O presente trabalho teve como objetivo geral descrever e analisar os processos de luto e perdas progressivas, vividos por uma pessoa idosa com Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), consciente destas perdas. Foi realizada uma pesquisa qualitativa, sob o enfoque fenomenológico, a partir de um estudo de caso. Como dados de análise, foram utilizados os relatos de sessões de psicoterapia domiciliar, com o consentimento livre e esclarecido da participante. Por meio desse material, foram selecionados os relatos em que se observavam a temática perda em decorrência da doença. Esses relatos compuseram quatro unidades de significado: Os Movimentos, A Fala, A Segurança e A Independência, caracterizadas pelas perdas mais significativas vividas pela participante durante o processo evolutivo da doença. As duas primeiras unidades estão relacionadas diretamente à doença, uma vez que figuram como características da ELA. As perdas da segurança e da independência estão presentes na maioria das situações de adoecimento. Sobre a vivência descrita nesse trabalho, destacam-se o vínculo familiar, o cuidador principal, a religião e o atendimento domiciliar como fatores que contribuem para o alívio do sofrimento da pessoa com ELA. Com relação à atuação do psicólogo, destacam-se, entre outras ações, a busca de recursos alternativos ao paciente diante das sucessivas perdas, considerando suas idiossincracias e necessidades específicas. A aproximação e o vínculo afetivo entre o profissional e o paciente, bem como o respeito aos seus valores e a sua história de vida são fatores fundamentais para a obtenção desses recursos. Além disso, o psicólogo deve oferecer ajuda e amparo aos familiares que também podem adoecer, necessitando de carinho e atenção profissional. Além da psicoterapia pessoal, para que essa experiência de atendimento tenha resultados positivos e satisfatórios para o estudante, para o profissional e, principalmente, para o paciente e seus familiares, são fundamentais os estudos sobre a morte e o morrer, as supervisões dos casos atendidos, o compartilhamento das vivências / The general objective from this work is to describe and analyze the mourning and progressive losses processes experienced by an elder person with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), provided that such person was aware of these losses. Starting from a case study, a qualitative research has been conducted focused on phenomenological aspects. Data from home psychotherapy sessions reports were used, and the participant has consented this usage in a free and informed way. Through this material, a selection process has separated the reports in which the loss theme has been mentioned as a consequence of the disease. These reports have formed four meaning units: Movements, Speech, Safety and Independence, characterized by the most significant losses experienced by the participant during the diseases evolutionary process. The first two units are directly related to the disease, as they are listed as ALS characteristics. Safety and independence issues are experienced by most of the people affected by the disease. Regarding the experience described in this work, its possible to list the family support, the main caretaker, the religion and the home attention as the main factors which may help the person to ease the sufferings caused by ALS. Regarding the psychologist aid, the most important aspect is to seek alternative resources for the patient to help him/her to deal with successive losses, considering the specific idiosyncrasies and needs. The approximation and the emotional connection between the professional and the patient, as well as the respect to the patients values and life story, are vital factors to obtain these resources. Besides, the psychologist shall offer help and support to the family members who are also subject to getting sick. They may also need professional care. Besides the personal psychotherapy, for this attention experience to be successful regarding the student, the professional and specially the patients and their families, the following aspects are vital: studies about death and losses, the supervisions on specific cases, the sharing of experiences and the knowledge about the physical and emotional aspects connected to the disease.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva e incurável, caracterizada pela perda seletiva dos neurônios motores (NM) superiores e inferiores com uma sobrevida média de 3 anos. As manifestações clínicas dependem da topografia e comprometimento dos NM. De causa desconhecida, descrições apontam para a participação das células gliais (astrócitos, microglia e célula de Schwann) na toxicidade neuronal. A retração precoce do axônio no músculo esquelético sugere a participação da célula de Schwann na morte neuronal retrógrada (dying back). Este estudo descreveu as alterações na expressão gênica no nervo motor extensor curto do hálux ainda funcionante dos pacientes ELA e o ramo motor do nervo acessório de sujeitos-controle (19 ELA, sendo 9 ELA espinhal e 5 ELA bulbar; 5 controles), utilizando-se plataformas expandidas de microarranjos de DNA (microarray) e análises de bioinformática (DAVID e os seus bancos de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes e o Gene Onthology Consorciun Anottation). Os resultados foram validados por PCRq e Redes de Interação de Proteínas foram geradas pelo Cytoscape. Foram encontrados 138 genes diferencialmente expressos entre esses grupos. O ribossomo e a síntese proteica foram apontados como elementos centrais no estudo em eventos relacionados tanto à neurotoxicidade quanto a protetivos. As Redes destacaram o gene EPS8 na ELA (ambas as formas, ELA bulbar e espinhal) em relação aos controles e o gene FAU na ELA bulbar em relação à ELA espinhal. Os genes e as vias apontados neste estudo deverão ser testados como alvos terapêuticos em estudos futuros envolvendo a ELA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an incurable progressive neurodegenerative disease characterized by the selective loss of upper and lower motor neurons (MN), with a median survival of 3 years. Clinical manifestations depend on onset site and involvement of the MN. Although the cause of ALS is unknown, reports point towards the participation of glial cells (astrocytes, microglia and Schwann cells) in the neuronal toxicity. The early retraction of the axonium indicates a participation of the Schwann cells in retrograde neuronal death (dying back). The current study described the abnormalities in the genic expression of the functioning extensor hallucis brevis motor neuron from ALS subjects, and the motor branch of the accessory nerve from control subjects (19 ALS, being 9 spinal and 5 bulbar types; 5 controls), through an expanded platform of DNA microarrays and bioinformatics analyses (DAVID, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, and Gene Onthology Consortium Annotation databases). The results were validated by Quantitative PCR (PCRq) and Protein-Protein interaction network generated by Cytoscape. A total of 138 differentially expressed genes were found in these groups. In this study, the ribosome and protein synthesis were pointed as central elements related both to neurotoxicity and protective events. These networks highlighted the EPS8 gene in ALS (in both types, bulbar and spinal) when correlated to controls, and the FAU gene in bulbar ALS in relation to spinal ALS. The genes and pathways identified in this study should be tested as therapeutic targets in future studies approaching ALS

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva de evolução rápida, caracterizada pela perda seletiva dos neurônios motores (NM) superiores e inferiores. Recentemente, as células gliais centrais (astrócito, microglia e oligodendrócito) mostraram-se tóxicas aos NM, porém os detalhes moleculares não estão completamente elucidados. Em relação às células gliais periféricas, alterações eletrofisiológicas no nervo ciático do modelo animal da ELA na idade pré-sintomática foram reportadas pelo nosso grupo e os achados de denervação precoce tanto no modelo animal quanto em pacientes sugerem a participação das células de Schwann (CS) na morte neuronal retrógrada na ELA, teoria conhecida como dying back. Nesse contexto, as CS mostraram-se capazes de induzir a retração axonal e a denervação das junções neuromusculares, eventos precoces na doença, ocorrendo possivelmente na fase présintomática. O objetivo deste trabalho foi verificar a influência das CS do modelo experimental na fase pré-sintomática e do paciente com evolução recente da forma esporádica da ELA, na sobrevida e no tamanho dos prolongamentos dos NM in vitro e entender a natureza molecular do fenômeno. Culturas de CS altamente purificadas foram obtidas a partir do nervo ciático do camundongo modelo animal e do nervo periférico de pacientes com ELA. Os NM da medula espinal de camundongos neonatos foram co-cultivados com as CS. A neurodegeneração foi avaliada pela presença do marcador Fluoro-Jade C (FJC). Os NM também foram tratados com o meio condicionado das culturas de CS do modelo animal ou dos pacientes com ELA. Os motoneurônios tiveram os seus prolongamentos contados e a morte neuronal foi identificada pela presença do FJC. Diversos fatores neurotróficos foram quantificados no meio condicionado das culturas de CS pela técnica de ELISA. A reação em cadeia da polimerase quantitativa (do inglês, quantitative polymerase chain reaction - qPCR) foi realizada para detectar alterações nas CS e no nervo periférico que pudessem estar relacionadas com disfunção na unidade CS/NM. Os resultados mostraram que os NM cultivados na ausência das CS mostraram-se mais susceptíveis à morte. Os NM cocultivados com as CS ELA mostraram maior número de perfis neurodegenerativos em comparação com os NM co-cultivados com as CS controle. Após o tratamento com o meio condicionado das CS ELA, os NM mostraram redução no tamanho dos prolongamentos e aumento do número de células em neurodegeneração em comparação com o grupo controle. Quantidades reduzidas dos fatores neurotróficos foram encontradas no meio condicionado das culturas de CS ELA. Alterações na expressão gênica das CS e no nervo periférico evidenciaram disfunções na unidade CS/NM que podem estar contribuindo para o processo neurodegenerativo visto na ELA. Conclui-se que a falência nos mecanismos de neuroproteção pelas CS ELA é um importante mecanismo implicado na morte neuronal, com grande potencial terapêutico / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease characterized by the selective loss of upper and lower motor neurons (MN). Recently, central glia (astrocytes, microglias and olygodendrocytes) were toxic to the MN, but the molecular aspects have not fully described. In relation to the peripheral glia, electrophysiological changes in the sciatic nerve of ALS animal model in the presymptomatic stage have been reported by our group and early denervation findings in both animal models and patients suggests the participation of Schwann cells (SC) in the retrograde neuronal death of ALS , theory known as dying back. In this context, the SC proved to be able to induce axonal retraction and denervation of the neuromuscular junctions, early events in the disease, possibly occurring in the pre-symptomatic phase. The aim of this thesis was to investigate the influence of SC of pre-symptomatic experimental model and from patient with recent evolution of ALS sporadic form, in the survival and axonal length of MN in vitro and understand the molecular nature of the phenomenon. Highly purified SC cultures were obtained from the sciatic nerve of the animal model and from ALS patient\'s peripheral nerve. MN from the newborn mouse spinal cord were co-cultured with SC and the neurodegeneration was assessed by the presence of the marker Fluoro-Jade C (FJC). MN were also treated with conditioned medium from cultures of SC of the animal model or ALS patients. MN had their neuronal length measured and neuronal degeneration was identified by the presence of the FJC. Several neurotrophic factors were measured in conditioned medium of mice and ALS patient\'s SC cultures by ELISA. The chain reaction quantitative polymerase (qPCR) was performed to detect changes in the SC and peripheral nerve that could be related with dysfunction in the functional unit SC/MN. The MN co-cultured with ALS SC showed a greater number of neurodegenerative profiles compared with MN cocultured with control SC. After treatment with ALS SC conditioned medium, MN showed a reduction in the neuronal length and increased number of cells in neurodegeneration compared with the control group. Lower levels of neurotrophic factors were found in the conditioned medium of ALS SC cultures. Changes in the gene expression of SC and peripheral nerve showed dysfunctions in SC/MN unit, which may be contributing to the neurodegenerative process seen in ALS. In conclusion, the failure of neuroprotection by ALS SC is an important mechanism implicated in the MN cell death, with great therapeutic potential

Esta pesquisa se desenvolveu a partir da parceria entre o Projeto APOIAR do Laboratório de Saúde Mental e Psicologia Clinica Social do Instituto de Psicologia da USP e a ABRELA (Associação Brasileira de Esclerose Lateral Amiotrófica). O estudo refere-se à investigação e compreensão de aspectos afetivos, emocionais e de qualidade de vida dos profissionais da área de saúde, enfocando sua relação com cuidadores e pacientes portadores de Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), doença degenerativa dos neurônios motores, sem prognóstico de cura, embora com a consciência mantida até a morte. Foi empregado o método clínico de pesquisa em onze profissionais, médicos, assistentes sociais, fisioterapeutas respiratórios e motor, nutricionista e terapeuta ocupacional, no setor da Neuromuscular da UNIFESP/Escola Paulista de Medicina em parceria com a ABRELA. Foram empregados como instrumentos: Entrevista Psicológica Semi Estruturada, Método de Rorschach pelo Sistema de Avaliação Aníbal Silveira (sendo alguns índices selecionados) e o Questionário de Vida de McGill. Os dados foram tratados considerando o grupo de forma geral e não de modo individualizado. Principais resultados obtidos apontam para a maturidade do grupo de profissionais, a sensibilidade da maioria à dor e ao sofrimento dos pacientes, com respostas que denotam afetividade, frustração diante da falta de cura e sucesso no tratamento. Demonstram qualidade de vida preservada, e os dados sugerem que trabalham na área que escolheram apesar das dificuldades que sentem. Sugere-se que sejam implementados programas que possam dar aos profissionais de saúde o suporte necessário para que se mantenham como o grupo estudado nessa pesquisa, em condições de dar conta do contato com pacientes com enfermidades graves e crônicas como a ELA. / The actual research was possible due to the partnership between the Project APOIAR (SUPPORT) of the Laboratory of Mental Health and Clinical Psychology of the Institute of Psychology of USP University of Sao Paulo, and ABRELA ( Brazilian Association of Amyotrophic Lateral Sclerosis ( ALS ). This study intends to investigate and better understand the Quality of Life and emotional aspects of health professionals in their relationship with ALS patients and their carers. ALS is a degenerative illness which affects motor neurons causing severe physical impediments, even tough its patients continue lucid up to their death. This illness does not have a prognosis of cure. We have applied the Clinical Method of survey and research on eleven professionals physicians, social workers, motor and respiratory physiotherapists, nutritionist and occupational therapist from de Department of neuromuscular of UNIFESP/ Federal Paulista Medical School and partnership with ABRELA. The study Instruments used were the Semi- Structured psychological Interview, the Rorschach Method ( the Evaluation System by Anibal Silveira) and the Questionnaire of Quality of Life. The collected data considered the group as a whole and not individuals. The main results point towards the maturity of the group of health professionals and their sensitivity related to the pain and suffering of patients, with answers showing affection and frustration due to impossibility of cure and success of treatment. The results show preserved Quality of Life and suggest that those health professionals work within their chosen specialty despite their difficulties.The study suggests the need of implementing programs which give health professionals the necessary support, as shown in this study, so that they can deal with their patients with serious and chronic illnesses such ALS.

Introdução: A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença degenerativa e progressiva que afeta neurônios motores da medula espinhal, tronco cerebral e/ ou córtex motor. Sua manifestação clínica é bastante variada, sua etiologia desconhecida e a progressão, fatal. Não existe ainda um tratamento curativo para a ELA, porém alguns medicamentos e a realização de fisioterapia podem auxiliar, fornecendo ao paciente uma melhor qualidade de vida. Objetivos: Testar a hipótese de que técnicas quantitativas de Ressonância Magnética (RM) são eficazes para detectar a lesão neuronal no encéfalo de pacientes com ELA no estágio inicial da doença e, verificar se existe correlação entre a lesão encefálica e a perda funcional do paciente. Dessa forma, pretende-se estabelecer um protocolo capaz de contribuir para o diagnóstico precoce da ELA. Metodologia: Quinze pacientes com diagnóstico de ELA definida ou provável (12 homens e três mulheres), com idade entre 37 e 79 anos e seus respectivos controles foram submetidos a um protocolo de avaliação por RM, que incluiu um estudo estrutural volumétrico e quantitativo do dano neuronal e mielínico por razão de sequências ponderadas em T1 e FLAIR, da Transferência de Magnetização (MT), Relaxometria, Anisotropia Fracionada (FA) e Difusão (DTI), além da Espectroscopia de prótons. Alguns dos sujeitos foram submetidos também à uma avaliação física de força muscular, de funcionalidade através da Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale Revised (ALSFRS-R), de qualidade de vida através da Amyotrophic Lateral Sclerosis Assessment Questionnaire (ALSAQ-40) e de quantificação da fadiga pela Fadigue Severity Scale (FSS). Os dados da RM dos dois grupos foram comparados através da análise de variância multi e univariada e submetidos à correção de múltiplas comparações de Bonferroni. Nas variáveis com diferença significante entre os grupos, foi estudada a validade preditiva da medida, calculando-se a área sob a curva ROC e estabelecidos os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia. Os dados das escalas foram comparados pelo teste de Mann-Whitney e correlacionados entre si e com as estruturas através da correlação de Spearman. Resultados: As várias técnicas da RM, com exceção da MT, identificaram pelo menos uma estrutura com diferença significante entre os dois grupos, totalizando 11 estruturas mais a razão dos metabólitos NAA/Cre. Os valores de sensibilidade, especificidade e acurácia foram satisfatórios variando entre 0,60 e 1,00 , com destaque para o Volume do Giro Superior Frontal Direito e Giro Superior Frontal Esquerdo que apresentaram valores 1,00 , 0,93 e 0,97 , respectivamente. As escalas ALSFRS-R e ALSAQ-40 apresentaram diferença significativa entre os dois grupos, mas a FSS não apresentou. As escalas apresentaram correlação significativa entre si em quase todos os escores totais e domínios. Já a correlação das escalas com as estruturas foi significativa apenas para o Volume. Conclusões: Técnicas como DTI, FA, Relaxometria e Volume se mostraram mais eficazes no diagnóstico precoce de pacientes com ELA do que as outras. A redução de volume de substância cinzenta se correlacionou positivamente com a ALSFRS-R. Por fim, propomos um protocolo para avaliação de pacientes com ELA, que inclua imagem volumétrica de alta resolução para cálculo da Volumetria e DTI. / Introduction: Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a progressive and degenerative disease that affects motor neurons in the spinal cord, brain stem and/ or motor cortex. Their clinical presentation is varied, its unknown etiology and fatal progression. There isnt still a curative treatment for ALS, but some medications and physical therapy can help by providing the patient a better quality of life. Objectives: To test the hypothesis that quantitative techniques of magnetic resonance imaging (MRI) are effective to detect neuronal damage in the brain of patients with ALS at the inicial stage of the disease and see if there is a correlation between brain injury and functional loss of the patient. Thus, we intend to establish a protocol can to contribute to early diagnosis of ALS. Methods: Fifteen patients with definite or probable ALS (12 men and three women) aged between 37 and 79 and their respective controls underwent an MRI evaluation protocol, including a volumetric and quantitative structural study of damage neuronal and myelin by reason of T1-weighted sequences and FLAIR , Magnetization Transfer (MT), Relaxometry, Fractional Anisotropy (FA), Diffusion (DTI) and Proton magnetic resonance spectroscopy. Some of the subjects also underwent a physical assessment of muscle strength, functionality by Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale Revised (ALSFRS-R), quality of life through the Amyotrophic Lateral Sclerosis Assessment Questionnaire (ALSAQ-40) and quantification of fatigue by Fadigue Severity Scale (FSS). The MRI data of the two groups were compared using analysis of variance multivariate and univariate and submitted to correction for multiple comparisons of Bonferroni. In the variables with significant differences between groups, we studied the predictive validity of the measure, by calculating the area under the ROC curve and set the sensitivity, specificity and accuracy. The data of the scales were compared using Mann-Whitney test and correlated with each other and with the structures by Spearman correlation. Results: The various MRI techniques, with the exception of MT, identified at least one structure with a significant difference between the two groups, a total of 11 structures over the reason for the metabolites NAA/Cre. The sensitivity, specificity and accuracy were satisfactory ranging from 0.60 to 1.00 , with emphasis on Volume of Gyros Superior Frontal Right and Gyros Superior Frontal Left that averaged 1.00 , 0.93 and 0,97 , respectively. The ALSFRS-R and ALSAQ-40 scales showed significant differences between the two groups, but the FSS did not. The scales were significantly correlated with each other in almost all domains and total scores. The correlation with the structures of the scales was significant only for the Volume. Conclusions: Techniques such as DTI, FA, Relaxometry and Volume are more effective in early diagnosis of ALS patients than others. The decrease in gray matter volume was positively correlated with the ALSFRS-R. Finally, we propose a protocol for evaluation patients with ALS, including high-resolution volumetric image to calculate the Volume and DTI.

As espécies reativas são associadas a processos toxicológicos e fisiopatológicos, agindo como importantes mediadores, por exemplo, na sinalização celular. Diversas classes de compostos têm sido utilizadas como possíveis biomarcadores de estresse redox, destacando-se os aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, capazes de alquilar biomoléculas como o DNA. Para evitar efeitos deletérios, estes aldeídos são detoxificados por glutationilação e posterior metabolização a derivados mercaptúricos. Contudo, avaliar o estado redox em sistemas biológicos ainda é tarefa bastante complexa, sendo a dificuldade em quantificar de forma prática e acurada os efeitos de sinalização e/ou dano molecular o maior problema dos estudos redox. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos acurados e sensíveis de análise de potenciais biomarcadores de estresse redox, isto é: nucleosídeos modificados, aldeídos endógenos e exógenos, glutationa e produtos de glutationilação, e avaliá-los em sistemas modelos, celular e animal, e em humanos. A avaliação dos níveis urinários de três nucleosídeos modificados por metodologia de HPLC-MS/MS desenvolvida pelo grupo em moradores da cidade de São Paulo - região com poluição atmosférica - demonstrou aumento significativo de 1,N2-propanodGuo comparado aos moradores de região não poluída. Ademais, comprova-se pela primeira vez que células deficientes em reparo de ligações cruzadas apresentam níveis basais elevados de 1,N2-propanodGuo, em duas linhagens independentes, colocando este aduto como potencial mediador de carcinogênese em pacientes portadores de Anemia de Fanconi. Utilizando cérebro de ratos SOD1G93A (modelo de Esclerose Lateral Amiotrófica - ELA), verificou-se aumento de 50% nos níveis de 1,N2-propanodGuo e de 100% nos de 1,N6-&#949;dAdo em fase sintomática, sugerindo influência do conteúdo lipídico cerebral, levando a comprometimento do metabolismo neuronal e morte celular. O perfil de aldeídos determinado em cérebro de ratos SOD1G93A demonstrou aumento de trans-hexa-2-enal e trans,trans-hexa-2,4-dienal em fase assintomática e de trans,trans-deca-2,4-dienal em fase sintomática, não sendo observada nenhuma alteração na medula. Conhecer estas variações permite direcionar estudos de modificações em biomoléculas, além de a metodologia per se corroborar com as áreas de análises lipidômicas. Técnicas distintas e o preparo de amostras refletiram nos níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) relatados. A técnica de espectrometria de massas mostrou-se mais precisa que a detecção eletroquímica; e a alquilação do grupo tiol minimizou interferências de matriz. Por análise de HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS, a quantificação de trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) e crotonaldeido conjugados com GSH demonstrou não haver alterações em cérebro e medula de ratos SOD1G93A. Contudo, há formação esteroespecífica dos adutos de HNE in vivo. Ressalta-se que a metodologia desenvolvida é extremamente sensível e específica e permite análise simultânea de GSH, GSSG, cisteína, cistina e dos adutos supracitados, servindo para análise de outros adutos de glutationilação de aldeídos que possam ser importantes em doenças associadas a estresse redox. / Free radicais and oxidant species are associated with toxicological and pathophysiological processes. It has been demonstrated that production of reactive oxygen species may be involved in cell signaling and regulation. Several biomarkers of redox processes have been used, including adducts formed through the reaction of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes with biomolecules such as DNA. In order to avoid these deleterious effects, aldehydes are detoxified through glutathionylation and further metabolized to mercapturic derivatives. However, assessing the redox status in biological systems is still a very complex task, and the difficulty in practical and accurate quantification of signaling effects and/or molecular damage is a major problem in redox studies. The objective of this work was to develop accurate and sensitive methods for analysis of potential biomarkers of redox stress, i.e., modified nucleosides, endogenous and exogenous aldehydes, glutathione and glutathionylation products, and their evaluation in cell, animal model and humans. Evaluation of urinary levels of 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine (1,N2-propanodGuo), 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine and 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine in residents of São Paulo City - polluted region - showed a significant increase (p<0.05) in 1,N2-propanodGuo levels compared to residents of an unpolluted region by a HPLC-MS/MS methodology developed by the group. Moreover, it was proven, for the first time, that repair deficient cells have basal levels of 1,N2-propanodGuo higher than proficient cells in two independent strains, placing 1,N2-propanodGuo as a potential mediator of carcinogenesis in Fanconi Anemia patients. In an Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) animal model (SOD1G93A rat) , a 50% increase in the levels of 1,N2-propanodGuo and 100% in the 1,N6-etheno-2\'-deoxyadenosine in brain tissue in the symptomatic phase was observed, suggesting that the high brain lipid content may play a role, leading to impairment of cell metabolism and neuronal cell death. There is an increase of trans-hex-2-enal and trans,trans-hexa-2,4-dienal in asymptomatic SOD1G93A rats brain and of trans,trans-deca-2,4-dienal in symptomatic ones. However, no alteration was observed in spinal cord. Our approach contributes to a better understanding of the aldehyde status in vivo and allows us to predict biomolecule modifications. The developed methodology can contribute to lipidomic studies. The use of different techniques and sample preparation reflected in the reported levels of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG). The mass spectrometry technique proved to be more accurate than the electrochemical one, and the use of thiol alkylating agent minimizes matrix interference. No changes were observed in the levels of the GSH conjugates of trans-4-hydroxy-2-nonenal (HNE) and crotonaldehyde in brain and spinal cord of SOD1G93A rats quantified by HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS compared to controls. However, it was observed stereospecific HNE adducts formation in vivo. Note that this methodology is extremely sensitive and specific and allows simultaneous analysis of GSH, GSSG, Cys, cystine and the aforementioned adducts, serving for analysis of other aldehyde-glutathionylation adducts that may be important in pathologies associated with stress redox.

Danos em biomoléculas podem ocorrer a partir de uma interação direta entre as biomoléculas e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio como também, pela reação de produtos secundários dessas espécies como eletrófilos gerados na peroxidação lipídica. Alguns desses produtos secundários possuem estabilidade química maior que as espécies reativas das quais foram derivadas e podem se ligar covalentemente as biomoléculas comprometendo o funcionamento normal das mesmas. Portanto, modificações em proteínas por aldeídos gerados na lipoperoxidação têm sido investigadas por suas implicações com desordens patológicas relacionadas à agregação proteica, e modificações em diversas vias de sinalização amplificando os efeitos deletérios em sistemas biológicos. Os objetivos desse trabalho foi contribuir na elucidação dos mecanismos moleculares associados ao desenvolvimento da esclerose lateral amiotrófica (ELA) através da identificação, caracterização e quantificação de modificações póstraducionais em proteínas pelos aldeídos 4-hidroxi-2-hexenal (HHE) e trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) in vitro (citocromo c) e in vivo (modelo ELA) a partir de técnicas de Western blot, imunoprecipitação e espectrometria de massa com abordagem proteômica de \"shotgun\" em ratosSOD1G93A modelo de esclerose lateral amiotrófica (ELA). Estudos com citocromo c mostraram a ligação dos aldeídos ao citocromo c e mecanismos de reação foram propostos. Foram encontrados seis peptídeos modificados por HHE e um para o HNE, e o peptídeo TGPNLHGLFGR se mostrou modificado pelos dois aldeídos paralelamente. Foi demonstrado que a histidina 33 é um \"hot spot\" frente as adições pelos aldeídos. Nas análises por western blot das proteínas ligadas a aldeídos foi possível observar uma tendência de aumento na concentração de proteínas ligadas ao HNE nos animais ELA, mais acentuada nas amostras de 70 dias comparadas ao controle. Com relação aos resultados obtidos com HHE tanto os animais pré-sintomáticos quanto os sintomáticos não apresentaram diferenças de HHE-proteína, tantonos controles quanto nos animais ELA. Nas amostras dos animais sintomáticos não detectamos diferença significativa na concentração de aldeído-proteína entre os grupos. Já as análises proteômicas revelaram 24 proteínas diferencialmente expressas, com destaque para proteínas com os maiores valores de significância (p-value), como a ubiquitina no grupo dos pré- sintomáticos e a neurogranina, no grupo dos animais sintomáticos e várias proteínas de metabolismo energético, de neurofilamentos, proteínas de processos redox e proteínas ligadas o metabolismo de cálcio (fundamentais na fisiopatologia em ELA). Algumas proteínas importantes foram encontradas com exclusividades nos grupos pré-sintomáticos e sintomáticos pelo diagrama de Venn. Com relação a proteínas modificadas pelos aldeídos, foram encontradas algumas relevantes como a proteína 2 de interação com a polimerase delta que foi modificada por HNE via adição de Michael encontrada nos animais ELA pré-sintomáticos e sintomáticos, a catalase que foi encontrada modificada por HNE via base de Schiff apenas nos ELA pré- sintomáticos, e a tiol redutase induzível por interferon gama no grupo dos animais ELA sintomáticos. Com relação a proteínas modificadas por HHE, foram encontradas a Janus quinase e proteína 3 de interação com microtúbulo, modificadas tanto por adição de Michael quanto via base de Schiff nos animais ELA sintomáticos. É interessante ressaltar que algumas modificações encontradas em proteínas não caracterizadas podem indicar proteínas novas ainda não descritas como modificadas por esses aldeídos. Os resultados mostram que algumas das proteínas modificadas por HNE e HHE encontradas neste trabalho, estão relacionadas ao estresse redox, vias metabólicas energéticas, proteínas envolvidas na resposta a danos oxidativos, e processos inflamatórios. Tais modificações ocorrem não só no modelo de neurodegeneração, mas foram previamente descritas em outros processos patológicos, como doença cardiovascular, lesão hepática por uso crônico de álcool. / Damage to biomolecules can occur from a direct interaction between biomolecules and reactive of oxygen and nitrogen species as well as from the reaction of secondary products of these species as electrophiles generated in lipid peroxidation. Some of these by-products have greater chemical stability than the derived reactive species and can bind to biomolecules compromising their normal function. Therefore, protein modifications by aldehydes generated during lipoperoxidation have been investigated for their implications with pathological disorders related to protein aggregation and modifications in signaling pathways amplifying the deleterious effects in biological systems. The aim of this work was to contribute to the elucidation of the molecular mechanisms associated with the development of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) through the identification, characterization and quantification of posttranslational modifications in proteins by 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) and trans-4-hydroxy-2- nonenal (HNE) in vitro, cytochrome c, and in vivo, rat model (SOD1G93A) of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), throught Western blot techniques, and mass spectrometry with shotgun proteomics approach. The results showed the binding of aldehydes to cytochrome c. Six peptides were modified by HHE and one by HNE. The peptide TGPNLHGLFGR was modified by the two aldehydes. Histidine 33 has been shown to be a hot spot against aldehydes additions. By western blot analysis of the aldehyde-bound proteins, it was possible to observe a tendency of increase in the concentration of HNE-bound proteins in the ALS animals, more pronounced in the samples of 70 days compared to control samples. Regarding the results obtained with HHE, both pre-symptomatic and symptomatic animals did not show HHE-protein differences, both in controls and in ALS animals. We did not detect a significant difference in the aldehyde-protein concentration between the groups in the samples of the symptomatic animals. Proteomic analysis revealed 24 differentially expressed proteins, with emphasis on proteins with thehighest values of significance (p-value), such as the ubiquitin in the pre-symptomatic group and neurogranin in the group of the symptomatic animals and several proteins of the energetic metabolism pathways, neurofilaments, proteins of redox processes and proteins linked to calcium metabolism (fundamental in the pathophysiology of ALS). Some important proteins were found exclusivity in the pre-symptomatic and symptomatic groups by the Venn diagram. With regard to aldehyde-modified proteins, some relevant ones such as Delta-2 polymerase interaction protein, that was modified by HNE via the addition of Michael found in presymptomatic and symptomatic ELA animals, catalase that was found to be modified by HNE via Schiff\'s base only in pre-symptomatic ALS, and gamma interferon-inducible thiol reductase in the group of symptomatic ALS animals. Janus kinase and microtubule interaction protein 3, were found to be modified by Michael addition and Schiff base pathway respectively in symptomatic ALS animals. It is interesting to note that some modifications found in uncharacterized proteins may indicate new proteins not yet described as modified by these aldehydes. The results show that some of the proteins modified by HNE and HHE found in this work are related to redox stress, energetic metabolic pathways, proteins involved in the response to oxidative damage, and inflammatory processes. Such modifications occur not only in the neurodegeneration model, but were previously described in other pathological processes, such as cardiovascular disease, liver injury due to chronic alcohol use

Mutações na enzima Cu,Zn-superóxido dismutase (SOD1) estão associadas a casos familiares de Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), uma doença neurodegenerativa motora fatal. Entretanto, a toxicidade das SOD1s mutantes não está totalmente compreendida. Sabe-se que o desenvolvimento da doença está associado ao acúmulo de lesões oxidativas em biomoléculas, mas o papel da SOD1 neste processo não está claro. Estudos com sistemas modelo são, ainda, necessários para desvendar os mecanismos envolvidos. Para contribuir na compreensão dos mecanismos de danos em DNA promovidos pela SOD1, foram realizados estudos in vitro com SOD1/H2O2/HCO3-, e estudos com neuroblastomas em cultura transfectados com SOD1 mutante G93A, característica de ELA. Através da quantificação de quebras em DNA plasmidial e dos níveis de 8-oxo-7,8-dihidro-2´-desoxiguanosina (8-oxodGuo) e 1,N2-eteno-2\'-desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo) em DNA de timo de bezerro, concluiu-se que o cobre liberado da SOD1 tem um papel central na formação de lesões no DNA promovidas pela SOD1 na presença de H2O2, e que o bicarbonato pode modular a reatividade do cobre liberado. Níveis aumentados de quebras no DNA, 8-oxodGuo e 1,N2-&#949;dGuo foram encontrados nos neuroblastomas transfectados com SOD1 G93A. Maior atividade de p53 foi também observada nestas células, indicando que o acúmulo de lesões no DNA pode desencadear o processo de apoptose neste modelo celular de ELA. Observou-se que a SOD1 pode estar associada à cromatina, e que a SOD1 G93A possui maior afinidade pelo DNA e maior atividade peroxidásica no núcleo. Estes resultados indicam que as lesões no DNA observadas no modelo celular de ELA podem ser diretamente promovidas pela SOD1 mutante. / Mutations in the gene encoding Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) have been linked to familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), a fatal motor neuron disease. However, the toxicity of mutant SOD1s was not completely understood. It is known that the development of the disease is associated with oxidative damage to biomolecules, but the role of SOD1 in this process is not clear. Model studies are still necessary to reveal the mechanisms involved. To understand the mechanism of DNA damage promoted by SOD1, in vitro studies with SOD1/H2O2/HCO3-, and studies with neuroblastoma cells transfected with the G93A ALS-mutant SOD1, were performed. Through the quantification of strand breaks in plasmid DNA and the quantification of 8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosine (8-oxodGuo) and 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) levels in calf thymus DNA, it was concluded that copper liberated from SOD1 has a central role in DNA damage promoted by SOD1 in the presence of H2O2, and that bicarbonate can modulate the reactivity of released copper. Increased levels of DNA strand breaks, 8-oxodGuo and 1,N2-&#949;dGuo were found in neuroblastoma cells transfected with G93A SOD1. Increased p53 activity was also observed in these cells, indicating that accumulation of DNA damage can lead to apoptosis in this ALS cellular model. Western blot analysis showed that G93A SOD1 is present in the nucleus, being associated to the DNA. Nuclear G93A SOD1 has identical superoxide dismutase-activity but displays increased peroxidase activity, when compared to wild-type. These results indicate that DNA damage observed in this ALS cellular model may be directly promoted by mutant SOD1.

Made available in DSpace on 2016-04-27T18:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isabella Bastos de Quadros.pdf: 525864 bytes, checksum: 3b2418c0bf5a7af2e07ce0ab5da4f6bc (MD5) Previous issue date: 2012-06-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The history of Leide Moreira, with Amyotrophic Lateral Sclerosis and whose eye globe is the single voluntary muscle movement preserved, was used as a metaphor to discuss how inhospitable life conditions may suggest, besides extreme fragility, capacity to modify one&#8223;s life. Although this is about a life experience not belonging exclusively to old age, it may be enhanced in this phase due to proximity to finitude. Reflection on a body beyond the physical body, deconstructing the mind-body dichotomy and, as a result, think old age and longevity without saying no to body changes and human finitude and, through each individual&#8223;s journey, consider the last phase of life, just like all the others, must be vested in both individual and group purposes and meanings, constantly building a personal history together with the hero that lies inside us all.The reflection on the hero&#8223;s journey is what this study is based upon because it emphasizes the fact that crisis need a lonely diving into personal and group unconsciousness which lead to changes, discoveries and, as a consequence, new perception towards the world by seeking a more conciliatory position between consciousness and unconsciousness. A wider horizon and the never seen before, always present throughout life, point out conflicts and inequalities, whose rejuvenated body cannot help to mitigate, on the contrary, it deepens the human abysm between what one wants to be and what one actually is. Fable, myth and poetry itself are means through which human beings trigger their own personal development which are getting more and more neglected nowadays due to reluctance to look beyond rationality. Such a metaphor makes explicit how health does not necessarily mean the elimination of a disease and it shows that there are possibilities to achieve emotional well being and keep on giving meaning to what is there to be lived, despite conflicts inherent to human beings and under any human condition whether in health or in sickness. As for such a destructive phase of life, the whole capability inside it to rebuild or modify should also be considered because a resistant power emerges through it, able to generate a new order of existence. The immovable and unresponsive body, in spite of such important limitations, is still a surface of contact: it can affect and be affected. Leide Moreira&#8223;s journey as a metaphor helps us increase our understanding of what longevity means within the contemporary society and mainly of what the limitations and capacity for reformulation in old age are. Facing the longevity scenery whose experience serves as a guide to events never seen before, it is relevant to consider how far we are preparing ourselves to such extended existence / A história de Leide Moreira, com Esclerose Lateral Amiotrófica e cujo único movimento muscular voluntário preservado é o globo ocular, foi utilizada como metáfora para refletir acerca de como condições inóspitas de vida sugeririam, além de fragilidade extrema, capacidade de reformulação da própria vida. Trata-se de vivência não exclusiva da velhice, mas que pode se potencializar nessa fase pela proximidade com a finitude. Reflexão sobre um corpo para além do físico, desconstruindo a dicotomia corpo-mente e, por meio disso, pensar o envelhecimento e a longevidade sem negar as alterações corporais nem a finitude humana e, pela jornada de cada indivíduo, considerar que a fase última da vida, como todas as demais, precisa ser investida de propósito e significado individual e coletivo, formando incessantemente uma história pessoal em parceria com o herói que nos habita a todos. A reflexão sobre a jornada do herói baseia este estudo justamente por enfatizar que as crises necessitam de um mergulho solitário no inconsciente pessoal e coletivo que promove transformações, descobertas e, consequentemente, novas percepções de mundo a partir da busca de um caminho conciliatório entre consciente e inconsciente. O horizonte mais amplo e o inédito que se faz sempre presente ao longo da vida evidenciam os conflitos e desigualdades, cujo corpo rejuvenescido não ajuda a amenizar, pelo contrário, intensifica o abismo humano entre o que se quer ser e o que se é. A fábula, o mito e a poesia são instrumentos utilizados pelo ser humano como propulsores do seu desenvolvimento pessoal, cada vez mais negligenciados na contemporaneidade por causa da relutância de se enxergar além do racional. Essa metáfora explicita o quanto saúde não significa implicitamente a eliminação da doença, mostrando que há possibilidades apesar dos conflitos inerentes ao ser humano. E em qualquer condição humana de saúde ou doença, de produzir bem-estar emocional e continuar conferindo significado para o que é vivido. Ao considerarmos a faceta destrutiva da vida, é preciso ressaltar toda a capacidade de reconstrução ou de reformulação nela contida porque, por meio dela, emerge um poder que resiste, capaz de gerar nova ordem de existência. O corpo imóvel, inerte. Mas apesar das limitações significativas, continua superfície de contato: afeta e é afetado. A trajetória de Leide Moreira como metáfora ajuda a melhor compreender a condição da longevidade na sociedade contemporânea, principalmente as limitações e capacidade de reformulação na velhice. Considerando o cenário da longevidade, cuja vivência é permeada por acontecimentos inéditos, é relevante pensar até que ponto nos preparamos para uma existência tão alongada

Os lipídeos abrangem uma ampla gama de moléculas hidrofóbicas presentes nas células. As características moleculares dos lipídios determinam sua localização celular e função biológica. Em geral, os lipídios são considerados componentes essenciais de membranas, reservatórios de energia e moduladores de vias de sinalização ligadas ao metabolismo celular, sobrevivência, entre outros. Em mamíferos, grande parte dos lipídios é esterificada em ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), especialmente os ácidos docosahexaenóico (DHA) e araquidônico (ARA), essenciais para vários processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento normal do cérebro. No entanto, os PUFAs são muito suscetíveis à oxidação por espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas endogenamente. Uma vez oxidados, lipídios são capazes de modificar grupos tióis de peptídeos e proteínas, levando à modulação das vias de sinalização e alterando o balanço redox celular. No capítulo 1, foram investigados os mecanismos envolvidos na modificação de grupos tióis de peptídeos e proteínas por produtos de auto-oxidação de PUFAs. Com as análises realizadas foi possível identificar vários adutos de glutationa (GSH) covalentemente modificados por endoperóxidos cíclicos derivados de DHA e ARA. Uma análise detalhada dos espectros de MS/MS dos adutos de GSH revelou que GSH e endoperóxidos cíclicos são provavelmente ligados através de uma ligação química de enxofre-oxigênio, em uma reação que envolve um ataque nucleofílico do ânion tiolato. Além disso, sugerimos que a eficiência da modificação do tiol por endoperóxidos cíclicos também é dependente da reatividade do tiol, como demonstrado pela modificação covalente do resíduo de cisteína mais reativo (Cys111) da enzima antioxidante superóxido dismutase 1(SOD1). Modificações químicas de tióis por endoperóxidos cíclicos podem modular a agregação proteica e o status redox celular, produzindo adutos de GSH capazes de modular a inflamação, como relatado para os conjugados de GSH gerados enzimaticamente. No capítulo 2, nós investigamos o papel dos lipídios na esclerose lateral amiotrófica (ALS), uma vez que a inflamação e o estresse oxidativo nos neurônios motores contribuem para o desenvolvimento desta doença neurodegenerativa. Usando uma abordagem lipidômica não direcionada baseada em espectrometria de massa acoplada à cromatografia líquida (UHPLC-MS/MS), nós investigamos o metabolismo lipídico no córtex motor e na medula espinhal de um modelo de ratos com ALS. A análise do córtex motor mostrou que as principais alterações lipídicas foram dependentes da idade e ligadas ao metabolismo dos esfingolipídios. Em contraste, as principais alterações lipídicas na medula espinhal foram encontradas no grupo sintomático da ALS, sendo o metabolismo de ceramidas, ésteres de colesterol e cardiolipinas os mais afetados. De acordo com os resultados obtidos e dados relatados na literatura, propusemos um mecanismo baseado em neuroproteção que envolve o acúmulo de ésteres de colesterol esterificados em PUFAs em astrócitos. Coletivamente, nossos achados sugerem que os lipídios desempenham um papel crucial na modulação de processos celulares ligado à oxidação de tióis e à neurodegeneração. / Lipids encompass a wide range of hydrophobic molecules present in cells. The molecular characteristics of lipids determine their cellular localization and biological function. In general, lipids are regarded as essential components of membranes, as energy reservoir and modulators of signaling pathways linked to cellular metabolism and survival, among others. In mammals, a large part of the lipids are esterified to polyunsaturated fatty acids (PUFAs), especially docosahexaenoic (DHA) and arachidonic (ARA) acids, essential for several physiological processes, including normal brain development. However, PUFAs are very susceptible to oxidation by reactive oxygen species (ROS) generated endogenously. Once oxidized, lipids are able to modify thiol groups of peptides and proteins leading to modulation of signaling pathways and cellular redox balance. In the chapter 1, we investigated the mechanisms involved in modification of thiol groups of peptides and protein by autoxidation products derived from PUFAs. Here, we identified several glutathione (GSH) adducts covalently modified by hydroxy-endoperoxides derived from both DHA and ARA. Detailed inspection of MS/MS spectra of GSH-adducts revealed that GSH and hydroxy-endoperoxides are likely bonded through a sulfur-oxygen chemical bond in a reaction which involves a nucleophilic attack by the thiolate anion. Also, we suggest that the efficiency of modification of thiol by hydroxy-endoperoxides are also dependent of the thiol reactivity, as demonstrated by covalent modification of the most reactive cysteine residue (Cys111) of the antioxidant enzyme Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1). Chemical modifications of thiol groups by hydroxy-endoperoxides may modulate protein aggregation and cellular redox status, yieldingGSH adducts capable to modulate inflammation, as reported for the enzymatically generated counterparts. In the chapter 2, we investigated the role of lipids in amyotrophic lateral sclerosis (ALS), since inflammation and oxidative stress in motor neurons are hallmarks of this neurodegenerative disease. Using an untargeted lipidomics approach based on mass spectrometry coupled to liquid chromatography (UHPLC-MS/MS), we investigated the lipid metabolism in motor cortex and spinal cord tissues of a rodent model of ALS. Analysis of the motor cortex showed that the main lipid alterations were age-dependent and linked to metabolism of sphingolipids. In contrast, the major lipid alterations in the spinal cord were found in ALS symptomatic group, being the metabolism of ceramides, cholesteryl esters and cardiolipin the most affected. According to our findings and data reported in the literature, we proposed a mechanism based on neuroprotection that involves accumulation of cholesteryl esters esterified to PUFAs in astrocytes. Collectively, our findings suggest that lipids play a crucial role in modulation of cellular process linked to thiol metabolism and neurodegeneration.