Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo894_1.pdf: 10228754 bytes, checksum: eeb46b108153af421d159eebe9f86d6a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A vacinação com o vírus atenuado 17D/17DD é o principal método de prevenção da Febre Amarela. Apesar do sucesso desta vacina em todo o mundo, reações adversas, aumento da severidade dos sintomas e até casos fatais têm sido reportados, o que estimula o desenvolvimento de uma vacina de DNA codificando seqüências específicas do vírus da Febre Amarela (VFA). Entretanto antígenos codificados por vacinas de DNA são expressos intracelularmente e preferencialmente apresentados ao sistema imune através de moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I (MHCI). O aumento da eficiência destas vacinas é possível através da fusão de seus antígenos com a Proteína de Associação à Membrana Lisossomal humana (hLAMP-1), direcionando-os para o compartimento do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II (MHCII). A via do MHCII é responsável pela ativação de linfócitos T CD4+, importantes para sustentar a resposta celular de linfócitos T CD8+ e para o desenvolvimento de memória, mudança de classe de anticorpos e expansão clonal de linfócitos B antígeno-específicos. As quimeras antígeno/LAMP apresentam uma maior indução da resposta imune quando comparadas aos antígenos nãofusionados à LAMP. Neste trabalho, apresentamos a análise da expressão e localização intracelular das proteínas não-estruturais NS1 e NS3 do VFA, nas suas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP. Para tanto, as seqüências de DNA das proteínas NS1 e NS3 foram selecionadas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e otimizadas através do algoritmo genético do programa LETO 1.0 (Entelechon®), de acordo com parâmetros como codon usage, estrutura secundária do mRNA, distribuição do conteúdo GC, motivos repetitivos de DNA, sítios crípticos de splicing, dentre outros, com o intuito de aumentar a expressão antigênica. As seqüências de DNA otimizadas foram enviadas para síntese comercial (Geneart®) e clonadas em vetores de expressão eucarióticos, nas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP. As construções vacinais obtidas foram enão utilizadas na transfecção de células eucarióticas cujos extratos foram analisados quanto à expressão protéica através de ensaios de Western-blot e imunofluorescência, utilizando anticorpos policlonais específicos produzidos através da imunização de coelhos com proteínas NS1 e NS3 recombinantes. Nestes ensaios, todas as construções vacinais apresentaram expressão eficiente e distribuição intracelular adequada. Enquanto as proteínas nativas apresentaram a distribuição reticular característica, os antígenos fusionados à LAMP apresentaram uma distribuição lisossomal típica do LAMP endógeno. As respostas imunes geradas contra as construções vacinais de NS1 foram avaliadas em camundongos BALB/c. Ambas as construções, fusionada e não-fusionada à LAMP, foram capazes de induzir uma forte resposta celular contra os mesmos epítopos induzidos pela vacina convencional 17DD. A resposta gerada pela construção fusionada a LAMP, entretanto, apresentou a melhor performance. Os resultados obtidos neste trabalho serão integrados a dados previamente obtidos em nosso laboratório em estudos com proteínas estruturais para o desenvolvimento de vacinas de DNA capazes de neutralizar infecções pelo VFA

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / A efetividade das vacinas contra febre amarela tem sido aferida indiretamentepelo sucesso das ações de vacinação em muitos países. Em que pese o sucesso das ações de vacinação no controle da doença, há questões pendentes sobre a imunogenicidade e reatogenicidade das vacinas disponíveis que precisam ser avaliadas para definição de estratégias das ações básicas de imunização na infância. Em um estudo observacional com a vacina 17DD, foi demonstrada menor imunogenicidade vacinal em crianças, principalmente com a aplicação simultânea da vacina contra sarampo (Grupo Colaborativo,2003). No atual calendário básico de imunizações há a possibilidade da aplicação simultânea das vacinas contra febre amarela e da vacina tríplice viral. Um ensaio clínico multicêntrico, randomizado, duplo-cego, foi realizado para investigar a imunogenicidade ea reatogenicidade das vacinas contra febre amarela (17D213/77 e 17DD) em crianças (Collaborative Group for Studies with Yellow Fever Vaccine, 2007) e definir os possíveisdeterminantes. A relevância deste estudo está na capacidade de obter dados para responder questões relativas às estratégias do Programa Nacional de Imunizações necessárias para adefinição das políticas públicas para controle e prevenção da doenças. A proporção de soroconversão e soropositividade pós-vacinal contra febre amarela em crianças aos 9 e 12meses de idade foi menor do que a observada previamente em ensaio clínico em adultos. Não houve diferença na imunogenicidade ou reatogenicidade das subcepas de vacinas contra febre amarela testadas (17D e 17DD). / A situação sorológica das mães não foi um fator determinante de menor soroconversão em crianças menores de 12 meses de idade, porém a presença de anticorpos pré-vacinais contra febre amarela em crianças menores de12 meses está associada a menor soroconversão. A vacinação simultânea contra febre amarela e tríplice viral afeta substancialmente a resposta imunológica para rubéola e febreamarela, mas não a vacina contra sarampo, o que pode influenciar de forma relevante as estratégias para controle da febre amarela e rubéola. A presença de anticorpos contradengue, independentemente de seu título, não interfere na imunogenicidade ou no padrão de reatogenicidade das vacinas contra febre amarela aplicadas em crianças residentes emáreas endêmicas. A proporção estimada de soronegatividade após duas doses de vacina contra febre amarela em crianças menores de 2 anos de idade foi de apenas 1,25 por cento. A ocorrência de casos esporádicos e surtos não permite que a idade recomendada para aprimovacinação seja deslocada para idades em que a vacina mostrou maiorimunogenicidade. Uma alternativa seria alterar o esquema primário de vacinação contra febre amarela para duas doses: mantendo a primeira dose aos 9 meses e aplicando umasegunda dose após 12 meses de vida. A aplicação da segunda dose aos 18 meses de idade seria conveniente para não coincidir com outras vacinas do calendário de imunizações. Aprimeira dose aos 9 meses seria mantida para proteger indivíduos de zonas endêmicas, o mais cedo possível. A segunda dose permitiria (1) imunizar um número adicional de crianças que não tinham respondido à primovacinação (falha primária), (2) reforçar respostas à primovacinação, e (3) ampliar as oportunidades de vacinar aqueles que não haviam recebido a primovacinação aos 9 meses.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:36:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 596.pdf: 2289551 bytes, checksum: 601c0a58cbb27cdb76a064d33a901a23 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A permanência do ciclo silvestre da febre amarela no território brasileiro tem estimulado estudos sobre sua complexa epidemiologia. No Brasil, esta doença tem um caráter endêmico e permanente nas regiões Norte e Centro Oeste, porém nos últimos cinco anos tem se manifestado de forma epidêmica fora da Amazônia Legal. Este trabalho tem como objetivo verificar a ocorrência e as características da febre amarela nas regiões fora dos limites da Amazônia Legal e compará-las com algumas características dos casos procedentes desta região no período de 1999 a 2003, analisando a reemergência de um padrão epizoótico-epidêmico. O referencial teórico aborda aspectos históricos, o ciclo básico da febre amarela silvestre, a espacialização de doenças, a teoria de foco natural de doenças e o processo infeccioso. Dois bancos de dados foram analisados, um relativo aos casos humanos e outro às mortes de primatas não humanos, ambos construídos na Gerência Técnica de Febre Amarela a partir de notificações oriundas das Secretarias Estaduais de Saúde. Foram confirmados 281 casos de febre amarela silvestre no período, sendo 176 (62,6%) fora da Amazônia Legal. Foram registradas mortes de primatas não humanos em 176 localidades de 100 municípios em cinco estados situados fora da Amazônia Legal. Observou-se que o processo epizoótico em primatas que, em geral, permite o aparecimento de casos humanos de febre amarela, encontra-se difundido atualmente para além da Amazônia Legal. A distribuição espacial desses eventos permitiu identificar sua ocorrência em áreas antropizadas dos diferentes biomas e bacias hidrográficas, predominando em locais com vegetação do tipo savana. São discutidas também as perspectivas de utilização das informações espaço-temporais de marcadores de epizootias no aperfeiçoamento da vigilância e controle de ações prospectivas.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2011. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-04-19T14:32:18Z No. of bitstreams: 1 2011_HelenaBarrosoBernal.pdf: 907376 bytes, checksum: f450bd3e860b09ea496e8692bc749556 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2012-04-20T10:45:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_HelenaBarrosoBernal.pdf: 907376 bytes, checksum: f450bd3e860b09ea496e8692bc749556 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-20T10:45:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_HelenaBarrosoBernal.pdf: 907376 bytes, checksum: f450bd3e860b09ea496e8692bc749556 (MD5) / Intodução: A resposta imune protetora à vacina contra febre amarela (VFA) em pessoas vivendo com HIV/AIDS (PVHA) ainda hoje permanece pouco estudada. A associação entre a resposta imune e o nível de linfócitos T-CD4+ (LT-CD4+) e carga viral para o HIV é descrita na literatura. A região central do Brasil é uma área crítica para febre amarela, assim é fundamental que estratégias de imunização contemplem PVHA nesta localidade. Objetivo: Avaliar a resposta imune protetora à VFA em PVHA e verificar a existência de associação entre essa resposta e a contagem de LT-CD4+ e o nível de carga viral plasmática de HIV em PVHA, além de outros possíveis fatores preditivos da resposta à vacina. Metodologia: Estudo transversal realizado em Brasília de 2009 a 2010. Critérios de inclusão: PVHA vacinadas contra febre amarela há mais de 30 dias, sem relato de infecção prévia pelo vírus amarílico. O nível de anticorpos neutralizantes contra febre amarela foi mensurado por meio do teste de neutralização em placas redutoras (PNRT), avaliando-o concomitantemente à contagem de LT-CD4+ e à carga viral. Estudou-se a associação e a correlação entre a resposta à vacina e às demais variáveis. Adotou-se para todos os testes estatísticos um nível de significância de p<0,05. Resultados: Coletaram exames laboratoriais de 58 PVHA. A idade média foi 41 anos, 55% do sexo masculino, 78% apresentavam-se com HIV/aids na categoria clínica A de classificação do CDC (Centro de Controle e Prevenção de Doenças) e 93% estavam em uso de terapia antirretoviral combinada (TARV), média do nadir de LT-CD4+ foi 214 cel/mm3, a média de tempo da última dose da vacina contra febre amarela foi 2 anos, 45% dos investigados já haviam recebido mais de uma dose e 3% dos pacientes descreveram eventos adversos leves relacionados à vacina. Apenas 53 pacientes (91%) apresentavam níveis protetores de anticorpos neutralizantes. Não se observou associação entre a contagem de LT-CD4+ e a resposta à vacina, todavia demonstrou-se uma correlação positiva fraca entre estas variáveis (r: 0,27; p = 0,03). Identificou-se indícios de associação negativa entre o nível de carga viral e a resposta a vacina (p: 0,05) e foi observada uma correlação negativa moderada entre estas variáveis (r:-0,41, p < 0,01). Observou-se uma tendência no grupo com níveis protetores de apresentarem-se mais na categoria A (CDC), possuirem menos infecções oportunistas no passado e terem um menor de tempo transcorrido desde a última dose da vacina, porém estas diferenças não foram estatisticamente significativas (p>0,05).Conclusão: PVHA responderam pior à vacina contra febre amarela no que se refere à proteção imune, comparando-se a indivíduos não infectados pelo HIV, todavia a vacina mostrou-se segura. Não foi possível identificar associação entre a reposta à vacina e a contagem de LT-CD4+, apesar de existir uma correlação positiva entre estas variáveis. Há indícios de associação entre o nível de carga viral e a resposta à vacina, e uma correlação negativa entre estas variáveis. Não foram identificados outros possíveis fatores preditivos da resposta à vacina. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: The protective immune response to yellow fever vaccine (YFV) in people living with HIV/aids (PLWHA) still remains little studied. The association between immune response and the level of CD4+ T lymphocytes and viral load of HIV is described in the literature. The central region of Brazil is a high incidence area for yellow fever, so it is important that immunization strategies include PLWHA living in this region. Objective: To evaluate the protective immune response to YFV in PLWHA and check the association between the immune response against yellow fever and the LT CD4+ count and plasma viral load of HIV in PLWHA, and other possible predictors of response to the vaccine. Methodology: Cross-sectional study in Brasilia from 2009 to 2010. Inclusion criteria: PLWHA vaccinated against yellow fever after more than 30 days, with no history of prior infection for yellow fever virus. The level of neutralizing antibodies against yellow fever was measured by plaque reduction neutralization test (PNRT), evaluated concurrently with LT-CD4+ count and viral load. The association and correlation between vaccine responses and other variables were studied. For all statistical tests a significance level of p<0.05 was adopted. Results: Fifty-eight PLWHA collected laboratory tests. The mean age was 41 years, 55% male, 78% infected by HIV were at the stage A according to CDC and 93% were in HAART, mean nadir CD4 + LT was 210 cell/mm3, the average time of the last dose of vaccine against yellow fever was 3 years, 45% of those investigated has received more than one dose and 3% of patients reported mild adverse events related to the vaccine. Only 53 patients (91%) had protective levels of neutralizing antibodies. No association was found between LT-CD4+ count and response to the vaccine, however, a positive correlation between these variables was demonstrated (r: 0.27, p= 0.03). Evidence of association between viral load and response to vaccine (p=0.05) and a moderate negative correlation between these variables (r: -0.41, p <0.01) were observed. Although statistical significance could not be achieved, a few trends could be observed in the group of responders: stage A (CDC criteria); low prevalence of opportunistic infections history and shorter time elapsed since the last dose of vaccine. Conclusion: PLWHA presents a worse response to YFV compared to individuals not infected with HIV. However the vaccine was safe. Association between the response to the vaccine and the LT-CD4+ count was not identified, although there is a positive correlation between these variables. There is evidence of association between viral load and response to the vaccine, and a negative correlation between these variables. Other possible predictors of response to the vaccine were not found.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-14T13:46:12Z No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-14T14:38:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T14:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Febre amarela é uma doença infecciosa, endêmica nas florestas tropicais da África, Américas Central e do Sul. O agente etiológico da febre amarela é o vírus da febre amarela pertencente ao gênero Flavivirus, e espécie-tipo da família Flaviviridae. O genoma contêm 10.233 pares de bases (bp) , que codifica as proteínas estruturais (Capsídeo – C, Membrana – Pré M/M, Envelope – E) e não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). NS1 é um gene essencial requerido para replicação eficiente do RNA viral. O diagnóstico mais utilizado para febre amarela é o teste MAC-ELISA para a detecção de IgM (pesquisa de anticorpos recentes). As reações cruzadas entre o vírus amaralíco e outros flavivirus são fatores que dificultam o diagnóstico sorológico, principalmente em áreas endêmicas de múltiplos flavivirus. Desta forma, nesse trabalho, a proteína NS1 do vírus da febre amarela foi expressa em sistemas procariótico (Escherichia coli) e eucariótico (células de inseto) com o objetivo de utilizá-la no diagnóstico precoce de infecção pelo vírus da febre amarela. Para expressão da proteína NS1 de YFV em sistema procariótico, foi utilizado o sistema de recombinação sítio específica Gateway® (Invitrogen). A proteína recombinante expressa em E. coli foi purificada e inoculada em camundongos para produção do anti-soro policlonal anti-NS1. Para expressão da proteína NS1 em sistema eucariótico, foi utilizada a técnica de transposição sítio específica Bac-to-Bac® (Invitrogen). O gene NS1 foi fusionado ao gene da poliedrina do baculovírus AcMNPV e introduzido no genoma viral. O vírus recombinante foi usado para infectar células de inseto e a proteína recombinante foi detectada por Western blot. Ambos os sistemas de expressão foram utilizados com sucesso e as proteínas recombinantes serão testadas como antígenos para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico de infecção pelo vírus da febre amarela. Palavras chaves: NS1; Baculovírus; Febre Amarela; Poliedrina; AcMNPV. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Yellow Fever is an infectious disease, endemic in African, Central and South American tropical forests. The etiologic agent of the yellow fever is the Yellow Fever Virus belonging to the genus Flavivirus, and the type-species of the family Flaviviridae. The genome has 10.233 base pairs (bp), which encodes structural (Capsid – C, Membrane – Pre M/M, Envelope – E) and non-structural (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) proteins. NS1 is an essential gene required for an efficient RNA viral replication. The most used diagnosis test to confirm yellow fever is the MAC-ELISA for the detection of IgM (survey about recent antibodies). The cross-reactivities between the amarilic virus and other flaviviruses are factors that hinder the serological diagnosis, especially in endemic areas with multiple flaviviruses. Hence, in this work, the NS1 protein of the yellow fever virus was expressed in prokaryotic (Escherichia coli) as well as in eucariotic systems (insect cells) with the aim of using this protein in the early diagnosis of yellow fever virus infection. For the expression of the YFV NS1 protein in a prokaryotic system it was used the site-specific recombinant system Gateway® (Invitrogen). The recombinant protein expressed in E. coli was purified and inoculated in mice for the production of polyclonal anti-serum anti-NS1. For the expression of the NS1 in a eukaryotic system, the Bac-to-Bac® (Invitrogen) site-specific transposition was used. The NS1 gene was fused to the polyhedrin gene of the baculovirus AcMNPV and introduced into the viral genome. The recombinant virus was used to infect insect cells and the recombinant protein detected by Western blot. Both expression systems were used with success and the recombinant proteins will be tested as antigens for the development of new diagnostic methods for yellow fever virus infection.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 2 e Anexos. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-26T16:10:44Z No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-08T19:10:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T19:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Os baculovírus são vírus de insetos amplamente utilizados no controle biológico de pragas agrícolas e também como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas. Os baixos custos, a segurança na manipulação e as diferentes formas de expressão de proteínas tornam os baculovírus e células de inseto uma escolha eficaz para a correta expressão de antígenos vacinais e produção de VLPs (“Virus like particles”). No capítulo 1 deste trabalho, foi avaliado o potencial imunogênico de BVs (“Budded virus”) recombinantes contendo o EDIII (Domínio III da proteína de envelope do vírus da Febre amarela – FA) fusionado à proteína GP64 dos baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV); e também de uma massa protéica gerada pela fusão de EDIII com a proteína poliedrina de AcMNPV. O EDIII interage com os receptores celulares e contém os epítopos reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes, sendo assim alvo para a produção de uma vacina de subunidade. Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da correta expressão das proteínas recombinantes (GP64 + EDIII e Poliedrina + EDIII) por Western blot, microscopia de luz e confocal. No caso do EDIII fusionado à GP64 de AcMNPV e AgMNPV, as partículas virais recombinantes foram purificadas e inoculadas em camundongos. O teste de proliferação de linfócitos indicou uma maior proliferação em camundongos inoculados com o vírus recombinante contendo o EDIII fusionado à proteína GP64 do baculovírus AgMNPV quando comparado com o controle LPS. Testes complementares serão feitos, para avaliar o perfil da resposta imunológica e confirmar a obtenção de um antígeno vacinal contra FA. No capítulo 2, o sistema baculovírus de expressão foi utilizado para expressar o precursor da proteína GAG (Pr55) de HIV-1. A expressão de Pr55 HIV-1 é suficiente para a montagem de VLPs na membrana plasmática da célula do hospedeiro. Porém, a proteína GP64 de baculovírus é altamente imunogênica e também é expressa na superfície de células infectadas e normalmente está presente na superfície da VLP. Neste trabalho, mostramos que não é possível separar BVs e VLPs produzidos em um mesmo ciclo de infecção por baculovírus mesmo usando diferentes metodologias de separação. Então, utilizando um sistema que consegue produzir baculovírus recombinantes livres de GP64, foi construído o vírus recombinante vGAGHIV-1 GP64 null e utilizado na infecção de células Sf9. Por Western blot foi observado a perda do sinal da proteína GP64 de baculovírus no extrato de células infectadas com esse vírus recombinante. Essas mesmas células foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), mostrando que mesmo quando GP64 não está presente (o que resulta na ausência de produção de BVs), o brotamento de VLPs continua a acontecer. Essa técnica mostrou-se eficiente para a produção de VLPs livres de partículas ou proteínas baculovirais. Este trabalho confirma a eficiência do uso do sistema de expressão baseado em baculovírus para a expressão de proteínas e VLPs de interesse famacológico. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are insect viruses widely used in the biological control of agricultural pests and as a tool for heterologous protein expression. Their low production costs, security in manipulation and the many ways of protein expression, make baculoviruses and insect cells an effective choice for the efficient expression of vaccine antigens and VLPs (Virus like particles) production. In chapter 1 of this work, it was evaluated the immunogenic potential of recombinant BVs (Budded virus) containing EDIII (Yellow fever virus -YF- envelope protein domain III) fused to the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) GP64 protein; and also of a protein mass generated by the fusion of the EDIII and AcMNPV polyhedrin protein. The EDIII interacts with cell receptors and contains epitopes recognized by neutralizing antibodies, being the target for the production of a subunit vaccine. We showed in this work the confirmation of the correct recombinant protein expression (GP64 + EDIII and Polyhedrin + EDIII) by Western blot, optical and confocal microscopy. In the case of the EDIII fused with AcMNPV and AgMNPV GP64, the recombinant viral particles were purified and inoculated in mice. The lymphocyte proliferation assay showed a higher proliferation in mice immunized with recombinant virus containing the EDIII fused with the GP64 from the AgMNPV baculovirus comparing to the LPS control. Complementary assays will be carried out in order to evaluate the immunological response pattern and to confirm the production of a vaccine antigen against YF. In chapter 2, the baculovirus expression system was used to express the GAG protein precursor (Pr55) of HIV-1. The Pr55 expression is sufficient to VLP assembly on the cell host plasma membrane. However, the GP64 baculovirus protein is highly immunogenic and is also expressed on the surface of infected cells and is also present on the surface of the VLP. In this work, we showed that is not possible to separate BVs and VLPs produced in the same baculovirus infection cycle using different separation methodologies. Then, using a system able to produce GP64 free recombinant baculovirus, the recombinant virus vGAGHIV-1 GP64 null was produced and used to infect Sf9 cells. By Western blot analyses, it was shown that the baculovirus protein GP64 signal was missing in the recombinant virus infected cell extract. These same cells were observed by transmission electron microscopy (MET), showing that even when the GP64 is absent (which results in the absence of BVs production), VLPs budding continues to happen. This technique was shown to be efficient for VLPs production, free of baculvirus particles or proteins. This work confirms the efficiency of the baculovirus expression system for protein expression and VLPs of pharmacological interest.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas, 2014. / Submitted by Estágio Supervisionado (gid@bce.unb.br) on 2015-01-08T11:40:14Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Ana Cristina 01.11.14 (FINAL EM PDF).pdf: 17966834 bytes, checksum: 9b92b35f1f17f5ea8199bedc65b46a00 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2015-01-12T12:00:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Ana Cristina 01.11.14 (FINAL EM PDF).pdf: 17966834 bytes, checksum: 9b92b35f1f17f5ea8199bedc65b46a00 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-12T12:00:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Ana Cristina 01.11.14 (FINAL EM PDF).pdf: 17966834 bytes, checksum: 9b92b35f1f17f5ea8199bedc65b46a00 (MD5) / Introdução: O Brasil possui a maior área endêmica de febre amarela (FA) do mundo. A doença é produzida por vírus de RNA transmitido pela picada de insetos hematófagos culicídeos. Trata-se de doença com significativa morbidade e letalidade e os casos suspeitos devem ser notificados em 24 horas às autoridades sanitárias, tamanha é seu potencial endêmico. O quadro clínico varia de formas assintomáticas até a chamada forma hemorrágica, com letalidade em torno de 50%. Não há tratamento específico e a vacina é forma mais eficaz e segura de prevenção. Esta é constituída a partir de vírus vivo atenuado. No entanto, uma forma rara de febre amarela provocada pelo vírus vacinal tem sido descrita e está provavelmente relacionada a características do hospedeiro, como o seu status imunológico. Por isso, a vacina 17D é contraindicada em pacientes com doenças reumáticas em uso de medicamentos imunomoduladores ou imunossupressores. Não se conhece a resposta imune à vacinação nesse grupo. Não há estudos nessa população que avaliem a resposta humoral pelo padrão ouro, que é a produção de anticorpos neutralizantes. Objetivos: Avaliar a resposta imune protetora, por meio de anticorpos neutralizantes e eventos adversos em pacientes com doenças reumáticas, em uso de imunomoduladores ou imunossupressores, que foram inadvertidamente revacinados contra a FA. Casuística e Métodos: Realizado estudo descritivo, do tipo série de casos de pacientes portadores de doenças reumáticas autoimunes, em uso de medicamentos imunomoduladores ou imunossupressores, inadvertidamente revacinados contra a FA, para avaliação da presença de anticorpos neutralizantes em níveis protetores e ocorrência de eventos adversos. Os pacientes foram selecionados nos ambulatórios de hospital terciário e clínicas particulares de região endêmica. Foram registrados dados como idade, data da vacinação, diagnóstico, medicações e eventos adversos possivelmente relacionados à vacinação. A análise de anticorpos neutralizantes foi ! feita pelo método padrão ouro, o PRNT (Teste de Neutralização por Redução de Placas). Valores acima de 794 mUI/mL (1:50) foram considerados positivos. Resultados: Selecionados 31 pacientes, todas do sexo feminino, com doenças reumáticas, 20 (64,5%) deles no serviço público e 11 (35,5%) em clínicas particulares. Diagnósticos: artrite reumatoide (23), lúpus eritematoso sistêmico (5), esclerose sistêmica (2) e espondilite anquilosante (1). A média de idade na revacinação foi 46,77 (DP =12,72) anos. O intervalo médio entre a imunização e a coleta foi de 39,61 (DP= 8,51) meses. Os títulos de anticorpos neutralizantes variaram de 221 a maior que 15.680 (mediana de 2159 mUI/mL). Quatro apresentaram eventos adversos leves, 24 negaram e 3 não se recordaram. A média geométrica de anticorpos neutralizantes naqueles que apresentaram eventos adversos foi de 2082,25 (Mediana= 2.229) e de 3395,02 (Mediana= 2145,50) mUI/ml nos assintomáticos, não sendo demonstrada correlação entre os resultados e a ocorrência de eventos adversos para a amostra estudada. (Pearson = -0,19) Conclusões: Os eventos adversos e títulos protetores foram semelhantes ao esperado para a população em geral, não sendo demonstrada correlação entre os anticorpos neutralizantes e ocorrência de eventos adversos. Este é o primeiro estudo que avalia a resposta imune protetora à vacina antiamarílica em pacientes com doenças reumáticas autoimunes, em uso de medicamentos imunomoduladores ou imunossupressores. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Brazil has the largest endemic area for yellow fever (YF) in the world. RNA virus transmitted by hematophagous insects of Culicidae family causes the disease. YF has significant morbidity and lethality. Thee suspected cases should be reported in 24 hours to health authorities, such is its gravity. The clinical picture varies from asymptomatic forms until the so-called hemorrhagic form, with lethality in 50 percent. There is no specific treatment and vaccine is the safest and the most effective form of prevention. This is made from live attenuated virus. However, a rare form of yellow fever caused by the vaccine virus has been described and is related to characteristics of the host, such as the immune status. Thus, the 17D vaccine is contraindicated for patients with rheumatic disease who are using immunosuppressants. There are no studies on this population to assess the humoral response by the gold standard. Therefore, no previous studies have assessed the humoral response and adverse reactions in this group. Objectives: To assess the protective immune response, based on neutralizing antibody (NAb) titers and adverse events (AEs), in patients with rheumatic disease who were using immunomodulators or immunosuppressants and inadvertently revaccinated against YF. Methods: We conducted a descriptive study of a number of cases of rheumatic disease to assess the protective levels of NAb and the occurrence of ARs. Epidemiological, medication, and AR data were recorded. The NAb analysis was conducted by using the plaque reduction neutralization test method, with a titer greater than 794 mIU/mL (1:50). Results: Thirty-one patients were selected, 23 with rheumatoid arthritis, 5 with lupus, 2 with systemic sclerosis, and 1 with ankylosing spondylitis. The mean (SD) age at revaccination was 46.77 (12.72) years. The mean (SD) interval between the immunization and sample collection was 39.61 (8.51) months. The NAb titer varied between 221 mIU/mL and 15,680 (median, 2,159 mIU/mL). Four patients presented with mild ARs. The geometric mean (SD) NAb titers were 2,082.25 (Median= 2,229) ! and 3,395.02 (Median= 2,145.50) mIU/mL in the patients with ARs and in asymptomatic patients, respectively. No correlation was found between the results and the occurrence of adverse events in all the study groups (Pearson, −0.19). Findings: The AEs and protective titers were similar to those expected for the overall population, and no correlation was found between the NAb titers and the occurrence of AE. This is the first study to assess the protective immune response to the yellow fever vaccine in patients with rheumatic disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:23:41Z No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:24:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T23:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / O vírus causador da febre amarela (YFV) é um membro da família Flaviviridae e importante arbovírus patogênico ao homem. O diagnóstico da febre amarela é importante tanto para medidas de saúde pública como também para o tratamento adequado dos pacientes, já que os sintomas iniciais são típicos de outras doenças virais infecciosas. A glicoproteína do envelope (E) desse vírus é a maior determinante da imunogenicidade viral e da resposta imunológica do hospedeiro. Neste trabalho, a proteína do envelope do vírus da febre amarela foi expressa fusionada com a proteína poliedrina (POLH) dos corpos de oclusão do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em células de inseto pela infecção com um baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinante. Primeiramente, foi construído um vetor baculoviral modificado para expressão de proteínas heterólogas fusionadas à POLH, o pFastAgPol. O fragmento de DNA contendo o gene da poliedrina (polh) do AgMNPV foi amplificado e, em seguida, transferido para o plasmídeo comercial pFASTBac1¿ (Invitrogen). Utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), o AcMNPV recombinante contendo o gene polh de AgMNPV foi construído (vAcPolAg). Células de inseto foram infectadas pelo vAcPolAg, e a expressão da proteína recombinante analisada por microscopia de luz, SDS-PAGE e Western blot. A proteína foi detectada por Western-blot, mas não houve a formação de corpos de oclusão. Um fragmento de DNA contendo o gene do envelope do YFV foi clonado no vetor de transferência pFastAgPol, em fase com o gene polh, para ser expresso como uma proteína de fusão e inserido no genoma do AcMNPV. Células de inseto também foram infectadas com o AcMNPV recombinante (vAcPolAgEnv) e a expressão da proteína recombinante foi analisada por SDS-PAGE e Western blot, que detectou um polipeptídeo de aproximadamente 88 kDa, correspondente à fusão da proteína E do vírus amarílico com a POLH de AgMNPV. Entretanto, também não ocorreu a formação de corpos de oclusão. As células infectadas com os dois recombinantes também foram analisadas por microscopia de luz, de transmissão e pelo microscópio confocal. A não formação de corpos de oclusão pode ter sido causada, no caso do vAcPolAg, pela substituição do sítio de terminação do gene polh por um sítio de clonagem para a fusão do gene E, o que resultou na introdução de 41 amino ácidos no C-terminal da POLH. No caso do vírus contendo a proteína de fusão, POLHENV, a própria fusão pode ter resultado na formação de uma proteína incapaz de formar corpos de oclusão pelas mudanças conformacionais. A construção dos vírus recombinantes, vAcPolAg e vAcPolAgEnv, e a expressão das proteínas fusionadas foram bem sucedidas demostrando o potencial do sistema baculoviral para o desenvolvimento de técnicas alternativas de diagnóstico e produção de vacinas utilizando partes virais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The yellow fever virus (YFV), a member of the family Flaviviridae, is an important arbovirus pathogenic to humans. The yellow fever diagnosis its important not only to public health measures but also to patients proper treatment, once the initial symptoms are similar to others viral infectious diseases. The envelope glycoprotein (E) of this virus is the major imunogenicity and host immune response determinant. In this work, the yellow fever virus envelope protein was expresse fused to the protein polyhedrin (POLH) of the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) occluded bodies in insect cells by the infection of a baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinant. First, was constructed a modified baculoviral vector (pFastAgPol) for heterologous protein expression fused to POLH. The DNA fragment containing the AgMNPV polyhedrin gene (polh) was amplified and then transferred to a commercial plasmid pFASTBac1™ (Invitrogen).Using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), the AcMNPV recombinant containg the AgMNPV polh gene was constructed (vAcPolAg). Insect cells were infected with vAcPolAg and the protein expressed was analyzed by light microscopy, SDS-PAGE and Western blot. The protein was detected by Western-blot but was not capable of forming occlued bodies. A DNA fragment containing the envelope gene of YFV was cloned into the transfer vector pFastAgPol, in frame with the polh gene, in order to be expressed as a protein fusion, and inserted into the AcMNPV genome. Insect cells were also infected with the AcMNPV recombinant (vAcPolAgEnv) and recombinant protein expression was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot which detected a polypeptide around 88kDa, corresponding to the fusion of the yellow fever virus protein E with the AgMNPV POLH. However, threre were no formation of occlusion bodies either. Infected cells with the two recombinants also were analyzed by light, electron and confocal microscopy. The lack of occlusion body formation, in the case of vAcPolAg, could have been due to the substitution of the stop codon of the polh gene by a restriction site for the fusion with the E gene which resulted in the introduction of 41 amino acids to the C-terminal end of POLH. In the case of virus containing the fusion protein POLHF, the fusion itself could be responsible for the formation of a protein uncapable of forming occlusion bodies due to conformational changes. The construction of recombinant viruses, vAcPolAg vAcPolAgEnv, and expression of fused proteins were successful, demonstrating the potential of the baculoviral system for the development of alternative techniques of diagnosis and production of viral vaccines using parts of it.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-08T10:40:45Z No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-08T10:40:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Neste trabalho, o perfil fenotípico e de síntese de citocinas pró-inflamatórias (IFN-, TNF- e IL-12) e reguladoras (IL-4, IL-5 e IL-10) em células da imunidade inata (neutrófilos, monócitos e células NK) e adaptativa (linfócitos CD4+, linfócitos CD8+ e linfócitos CD19+) do sangue periférico de indivíduos primo e/ou revacinados com a vacina antiamarílica 17DD, bem como um caso de reação adversa à vacinação foram investigados por citometria de fluxo após cultura rápida in vitro na ausência e presença da estimulação antígeno-específica. Foram avaliados 10 adultos saudáveis, com idade entre 21 e 51 anos, em 4 tempos distintos: antes da vacinação, 7, 15 e 30 dias após primovacinação. Após cultura in vitro foi observado um perfil global de citocinas pró-inflamatórias, transiente no 7° dia, principalmente devido às células da imunidade inata, seguido por perfil misto de citocinas inflamatórias e reguladoras nos 15° e 30° dias após a vacinação antiamarílica 17DD. Em um 2º estudo, foi observada uma resposta imune adaptativa robusta, acompanhada por anormalidades na resposta do sistema imune inato em um caso de evento adverso grave, seguido à vacinação 17D. Em adição, em um 3º estudo, foram incluídas 60 crianças com idade entre 9 e 47 meses, um ano após a primo e/ou revacinação antiamarílica 17DD, classificadas de acordo com os níveis de anticorpos neutralizantes antiamarílicos apresentados após a vacinação em: respondedoras (médios ou altos títulos de anticorpos neutralizantes), não respondedoras, respondedoras após revacinação e um grupo de crianças não vacinadas. Os dados da avaliação do impacto dos antígenos vacinais 17DD no perfil das citocinas dos leucócitos periféricos destas crianças demonstraram que, na presença de títulos médios de anticorpos neutralizantes após a primovacinação, o estímulo por antígenos vacinais 17DD in vitro foi capaz de induzir um perfil balanceado de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo células da imunidade inata e adaptativa, enquanto que uma assinatura polarizada reguladora foi observada no grupo de crianças primovacinadas não respondedoras e uma assinatura proeminente pró-inflamatória no grupo de crianças que apresentaram títulos altos de anticorpos neutralizantes após a primovacinação. Em conjunto os dados sugerem que uma resposta imune predominantemente do tipo balanceada, com síntese de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo tanto células da imunidade inata quanto da imunidade adaptativa parece ser essencial para a indução de uma resposta imune efetiva e segura após a vacinação antiamarílica. / In this study, phenotypic analysis and intracytoplasmic pro-inflammatory (IFN-, TNF- and IL-12) and regulatory (IL-4, IL-5 and IL-10) cytokines synthesis by innate (neutrophils, monocytes and NK cells) and adaptive (CD4+ and CD8+ T subsets, and CD19+) immunity cells of peripheral leucocytes of 17DD yellow fever (YF) prime or revaccinated volunteers, as well as a case of serious adverse events (YF-SAE) temporally associated with 17D YF vaccination were performed using short-term cultures, in absence or presence of YF-17DD-antigens, and single-cell flow cytometry. Ten healthy non-vaccinated volunteers, aged 21 to 51 years were evaluated at four consecutive periods including: before vaccination, 7, 15 and 30 days after vaccination. After whole blood cells culture, the overall cytokine signature showed a transient pro-inflammatory profile at day 7, mainly due to the innate immunity cells, which draws back toward a mixed or modulated pattern at day 15 and day 30 in most vaccines. In another study a robust adaptive response and abnormalities in the innate immune system were observed in one severe adverse event following primary YF-17D vaccination. In addition it was evaluated sixty healthy children with age raging from 9 to 47 months, one year after 17DD yellow fever prime or revaccination, classified according to anti-YF neutralizing antibodies results after vaccination as seroconverters (medium or high neutralizing antibodies levels), non-seroconverters, seroconverters after revaccination, and a unvaccinated group. The impact of YF-17DD-antigens recall on cytokine profiles of YF-17DD primo-vaccinated children characterized by single-cell flow cytometry after short-term cultures of whole blood samples demonstrate that the overall signature of high cytokine producers triggered by YF-Ag recall is associated with the levels of anti-YF neutralizing antibodies, with a balanced pro-inflammatory and regulatory profile of innate and adaptive immunity being the hallmark of seroconverters who presented medium neutralizing antibodies levels, whereas a polarized regulatory signature is observed in non-seroconverters and a prominent pro-inflammatory signature is characteristic of seroconverters who presented high neutralizing antibodies levels. Taken together, the results suggest that mixed type immune response, pro and anti-inflammatory, involving both innate immunity cells and adaptive immunity cells, it may play a pivotal role in the establishment of effective and safe immunization by yellow fever vaccine

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:15:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 543.pdf: 8925228 bytes, checksum: 925b64580b1332e511b1fd095206354d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A Febre Amarela (FA) constitui um grave problema de saúde pública mundial, principalmente nos países tropicais (embora este cenário venha sendo modificado pois o clima continua sendo afetado pelo aquecimento global). Apesar da eficiência comprovada da vacina convencional atenuada (17DD), existem registros de casos adversos graves pós-vacinação, incluindo o registro de óbitos. Adicionalmente a vacina 17DD não é recomendada para infantes, mulheres grávidas, pessoas com imunodeficiência e aquelas que apresentam alguma alergia aos componentes do ovo. Considerando todos estes fatores, faz-se necessário o desenvolvimento de estratégias de vacinação ainda mais seguras contra a FA, como por exemplo vacinas de DNA. As vacinas genéticas podem ser mais facilmente manipuladas e dosadas, não necessitam de baixas temperaturas para o acondicionamento/distribuição e não são capazes desencadear efeitos adversos graves por não se tratarem de agentes infecciosos. Neste trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento e avaliação da expressão de antígenos codificados por vacinas de DNA contra o Vírus da Febre Amarela (VFA). O genoma do VFA codifica três genes para proteínas estruturais (Capsídeo, Membrana e Envelope - E) e sete genes que codificam proteínas não-estruturais. Considerando que a proteína E é reconhecida como a principal proteína da superfície viral, e principal alvo para a indução da produção de anticorpos neutralizantes, nossas formulações vacinais foram baseadas neste antígeno. O antígeno vacinal foi otimizado para a expressão em células eucarióticas e subclonado em um vetor eucariótico de expressão, gerando a construção p/YFEOPT . Uma segunda construção foi ainda obtida, pL/YFEOPT, que codifica o antígeno vacinal fusionado à região C-terminal da Proteína de Associação à Membrana Lisossomal humana - hLAMP (visando desviar a apresentação antigênica para a via do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II - MHCII). Estas construções foram utilizadas para transfectar células eucarióticas e a expressão, dos antígenos codificados, foi avaliada através de ensaios de imunofluorescência e western-blot. A próxima etapa deste trabalho será a avaliação do efeito de proteção da vacina de DNA pL/YFEOPT em modelos primatas não-humanos. De acordo com os resultados obtidos, pretendemos avançar para ensaios clínicos em humanos