sensing bacterià. En el transcurs de les infeccions cròniques sovint es seleccionen mutants que presenten un grau d’adaptació al nínxol ecològic i als antibiòtics, tal com escau amb el mutant nfxB, gen regulador negatiu de la bomba d’expulsió activa MexCD-OprJ. Aquest fenotip freqüentment és aïllat en mostres respiratòries de pacients amb fibrosi quística, MPOC i bronquièctasis, i es caracteritza per presentar resistència als antibiòtics que poden actuar com a substrat i per presentar una marcada hipersensibilitat als antibiòtics betalactàmics no substrats de la bomba i aminoglucòsids. Un dels principals objectius d’aquest treball va esser esbrinar si durant l’exposició perllongada a azitromicina es seleccionen mutants nfxB tant en cultiu planctònic com en forma de biofilm. Es va avaluar l’impacte de la hiperproducció d’alginat i l’efecte de la hipermutació sobre l’efecte bactericida, sobre la dinàmica de desenvolupament de resistències a azitromicina. També va esser objecte d’estudi la caracterització del mutant nfxB, així com la relació entre la hiperexpresió de MexCD-OprJ (a través de la mutació al seu gen regulador nfxB), la activitat de la cefalosporinasa cromosòmica AmpC, i les bombes d’expulsió intrínseques MexAB-OprM i MexXY-OprM. Per a dur a terme aquests objectius es van construir mutants deficients en el gen mucA, mutS) i la combinació de ambdós. Seguidament s’avaluà el comportament del mutants en dins un biofilm tractat amb diferents concentracions de azitromicina, així com la dinàmica de desenvolupament de resistències durant varis dies. Es caracteritzaren els mutants resistents a azitromicina, es va determinar el seu perfil de sensibilitat, es quantificà l’expressió relativa de mexD i finalment es va seqüenciar el seu gen regulador nfxB revelant diverses mutacions inactivants. En resum, els resultats obtinguts ens han permès demostrar que durant el tractament de biofilms amb azitromicina existeix una selecció de mutants nfxB a les soques salvatges, les hiperproductores d’alginat i particularment a les soques hipermutadores. Seguidament es va construir el mutant nul nfxB i es va procedir a l’avaluació de les seves propietats biològiques, la seva sensibilitat al complement del sèrum humà i la tassa i freqüència de mutació en rifampicina. Finalment es va analitzar el seu transcriptoma, mostrant que aparentment no es sobreexpressen gens implicats en la residència antibiòtica, exceptuant aquells que pertanyen a l’operó mexCD-oprJ. Al perfil de proteïnes fixadores de penicil•lina no es trobaren diferencies entre el mutant nfxB i la soca de referència, però l’anàlisi de proteïnes de membrana externa va revelar una disminució de la expressió de OprM, responsable de la hipersensibilitat a aminoglucòsids i betalactàmics amb l’excepció de l’imipenem. De forma anàloga, la disminució de l’expressió de OprM no justificà la reversió del fenotip de resistència a betalactàmics en el mutant nfxB-dacB. No obstant, la determinació fraccionada (extracte cru, periplasma i sobrenedant) de l’activitat betalactamasa específica del mutant nfxB i del mutant doble nfxB-dacB mostrà un dràstic descens de l’activitat periplasmática com a conseqüència de la inactivació de nfxB, a costa d’un augment de l’activitat mesurada al sobrenedant. Així, les nostres dades revelen que la hipersensibilitat a betalactámics és deguda a la incapacitat per acumular AmpC a l’espai periplàsmic, produint-se una permeabilització cap al medi extracel•lular. No obstant una anàlisi d’aquest fenomen ens ha permès descriure com aquesta permreabilització resulta beneficiosa en el si d’un biofilm tractat amb betalactàmics, degut a que AmpC quedaria reclòs dins la seva matriu. Finalment, les dades preliminars suggereixen que la permeabilització que experimenta AmpC al mutant nfxB ocorre també amb altres betalactamases, particularment de les classes B i D.

No description available.

Der Komponist und Klangkünstler Alvin Lucier ist einer der Mitbegründer der Live Electronic Music-Szene der 60er Jahre in den USA. Vergangenes Jahr feierte er seinen 80. Geburtstag. Im Dezember 2009 widmete sich das SOLOLALA Festival, eine Veranstaltungsreihe des ausland Berlin unter der Leitung von Gregor Hotz, Alvin Luciers Solo-Stücken. Fünf seiner Stücke wurden hierfür von fünf Performerinnen neu interpretiert, darunter zwei seiner bekanntesten, "Music for Solo Performer" (1965) und "I Am Sitting in a Room" (1970). Der Beitrag führt Interviews und Statements der Beteiligten – Performerinnen, Techniker, Lichtdesignerin und Kurator – zusammen. In dieser Vielstimmigkeit wirft er den Blick auf das Solo als Teamarbeit, die Aufführungspraxis in Musik und Performancekunst und fragt nach der inspirierenden Essenz von Luciers langjährigem Schaffen.

Thesis (M.A. (Communication Studies))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2010.

Thesis (M.A. (Communication Studies))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2010.

This study aims to present and evaluate a new method for measuring the distribution of snow within built-up environments by differencing elevations collected by an Airborne Laser Scanner (ALS) before, and during peak snow accumulation. Few efforts have been made to study the distribution of snow within built-up environments due to the false assumption that high-intensity rainfall is the main contributor to peak yearly runoff rates. Traditional techniques for measuring snow are often difficult to replicate in built-up environments due to incompatibility of methods and barriers such as buildings, roads and private property. Light Detection and Ranging (LiDAR) technology, specifically ALSs, have previously been used to characterize the distribution of snow under forest canopy, and in remote mountain environments. This study investigates and assesses the utility of high resolution, non-intrusive ALS data for estimating the depth and distribution of snow within the town of Uxbridge, Ontario. ALS flights for this study were completed before the onset of snow accumulation, as well as near peak snow accumulation for the winters of 2010 and 2011. Pre and post snow accumulation ALS measured elevations were differenced to estimate the depth of the snowpack across the entire study area at a resolution of 0.5 m. Ground measurements of snow depth were also completed within 24 hours of each of the winter flights. The LiDAR-estimated and ground-measured snow depths were compared using Spearman's rank correlation coefficient as well as Mean Absolute Error (MAE) and Root Mean Squared Error (RMSE). Results from this thesis show that: 1) Snow depths estimated by differencing elevations from two ALS flights show a MAE of 3 cm and an RMSE of 10 cm when compared to ground-measured snow depths. (2) There is a strong, statistically significant relationship (ρ = 0:82, p < 0:001) between LiDAR-estimated and ground-measured snow depths. (3) An average bias of -3 cm was found for the entire dataset showing an underestimation in the LiDAR-estimated snow depths most likely caused by the effects of low lying vegetation on the fall ALS measurements. The results presented in this study demonstrate that ALSs are capable of providing high spatial resolution snow depth estimates within built-up environments. Furthermore, snow depth measurements made using an ALS can be used to increase the current body of knowledge on the distribution and re-distribution of snow within built-up environments. Snow distributions measured by an ALS could also be used for future development and verification of urban hydrological models.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans es una bacteria Gramnegativa anaerobia facultativa, de morfología bacilar o coco-bacilar, frecuentemente asociada a procesos patológicos de la cavidad bucal como la gingivitis, la periodontitis juvenil o la periodontitis progresiva aguda. El papel de su membrana externa en la resistencia a los antibióticos de uso común en odontología se conoce poco.En nuestro trabajo hemos procedido al aislamiento e identificación de una serie de cepas de A. actinomycetemcomitans procedentes de muestras clínicas de casos especialmente graves de periodontitis agresivas y menos agresivas, que hemos comparado con dos cepas referencia de laboratorio. Hemos comprobado como tanto los patrones de susceptibilidad antibiótica frente a antibióticos de uso común en odontología, como los perfiles de proteínas de membrana externa estudiados mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida (SDS-PAGE), no varían significativamente entre unas cepas y otras, no presentando la variabilidad esperada. Además, una de las proteínas de membrana externa presente en todas las cepas, la denominada según su peso molecular como Omp 39, cumple la mayoría de las condiciones que presentan las porinas, habiéndose puesto de manifiesto su actividad formadora de poro mediante experimentos en Planar Lipid Bilayer, en los que muestra una conductancia de 0.75nS en KCl 1M y un tamaño de poro de alrededor de 0.73nm.Además, se ha demostrado la presencia funcional de una bomba de reflujo tipo acrAB, inhibible por CCCP, habiéndose detectado por amplificación la presencia de los genes que la codifican.La presencia de una única pequeña porina en la pared celular de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, unido a la ausencia de otros mecanismos de resistencia comunes como la existencia de integrones con genes de resistencia, podría condicionar su demostrada resistencia a ciertos tipos de antibióticos.

Aquest treball s'integra en una de les línies d'investigació del grup de recerca "Quimiometria" del Departament de Química Analítica de la Universitat de Barcelona. Aquesta línia d'investigació es centra en el desenvolupament de mètodes quimiomètrics d'anàlisi multivariant de dades, i en la seva aplicació a l'estudi analític dels canvis de conformació i/o de les interaccions entre biomolècules.Actualment és possible enregistrar l'espectre sencer d'una mostra en poc temps. Aquest augment del nombre i de la complexitat de les dades adquirides ha portat a l'aparició de mètodes que tenen com a finalitat la obtenció d'informació d'interés físico-químic a partir d'aquests conjunt de dades. Amb aquesta finalitat es poden trobar dues aproximacions: a) els mètodes de modelatge rígid que exigeixen la postulació d'un model químic o cinètic al qual ajustar les dades experimentals, i b) els mètodes de modelatge flexible que no necessiten la postulació d'un model.El treball realitzat en aquests tesi doctoral es pot dividir en tres blocs.En primer lloc, s'ha desenvolupat una interfície gràfica en l'entorn de programació MATLAB pel mètode de resolució multivariant de corbes mitjançant mínims quadrats alternats (MCR-ALS). Aquesta interfície millora notablement la interacció entre l'usuari i el programa, i potencía la seva utilització generalitzada per part d'usuaris no acostumats a treballar amb eines pròpies de la Quimiometria.En segon lloc, s'ha dut a terme la validació de diversos mètodes d'anàlisi multivariant, és a dir, s'ha estudiat la fiabilitat de les solucions obtingudes per aquest tipus de mètodes quimiomètrics. Així, pel mètode MCR-ALS, s'ha analitzat la influència i la propagació de l'error experimental i les possibles repercusions sobre les ambigüetats matemàtiques existents en les solucions obtingudes. Aquest estudi s'ha realitzat tant en el cas de l'anàlisi individual de matrius de dades obtingudes en un únic experiment, com en el cas de l'anàlisi simultani de matrius de dades obtingudes en diversos experiments. En el cas dels mètodes de modelatge rígid s'ha estudiat l'ambigüetat existent al ajustar mecanismes cinètics complexos. En aquest cas s'ha observat l'aparició de mínims locals múltiples amb el mateix valor d'ajust en la superfície de desposta associada.Finalment, s'han aplicat els mètodes quimiomètrics de modelatge flexible i de modelatge rígid a l'estudi dels equilibris en solució dels àcids nucleics. Aquestes són biomolècules que tenen una organització jeràrquica començant en la seqüència de nucleòtids a les cadenes fins a estructures complexes d'ordre superior com els tríplexs o quadruplexs. Els canvis conformacionals o les interaccions amb d'altres biomolècules s'han estudiat tradicionalment mitjançant experiments seguits amb tècniques espectroscòpies. En aquest treball es seguiran aquests processos mitjançant lectures a moltes longituts d'ona (aproximació multivariant) i s'aplicaran mètodes quimiomètrics adients de tractaments de dades multivariants. Els procesos estudiants en aquesta Tesi són bàsicament els canvis conformacionals provocats en variar condicions del medi, com el pH, la temperatura, la concentració d'altres ions... S'han emprat tècniques espectroscòpiques com l'absorció molecular a l'UV-visible, la fluorescència, el dicroisme circular i la ressonància magnètica nuclear. Una altra aplicació, ha estat l'anàlisi de micromatrius d'ADN. L'aparició d'aquesta la tecnologia ha permès obtenir informació sobre els nivells de l'expressió gènica per un gran nombre de gens en un únic experiment. La generació de grans quantitats de dades requereix la utilització d'eines mitjançant les quals es pugui extreure la informació biològica. En aquest treball s'ha aplicat el mètode MCR-ALS a l'anàlisis de diversos conjunts de dades per tal de poder determinar la relació entre les mostres que presenten diferents tipus de càncer i els gens estudiats. / OF THE PHD THESIS: This PhD Thesis has been developed in the framework of the Chemometrics group at the Universitat de Barcelona. The work deals with the development and validation of Multivariate Curve Resolution (MCR) methods (both hard- and soft-modelling), and with their application to bioanalytical problems. The work has been organized into three blocks:First, a graphical interface has been developed for the program running the MCR-ALS (Multivariate Curve resolution Alternating Least Squares) method in the MATLAB® environment. This interface improves the interaction between the user and the program and facilitates the use of multivariate curve resolution to little experineced potential users.Secondly, validation of multivariate resolution methods of data analysis has been carried out. For the MCR-ALS method, effects of rotational ambiguities and of propagation of experimental noise have been studied. These studies have been performed in the analysis of a single experiment and in the case of analyzing multiple experiments simultaneously. In the case of hard-modelling kinetic data fitting methods, ambiguities in the analysis of kinetic experiments have been studied and methods to overcome this ambiguity have been proposed.Third, multivariate resolution methods have been applied to the study of conformational equilibria of nucleic acids. These are biomolecules that have a hierarchic organization from the nucleotide sequence to higher order structures such as triplex or quadruplex. Traditionally, conformational changes or interactions of nucleic acids with other biomolecules have been spectroscopically monitored at just one wavelength. In this work, these processes have been followed at multiple wavelengths and suitable multivariate resolution methods for the data treatment have been applied. Processes studied during this Thesis have been DNA conformational changes induced by pH, temperature or salinity. Spectroscopic techniques such as molecular absorption in the UV-visible, circular dichroism or nuclear magnetic resonance have been used for this purpose. Finally, data obtained using DNA microarrays have been analyzed. This technique allows highthroughput analysis of relative gene expressions of thousands of genes of an organism that generates large amounts of data. This has caused a need for statistical methods that can extract useful information for further research. In this PhD Thesis, the MCR-ALS method has been proposed for the analysis of this kind of data with very promising results.