As consequências de eventos estressantes sobre a saúde humana, principalmente relacionada à condição psiquiátrica, tem ganhado notoriedade nos últimos anos em decorrência do crescente número de comorbidades associadas ao estresse registradas nas grandes cidades. Transtornos emocionais relacionados a sintomas de ansiedade são comuns dentre os relatados na clínica psiquiátrica e ganham importância em trabalhos científicos devotados ao estresse, que lançam mão de abordagens diversas para compreender os mecanismos neurobiológicos subjacentes à a persistência de sintomas ansiosos decorrentes de um evento estressante. Trabalhos prévios mostraram que tanto o estresse agudo de contenção quanto a administração sistêmica de corticosterona (CORT, hormônio glicocorticoide murino) promovem, 10 dias depois, comportamento do tipo ansioso e remodelamento dendrítico no complexo basolateral da amígdala (BLA) em ratos. Além disso, alguns trabalhos recentes mostraram que a exposição ao enriquecimento ambiental (EA) reverteu o efeito ansiogênico e sobre a modulação dendrítica do BLA induzidos por estresse repetido. Em trabalho recente, nós verificamos que o EA preveniu o efeito ansiogênico imediato do estresse agudo de contenção. Esse efeito protetor do EA pareceu estar relacionado a seu efeito preventivo no aumento da atividade neuronal e do receptor de glicocorticoide (GR) no BLA. No presente trabalho, nós verificamos que o EA preveniu tanto o surgimento do comportamento do tipo ansioso quanto o déficit de extinção da memória de medo induzidos por estresse agudo de contenção verificados 10 dias depois. Porém, não está claro se esses efeitos estão relacionados com alterações na árvore dendrítica do BLA e/ou com a atividade de GR no mesmo núcleo. Dessa forma, um dos objetivos centrais do trabalho foi determinar se o efeito preventivo do EA na persistência das alterações comportamentais, e nas alterações morfológicos no BLA, induzidas por estresse agudo, são atribuidas às ações de CORT. Nós observamos que o efeito preventivo do EA na ansiedade e no déficit de extinção, verificados 10 dias após o estresse, não estão relacionados à prevenção no aumento da densidade de espinhos dendríticos do BLA. Além disso, ainibição da síntese de CORT por metirapona preveniu a emergência do comportamento do tipo ansioso 10 dias após o estresse, indicando que a sinalização desse hormônio é crucial para os efeitos comportamentais tardios relacionados ao estresse agudo. Finalmente, lançando mão do uso da tecnologia do DNA recombinante, nós verificamos que a inibição da atividade genômicoa de GR no BLA preveniu o comportamento do tipo ansioso manifestado 10 dias após o estresse. / The consequences of stressful events on human health, especially related to psychiatric disorders, have gained attention in recent years due the increasing number of comorbidities associated to stress in large cities. Anxiety-related disorders are common among the psychiatric patients and are widely present in studies devoted to stress, which use different approaches to investigate the neurobiological mechanisms underlying the persistence of anxiety symptoms caused by a stressful event. Either acute restraint stress or systemic injection of corticosterone (CORT, a rodent glucocorticoid) in rats leads to enhanced anxiety-like behavior and dendritic branch remodeling in the basolateral amygdala complex (BLA) 10 days later. Also, some studies showed that exposure to environmental enrichment (EE) reverted the long- lasting anxiety-like behavior and the repeated stress-induced BLA dendritic hypertrophy in rats. In a recent study, we found that EE prevented anxiety-related behavior in adult rats observed immediately after acute restraint stress. This protective role of EE appears to be due to the prevention of the stress-induced increase in neuronal activity and in glucocorticoid receptor (GR) nuclear activity in the BLA. In this study, we showed that EE prevented the restraint stress-induced long-lasting anxiety and contextual fear extinction impairment in adult rats. However, it is not yet clear if this protective role of EE is related to changes in the dendritic branch and/or in the GR signaling in the BLA. The present study sought to determine whether the preventive effect of EE on persistent stress-related changes in behavior as well as in the BLA morphology and activity are attributed to CORT signaling. We found that the EE- induced protection on anxiety-like behavior and fear extinction impairment 10 days after acute restraint stress was not related to prevention of the increase in spine density in BLA. Moreover, systemic injection of GC synthesis inhibitor (metyrapone) prevented the anxiety-like behavior 10 days after stress, showing that GC signaling during stress is crucial to late stress-related behavior. Finally, by antagonizing the genomic signaling of the endogenous GR in the BLA, through the use of recombinant DNA technology, we prevented the emergence of anxiety-related behavior 10 days after acute stress.

INTRODUÇÃO: Epilepsia do lobo temporal (ELTM) é a forma mais comum de epilepsia parcial, ocorrendo em cerca de 40% dos pacientes. Na ELTM as crises epilépticas podem ter origem na região cortical, o que é menos comum, porém ocorrem frequentemente em estruturas mesiais do lobo temporal, representadas basicamente pelo hipocampo e/ou amígdala. Com intuito de incluir novas possibilidades de tratamento e diagnóstico, torna-se necessário uma maior compreensão das bases moleculares da ELMT. Dentro desta perspectiva, um dos grandes desafios para a Neurociências na atualidade é o desenvolvimento de biomarcadores que facilitem o diagnóstico e prognóstico para a epilepsia. Recentemente, com o desenvolvimento de algumas pesquisas e novas técnicas no campo da biologia molecular demonstram que microRNAs circulantes no sangue são biomarcadores sensíveis e específicos para várias doenças, incluindo doenças neurológicas, podendo ser obtido de forma não invasiva, representando assim um método de eficiente detecção e custo baixo. OBJETIVOS: Analisar o perfil de expressão dos microRNAs miR-629-3p, miR-1202, miR1225-5p na amígdala, hipocampo e sangue de pacientes submetidos a cirurgia para tratamento da epilepsia do lobo temporal mesial refratários ao tratamento medicamentoso e investigar se os mesmos podem auxiliar como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico para a epilepsia. PACIENTES E MÉTODOS: Foram utilizadas amostras de amígdalas, hipocampos e sangue de 20 pacientes com ELTM, sendo 10 com boa evolução pós-operatória (Engel I) e 10 com evolução pós-operatória insatisfatória (Engel III e IV), e para controle foram utilizados 10 amostras de amígdalas e 10 de hipocampos de necrópsias, assim como 10 amostras de sangue de indivíduos saudáveis. A análise de expressão dos miRNAs foi feita utilizando a técnica de RQPCR. RESULTADOS e CONCLUSÕES: Os miRNAs miR-629-3p, miR-1202 e miR- 1225-5p apresentaram-se hiperexpressos no sangue de pacientes com ELTM, podendo sugerir um possível papel de biomarcadores auxiliando no diagnóstico da ELTM. Os miRNAs-629-3p, 1202 e 1225-5p apresentaram aumento nos níveis de expressão sanguíneos progressivos entre os grupos controle, Engel I e Engel III e IV respectivamente, apresentando também possível potencial de biomarcadores no prognóstico cirúrgico entre Engel I e Engel III e IV. / INTRODUCTION: Epilepsy of the temporal lobe is the most common form of partial epilepsy, occurring in about 40% of patients. In TLE epileptic seizures may originate in the cortical region, which is less common. However they occur more frequently in temporal lobe mesial structures, represented primarily by the hippocampus and / or amygdala. A greater understanding of the epilepsy molecular basis is necessary when aiming to implement new treatments possibilities. Within this field of study, one of the major challenges for neuroscience today is the development of biomarkers that facilitate the diagnosis and prognosis for epilepsy. Recently, with the development of some researches and new techniques in the field of molecular biology, it demonstrate that microRNAs circulating in the blood are sensitive and specific biomarkers for various diseases, including neurological diseases and they can be obtained noninvasively, thus representing a low cost method of efficient detection. OBJECTIVES: To analyze the expression profile of miR-629-3p, miR-1202, miR1225-5p microRNAs in the amygdala, hippocampus and blood of patients operated to treat the mesial temporal lobe epilepsy refractory to drug treatment and investigate whether they can be used as biomarkers for epilepsy diagnosis and prognosis. PATIENTS AND METHODS: Amygdala, hippocampus and blood samples of 20 patients with MTLE were used; 10 with good postoperative outcome (Engel I) and 10 with poor postoperative outcome (Engel III and IV), and for the control group 10 amygdalas and 10 hippocampus of necropsy, as well as, 10 samples blood from healthy individuals. The analysisof the expression of miRNAs was performed using RQ-PCR. RESULTS AND CONCLUSION: MiRNAs miR-629-3P, miR-1202 and miR- 1225-5P were hyper-expressed in the blood of patients with MTLE, and may suggest a possible role of biomarkers in the diagnosis of MTLE. miR-629-3p, miR-1202 and miR-1225-5p were progressively expressed in the blood of patients in the control, Engel I and Engel III and IV groups respectively, representing also potential biomarkers for surgical prognosis between Engel I and Engel III and IV.

O núcleo basolateral anterior da amígdala (BLAa) tem sido extensivamente investigado em estudos de condicionamento pavloviano envolvendo estímulos aversivos físicos. Até o presente momento não há descrição funcional específica do BLAa frente aos estímulos etologicamente relevantes. Neste trabalho, inicialmente revisitamos as conexões aferentes e eferentes do BLAa. Nossos achados confirmam em grande medida relatos anteriores da literatura e mostram que o núcleo integra informações de sistemas relacionados ao alerta emocional (tais como o locus coeruleus, dorsal da rafe e substância inominada). Este também se relaciona intimamente a estruturas ligadas à circuitaria do córtex pré-frontal, como o núcleo acúmbens, o caudo-putamen dorsomedial além dos córtices pré-límbico e cingulado anterior. Além disso estabelece conexões bidirecionais importantes com o córtex insular e com a região para-hipocampal. Testamos ainda o papel específico do BLAa frente à ameaça predatória e vimos que este influencia respostas de medo inato e contextual à ameaça predatória. Primeiramente, sugerimos que o BLAa responde ao estímulo do predador pelos sistemas de controle de alerta emocional, dado que ele recebe aferências de estruturas responsivas à presença do predador, como o locus coeruleus, que estão ligadas ao controle do alerta. Sugerimos também que através de suas projeções para o núcleo acúmbens, a região estudada, possa influenciar as respostas de defesa inata. Ademais as respostas de medo aprendido, ao contexto em que o rato foi exposto ao predador, podem ser afetadas por meio das relações do BLAa com os córtices pré-limbico, cingulado anterior e com a região para-hipocampal. / The anterior basolateral nucleus of the amygdala (BLAa) has been extensively investigated in studies of Pavlovian conditioning involving physical aversive stimuli. To date, there is no specific functional study of the BLAa regarding its functional roles on responses to ethologically relevant threats. In this work, we initially revisited the afferent and efferent connections of the BLAa. Our findings largely confirm previous reports in the literature, and show that the nucleus integrates information from systems related to emotional alertness (such as the locus coeruleus, dorsal raphe and innominate substance), and is also closely related to the prefrontal cortex circuitry, including the nucleus accumbens, the dorsomedial caudoputamen, and the prelimbic and anterior cingulate cortices. It also establishes important bi-directional connections with the insular cortex and parahippocampal region. We also tested the specific role of BLAa in innate and contextual responses to predatory threat. Thus, we have seen that BLAa influences innate and contextual fear responses to predatory menace. Firstly, we suggest that the BLAa responds to the predator\'s stimulus by the emotional arousal systems, given that it receives inputs from alert related structures highly responsive to the predator threat, such as the locus coeruleus. We also suggest that through its projections to the nucleus accumbens, the BLAa may influence innate defensive responses. In addition, we suggested that the BLAa influences contextual fear responses mostly through its relationships with the prelimbic, anterior cingulate and parahippocampal cortices.

A amígdala participa dos processos de aprendizagem e memória de natureza emocional, incluindo os comportamentos aversivos. Essa estrutura compreende vários núcleos que estabelecem diferentes conexões com outras estruturas do sistema nervoso. Seu núcleo basal (BA) é um dos principais alvos amigdalares de informações processadas pelo hipocampo. Evidências apontam que o hipocampo seria responsável pela aprendizagem contextual, construindo uma representação integrada dos diferentes estímulos do ambiente numa representação única, denominada representação configuracional do contexto, que inclui também representações do espaço. Congruente com essa hodologia, lesões seletivas do BA resultam em prejuízos comportamentais similares aos encontrados após lesão hipocampal. Por exemplo, ratos com lesão no BA exibem deficiências na tarefa de medo condicionado ao contexto, mas não ao som, indicando que essa região está envolvida no processo de condicionamento aversivo contextual. Porém, não está claro se esse prejuízo decorre da participação do BA na aquisição e/ou evocação e expressão do medo contextual. Os objetivos do presente estudo incluíram avaliar, por meio da inativação reversível do BA, (1) se ele é necessário na aquisição do condicionamento aversivo ao som e/ou ao contexto e (2) qual a natureza da sua participação no condicionamento aversivo ao contexto, isto é, se é necessário para a construção do contexto, para sua associação com o estímulo aversivo e/ou para a evocação da memória e expressão das respostas condicionadas. Num primeiro experimento, muscimol foi infundido no BA antes do treinamento na tarefa de condicionamento aversivo concorrente ao som e ao contexto, e os testes de medo condicionado ao som e ao contexto foram realizados separadamente, na ausência de muscimol. Como esperado, os resultados revelaram prejuízo de desempenho na tarefa de medo condicionado ao contexto, mas não na tarefa de medo condicionado ao som. Num segundo experimento, muscimol foi infundido, em grupos independentes de animais, antes de cada fase da variante do condicionamento aversivo ao contexto que envolve facilitação pela pré-exposição ao contexto, a qual permite distinguir entre a construção configuracional do contexto (fase 1), sua associação com o estímulo aversivo (fase 2) e posterior evocação e expressão do medo condicionado (fase 3). Resultados mostraram que somente os ratos que receberam muscimol antes da fase 2, mas não os que receberam muscimol antes das fases 1 e 3, apresentaram prejuízo de desempenho na tarefa de medo condicionado ao contexto. No conjunto, esses resultados indicam que o BA participa do condicionamento aversivo ao contexto sendo imprescindível no processo de associação da representação configuracional do contexto com o estímulo aversivo, mas não nos processos de construção da representação sobre o contexto e nem de evocação da memória e expressão das respostas condicionadas de medo / The amygdala is involved in emotional learning and memory, including fear conditioning. This brain structure includes several nuclei with distinct hodology. The basal nucleus (BA) receives processed information from the hippocampal formation. Evidence indicates that the hippocampus integrates environmental stimuli in a single representation thus rendering it involved in contextual (including spatial) learning and memory. Congruent with this hodological evidence, selective damage to the BA results in behavioral impairments similar to those found after hippocampal damage. For instance, rats with BA damage exhibit performance impairments in contextual, but not auditory, fear conditioning tasks. However, it is not clear to which extent this disruption is related to the BA involvement in either acquisition of contextual fear or retrieval of memory and fear expression, or both. This study aimed at investigating, by way of reversible inactivation of the BA, (1) its involvement in acquisition of auditory and contextual fear conditioning, and (2) the nature of its participation in contextual fear conditioning, that is, if it is necessary for building a representation about the context, for associating the context with the aversive stimulus and/or for memory retrieval and expression of contextual fear conditioning. In the first experiment, muscimol was infused into the BA before training in a concurrent auditory and contextual fear conditioning task, and testing for auditory and contextual fear conditioning was run separately in the absence of muscimol. As expected, results revealed disruption of performance in the contextual, but not in the auditory, conditioning task. In the second experiment, muscimol was infused into the BA, in independent groups of animals, before each of the three phases of a contextual fear conditioning variant that involves context pre-exposure facilitation, thus allowing to evaluate if functional reversible inactivation of the BA interfered with (1) building an integrated representation of the environment (the context), (2) its association with the aversive stimulus, and/or (3) memory retrieval and expression of fear conditioning. Results showed that muscimol infusion into BA before phase 2, but not phases 1 and 3, impaired performance in the contextual fear conditioning task. Together, these results indicate that a functional BA is required for acquisition of contextual fear conditioning in order to establish an association between the context and the aversive stimulus, but not for building a context neither for memory retrieval and expression of fear conditioned responses

Ocitocina (OT) é um nonapeptídeo neurosecretório sintetizado nas células hipotalâmicas que se projetam para a neurohipófise e para locais extensamente distribuídos no sistema nervoso central. As microinjeções centrais de OT induzem uma variedade de comportamentos em animais no âmbito cognitivo, sexual, reprodutivo, de autolimpeza e afiliativo. O transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) inclui uma escala dos sintomas cognitivos e comportamentais que tem alguma relação com dimensões de comportamento associadas com a OT. A administração de OT no núcleo central da amígdala (CeA) induz autolimpeza exacerbada, considerada um sintoma de TOC. Neste trabalho, nós estudamos os substratos neuroanatômicos e celulares deste comportamento. Nossos dados sugerem uma ligação entre o CeA e a “área hipotalâmica de grooming" (HGA). A HGA inclui parte do núcleo paraventricular do hipotálamo e a área hipotalâmica dorsal. Nossos dados mostrando co-localização de OT (imunohistoquímica para peptídeo), receptor para OT (ensaio de binding) e marcação de células retrogradamente depois da injeção de Fluoro-Gold no CeA sugerem que o CeA e conexões são substratos importantes nos circuitos subjacentes de comportamento normal e de quadro patológico tal como o TOC dependente de OT descrito neste trabalho. / Oxytocin (OT) is a neurosecretory nonapeptide synthesized in hypothalamic cells that project to the neurohypophysis as well as to widely distributed sites in the central nervous system. Central OT microinjections induce a variety of cognitive, sexual, reproductive, grooming and affiliative behaviors in animals. Obsessive-compulsive disorder (OCD) includes a range of cognitive and behavioral symptoms that bear some relationship to dimensions of behavior associated with OT. The administration of OT into central nucleus of amygdala (CeA) induces hypergrooming, considered a symptom of OCD. Here, we study the neuroanatomical and cellular substrates of this behavior. Our data suggest a link between the CeA and the “hypothalamic grooming area" (HGA). The HGA includes parts of the paraventricular hypothalamic nucleus and the dorsal hypothalamic area. Our data on co-localization of OT (immunohistochemistry for peptide), OT receptor (binding assay) and retrogradely labeled cells after Fluoro Gold injection in CeA suggest that CeA and connections are an important substrate of the circuit underlying this OCD-like OT-dependent behavior.

Rinovírus (RV) é freqüentemente detectado nos tecidos tonsilares e nas secreções de nasofaringe de pacientes com doença adenotonsilar crônica, sem sintomas de infecção respiratória aguda (IRA). O objetivo deste estudo foi investigar a infecção por rinovírus em tonsilas humanas, com base em dois aspectos: infecção in vivo de células linfóides de tonsilas humanas naturalmente infectadas; e infecção ex vivo de células dissociadas desses tecidos inoculadas com rinovírus, visando a contribuir para elucidar possíveis mecanismos de infecção em amígdalas palatinas e adenóides humanas. De um total de 104 pacientes com doenças adenotonsilar crônicas, 21.1% (22/104) e 42.3% (44/104) apresentaram respectivamente amígdalas palatinas e adenóides positivas para RV por PCR. A replicação viral foi confirmada por hibridização in situ com sonda para intermediário replicativo nas regiões internas e externas aos folículos linfóides de amígdalas e adenóides, bem como em porções do epitélio ciliado de adenoides, e apenas raramente nas células epiteliais escamosas de tonsilas palatinas. A presença e distribuição de proteína estrutural do capsídeo viral foi detectada por imunohistoquímica (IHQ), utilizando anticorpos contra proteínas estruturais virais VP1 e VP2 nas tonsilas positivas para RV por qPCR. Os resultados indicaram marcação positiva tanto na superfície (epitélio), quanto em regiões extrafoliculares e centros germinativos. Em seguida, foi possível verificar a co-localização da marcação positiva da proteína estrutural VP2 de RV com marcadores linfocitários de membrana. Células CD4 + e CD20 + apresentaram marcação positiva para VP2 verificada usando estratégia de \'sequential immuno-peroxidase labelling and erasing\' (SIMPLE). Culturas primárias de células linfomononucleares (CLMN) de tonsilas sabidamente negativas para RV por PCR, foram infectadas in vitro, com RV (MOI=1). A replicação de RV foi titulada por TCID50, mostrando aumento inicial (24 h) e subsequente queda após 48 horas. Por IF observamos que os fenótipos de CLMN infectadas com RV in vitro foram células T CD4 + e B, mas também com células CD8 +, CD56 + e CD33 +. RV não infectou células CD123 +. RV foi isolado em WI- 38 e HeLa a partir de tecidos e secreções de nasofaringe de pacientes com hipertrofia tonsilar sem sintomas de infecção respiratória aguda. Nossos resultados confirmam que tonsilas de pacientes sem sintomas respiratórios agudos podem ser reservatórios de RV, que infecta não somente epitélio, mas também CLMN (frequentemente linfócitos T CD4 + e linfócitos B). A detecção de RNA intermediário replicativo e proteínas estruturais VP1 e VP2 nas tonsilas hipertróficas, além do isolamento de vírus infeccioso a partir de tecidos e secreções nasofaríngeas, classificam tonsilas hipertróficas como sítios de infecção e replicação de RV, e sugerem que esses indivíduos hipertróficos são portadores assintomáticos de RV persistente, e podem ser importantes fontes de transmissão de RV na comunidade. / The chronic adenotonsillar diseases are frequent otorhinolaryngologic conditions caused by chronic inflammation of adenoids and palatine tonsils. Rhinovirus (RV) is highly frequently detected in secretions, and tonsillar tissues from patients experience chronic tonsillar hypertrophy without symptoms of ARI, and our goal is to full understanding of viral infections in hypertrophic tonsillar tissues by RV. Of 104 enrolled patients with adenotonsillar chronic diseases, 21.1% (22/104) and 42.3% (44/104) had palatine tonsils and adenoids positive for RV by qPCR, respectively. RV Viral replication was confirmed by in situ hybridizations. Minus-strand RNA were detected in all tested samples (7 tonsils and 9 adenoids), and positive reactions were seen inside and outside of lymphoid follicles from tonsils and adenoids, in the ciliated epithelium of the adenoids and rarely in positive squamous epithelium cells from tonsils. The presence of viral structural protein VP1 and VP2 was detected within and outside of the lymphoid follicles from tonsils and adenoids, and also in epithelial cells from adenoids by immunohistochemistry (IHC). Later, by sequential immuno-peroxidase labelling and erasing protocol (SIMPLE), we saw co-localization of RV VP2 capsid protein staining with CD4 positive cells and CD20 positive cells. We confirmed that RV could infect primary culture of tonsilar mononuclear cells (TMNCs). Additionally, intracellular replication of RV in TMNCs, measured by TCID50 in HeLa cells, had an initial increase in the first 24 hours, and dropped at 48 hours post infection. Immunolocalization staining with anti-RV and TMNCs surface markers indicated that phenotypes of susceptible cells were T-cells both CD4+ and CD20+, but also, we saw co-localization of VP-2 protein with CD8+ cells, CD56+ cells and CD33+ cells. RV-16 couldn\'t infect CD123+ cell in our experiments. Finally, we were able to recover 4 rhinoviruses by inoculating WI-38 fibroblast cells and HeLa cells, confirming by the cytopathic effect and immunofluorescence positive staining with anti-VP1 antibody. Taken together, our results indicate that tonsils and adenoids of patients without ARI may be reservoirs of replicating human rhinovirus, infecting manly Tcells CD4+ and CD20+ B-cells. The high-frequency detection of RNA (-) and VP1 expression in tissues from patients with chronic adenotonsillar diseases, plus the isolation of infectious viral particles, suggests that these detected agents replicate in the adenotonsillar tissues and this specific sites may be important sources of transmission of RV in the community.

A morte súbita inexplicável na epilepsia (SUDEP) ainda está sujeita a várias controvérsias na literatura. No entanto, uma das possíveis causas de óbito são as apnéias observadas durante o sono, promovendo aumento dos níveis de CO2 (hipercapnia) e/ou diminuição dos níveis de O2 (hipoxemia). Tem sido especulado que essas alterações podem estar associadas às disfunções na atividade dos neurônios quimiossensíveis localizados no tronco encefálico. Além disso, é possível que os distúrbios respiratórios poderiam envolver alterações na neurotransmissão serotoninérgica. Os neurônios quimiossensíveis, localizados no núcleo retrotrapezoide (RTN), constituem um dos principais grupamentos responsáveis por controlar a atividade respiratória. O RTN recebe uma densa inervação serotoninérgica dos vários subnúcleos da rafe. Diante das várias lacunas na literatura, sobre as alterações respiratórias como possíveis causadoras de morte inexplicável na epilepsia, o presente estudo procurou entender quais eram as possíveis alterações respiratórias e neuroanatômicas no tronco encefálico observadas em dois modelos experimentais de epilepsia: ratos Wistar audiogênicos (cepa WAR) e animais submetidos à estimulação da amígdala (kindling rápido da amígdala - ARK). Os animais WAR apresentaram uma redução da ventilação (VE) basal (332 ± 105, vs. Wistar: 505 ± 36 ml/kg/min) e uma redução da resposta ventilatória a hipercapnia (7% CO2) (813 ± 341, vs. Wistar: 1661 ± 177 ml/kg/min). No modelo ARK, observamos apenas que a resposta de taquipnéia ao aumento do CO2 foi reduzida (126 ± 6 vs controle: 143 ± 6 rpm) comparado com o grupo controle. Em outro protocolo experimental, os animais WAR foram submetidos à exposição em hipercapnia durante um período de 3 horas para a expressão da proteína fos. Nesses animais, observamos uma redução no número de neurônios imunorreativos para fos na região do RTN e na região da rafe pálido e obscurus. Por outro lado, observamos um aumento do número de neurônios imunorreativos para fos na região do locus coeruleus. Os animais WAR também apresentaram uma redução significante do número de varicosidades serotoninérgicas na superfície ventral da região do RTN, quando comparados com os ratos Wistar. Essa redução foi devida a uma redução no número de neurônios imunorreativos para serotonina na rafe pallidus e obscurus. Por fim, observamos também que aumento da VE produzida pela injeção unilateral de serotonina no RTN foi menor nos animais WAR quando comparado aos animais Wistar. No modelo de epilepsia de ARK quando submetidos à hipercapnia de 3 horas, observamos também uma redução no número de neurônios imunorreativos a expressão de fos na região do RTN e na região do núcleo do trato solitário. Da mesma maneira aos animais WAR, observamos um aumento do número de neurônios imunorreativos para fos na região do locus coeruleus. Considerando estes resultados, sugere-se que nos modelos experimentais de epilepsia utilizados no presente estudo, observamos uma redução da atividade respiratória basal e na resposta ventilatória à hipercapnia, bem como uma alteração neuroanatômica no tronco encefálico. Assim, gostaríamos de sugerir que ambos os modelos experimentais de epilepsia, utilizados no presente estudo, podem ser considerados modelos experimentais de epilepsia com o objetivo de se estudar distúrbios respiratórios e possivelmente correlacionar com mortes súbitas e inexplicáveis na epilepsia. / Unexplained sudden death in epilepsy (SUDEP) is still subject to several controversies in the literature. However, one of the possible causes of death are the apneas observed during sleep, promoting an increase in CO2 levels (hypercapnia) and/or a decrease in O2 levels (hypoxemia). It has been speculated that these changes may be associated with dysfunctions in chemosensitive neurons. In addition, it is possible that respiratory disorders may involve changes in serotonergic neurotransmission. The chemosensitive neurons located in the retrotrapezoid nucleus (RTN) are one of the main groups responsible for controlling respiratory activity. The RTN receives a dense serotonergic innervation of the various subnuclei of rafe. The present study sought to understand the possible respiratory alterations observed in two models of epilepsy: audiogenic Wistar rats (WAR strain) and rapid amygdala kindling (ARK). WAR animals showed a reduction in baseline ventilation (332 ± 105, vs. Wistar: 505 ± 36 ml/kg/min) and a reduction in hypercapnic (7% CO2) ventilatory response (813 ± 341, vs. Wistar: 1661 ± 177 ml/kg/min). In the ARK model, we only observed that the tachypnea response to CO2 was reduced (126 ± 6 vs control: 143 ± 6 rpm). In a different experimental protocol, WAR animals were exposed to hypercapnia for a period of 3 hours in order to have the fos protein expression. In these animals, we observed a reduction in the number of fos-immunoreactive neurons in the RTN region and in the raphe pallidus and obscurus. On the other hand, we observed an increase in the number of fos-immunoreactive neurons of the locus coeruleus. WAR animals also showed a significant reduction in the number of serotonergic varicosities of the ventral medullary surface. This reduction was due to a reduction in the number of serotonin-immunoreactive neurons in raphe pallidus and obscurus. Finally, we also observed that the increase in VE produced by the unilateral injection of serotonin in the RTN was lower in the WAR animals when compared to the Wistar rats. In the ARK epilepsy model submitted to 3 hour of hypercapnia, we also observed a reduction in the number of fos-immunoreactive neurons in the RTN region and in the region of the nucleus of the solitary tract. In the same way as WAR animals, we observed an increase in the number of fos-immunoreactive neurons in the locus coeruleus region. Considering these results, it is suggested that in the experimental models of epilepsy used in the present study, we observed a reduction of basal respiratory activity and hypercapnic ventilatory response, as well as a neuroanatomic changes in the brainstem. Thus, we would like to suggest that both experimental models of epilepsy used in the present study can be considered good experimental models of epilepsy in order to study respiratory disorders and possibly correlate with sudden and unexplained deaths in epilepsy.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-10-23T17:18:48Z No. of bitstreams: 1 Daniela Almeida Participaçao dos receptores....pdf: 1297031 bytes, checksum: 754812103a71d951c868e902bd43f90c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-23T17:18:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daniela Almeida Participaçao dos receptores....pdf: 1297031 bytes, checksum: 754812103a71d951c868e902bd43f90c (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Situações de estresse repetido ou prolongado podem resultar em vários estados patológicos, como hipertensão arterial, arritmias cardíacas, infarto do miocárdio e até mesmo morte súbita. Embora se tenha muita informação sobre o controle cerebral da pressão arterial, as respostas cardiovasculares ao estresse não são totalmente compreendidas. Dados da literatura mostram a importância do núcleo medial da amigdala (MeA) e da neurotrasmissão histaminérgica no controle autonômico das funções cardiovasculares, no entanto, não há estudos evidanciando o papel das vias histaminérgicas no MeA nas adaptações cardiovasculares evocada pelo estresse emocional. Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi estudar a participação dos receptores H1 e H2 no MeA sobre as respostas cardiovasculares em ratos estressados e não-estressados. Ratos Wistar (280-320g) foram submetidos à cirurgia estereotáxica para canulação bilateral do MeA. Passado cinco dias da estereotaxia, os animais foram submetidos a cateterização da artéria carótida esquerda. Vinte e quatro horas após a inserção do cateter, foram iniciados os experimentos com a gravação do registro da pressão arterial pulsátil (PAP) dos animais em condições basais e em livre movimento em suas respectivas caixas de forma continuada. As drogas utilizadas para a microinjeção central foram a mepiramina (antagonista dos receptores H1) nos grupos experimentais I e III e a cimetidina (antagonista dos receptores H2) nos grupos experimentais II e IV. Nos grupos experimentais I e II, 15 min após microinjeção central bilateral de mepiramina ou cimetidina respectivamente, em diferentes doses, os animais foram submetidos a estresse de restrição de movimentos em tubos de polietileno, e a PAP foi registrada continuamente durante 45 min. Após o período de estresse, os animais foram realocados em suas caixas e a PAP foi registrada por mais 30 min. Nos grupos experimentais III e IV, após as microinjeções centrais bilaterais no MeA, a PAP continuou sendo registrada por 75 min em animais sob condições basais e em livre movimento (não estressados). Os animais controles de todos os grupos experimentais receberam microinjeções de salina 0,9%. Os experimentos foram realizados entre 7h00min às 13h00min e os animais não tiveram acesso à água ou ração durante o experimento. Os dados estão expressos como média±E.P.M das variações da PAM e FC. Microinjeções de mepiramina nas doses de 50, 100 e 200 nmol promoveu bloqueio dose-dependente da resposta hipertensiva evocada pelo estresse de restrição. A cimetidina (100 e 200 nmol) atenuou a resposta hipertensiva ao estresse apenas na maior dose utilizada. A resposta anti-hipertensiva ao estresse foi maior nos animais que receberam microinjeções de mepiramina do que de cimetidina nas mesmas doses. Nenhuma das drogas alterou a resposta taquicárdica típica do estresse. Mepiramina ou cimetidina foram incapazes de alterar a PAM ou a FC de animais não estressados. Os dados sugerem que as vias histaminérgicas presentes no MeA medeiam a resposta pressora sem alterar a taquicardia evocadas pelo estresse de restrição, ativando preferencialmente os receptores do tipo H1. Além disto, os dados confirmam a hipótese de que a via histaminérgica no MeA não exerce modulação tônica do sistema cardiovascular. A obtenção de dados adicionais relativos ao papel fisiológico dos receptores histaminérgicos centrais no controle das funções cardiovasculares se reveste de grande importância para as ciências biológicas e para a clínica médica, principalmente quando vinculada à variável estresse. Os resultados deste trabalho contribuem para o esclarecimento da participação destes receptores no controle das funções cardiovasculares. / Repeated long lasting experiences of stress situations may result in various pathologic states such as arterial hypertension, cardiac dysrhythmias, myocardial stroke and even sudden death. Although there is a lot information about the neural control of the arterial blood pressure, especially by the brain stem and some other prosencephalic areas, stress-evoked cardiovascular responses are not totally understood. Previews studies shows the importance of the medial amygdala nucleus (MeA) and of the histaminergic neurotransmission on the autonomic control of cardiovascular functions, however there aren’t studies that evidence the role of the histaminergic pathways in MeA on emotional stress-evoked cardiovascular adaptations. Therefore, the aim of this study was investigate the participation of the histaminergic receptors H1 and H2 in MeA on the cardiovascular responses in stressed and non-stressed rats. Wistar rats (280-320g) were submitted to stereotaxic surgery for bilateral cannulation of MeA. Five days after surgery, animals were submitted to catheterization of the left carotid artery. Twenty four hours after catheter insertion, experiments were started and the pulsatile arterial pressure (PAP) of freely moving rats on basal conditions was recorded. Drugs used for central administration were mepyramine (H1 receptors antagonist) on experimental groups I and III and cimetidine (H2 receptors antagonist) on experimental groups II and IV. At experimental groups I and II, 15 min after central microinjections of mepyramine or cimetidine respectively, in different doses, the rats was submitted to restraint stress in a polyvinyl apparatus, and PAP were continuously recorded for 45 min. After stress period, rats were replaced in their own cages and an additional 30 min were recorded for PAP reestablishment. At experimental groups III and IV, after 30 min of basal recording, rats received bilateral central microinjections of mepyramine or cimetidine in a dose of 200 nmol, respectively, and an additional period of 75 min was recorded in freely moving rats on basal conditions. Saline 0,9% was administered as vehicle in control animals of all experimental groups. Mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) were, then, calculated from the PAP signal. Experiments occurred between 7:00 and 13:00 and rat did not have access to water and food during the sessions. Data were expressed as mean±S.E.M. of MAP and HR variation. Mepyramine microinjections at doses of 50, 100 and 200 nmol promoted dose-dependent blockade of the restraint stress-evoked hypertensive response. Cimetidine (100 and 200 nmol) attenuated the hypertensive response to stress only at the highest dose administered. The anti-hypertensive response was bigger on animals which received mepyramine than cimetidine. Neither drugs altered the typical stress-evoked tachycardiac responses. Indeed, mepyramine or cimetidina were unable to modify the MAP or HR of freely moving rats on basal conditionals (non-stressed rats). These data suggest that histaminergic pathways in MeA mediates pressor responses without modifying the tachycardia promoted by restraint stress, activating preferentially H1 receptors. Besides, data corroborate to the hypothesis that histaminergic pathways in MeA do not plays tonic modulation of the cardiovascular system. Additional information acquired about physiologic role of central histaminergic receptor on the cardiovascular functions is important to biological science and to medical practice, especially when linked to the stress factor. These data contribute to clarify the role of these receptors on cardiovascular functions

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No. of bitstreams: 1 DissLRRT.pdf: 1317373 bytes, checksum: 51206e583775263173013e3c30ea57eb (MD5) Previous issue date: 2016-03-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Previous studies have implicated the 5HT1A and 5HT2C serotonin receptors subtypes located within the amygdala in the modulation of defensive behaviors in rodents exposed to the elevated plus-maze (EPM). Further studies have shown that exposure to a threatening stimulus can result in pain inhibition. This study evaluated the effects of intra-amygdala injections of 5HT1A and 5HT2C receptor agonists on open arms antinociception (OAA) in the EPM, and possible alterations of this response with concomitant fluoxetine treatment. Male Swiss mice received 0.1 μl intra-amygdala injections of either 5.6 or 10 nmol of 8-OHDPAT, a 5-HT1A receptor agonist, and an i.p. injection of 0.6% acetic acid, a nociceptive stimulus. After confirming the start of writhing, half of the animals in each group were confined to the OA and half to the EA of the EPM, to record the number of writhes during a five-minute period (Experiment 1) A similar experimental protocol was repeated in the experiments described below. Subsequently, the animals received combined injections of fluoxetine (2.5mg/kg) and 10 nmol of 8-OHDPAT (Experiment 2). In Experiment 3, the animals received injections of either 0.21 or 0.63 nmol of MK-212, a 5-HT2C receptor agonist, and combined injections of fluoxetine (2.5mg/kg) and 0.63 nmol of MK-212 (Experiment 4). Our results showed that intra-amygdala infusions of 8-OH-DPAT enhanced nociception in both arms. Combined administration of fluoxetine and 8-OH-DPAT did not alter the observed effects. Injection of MK-212 increased the OAA, while combined administration of fluoxetine and MK-212 reversed the increase in OAA observed with MK-212 injection. These findings suggest that OAA is mediated by 5-HT2C and 5-HT1A receptors located in the amygdala. Fluoxetine interacted with 5-HT2C receptors, blocking the increase of OAA induced by activation of this serotonin receptor subtype. / Estudos têm demonstrado que os subtipos de receptores serotonérgicos 5HT1A e 5HT2C localizados na amígdala estão envolvidos na modulação de comportamentos defensivos avaliados em camundongos expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE). Além disso, evidências demonstram que a exposição a situações ameaçadoras podem resultar em inibição da dor. Este estudo avaliou os efeitos da fluoxetina sobre a modulação da nocicepção pelos receptores 5-HT1A e 5-HT2C da amígdala em camundongos confinados nos braços abertos (BA) e fechados (BF) do LCE. Camundongos machos da linhagem suíço-albino receberam 0,1ul de injeções intra-amígdala de 8-OH-DPAT (agonista do receptor 5HT1A) nas doses de 5,6 ou 10 nmol e em seguida, uma injeção de ácido acético (estímulo nociceptivo), 0,6% (0,1ml/10g por peso corpóreo, i.p.). Após a confirmação do início das contorções, os camundongos foram confinados no BA ou BF do LCE durante 5 minutos para o registro do número de contorções abdominais (Experimento 1). Este protocolo sucedeu-se para os demais experimentos. Subsequentemente, os animais receberam injeções combinadas de fluoxetina (2,5 mg/kg, s.c.) e 10 nmol de 8-OH-DPAT intra-amígdala (Experimento 2). No experimento 3, os animais receberam injeções intra-amígdala de 0,21 ou 0,63mol de MK-212 (agonista do receptor 5-HT2C) e injeções combinadas de fluoxetina (2,5 mg/kg, s.c.) e 0,63nmol de MK-212 intra-amígdala (Experimento 4). Os nossos resultados mostraram que as injeções intraamígdalade 8-OH-DPAT acentuaram a nocicepção nos animais confinados em ambos os braços do LCE. A administração combinada de fluoxetina, e 8-OH-DPAT intra-amígdala não alterou os efeitos observados deste agonista do receptor 5HT1A. A microinjeção de MK-212 aumentou a antinocicepção induzida pelo BA, enquanto a administração combinada de fluoxetina e MK-212 intra-amígdala reverteu o aumento da antinocicepção induzida pelo BA observado com a microinjeção de MK-212 intra-amígdala. Estes resultados mostram que a antinocicepção induzida pelo BA do LCE pode ser mediada tanto pelos receptores 5-HT1A como por receptores 5-HT2C localizados na amígdala de camundongos. Entretanto, o bloqueio do aumento da antinocicepção induzida por situações aversivas promovido pela fluoxetina ocorreu apenas na interação com os receptores 5-HT2C.

Rinovírus (RV) é freqüentemente detectado nos tecidos tonsilares e nas secreções de nasofaringe de pacientes com doença adenotonsilar crônica, sem sintomas de infecção respiratória aguda (IRA). O objetivo deste estudo foi investigar a infecção por rinovírus em tonsilas humanas, com base em dois aspectos: infecção in vivo de células linfóides de tonsilas humanas naturalmente infectadas; e infecção ex vivo de células dissociadas desses tecidos inoculadas com rinovírus, visando a contribuir para elucidar possíveis mecanismos de infecção em amígdalas palatinas e adenóides humanas. De um total de 104 pacientes com doenças adenotonsilar crônicas, 21.1% (22/104) e 42.3% (44/104) apresentaram respectivamente amígdalas palatinas e adenóides positivas para RV por PCR. A replicação viral foi confirmada por hibridização in situ com sonda para intermediário replicativo nas regiões internas e externas aos folículos linfóides de amígdalas e adenóides, bem como em porções do epitélio ciliado de adenoides, e apenas raramente nas células epiteliais escamosas de tonsilas palatinas. A presença e distribuição de proteína estrutural do capsídeo viral foi detectada por imunohistoquímica (IHQ), utilizando anticorpos contra proteínas estruturais virais VP1 e VP2 nas tonsilas positivas para RV por qPCR. Os resultados indicaram marcação positiva tanto na superfície (epitélio), quanto em regiões extrafoliculares e centros germinativos. Em seguida, foi possível verificar a co-localização da marcação positiva da proteína estrutural VP2 de RV com marcadores linfocitários de membrana. Células CD4 + e CD20 + apresentaram marcação positiva para VP2 verificada usando estratégia de \'sequential immuno-peroxidase labelling and erasing\' (SIMPLE). Culturas primárias de células linfomononucleares (CLMN) de tonsilas sabidamente negativas para RV por PCR, foram infectadas in vitro, com RV (MOI=1). A replicação de RV foi titulada por TCID50, mostrando aumento inicial (24 h) e subsequente queda após 48 horas. Por IF observamos que os fenótipos de CLMN infectadas com RV in vitro foram células T CD4 + e B, mas também com células CD8 +, CD56 + e CD33 +. RV não infectou células CD123 +. RV foi isolado em WI- 38 e HeLa a partir de tecidos e secreções de nasofaringe de pacientes com hipertrofia tonsilar sem sintomas de infecção respiratória aguda. Nossos resultados confirmam que tonsilas de pacientes sem sintomas respiratórios agudos podem ser reservatórios de RV, que infecta não somente epitélio, mas também CLMN (frequentemente linfócitos T CD4 + e linfócitos B). A detecção de RNA intermediário replicativo e proteínas estruturais VP1 e VP2 nas tonsilas hipertróficas, além do isolamento de vírus infeccioso a partir de tecidos e secreções nasofaríngeas, classificam tonsilas hipertróficas como sítios de infecção e replicação de RV, e sugerem que esses indivíduos hipertróficos são portadores assintomáticos de RV persistente, e podem ser importantes fontes de transmissão de RV na comunidade. / The chronic adenotonsillar diseases are frequent otorhinolaryngologic conditions caused by chronic inflammation of adenoids and palatine tonsils. Rhinovirus (RV) is highly frequently detected in secretions, and tonsillar tissues from patients experience chronic tonsillar hypertrophy without symptoms of ARI, and our goal is to full understanding of viral infections in hypertrophic tonsillar tissues by RV. Of 104 enrolled patients with adenotonsillar chronic diseases, 21.1% (22/104) and 42.3% (44/104) had palatine tonsils and adenoids positive for RV by qPCR, respectively. RV Viral replication was confirmed by in situ hybridizations. Minus-strand RNA were detected in all tested samples (7 tonsils and 9 adenoids), and positive reactions were seen inside and outside of lymphoid follicles from tonsils and adenoids, in the ciliated epithelium of the adenoids and rarely in positive squamous epithelium cells from tonsils. The presence of viral structural protein VP1 and VP2 was detected within and outside of the lymphoid follicles from tonsils and adenoids, and also in epithelial cells from adenoids by immunohistochemistry (IHC). Later, by sequential immuno-peroxidase labelling and erasing protocol (SIMPLE), we saw co-localization of RV VP2 capsid protein staining with CD4 positive cells and CD20 positive cells. We confirmed that RV could infect primary culture of tonsilar mononuclear cells (TMNCs). Additionally, intracellular replication of RV in TMNCs, measured by TCID50 in HeLa cells, had an initial increase in the first 24 hours, and dropped at 48 hours post infection. Immunolocalization staining with anti-RV and TMNCs surface markers indicated that phenotypes of susceptible cells were T-cells both CD4+ and CD20+, but also, we saw co-localization of VP-2 protein with CD8+ cells, CD56+ cells and CD33+ cells. RV-16 couldn\'t infect CD123+ cell in our experiments. Finally, we were able to recover 4 rhinoviruses by inoculating WI-38 fibroblast cells and HeLa cells, confirming by the cytopathic effect and immunofluorescence positive staining with anti-VP1 antibody. Taken together, our results indicate that tonsils and adenoids of patients without ARI may be reservoirs of replicating human rhinovirus, infecting manly Tcells CD4+ and CD20+ B-cells. The high-frequency detection of RNA (-) and VP1 expression in tissues from patients with chronic adenotonsillar diseases, plus the isolation of infectious viral particles, suggests that these detected agents replicate in the adenotonsillar tissues and this specific sites may be important sources of transmission of RV in the community.