Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 pedro_manso_ioc_dout_2014.pdf: 3405057 bytes, checksum: 6746c4f31f57631cda4cf25c55563336 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A vacina contra febre amarela é produzida a partir da inoculação do vírus atenuado 17DD em ovos embrionados de galinha. Esta vacina é extremamente eficaz e segura, gerando imunidade que pode perdurar por até trinta e cinco anos. Embora a replicação deste vírus em embriões de galinha seja utilizada desde 1937, pouco se sabe sobre os aspectos da infecção nestes embriões, especialmente que órgãos, tecidos e células são responsáveis pela replicação viral. Nesse trabalho, analisamos embriões de galinha (Gallus gallus) infectados pelo vírus da FA 17DD em diferentes tempos de infecção (24, 48, 72 e 96 horas) conforme as condições empregadas na produção de vacina na Fiocruz. Identificamos o vírus da Febre Amarela através de imunofluorescência em diferentes tecidos, correlacionamos a presença deste agente infeccioso às pequenas reações histopatológicas observadas nos tecidos, validamos essa detecção pela confirmação do material genético viral e seu sequenciamento, e confirmamos que este vírus replica na região onde foi identificado pela presença detecção de seu intermediário replicativo. Nesse sentido observamos que as alterações histopatológicas que ocorrem nos embriões de galinha infectados pelo vírus FA 17DD se apresenta branda e sistêmica ao longo do tempo analisado. Nossos dados apontam que as primeiras células a manifestar a infecção são mioblastos com aspecto mesenquimal que puderam ser observados no coração e no músculo esquelético a partir de 48 horas de infecção Após 72 horas, o vírus FA 17DD replica em células do músculo esquelético, cardiomiócitos, células da glia e neurônios, no epitélio tubular renal, parênquima pulmonar e fibroblastos. Nossos dados permitem sugerir o tecido muscular esquelético como um local privilegiado na produção das partículas virais. Após 96 horas a infecção se torna mais intensa no sistema nervoso e se mantém nos mesmos níveis nos demais tecidos já infectados. O conjunto de dados gerados nesse trabalho contribui para elucidar aspectos importantes sobre a patologia da febre amarela em embriões de galinha, e evidenciar os tecidos e células responsáveis pela produção do vírus FA 17DD nestes embriões. Estes dados podem ser úteis na compreensão e formulação de novas estratégias de produção da vacina, além de impactar no desenvolvimento de estratégias baseadas no uso do vírus FA 17DD como plataforma de produção para outras vacinas / Yellow fever vaccine is produced from the inoculation of attenuated virus YF 17DD in embryonated chicken eggs. This vaccine is extremely effective and safe, generating immunity that can persist across up to thirty-five years. Although replication of this virus in chicken embryos is used since 1937, little is known about aspects of infection in these embryos, especially that organs, tissues and cells are responsible for viral replication. In this study we analyzed chicken embryos (Gallus gallus) infected in vaccine production (Biomanguinhos) with YF 17DD virus in different times post infection (24, 48, 72 and 96 hours). Here it was possible to detect the Yellow Fever Virus by immunofluorescence, to correlate this presence with tiny tissue reactions, to validate it by genomic RNA detection and to sequence it in the same studied area, confirming that this virus is replicated in these regions by the replicative intermediate detection. In this thesis the histopathological changes that occur in chicken embryos infected by YF 17DD virus during the production of yellow fever vaccine were observed in a kinetic way. We observed that the infection in these embryos presented itself mild and systemic. Our data show that the first cells which express infection are myoblasts with mesenchymal shape that could be observed in the heart and skeletal muscle at 48 hours of infection. After 72 hours the yellow fever virus 17DD replicates mainly in skeletal muscle cells, cardiomyocytes, glial cells and neurons, but also in the renal tubular epithelium, lung parenchyma and fibroblasts. Our findings suggested skeletal muscle tissue as a main place in the production of viral particles. After 96 hours the infection becomes more intense in the nervous system and is maintained at the same levels in other tissues already infected. The data generated in this study contributes to elucidate important aspects of the yellow fever pathology in chicken embryos, and elucidate the tissues and cells responsible for YF 17DD virus production in this model. Our data may be helpful in the understanding and design new strategies of vaccine production, and impact in development of strategies based on the use of the virus YF 17DD as a platform for other vaccines production.

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-03-16T18:52:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Vinicius Viana - Dissetação com ficha catalográfica para impressão e depósito.pdf: 7141197 bytes, checksum: 748444bc121997d6c1dcadbca502f6c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-16T18:52:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Vinicius Viana - Dissetação com ficha catalográfica para impressão e depósito.pdf: 7141197 bytes, checksum: 748444bc121997d6c1dcadbca502f6c9 (MD5) Previous issue date: 2015-05-27 / CAPES / Esta pesquisa teve como objetivo geral analisar as percepções de violência no bairro de Casa Amarela, através dos relatos dos docentes, estudantes, funcionários(as) e gestor(a) da Escola Pública Estadual Dom Vital no período de 2007 – 2010. A dissertação está fundamentada principalmente nas obras do sociólogo alemão Norbert Elias (1970, 1990, 1993, 1994, 1997) e Norbert Elias e John Scotson (2000). Utilizamos como instrumentos de coleta de dados questionários e entrevistas, onde participaram do estudo 61 atores, dos quais identificamos 18 docentes, 9 funcionários (Assistente Administrativo, Auxiliar Administrativo, Apoio Pedagógico, Analista Educacional, Professora Readaptada, Merendeira Terceirizada, Serviços Gerais Terceirizada), 33 estudantes e um(a) gestor(a). Desse quantitativo aplicamos o questionário a 60 participantes e entrevistamos 14 atores. Um termo de consentimento foi exigido para que os menores de idade pudessem participar do estudo. Os questionários e as entrevistas foram analisados sobre a orientação da análise de conteúdo na perspectiva proposta por Laurence Bardin (2009). Os resultados obtidos revelam poucos indicadores referentes à ausência de percepção de violência no bairro e uma quantidade maior de indicadores que apontaram diversas percepções de violência. Constatamos que as principais situações de violência percebidas no bairro de Casa Amarela foram: furtos, assaltos e tráfico de drogas, além de casos de violência diversos e a sensação de insegurança no bairro. No que se refere à escola Dom Vital, identificamos que as principais situações de violência apontaram para: a violência contra o patrimônio da escola, o consumo de drogas na escola, tensões e conflitos entre os estudantes e docentes, participantes que foram expostos a situações de violência e situações em que foi necessária a intervenção da polícia para resolução de problemas. Percebemos que as principais estratégias usadas pela comunidade escolar no enfrentamento às situações de violência foram: o registro das situações de violência no livro de ocorrência, a solicitação da presença da família na escola, a transferência de estudantes envolvidos em caso de violência, o uso das ―salas ambientes‖ e a utilização do sistema interno de segurança ―câmeras‖. Concluímos que a escola Dom Vital teve seu funcionamento afetado pelas situações de violência no bairro e também pelas violências oriundas da própria configuração escolar, no período compreendido entre os anos 2007 a 2010, mas que essas tensões e violências foram resolvidas pela ação da gestão, corpo docente, corpo de funcionários e em alguns casos pela polícia militar. / This research aimed to analyze the perceptions of violence in the neighborhood of Casa Amarela through reports from teachers, students, employees and manager of the State Public School Dom Vital from 2007 - 2010. The paper is based mainly on the studies of the German sociologist Norbert Elias (1970, 1990, 1993, 1994, 1997) and Norbert Elias and John Scotson (2000). We use questionnaires and interviews as data collection. 61 people were corpus for the research, as follows: 18 teachers, nine employees (Administrative Assistant, Administrative Auxiliary, Educational Support, Education Analyst, readapted Professor, Lunch Box Outsourcing, Outsourced General Services) 33 students and a manager, of that quantitative applied the questionnaire to 60 participants and interviewed 14 actors. A consent form is required for minors could participate in. Questionnaires and interviews were analyzed on the orientation of content analysis under the perspective proposed by Laurence Bardin (2009). The results point out few indicators related to the lack of perception of violence in the neighborhood and a larger quantity indicators showed up different samples of violence. We notice that the main situations of violence perceived in the neighborhood of Casa Amarela were: thefts, robberies and drug dealing, in addition to several cases of violence and the feeling of insecurity in the neighborhood. About the Dom Vital school we identified that the main situations of violence focused on: violence against school property, drug usage in school, tensions and conflicts between students and teachers, participants who were exposed to situations of violence and situations where police intervention was necessary to solve problems. We realize that the strategies used by the school community in facing situations of violence were the record of situations of violence in the occurrence book, the request of the family's presence in school, transferring students involved in cases of violence, the use of ―salas ambientes‖ and the internal system security cameras. We conclude that Dom Vital school had its operation affected by situations of violence in the neighborhood and also the violence coming from the school environment itself, from 2007 to 2010, but these tensions and violence have been resolved by the action of the management, teachers, employees and in some cases by military police.

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-03-22T17:35:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação - Cores, Cheiros e Sons... É dia de Feira!!! (Rogério Luiz Souto Cavalcanti - Program_0.pdf: 19134192 bytes, checksum: 4b5d0b3263401818d6a901bf6634102f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T17:35:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação - Cores, Cheiros e Sons... É dia de Feira!!! (Rogério Luiz Souto Cavalcanti - Program_0.pdf: 19134192 bytes, checksum: 4b5d0b3263401818d6a901bf6634102f (MD5) Previous issue date: 2015-03-09 / FACEPE / O multicolorido, o cheiro dos hortifrútis e os sons – nem tão harmoniosos –, entoados pelos feirantes, principalmente no momento da “xepa1”, como estratégia para buscar as melhores vendas, são elementos particulares encontrados em inúmeras ocasiões, nesses confusos teatros, distribuídos no território brasileiro. Nesta pesquisa analisamos a Feira Livre de Casa Amarela, zona Norte da cidade do Recife/Pernambuco, almejando, sob a perspectiva do planejamento urbano, elucidar os processos da gestão urbana nestes ambientes. Nesse sentido, ao lançarmos um olhar sobre os referenciais teóricos acerca das feiras, privilegiamos os debates sobre o desenvolvimento urbano, enfatizando a relação: Feira Livre x Gestão Pública Urbana, com enfoque no recorte territorial selecionado. Fundamenta-se na Análise de Conteúdo contextualizada por Bardin (2004), empregando uma metodologia com abordagem qualitativa contextualizada em três etapas: pré-análise, exploração do material e tratamento dos resultados. A investigação tem em paralelo, no contexto metodológico, os direcionamentos realizados por Mott (2000) para a realização dos trabalhos de campo envolvendo as feiras livres. Assim, partimos do pressuposto de que, na contemporaneidade, as questões referentes à Feira Livre de Casa Amarela revelam uma lacuna entre a Gestão Pública Urbana e a vida cotidiana no ambiente retratado. / The multicolored, the smell of fruits and vegetables and the sounds - not so harmonious - sung by merchants, especially at the moment of "xepa1" as a strategy to get the best sales, are particular elements found on numerous occasions, in these confused “theaters” spread around Brazil. In this study it will be analyzed the Free Market of Casa Amarela, north zone of the city of Recife/Pernambuco, targeting, from the perspective of urban planning, to elucidate the processes of urban management in these environments. Hereby, to launch a look at the theoretical framework about the fairs, we focus on the debates on urban development, emphasizing the relationship: Free markets x Urban Public Management, focusing on the selected territorial clipping. It is based on the contextualized Analysis of Content by Bardin (2004), using a qualitative approach methodology contextualized in three steps: pre-analysis, material exploration and treatment of results. The research has, in parallel, in the methodological context, the guidelines made by Mott (2000) for the realization of the fieldwork involving the free fairs. Thus, it is assumed that, in contemporary times, the issues of the Free Fair of Casa Amarela reveal a gap between the Urban Public Management and the daily lives in the portrayed environment.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-10Bitstream added on 2014-06-13T19:22:41Z : No. of bitstreams: 1 morais_ats_dr_sjrp.pdf: 1276143 bytes, checksum: 62a89d8b555ac92b5faf4baa19e4db2f (MD5) / O vírus da Febre Amarela (YFV) pertence ao gênero Flavivirus e causa uma importante doença. Nos últimos anos, uma alarmante ressurgência da circulação viral e expansão do vírus em áreas endêmicas têm sido detectadas na África e América do Sul. NS5 é uma proteína viral não estrutural com duas atividades essenciais para a replicação viral, uma de metiltransferase e outra de RNA Polimerase dependente de RNA (RdRp). Para o melhor entendimento dos mecanismos de replicação viral, interações entre NS5 e proteínas celulares têm sido amplamente estudadas. Assim, os objetivos desse estudo foram caracterizar a interação da proteína NS5 e eIF3L, avaliar a função de eIF3L na replicação do vírus da febre amarela, e caracterizar estruturalmente a proteína eIF3L. Métodos. Para identificar a interação de NS5 YFV com eIF3L, foi realizado ensaios em sistema duplo-híbrido usando RdRp NS5 YFV contra eIF3L. Para o mapeamento da interação, foram construídos mutantes deletantes de RNApol e analisados em sistema duplo-híbrido. A região de interação de RNApol foi segmentada em três fragmentos e analisada na presença de eIF3L. Para mapear os resíduos de NS5 críticos para a interação, foi realizada mutagênese sítio-dirigida no segmento 3 de ID. A interação foi analisada em ensaios in vitro e em cultura de células de mamíferos. A significância de eIF3L para a replicação do YFV foi investigada usando superexpressão de eIF3L em células BHK21-RepYF17D LucNeoIres. A proteína eIF3L foi purificada usando uma combinação de cromatografia de afinidade e de exclusão molecular para subsequente caracterização estrutural. Resultados. Nesse estudo, foi caracterizada a interação de NS5 com o fator eucariótico de início de tradução... / Yellow fever virus (YFV) belongs to the Flavivirus genus and causes an important disease. An alarming resurgence of viral circulation and expansion of the YFV endemic zones have been detected in Africa and South America in recent years. NS5 is a viral protein that contains the methyltransferase and RNA-dependent RNA polymerase domains, which are essential during viral replication. Interactions among NS5 and cellular proteins have been studied for the understanding of viral replication. The aim of this study was to characterize the interaction of NS5 protein with EIF3L and evaluate the role of EIF3L in yellow fever replication. Methods. To identify the interaction of YFV NS5 with cellular proteins, we performed a two-hybrid screen using YFV NS5 RdRp domain as bait and a human cDNA library. For mapping the interaction, RNApol deletions mutants were performed and analyses in two-hybrid system. The RNApol region of interaction was segmented in three fragments and analyses into yeast containing eIF3L. To map residues of NS5 that are critical for its interaction, we performed a site-direct mutagenesis in segment 3 of ID. The interaction was confirmed in vitro assays and by in vivo coimmunoprecipitations. The significance of eIF3L for replication of YFV was investigated using overexpression of eIF3L in BHK21-RepYF17D LucNeoIres cells. eIF3L was purified using a combination of affinity and subsequent size exclusion chromatography for subsequent structural characterization. Results. In this work we describe and characterize the interaction of NS5 with the translation factor eIF3L. The interaction between NS5 and eIF3L was confirmed by in vitro binding and in vivo coimmunoprecipitation assays. This interaction occurs in a region (Interaction Domain of RNApol domain) that is conserved in several... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-16T11:43:38Z No. of bitstreams: 1 mauro-franca-da-silva.pdf: 1113117 bytes, checksum: 4721a993f32ab60140b4d0cf8c0f704f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-16T11:43:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mauro-franca-da-silva.pdf: 1113117 bytes, checksum: 4721a993f32ab60140b4d0cf8c0f704f (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O vírus atenuado da febre amarela, subcepa 17DD, é utilizado por Bio-Manguinhos para a produção da vacina contra a febre amarela. Esta vacina tem sido utilizada para a imunização humana com um excelente histórico de eficácia e segurança. Entretanto, nos últimos anos, devido à ocorrência de alguns casos de eventos adversos associados ao vírus vacinal cepa 17D e subcepa 17DD, apontou-se a necessidade de desenvolvimento de uma vacina inativada. Para a implementação desta nova vacina torna-se necessário o desenvolvimento de métodos de quantificação de antígenos virais. Diferentes metodologias de quantificação podem ser utilizadas na produção de vacinas inativadas, sendo as mais comuns o teste imunoenzimático (ELISA) e o teste de dose-resposta. O presente estudo teve como objetivo o estabelecimento de um ELISA visando à detecção do antígeno do vírus da febre amarela inativado. Para este propósito, foram obtidos estoques de partículas virais da subcepa 17DD, a partir de culturas de células Vero, os quais foram purificados e quantificados por métodos bioquímicos e virológicos clássicos, respectivamente. Para o desenvolvimento do teste utilizamos diferentes anticorpos como capturana fase sólida. Os resultados obtidos para os testes utilizando o anticorpo 2D12 como captura mostraram um limite de detecção do antígeno no ELISA foi de 2,21 log 10 PFU/0,1mL e (1,55 µg/0,1mL). A partir deste valor, foi estabelecido um controle positivo contendo o vírus 17DD atenuado com título de 3,06 log10 PFU/mL e (29µg/0,1mL). Os resultados mostram, também, que o ELISA foi capaz de detectar o vírus 17DD inativado por formaldeído até a diluição 1:16 (52,9 µg/0,1mL). Baseado nos resultados obtidos acredita-se que o desenvolvimento de um teste de ELISA para detecção e quantificação do antígeno 17DD possa representar umimportante avanço tecnológico no controle da produção de uma vacina inativada contraa febre amarela. / The attenuated 17DD substrain of yellow fever virus is used in Bio-Manguinhos for yellow fever vaccine production. This vaccine has been used for human immunization with an excellent history of efficacy and safety. However, in the latest years, the occurrence of adverse events associated with 17D and 17DD substrain pointed to the necessity of developing technologies for the production of an inactivated vaccine. The implementation of this new vaccine will require methods for antigen quantification. Different methodologies of quantification can be used, being the most commonlyused the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and dose response test.The aim of this study was the establishment of an ELISA for the detection of inactivated yellow fever virus antigen. For this purpose, 17DD virus was obtained from Vero cell cultures, purified and quantified by biochemical and virological classical methods, respectively. The results showed that ELISA test using the 2D12 capture antibody presented a limit of 2,21 log10PFU/0.1mL of viral titer and (1,55 µg viral protein/0.1mL). Based on this value, a positive control was established which contained the attenuated 17DD substrain of yellow fever virus with a titer of 2,95log 10 PFU/mL and (29 µg/0.1mL). The results also showed that the ELISA was able to detect 17DD virus inactivated by formaldehyde up the dilution 1:16 (52,9 µg protein/0,1mL). The development of an ELISA test for the detection and quantification of 17DD antigen can represent an important step in the production control of the inactivated vaccine against of yellow fever.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:35:56Z No. of bitstreams: 1 raquel_t_nogueira_ioc_bcm_0036_2011.pdf: 26030733 bytes, checksum: f5f3242630bf6c38b49320fb704ac2e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T16:35:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_t_nogueira_ioc_bcm_0036_2011.pdf: 26030733 bytes, checksum: f5f3242630bf6c38b49320fb704ac2e4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O vírus vivo atenuado de Febre Amarela (FA) YF 17D é uma das vacinas virais mais seguras e eficazes já administradas a humanos, a qual induz uma resposta imune polivalente. Estas características tornam este vírus vacinal umaplataforma tecnológica para o desenvolvimento de novas vacinas. Através da tecnologia do clone infeccioso, nós utilizamos o arcabouço de YF 17D para expressar epítopo indutor de linfócitos T CD8 + , TEWETGQI e um fragmento imunogênico, ambos provenientes da proteína de superfície de amastigota 2 (ASP-2) de Trypanosoma cruzi, parasita causador da Doença de Chagas. Este estudo objetivou evidenciar o potencial deste vírus em expressar antígenos heterólogos. O epítopo TEWETGQI foi clonado e expresso baseando-se em doissítios distintos do genoma: na alça fgda proteína de Envelope (E) (YF17D/E200/Tc) e no sítio de clivagem proteolítico entre NS2B e NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). Uma terceira estratégia envolveu a montagem de um cassete heterólogo expressando um fragmento imunogênico de 120 aminoácidos de ASP-2 entre as proteínas E e NS1 (YF17D/ENS1/Tc). Nós investigamos se o sítio de expressão poderia influenciar a imunogenicidade do antígeno heterólogo. Assim, foram gerados vírus que se replicaram em cultura de células similar ao YF 17DD e permaneceram estáveis geneticamente após algumas passagens seriadas em célula Vero. A expressão dos antígenos heterólogos pelos vírus recombinantes revelou distintos padrões de detecção em diferentes regiões da célula. Outros estudos de caracterizaçãomostraram que os vírus YF17D/E200/Tc e YF17D/NS2B3/Tc são mais atenuados do que YF 17DD, quando inoculados via intracerebral em camundongos, sendo YF17D/E200/Tc o mais atenuado. Estudos de imunogenicidade revelaram que todos os vírus foram capazes de induzir anticorpos neutralizantes para Febre Amarela e o vírus YF17D/ENS1/Tc induziu anticorpos que reagem especificamente com amastigotas. Além disso, os vírus recombinantes induziram em camundongos imunizados uma resposta celular T produtora de interferon-gama(IFN-γ) antígeno-específica, além de uma resposta balanceada T CD4 + e T CD8 + para Febre Amarela. A vacinação de uma linhagem murina altamente suscetível à infecção por T. cruzicom um regime de dose-reforço homólogo que utilizou uma formulação de vírus YF 17D recombinantes induziu células T CD8 + TEWETGQI específicas após uma única dose, a qual poderia explicar o maior grau de proteção após desafio com T. cruzi. Assim, concluímos que a plataforma de YF 17D é útil para expressar antígenos de protozoários (T. cruzi) em regiões funcionais distintas do genoma com um impacto mínimo na viabilidade viral. Além disso, o uso de novas formulações contendo diferentes vírus YF 17D recombinantes parece ser uma estratégia promissora, a qual será explorada para outros patógenos. / The attenuated Yellow Fever (YF) 17D vaccine virus is one of the safest and most effective viral vaccines administered to humans, inwhich it elicits a polyvalent immune response. These characteristics make this vaccine virus a technological platform to the development of new vaccines. Herein, through the infectious clone technology, we used the YF 17D backbone to express a CD8 + T cell epitope, TEWETGQI and an immunogenic fragment, both originated from the Trypanosoma cruzi (the causative agent of Chagas disease) Amastigote Surface Protein 2 (ASP-2). This study aimed to provide further evidence for the potential of this virus to express foreign epitopes. The TEWETGQI epitope was cloned and expressed in two different genomic insertion sites:the fg loop of the viral Envelope protein (E) (YF17D/E200/Tc) and the protease cleavage site between the NS2B and NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). A third strategy involved the construction of a heterologous cassette expressing an immunogenic ASP-2 fragment between E and NS1 (YF17D/ENS1/Tc). We investigated whether the site of expression had any influence on foreign antigen immunogenicity. In this sense, we generated virus that replicated similarly to vaccine virus YF 17DD in cell culture and remained genetically stable after some serial passages in Vero cells. The expression of the heterologous antigens by the recombinant viruses revealed distinct patterns of detection regarding different regions of the cell. Other characterization studies showed that YF17D/E200/Tc and YF17D/NS2B3/Tc were more attenuated than YF 17DD, when inoculated intracerebrally in mice, YF17D/E200/Tc being the most attenuated. Immunogenicity studies revealed that all viruses elicited neutralizing antibodies to YF virus and YF17D/ENS1/Tc virus induced antibodies that react specifically to amastigotes. Moreover, recombinant viruses generated an antigen specificgamma interferon (IFN-γ) mediated T-cell response in immunized mice as well as a balanced YF T CD4 + and T CD8 + response. Vaccination of a mouse lineage highly susceptible to infection by T. cruziwith a homologous prime-boost regimen of a YF 17D recombinant formulation elicited TEWETGQI specific CD8 + T cells after only one dose which could explain the higher degree of protection after T. cruzichallenge. We conclude that the YF 17D platform is useful to express Protozoan (T. cruzi) antigens at different functional regions of its genome with minimal reduction in vector viability. Besides, the use of new viral formulations composed of different YF 17D recombinant viruses seem to be a promising strategythat will be explored to other pathogens.

Made available in DSpace on 2015-02-27T17:39:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 64.pdf: 604343 bytes, checksum: edae78b2242ec5e83a56d865390be3ce (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O presente trabalho teve como objetivo (i) avaliar o processo de controle da qualidade relacionado às vacinas contra febre amarela utilizadas pelo Programa Nacional de Imunizações (PNI) do Ministério da Saúde no período de 2000 a 2008, através de levantamento de dados provenientes do Sistema de Gerenciamento de Amostras (SGA) do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) e (ii) propor a utilização de gráficos de controle, como ferramentas úteis para a melhoria desse processo, a partir da análise comparativa dos resultados obtidos para vacinas nacionais e importadas, e da consistência de produção e detecção de tendências sistemáticas. Teve ainda como proposta (iii) a validação retrospectiva do teste de potência da vacina em questão, através da demonstração de sua confiabilidade (variabilidade e precisão) e do acompanhamento do desempenho da vacina de referência usada nos testes de potência e termoestabilidade. Compuseram a análise relativa ao controle da qualidade das vacinas contra febre amarela os seguintes parâmetros: (i.) análise do protocolo resumido de produção e controle emitido pelo fabricante, (ii.) teste de potência, (iii.) teste de termoestabilidade, (iv.) teste de determinação de ovalbumina, (v.) teste de esterilidade bacteriana e fúngica, (vi.) teor de umidade residual e (vii.) endotoxina bacteriana. Para confecção dos gráficos de controle foram estabelecidos os limites de controle (3 DP a partir da média) e limites de alerta (2 DP), calculados a partir dos 20 primeiros resultados a cada ano, como definido pela OMS (OMS, 1997) e através do programa SPC Explorer RT, versão 5.21 (Quality America Inc.). No período estudado ingressaram no INCQS 1031 lotes de vacinas contra febre amarela, produzidos por dois fabricantes distintos (97% pelo fabricante A e 3% pelo fabricante B), representando um total de 285 milhões de doses individuais. / O presente trabalho teve como objetivo (i) avaliar o processo de controle da qualidade relacionado às vacinas contra febre amarela utilizadas pelo Programa Nacional de Imunizações (PNI) do Ministério da Saúde no período de 2000 a 2008, através de levantamento de dados provenientes do Sistema de Gerenciamento de Amostras (SGA) do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) e (ii) propor a utilização de gráficos de controle, como ferramentas úteis para a melhoria desse processo, a partir da análise comparativa dos resultados obtidos para vacinas nacionais e importadas, e da consistência de produção e detecção de tendências sistemáticas. Teve ainda como proposta (iii) a validação retrospectiva do teste de potência da vacina em questão, através da demonstração de sua confiabilidade (variabilidade e precisão) e do acompanhamento do desempenho da vacina de referência usada nos testes de potência e termoestabilidade. Compuseram a análise relativa ao controle da qualidade das vacinas contra febre amarela os seguintes parâmetros: (i.) análise do protocolo resumido de produção e controle emitido pelo fabricante, (ii.) teste de potência, (iii.) teste de termoestabilidade, (iv.) teste de determinação de ovalbumina, (v.) teste de esterilidade bacteriana e fúngica, (vi.) teor de umidade residual e (vii.) endotoxina bacteriana. Para confecção dos gráficos de controle foram estabelecidos os limites de controle (3 DP a partir da média) e limites de alerta (2 DP), calculados a partir dos 20 primeiros resultados a cada ano, como definido pela OMS (OMS, 1997) e através do programa SPC Explorer RT, versão 5.21 (Quality America Inc.). No período estudado ingressaram no INCQS 1031 lotes de vacinas contra febre amarela, produzidos por dois fabricantes distintos (97% pelo fabricante A e 3% pelo fabricante B), representando um total de 285 milhões de doses individuais. Desse total, 5 lotes do fabricante A (0,5% do total de lotes deste fabricante) foram consideramos insatisfatórios (cerca de 1,7 milhões de doses), sendo três lotes no teste de esterilidade bacteriana e fúngica e dois lotes no teste de umidade residual. A avaliação dos gráficos de controle dos resultados de potência e de termoestabilidade mostraram que estes testes apresentam menor variação no INCQS do que no fabricante A. Além disso, no ano de 2007 foi possível observar um número significativo de valores do teste de potência deste fabricante abaixo do limite inferior de controle. Estes valores concentravam-se na segunda metade do gráfico, coincidindo com um período em que houve maior demanda pela vacina contra febre amarela, devido ao aumento no número de casos da doença no Brasil e em alguns países da América do Sul. Nosso resultados indicam ainda que no INCQS, o processo está sob controle estatístico e as causas especiais de variação, caso ocorram estão sendo controladas. Quanto à validação retrospectiva do teste de potência contra febre amarela no INCQS, concluímos que a exatidão foi de 0,19 (0,09-0,25), e recuperação de 96,14. A precisão total foi de 14,48%, sendo a repetitividade de 11,92% e precisão intermediária de 7,78% entre ensaios, e 7,80% entre analistas. Estes valores encontram-se satisfatórios e de acordo com o preconizado para ensaios biológicos por agências internacionais.

Made available in DSpace on 2015-06-01T19:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 501.pdf: 2806630 bytes, checksum: 5dbcbb44377fbc1620ff4879d96a08d9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / A vacina da febre amarela 17D (YFV-17D) é bastante segura e uma dose única confere imunidade potente e duradoura. Por essas e outras características, diferentes tecnologias têm sido propostas para a utilização da cepa 17D como vetor vacinal. Estratégias promissoras para o desenvolvimento de novas vacinas têm se baseado na construção de quimeras YFV-17D com inserção de seqüências heterólogas e produção em larga escala de replicons empacotados em partículas pseudo-infecciosas (PPIs), no entanto, ainda não existe um consenso da melhor estratégia a ser utilizada para esses fins. O presente estudo teve por objetivo avaliar diferentes estratégias de construção para a utilização do YFV-17D como vetor vacinal. Para isso foram construídos duas quimeras do YFV-17D com inserção de um gene repórter YFP (Yellow Fluorescent Protein) na junção E/NS1 e dois replicons subgenômicos do YFV-17D expressando o gene repórter luciferase. Para a produção de PPIs foi desenvolvida a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt. O YFV-YFPSSE revelou instabilidade genética com perda do gene YFP e correlação negativa entre expressão de proteínas virais e do gene repórter. O YFV-YFP-DENV1linker mostrou-se estável geneticamente com expressão eficiente de YFP e proteínas virais, e mostrou-se ser o mais adequado para ser utilizado como vetor viral. Os replicons do YFV-17D mostraram-se funcionais e capazes de expressar eficientemente o gene heterólogo. E, embora a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt tenha expressado as proteínas estruturais prM e E eficientemente, poucas partículas pseudo-infecciosas foram produzidas. Diante do exposto, as diferentes estratégias de manipulação genética do YFV avaliadas neste trabalho constituem ferramentas viáveis e aplicáveis ao processo de desenvolvimento de vacinas, havendo, porém, necessidade de otimização dessas estratégias para assegurar maiores segurança e eficácia

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:39:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 noemia_lima_ioc_dout_2015.pdf: 29567185 bytes, checksum: 3de9ba1c4aa0b0fd32cd0580439ffbde (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A vacina contra febre amarela, constituída pelo vírus febre amarela (FA) vivo atenuado da cepa 17D, é uma das mais seguras e eficazes vacinas desenvolvidas até hoje. Seu correlato de proteção é a indução de anticorpos neutralizantes, que é acompanhada de intensa resposta imune celular, com ativação de um perfil balanceado de células TH1 e TH2, devido à ampla estimulação da resposta imune inata. Estas boas características tornam atraente o uso do vírus FA 17D como vetor para o desenvolvimento de novas vacinas contra outras doenças. O nosso laboratório utiliza uma estratégia única para expressão de proteínas heterólogas ao vírus FA 17D, através da inserção de cassetes de expressão na região intergênica E/NS1. Neste trabalho, determinamos a importância de alguns motivos funcionais introduzidos nas extremidades da GFP recombinante expressa por este vetor, que causaram impacto sobre a sua expressão, através do correto enovelamento proteico e transporte para a via secretora. Além disto, apresentamos diferentes plataformas, através de modificações no vetor previamente desenvolvido, que exibiram diferenças quanto à estabilidade genética do inserto, menor interferência com a replicação viral, menor indução de morte celular e capacidade de secreção da proteína recombinante. Adicionalmente, expressamos proteínas de envelope de SIV através de alguns dos novos vetores FA 17D desenvolvidos, que foram capazes de estimular anticorpos específicos em camundongos, demonstrando o potencial do vírus FA 17D como vetor para o desenvolvimento de vacina recombinante contra AIDS baseada na indução de resposta imune humoral / The yellow fever vaccine, composed of the live attenuated Yellow fever (YF) virus strain 17D, is one of the safest and most effective vaccines ever developed. Its correlate of protection is the induction of neutralizing antibodies, which is accompanied by intense cellular immune response with activation of a balanced profile of TH1 and TH2 cells due to the broad stimulation of the innate immune response. These characteristics make this virus attractive to be used as a vector for development of new vaccines against other diseases. Our laboratory uses a unique strategy for expression of heterologous proteins in the YF 17D virus by insertion of expression cassettes in the intergenic region E/NS1. Here, we determine the importance of some functional motifs introduced at the ends of the recombinant GFP expressed by this vector, which were able to improve its expression through the proper protein folding and its transport to the secretory pathway. Moreover, we present different platforms, which show differences in genetic stability of the insert, less interference with viral replication, less induction of cell death and enhanced capacity of secretion of the recombinant protein. Additionally, we express SIV envelope proteins by some of the new vectors developed that were able to elicit specific antibodies in mice, demonstrating the potential of the YF 17D virus as a vector for the development of recombinant vaccine against AIDS based on the induction of humoral immune response / 2100-Fev-02

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-13T18:45:42Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-29T14:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T14:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é considerada uma doença infecciosa negligenciada que causa, anualmente cerca de 15.000 mortes na América Latina, causando impactos econômicos e redução da produtividade em países endêmicos. A expansão da infecção por Trypanosoma cruzi tem induzido avanços científicos na prevenção da doença por meio da vacinação. A principal resposta contra o parasito é celular de perfil Th1 com ativação de linfócitos T CD8+ e produção de citocinas como IFN-\03B3, TNF-\03B1. A construção de vírus recombinantes utilizando o vírus vacinal da febre amarela (VFA) 17DD como vetor para expressão da proteína ASP-2 de T. cruzi, constitui uma promissora abordagem para protótipos vacinais para Doença de Chagas, já estudada por nosso grupo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida por vírus recombinante expressando um fragmento de ASP-2 através da imunização de camundongos C57BL/6 e A/J. Visando melhorar a imunogenicidade, novas construções virais foram realizadas e testadas neste trabalho. Esses vírus recombinantes diferem entre si quanto à plataforma de expressão e quanto ao inserto. O primeiro, VFA Tc1, possui um fragmento maior da protéina ASP-2296-560 expresso na plataforma I, entre as proteínas E/NS1 do VFA 17DD. O segundo possui epítopos imunodominantes para linfócitos T CD8+, TEWETGQI ou VNHRFTLV, expressos entre as proteínas NS2B/NS3 do VFA Análises da expressão do inserto heterólogo nesses vírus indicaram a capacidade de expressar o fragmento inserido, então foi realizada uma predição de epítopos imunodominates restritos a MHC classe I. Epítopos foram selecionados e testados, através da técnica de ELISPOT, em esplenócitos de camundongos imunizados com os vírus recombinantes. A imunização promoveu aumento de células produtoras de IFN-\03B3 responsivas ao inserto de ASP-2. A resposta humoral também foi avaliada, para o vírus da Febre Amarela e para a ASP-2. A maioria dos camundongos obtiveram soroconversão para o vírus FA pela técnica de PRNT, mas não foram detectados anticorpos anti-ASP2 por ELISA, no entanto quando realizada imunofluorescência com os soros dos camundongos imunizados em ninhos de amastigotas, houve marcação, indicando que há anticorpos anti-ASP2 nesses soros. Ensaios de desafio sugerem indução de resposta protetora, indicando tendências de redução de pico parasitêmico assim como retardo na morte de camundongos imunizados / Abstract: Chagas disease is considered an infectious neglected tropical disease that causes, annually, around 15.000 deaths in Latin America, decreasing productivity and causing an economic impact in endemic countries. The expansion of Trypanosoma cruzi infection has led to scientific advances, as new therapies and vaccine candidates. It´s known that the main response against the parasite is Th1, leading to CD8+ T cell activation and cytokine production as IFN-\03B3 and TNF-\03B1. The construction of recombinant viruses using the Yellow Fever 17DD vaccine strain as a vector for T. cruzi ASP-2 protein expression is considered a promising approach for a novel Chagas disease vaccine, which our laboratory has been investigating. This study aim was to evaluate the immune response induced by recombinant viruses expressing an ASP-2 fragment, a protein well known to induce cellular and humoral responses in animal model, through C57BL/6 and A/J mice immunization. Aiming to improve the immunogenicity, new viral constructions were obtained and tested in this study. These recombinant viruses differ in the expression platform and the insert. One of the recombinant virus has the ASP-2296-560 fragment inserted between E/NS1, while the other one has immunodominant CD8+ T cell epitope TEWETGQI or VNHRFTLV, inserted between NS2B/NS3 proteins The heterologous protein expression was evaluate by different assays, and the results showed the recombinant viruses were capable of expressing ASP-2. Thereafter, a MHC class I epitope prediction was performed, and immunodominant epitopes were selected and tested by ELISPOT, using splenocytes from immunized mice. This assay showed that the immunization was able to increase the number of IFN-\03B3 producing cells. The humoral response was also evaluated for 17DD virus and ASP-2. Results from PRNT assay, showed that the majority of the mice, from both lineages, presented serum-conversion for YFV, but anti- ASP-2 antibodies were not detected by ELISA. However, immunofluorescence using cells infected with amastigotes and serum obtained from immunized mice, detected antibodies anti-ASP2. Challenge assays results suggested a protective response in immunized mice, indicating a possible reduction in the parasitemic peak as well a delay in mortality