Objectives: There is debate on whether the use of third-generation cephalosporins (3GC) increases the risk of clinical failure in bloodstream infections (BSIs) caused by chromosomally-mediated AmpC-producing Enterobacterales (CAE). This study evaluates the impact of definitive 3GC therapy versus other antibiotics on clinical outcomes in BSIs due to Enterobacter, Serratia, or Citrobacter species. Methods: This multicenter, retrospective cohort study evaluated adult hospitalized patients with BSIs secondary to Enterobacter, Serratia, or Citrobacter species from 1 January 2006 to 1 September 2014. Definitive 3GC therapy was compared to definitive therapy with other non-3GC antibiotics. Multivariable Cox proportional hazards regression evaluated the impact of definitive 3GC on overall treatment failure (OTF) as a composite of in-hospital mortality, 30-day hospital readmission, or 90-day reinfection. Results: A total of 381 patients from 18 institutions in the southeastern United States were enrolled. Common sources of BSIs were the urinary tract and central venous catheters (78 (20.5%) patients each). Definitive 3GC therapy was utilized in 65 (17.1%) patients. OTF occurred in 22/65 patients (33.9%) in the definitive 3GC group vs. 94/316 (29.8%) in the non-3GC group (p = 0.51). Individual components of OTF were comparable between groups. Risk of OTF was comparable with definitive 3GC therapy vs. definitive non-3GC therapy (aHR 0.93, 95% CI 0.51–1.72) in multivariable Cox proportional hazards regression analysis. Conclusions: These outcomes suggest definitive 3GC therapy does not significantly alter the risk of poor clinical outcomes in the treatment of BSIs secondary to Enterobacter, Serratia, or Citrobacter species compared to other antimicrobial agents.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:39Z : No. of bitstreams: 1 Publico-056a.pdf: 696691 bytes, checksum: 64c4289072c6f1c83f49be3d7e27f3ae (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:39Z : No. of bitstreams: 2 Publico-056a.pdf: 696691 bytes, checksum: 64c4289072c6f1c83f49be3d7e27f3ae (MD5) Publico-056b.pdf: 486744 bytes, checksum: 8df649e134c8e80fb3b1eb63056a2d16 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:39Z : No. of bitstreams: 3 Publico-056a.pdf: 696691 bytes, checksum: 64c4289072c6f1c83f49be3d7e27f3ae (MD5) Publico-056b.pdf: 486744 bytes, checksum: 8df649e134c8e80fb3b1eb63056a2d16 (MD5) Publico-056c.pdf: 204395 bytes, checksum: 0a9399461d184b10dd67c8512f955943 (MD5). 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Em nosso meio, a resistência às cefalosporinas de amplo espectro em enterobactérias tem sido associada à produção de β-lactamases de espectro ampliado (ESβL). Porém, nos últimos anos, a produção de cefalosporinases do tipo AmpC mediadas por genes plasmídiais (pAmpC) também tem sido responsabilizada pela resistência a essas drogas. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de pAmpCs entre amostras de enterobactérias isoladas de pacientes internados no Hospital São Paulo que apresentaram infecção de corrente sangüínea, entre janeiro e julho de 2006. Foram estudadas 133 amostras de enterobactérias identificadas como K. pneumoniae (65 amostras), K. oxytoca (5 amostras), E. coli (41 amostras), P. mirabilis (18 amostras) e Salmonella spp. (4 amostras). O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos selecionados foi avaliado pela técnica de diluição em ágar, segundo as recomendações do CLSI. A detecção fenotípica da produção de pAmpC foi realizada pelos testes tri-dimensional e de Hodge modificado. Adicionalmente, foi realizada a detecção fenotípica da produção de ESβL. A pesquisa e identificação dos genes que codificam pAmpC foram realizados pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciamento. Entre os antimicrobianos testados, imipenem (99,2%) apresentou a maior taxa de sensibilidade, seguido pela cefoxitina (80,5%). De forma geral, os isolados de K. pneumoniae apresentaram alto grau de resistência aos β- lactâmicos e os isolados de P. mirabilis apresentaram a menor taxa de sensibilidade para ciprofloxacino (27,8%). Entre as 133 amostras estudadas, 59 (44,4%) foram classificadas fenotipicamente como produtoras de ESβL pela metodologia de disco aproximação. Foi observada discordância entre os resultados dos testes fenotípicos para detecção de pAmpC. A produção de pAmpC foi observada em seis isolados de acordo com o teste tri-dimensional, enquanto, o método de Hodge modificado classificou 19 isolados como possíveis produtores de pAmpC. Além disso, resultados duvidosos foram observados em ambas as técnicas. Um único isolado de K. pneumoniae foi identificado como produtor de CMY-2. Este isolado foi corretamente identificado como produtor de pAmpC por ambos métodos fenotípicos empregados. / The broad-spectrum cephalosporins are the main therapeutic options to Enterobacteriaceae infections and the resistance to these agents has been associated to ESβL production. However, plasmid-mediated AmpC β-lactamases (pAmpC) have been associated with this resistance phenotype. The aim of this study was to determine the occurrence of pAmpC among clinical isolates recovered from bloodstream from patients hospitalized at a Brazilian teaching hospital, collected between January and July 2006. A total of 133 non-repetitive Enterobacteriaceae per patients (65 K. pneumoniae, 41 E. coli, 18 P. mirabilis, 05 K. oxytoca and 04 Salmonella spp.) were studied. The antimicrobial susceptibility profile was determined by CLSI agar dilution method. ESβL phenotype was detected by doubledisk diffusion method while pAmpC production was evaluated by two phenotypic methods: modified three-dimensional and modified Hodge tests and the presence of pAmpC genes was confirmed by PCR and sequencing. Among tested antimicrobial, imipenem showed the highest susceptibility rate (99.2%), followed by cefoxitin (80.5%). K. pneumoniae presented high resistance to β-lactams. P. mirabilis isolates showed the lower susceptibility rate to ciprofloxacin (27.8%). Fifty-nine (44.4%) of studied isolates were phenotypically classified as ESβL producers. Modified threedimensional and Hodge methods classified 06 and 19 Enterobacteriaceae strains as pAmpC producers, respectively. Discordant results were observed between phenotypic pAmpC detection methods. Of those, a single K. pneumoniae isolate was confirmed as CMY-2 producer. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A diferenciação da oligodendroglia depende de alterações coordenadas no citoesqueleto e na sua relação com a membrana plasmática, um componente importante para a formação da bainha de mielina. A 23 nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) está relacionada com a organização do citoesqueleto, sendo uma proteína ancoradoura de microtúbulos na membrana plasmática. In vitro, a CNPase compõe, com a F-actina e os microtúbulos, as estruturas semelhantes a nervuras ou os componentes radiais. A glicoproteína associada a mielina (MAG), também é importante para a formação dos véus de membrana e está associada a CNPase e a tubulina. Além disso, as três proteínas podem ser reguladas pela via de sinalização do AMPc/PKA. Buscando avaliar os efeitos da via do AMPc/PKA na regulação da diferenciação oligodendroglial, culturas de hemisférios cerebrais com 5 dias foram tratadas por 30 min ou 24 h com o inibidor (SQ22356-SQ [1 M]) ou com o ativador (forscolina [10M]) da adenilato ciclase ou com o inibidor da PKA, H-89 [1 M]. A oligodendroglia foi identificada pelo anticorpo anti-CNPase e por sua morfologia. Com 30 min de tratamento com forscolina, as células das culturas tratadas apresentaram prolongamentos maiores e menos véus de membrana quando comparadas às culturas controle. O tratamento com SQ também causou um aumento no tamanho dos prolongamentos e o tratamento com H-89 causou a redução no tamanho dos prolongamentos e nos véus de membrana. Com 24 h, as células tratadas com forscolina apresentaram poucos prolongamentos, já as culturas tratadas com SQ apresentaram um aumento no tamanho do prolongamento e as tratadas com H-89 demonstraram redução no véu de membrana. Observamos também alterações na distribuição da CNPase, tubulina e MAG, a primeira apresentou uma concentração próxima ao núcleo depois dos dois tempos de tratamento com H-89, o mesmo ocorreu com a tubulina. A CNPase adquiriu ainda um padrão puntiforme depois de 24 h de tratamento com ambos os inibidores. A MAG apresentou um aumento na concentração próximo ao núcleo depois de 30 min de tratamento com forscolina e SQ. O tratamento com SQ também reduziu a distribuição da MAG nos véus de membrana. A mesma redução foi observada depois de 24 h de tratamento com H-89. Esses resultados reforçam a participação da via do AMPc/PKA no desenvolvimento da oligodendroglia, incluindo a formação dos prolongamentos, suas ramificações e ainda a formação dos véus de membrana, com prováveis consequências na formação e manutenção da bainha de mielina. / Oligodendroglial differentiation depends on coordinated changes in the cytoskeleton and on its relationship with the plasmatic membrane, a critical site regarding the formation of the myelin sheath. 23cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase (CNPase) is related to cytoskeleton modulation, anchoring microtubules to the plasmatic membrane. In vitro, CNPase composes, together with F-actin and microtubules, the vein-like structures or radial components in myelin sheath. Myelin associated glycoprotein (MAG) is important to membrane vellum formation and is associated with CNPase and tubulin. Besides, the AMPc/PKA pathway can regulate these three proteins. In order to evaluate the effects of the cAMP/PKA pathway modulation on oligodendroglial differentiation, cultures of cerebral hemispheres were treated for 30 min or 24 h with the adenylyl cyclase inhibitor SQ22536 SQ [1 lM] or with its activator forskolin [10 lM], or with the PKA inhibitor H-89 [1 lM]. Oligodendroglia was identified using anti-CNPase antibody as also by morphology. At 30 min, the cells treated with forskolin showed bigger processes and a shorter membrane vellum when compared to control cultures, the treatment with SQ caused an increase in the processes length, the H-89 treatment reduced the processes length and the membrane vellum. At 24 h, cultures treated with forskolin showed few processes when compared to control cultures. Cultures treated with SQ showed an increase in the processes length and after H89 treatment oligodendroglial cells presented a reduction in the membrane vellum. We also observed alterations in the distribution of CNPase, tubulin and MAG, the first showed an increase in the distribution closest to nucleus in both periods of H-89 treatment, the same pattern occurred for tubulin. The CNPase acquired a punctiform pattern after 24 hours of treatment with both inhibitors. The MAG also showed an increase closest to nucleus after 30 minutes of treatment with forskolin and SQ. The SQ treatment also caused a reduction in the protein distribution to membrane vellum. The same reduction is observed after 24 hours of treatment with H-89.These findings reinforce a role for AMPc/PKA pathway in oligodendroglial differentiation including the processes extension and arborization as also the formation of membranar vellum, with possible consequences in the formation and maintenance of myelin sheath.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A diferenciação da oligodendroglia depende de alterações coordenadas no citoesqueleto e na sua relação com a membrana plasmática, um componente importante para a formação da bainha de mielina. A 23 nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) está relacionada com a organização do citoesqueleto, sendo uma proteína ancoradoura de microtúbulos na membrana plasmática. In vitro, a CNPase compõe, com a F-actina e os microtúbulos, as estruturas semelhantes a nervuras ou os componentes radiais. A glicoproteína associada a mielina (MAG), também é importante para a formação dos véus de membrana e está associada a CNPase e a tubulina. Além disso, as três proteínas podem ser reguladas pela via de sinalização do AMPc/PKA. Buscando avaliar os efeitos da via do AMPc/PKA na regulação da diferenciação oligodendroglial, culturas de hemisférios cerebrais com 5 dias foram tratadas por 30 min ou 24 h com o inibidor (SQ22356-SQ [1 M]) ou com o ativador (forscolina [10M]) da adenilato ciclase ou com o inibidor da PKA, H-89 [1 M]. A oligodendroglia foi identificada pelo anticorpo anti-CNPase e por sua morfologia. Com 30 min de tratamento com forscolina, as células das culturas tratadas apresentaram prolongamentos maiores e menos véus de membrana quando comparadas às culturas controle. O tratamento com SQ também causou um aumento no tamanho dos prolongamentos e o tratamento com H-89 causou a redução no tamanho dos prolongamentos e nos véus de membrana. Com 24 h, as células tratadas com forscolina apresentaram poucos prolongamentos, já as culturas tratadas com SQ apresentaram um aumento no tamanho do prolongamento e as tratadas com H-89 demonstraram redução no véu de membrana. Observamos também alterações na distribuição da CNPase, tubulina e MAG, a primeira apresentou uma concentração próxima ao núcleo depois dos dois tempos de tratamento com H-89, o mesmo ocorreu com a tubulina. A CNPase adquiriu ainda um padrão puntiforme depois de 24 h de tratamento com ambos os inibidores. A MAG apresentou um aumento na concentração próximo ao núcleo depois de 30 min de tratamento com forscolina e SQ. O tratamento com SQ também reduziu a distribuição da MAG nos véus de membrana. A mesma redução foi observada depois de 24 h de tratamento com H-89. Esses resultados reforçam a participação da via do AMPc/PKA no desenvolvimento da oligodendroglia, incluindo a formação dos prolongamentos, suas ramificações e ainda a formação dos véus de membrana, com prováveis consequências na formação e manutenção da bainha de mielina. / Oligodendroglial differentiation depends on coordinated changes in the cytoskeleton and on its relationship with the plasmatic membrane, a critical site regarding the formation of the myelin sheath. 23cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase (CNPase) is related to cytoskeleton modulation, anchoring microtubules to the plasmatic membrane. In vitro, CNPase composes, together with F-actin and microtubules, the vein-like structures or radial components in myelin sheath. Myelin associated glycoprotein (MAG) is important to membrane vellum formation and is associated with CNPase and tubulin. Besides, the AMPc/PKA pathway can regulate these three proteins. 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We also observed alterations in the distribution of CNPase, tubulin and MAG, the first showed an increase in the distribution closest to nucleus in both periods of H-89 treatment, the same pattern occurred for tubulin. The CNPase acquired a punctiform pattern after 24 hours of treatment with both inhibitors. The MAG also showed an increase closest to nucleus after 30 minutes of treatment with forskolin and SQ. The SQ treatment also caused a reduction in the protein distribution to membrane vellum. The same reduction is observed after 24 hours of treatment with H-89.These findings reinforce a role for AMPc/PKA pathway in oligodendroglial differentiation including the processes extension and arborization as also the formation of membranar vellum, with possible consequences in the formation and maintenance of myelin sheath.

Orientador: Angelo Berchieri Junior / Resumo: Salmonella Heidelberg (SH) é um dos sorovares do gênero Salmonella capaz de infectar tanto seres humanos quanto animais. Surtos infecciosos em seres humanos estão relacionados principalmente à ingestão de produtos de origem avícola e o tratamento é realizado com o uso de antimicrobianos. Entretanto, estas drogas também são utilizadas na produção avícola como melhoradores de desempenho, o que resulta em resistência bacteriana em SH, já relatada em literatura. Com isso, o objetivo deste estudo foi caracterizar 62 isolados de SH quanto ao fenótipo de resistência a 20 antimicrobianos; identificar o genótipo de resistência aos β-lactâmicos por meio da PCR; e avaliar a similaridade dos isolados utilizando as metodologias ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR e PFGE. Todas as estirpes de SH foram confirmadas por PCR e submetidas aos testes de sensibilidade a 20 antimicrobianos. A resistência foi observada em 16 dos 20 antimicrobianos utilizados, ressaltando a elevada resistência aos β-lactâmicos (CEF, FOX, AMP, CTX, AMX, AMC e IMP) com a identificação de 41 estirpes multirresistentes. A partir da PCR identificou-se genes codificadores de enzimas ESBL e AmpC, havendo predominância do gene blaCMY-2. O PFGE demonstrou ser a metodologia com a maior diversidade em comparação as demais utilizadas, com a maioria das estirpes sendo agrupadas de acordo com a fonte de isolamento. A partir dos resultados deste estudo é possível observar a diversidade dos isolados de SH no Brasil albergando genes AmpC e a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Salmonella Heidelberg (SH) is one of the serovars of the Salmonella genus capable of infecting both humans and animals. Infectious outbreaks in humans are mainly related to the consumption of products of poultry origin and the treatment is carried out with the use of antimicrobials. However, these drugs are also used in poultry production as performance enhancers, which results in bacterial resistance in SH, already reported in the literature. Thus, the aim of this study was to characterize 62 SH isolates regarding the phenotype of resistance to 20 antimicrobials; identify the genotype of resistance to β-lactams by means of PCR; and to evaluate the similarity of the isolates using the ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR and PFGE methodologies. All strains of SH were confirmed by PCR and subjected to sensitivity tests to 20 antimicrobials. Resistance was observed in 16 of the 20 antimicrobials used, highlighting the high resistance to β-lactams (CEF, FOX, AMP, CTX, AMX, AMC and IMP) with the identification of 41 multidrug resistant strains. From the PCR, genes encoding ESBL and AmpC enzymes were identified with a predominance of the blaCMY-2 gene. The PFGE proved to be the methodology with the greatest diversity compared to the others used with the majority of strains being grouped according to the isolation source. From the results of this study, it is possible to observe the diversity of SH isolates in Brazil harboring AmpC genes and presenting different profiles of phenotypic multid... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dans le système nerveux central, le principal effecteur de la voie de transduction de l'AMPc<br />est la protéine kinase activée par l'AMPc (PKA). L'activation de la PKA est impliquée dans de<br />nombreux processus comme la modulation de l'excitabilité neuronale par phosphorylation de<br />canaux ioniques, de l'homéostasie cellulaire par phosphorylation de cibles cytosoliques et de la<br />régulation génique par phosphorylation de facteurs de transcription. La régulation de l'activité de la<br />PKA ainsi que son activation spatiale et temporelle sont des paramètres indispensables à la<br />compréhension des mécanismes cellulaires à l'origine des effets de cette voie de seconds messagers.<br />Faute d'approches méthodologiques adaptées, très peu d'études se sont intéressées à la dynamique<br />spatiale et temporelle, à la spécificité et à la régulation de l'activité de la PKA dans les neurones.<br />Grâce aux sondes fluorescentes codées génétiquement, il est possible maintenant d'avoir<br />accès à ces paramètres. A l'aide d'un vecteur viral, nous avons fait exprimer une sonde sensible à<br />l'activité PKA (sonde AKAR pour A-kinase activity reporter) dans des préparations de neurones en<br />tranches. Cette sonde utilise le principe du transfert d'énergie par résonance (FRET) et permet de<br />mesurer par imagerie ratiométrique l'activité kinase de la PKA. Nous avons montré que la sonde<br />AKAR2, exprimée dans les neurones, modifie son spectre d'émission en réponse à une stimulation<br />de la voie AMPc. L'utilisation d'une sonde mutante, dont le site de phosphorylation a été modifié,<br />démontre que les changements observés dans le spectre d'émission de la sonde AKAR2 sont bien<br />attribuables à une phosphorylation.<br />Dans une première partie, nous avons étudié la phosphorylation de protéines cibles de la<br />PKA dans différents compartiments subcellulaires en réponse à différentes stimulations<br />extracellulaires. La phosphorylation de la sonde AKAR2, nous a permis de suivre en temps réel<br />l'activité de la PKA dans le cytosol. Afin de mesurer l'activité de la PKA dans le noyau, nous avons<br />adressé la sonde AKAR2 en utilisant un signal de localisation nucléaire (NLS). Enfin, la mesure de<br />l'activité de la PKA à la membrane a été réalisée grâce à l'étude de la phosphorylation des canaux<br />responsables du courant de l'AHP lente (IsAHP). Nous avons montré que la phosphorylation des<br />canaux ioniques est plus rapide que la phosphorylation des cibles cytosoliques, elles-mêmes plus<br />rapide que la phosphorylation des protéines nucléaires. De plus, nous avons montré que l'activité de<br />la PKA stimulée par l'activation de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est différente de<br />l'activation directe des adénylyl cyclases (AC). En effet, l'activation de la PKA résultant de la<br />stimulation des RCPG produit des amplitudes de phosphorylation plus faible de la sonde AKAR2<br />dans le cytosol et le noyau.<br />Dans une deuxième partie, nous avons étudié le rôle des phosphodiestérases de type 4<br />(PDE4) dans la régulation des réponses β-adrénergiques. L'inhibition des PDE4 produit une<br />activation de la PKA dans les neurones traduisant ainsi une activité tonique des AC. Nous montrons<br />également que l'inhibition des PDE4 permet de potentialiser l'activité de la PKA en réponse à de<br />faibles concentrations d'agonistes β adrénergiques. Cette famille de PDEs, en dégradant l'AMPc,<br />participe donc à la régulation et la propagation des signaux PKA dans les neurones.<br />Enfin, au cours de ma thèse, je me suis également intéressé au γ-hydroxybutyrate (GHB)<br />composé qui est utilisé pour soigner certains troubles du sommeil et provoque chez le rat<br />l'apparition de signes comportementaux et de tracés encéphalographiques similaires à ceux observés<br />chez l'humain lors de crises d'épilepsie de type absence. L'ensemble de ces effets du GHB passe<br />probablement par une action sur la boucle thalamocorticale mais les mécanismes cellulaires à leurs<br />origines sont inconnus. Nous avons montré grâce à l'utilisation d'enregistrements<br />électrophysiologiques, que les courants post-synaptiques inhibiteurs sont beaucoup moins sensibles<br />au GHB que les courants post-synaptiques excitateurs et les courants potassiques à rectification<br />entrante (GIRK). Cette différence de sensibilité serait à l'origine d'un déséquilibre de la balance<br />excitation/inhibition reçue par les neurones thalamocorticaux ce qui participerait à la genèse d'une<br />activité oscillante du potentiel membranaire de ces neurones.

De plus en plus d'études désignent les canaux K+ et Ca2+ comme de nouvelles cibles très prometteuses pour des thérapies anticancéreuses. Parmi ces canaux, les canaux SK3 et CaV1.3 ont été identifiés comme des régulateurs de la migration des cellules cancéreuses. Lors de mes travaux de thèse, nous avons découvert une nouvelle voie de signalisation montrant que la protéine αlD du canal CaVl.3 est impliquée dans la régulation de l'homéostasie Ca2+ ainsi que dans la migration cellulaire, par un mécanisme indépendant de sa fonction canonique. En parallèle nous avons identifié des résidus sérines du canal SK3 qui sont importants dans la régulation négative du canal SK3 par l'activation de la voie AMPc-PKA. Ces résultats suggèrent également que l'Ohmline, un éther-lipide de synthèse, inhibiteur du canal SK3, ne réduit pas l' activité du canal SK3 en favorisant sa phosphorylation suite à l'activation de la voie AMPc-PKA. / Many studies show that K+ and Ca2+ channels are promising new targets for anticancer therapies. Among these channels, SK3 and Ca V 1.3 ion channels have been identified as regulators of cancer cell migration. Here, we have discovered a new signalization pathway showing that the αlD protein of the CaV1 .3 channel is involved in the regulation of Ca2+ homeostasis and in cell migration by a mechanism independent of its canonical function. In parallel, we have identified serine residues of SK3 channel that are important in the negative regulation of the SK3 channel by activation of the cAMP-PKA pathway. These results also suggest that Ohmline, a synthetic ether-lipid, and inhibitor of SK3 channel, does not reduce the activity of SK3 channel by promoting its phosphorylation following the activation of the cAMP-PKA pathway.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-09-20T11:52:49Z No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 663329 bytes, checksum: a6ecc4c9fdb1483811c9adc9cb8fad2c (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-09-26T20:23:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 663329 bytes, checksum: a6ecc4c9fdb1483811c9adc9cb8fad2c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-26T20:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 663329 bytes, checksum: a6ecc4c9fdb1483811c9adc9cb8fad2c (MD5) Previous issue date: 2010-12-10 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / As infecções do trato urinário (ITU) são manifestações freqüentes na população, geralmente causadas por bacilos Gram-negativos. As β-lactamases são enzimas bacterianas que conferem resistência aos antimicrobianos do tipo β-lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas, aztreonam e carbapenêmicos). A produção de β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) tem sido descrita como um importante mecanismo de resistência aos β-lactâmicos. De maneira geral, Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae são as espécies bacterianas mais comumente encontradas produzindo ESBL, embora a detecção dessas enzimas já tenha sido observada em diversos gêneros dentro da família Enterobacteriaceae. O objetivo deste estudo foi avaliar os perfis de susceptibilidade a antimicrobianos e correlacionar os testes fenotípicos com a detecção de marcadores genéticos para produção de β-lactamases dos tipos ESBL, AmpC e KPC em enterobactérias associadas à etiologia de ITUs em pacientes atendidos em um Laboratório de Análises Clínicas da cidade de Juiz de Fora, MG. Para o estudo restrospectivo (20012008), 66.660 isolados de urina com suspeita de ITU foram analisadas, e após a identificação bioquímica, as linhagens de enterobactérias foram submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos, pelo método de disco-difusão, de acordo com as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute/CLSI. A detecção fenotípica da produção de ESBL foi feita através do teste de aproximação dos discos. Para o estudo prospectivo (2009), 12.304 amostras com suspeita de ITU foram avaliadas, e após a identificação bioquímica das linhagens, foram feitos os testes de susceptibilidade aos antimicrobianos e o teste de aproximação dos discos, para a detecção fenotípica da produção de ESBL. A identificação dos marcadores de β-lactamase (SHV, TEM, CTX-M, AMPc e KPC) foi feita por reação em cadeia da polimerase (PCR). De 416 linhagens produtoras de ESBL entre 2001- 2008, E. coli foi a mais freqüente (74,4%). Altos níveis de resistência foram obtidos para sulfazotrim, gentamicina e ciprofloxacina neste período. Todas as linhagens foram sensíveis ao imipenem. No estudo prospectivo, 105 linhagens produtoras de ESBL foram isoladas, sendo E. coli a mais freqüente (63%). Foi observado um alto índice de resistência a amoxacilina-clavulanato (80,8%), e aproximadamente 70% das amostras foram resistentes à associação trimetoprim/sulfametoxazol e as fluoroquionolonas (ciprofloxacina e ácido nalidíxico). Dentre as drogas utilizadas como substrato para detecção de ESBL, a cefotaxima foi o substrato com maior índice de resistência (86,6%), seguido de aztreonam (60,9%) e ceftazidima (55,2%). Entre as 105 linhagens recuperadas, todos os marcadores genéticos pesquisados para ESBL foram detectados. Considerando-se a freqüência de detecção dos marcadores genéticos, TEM foi o mais frequente (86,6%), seguido por SHV (59%), CTX-M (31,4%) e AMPc (27,6%). Em todas as linhagens bacterianas avaliadas, foi detectado pelo menos 1 dos marcadores genéticos associados à produção de β-lactamases (22,8%), 52,4% apresentaram 2 marcadores, 20% apresentaram 3 marcadores e 4,8% apresentaram 4 dos marcadores pesquisados. β-lactamases do tipo KPC não foram detectadas. O conhecimento da epidemiologia, dinâmica de disseminação e circulação destes marcadores genéticos de resistência a drogas constitui um dado clínico relevante, pois possibilita a instauração de uma terapia antimicrobiana mais adequada, bem como a construção de um banco de informações epidemiológicas, como ferramenta para contenção da expansão da disseminação dos genes de resistência aos antimicrobianos β-lactâmicos. / The urinary tract infections (UTI) are highly frequent within the population and usually caused by Gram-negative rods. The bacterial β-lactamases are enzymes which confer resistance against β-lactam antibiotics (penicillins, cephalosporins, aztreonam and carbapenems) amongst which Extended Spectrum β-Lactamases (ESBL) has been described as an important resistance mechanism to the β-lactam in Gram-negative bacteria. Generally, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae are the most frequent ESBL producing bacterial species, but its production by representatives of other bacterial genus within the Enterobacteriaceae family has already been documented. The aim of this study were to evaluate the antimicrobial susceptibility patterns and to correlate phenotypic tests with the detection of genetic markers for β-lactamases production such as ESBL, AmpC and KPC in enterobacteria associated to the UTI etiology in patients assisted at a Clinical Analyses Laboratory in Juiz de Fora, MG. From a retrospective study (2001-2008), 66.660 urine samples were analyzed, and the biochemically identified bacteria were submitted to antibiotic susceptibility testing by the disk-diffusion method, according to the Clinical Laboratory Standards Institute/CLSI guidelines. Further, phenotypic detection of the ESBL production was carried out through the disk approximation test. From a prospective study (2009), 12.304 samples were evaluated, and after the microbial identification, antibiotic susceptibility tests and disk approximation assays were performed, for ESBL phenotypic detection. Identification of β-lactamase genetic markers (SHV, TEM, CTX-M, AMPc and KPC) were performed through polymerase chain reaction (PCR). Out of 416 ESBL producing bacteria identified between 2001 and 2008, E. coli was the most frequent (74.4%). High resistance levels were obtained for trimethopim-sulfamethoxazole, gentamicin and ciprofloxacin in this period. All of the strains were sensitive to imipenem. Regarding the prospective study, 105 ESBL producing bacteria were isolated, being E. coli the most frequent (63%). A high resistance rate was observed against amoxacilin/clavulanic-acid (80.8%), and almost 70% of the samples were resistant to the association trimethopim-sulfamethoxazole and the fluoroquionolones (ciprofloxacin and nalidixic acid). Among the drugs for ESBL detection, the cefotaxime was the substrate with the highest resistance rate (86.6%), followed by aztreonam (60.9%) and ceftazidime (55.2%). Among these strains, all of the researched genetic markers for ESBL were detected. In regard to the frequency of detection of the genetic markers, TEM was the most frequent (86.6%), following by SHV (59%), CTX-M (31.4%) and AmpC (27.6%). In all of the bacterial strains it was detected at least 1 of the genetic markers associated to the production of β –lactamases. Two markers were detected in 52.4% and in 20% and 48%, at least 3 or 4 markers were detected, respectively. The KPC type β -lactamase was not detected. The knowledge about the epidemiology, spread dynamics and circulation of these resistance genetic markers to drugs among the different bacterial populations constitutes a relevant issue and makes possible the establishment of a more appropriated chemotherapy. Besides, the generation of basic epidemiological information may sustain for contention of the antimicrobial resistance and the spread of resistant genetic markers related to inactivation of β-lactam drugs.

Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique,... Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire. Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale). Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes. Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc. Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2. En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte.

A maturação in vitro do oócito é um dos fatores limitantes na produção in vitro de embriões. In vivo, esta maturação é um processo altamente orquestrado no qual a meiose é retomada pela onda de gonadotrofina que antecede a ovulação e que induz à queda dos níveis de AMPc no oócito. No entanto, os oócitos aspirados ao serem retirados dos folículos ovarianos retomam espontaneamente a maturação comprometendo a competência de seu desenvolvimento. O AMPc é sintetizado pela adenilato ciclase (AC) e degradado pelas fosfodiesterases (PDE), existindo algumas relacionadas à degradação do AMPc e outras do GMPc. Sendo assim, a proposição deste trabalho foi averiguar a contribuição de diferentes isoformas de fosfodiesterases na retomada da meiose e nos níveis de GMPc, AMPc e ainda, determinar quando há manutenção de AMPc em níveis elevados observando sua influência na competência oocitária e ativação da MAPK. Para isso, os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram maturados in vitro na ausência, presença ou associação de inibidores de PDEs-AMPc e GMPc específicas e FSHr. As amostras foram avaliadas em relação a: 1) taxa de maturação; 2) níveis intracelulares de AMPc e GMPc nos CCOs; 3) taxa de desenvolvimento de blastocistos ; 4) ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. Os resultados obtidos no primeiro experimento indiaram que o inibidor da PDE3 foi o mais eficaz (p&lt;0,05) em atrasar a retomada da meiose, às nove horas de maturação, porém, isolado ou em associação com o inibidor da PDE8, não foi capaz de alterar (p&gt;0,05) os níveis de AMPc. No experimento dois, o inibidor da PDE5 isolado não influenciou a retomada da meiose (p&gt;0,05), porém, quando associado aos inibidores da PDE3 e 8 houve atraso na retomada (p&lt;0,05) e ainda alteraram os níveis de GMPc e AMPc (p&lt;0,05) nas primeiras horas de maturação. O experimento três mostrou a influencia do FSHr durante a MIV, o qual estimulou a retomada da meiose, mas em associação com inibidores da PDE5 e 8 atrasa a retomada (p&lt;0,05). Além disso, o FSHr provoca aumento do nível de AMPc e sua associação com inibidores de PDE5 e PDE8 ocasionou elevação adicional (p&lt;0,05). As condições de cultivo estudadas no experimento quatro mostraram que a maturação induzida (pré-MIV de duas horas com agentes para elevar AMPc seguindo de 22 horas de MIV com FSH associado a inibidores de PDEs) atrasaram a retomada da meiose às nove horas de maturação, mas não afetaram progressão da meiose às 24, 28 e 30 horas. Os tratamentos, porém, não melhoraram a competência oocitária após a fertilização in vitro e ocasionaram pequenas variações na ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. / In vitro maturation of oocytes is a limiting factor in the in vitro production of bovine embryos. In vivo, this maturation is a highly orchestrated process in which meiosis resumption by the gonadotropin surge that precedes ovulation induces the decrease in cAMP levels in the oocyte. However, when oocytes are removed from follicles, they spontaneously resume maturation compromising the competence for its development. cAMP is synthesized by adenylyl cyclase (AC) and degraded by phosphodiesterases (PDE), and there are some PDEs related to degradation of cAMP and/or cGMP. Thus, the purpose of this work was to investigate the contribution of different isoforms of phosphodiesterases in the resumption of meiosis and levels of cAMP and, also, to determine differences in signaling pathways when maintaining high levels of cAMP and its influence on oocyte competence. For this purpose, cumulus-oocyte complexes (COC) were matured in vitro in the presence, absence or combination of inhibitors of cAMP- and cGMP-specific PDEs and FSH. Samples be were evaluated in relation to: 1) maturation rate, 2) intracellular levels of cAMP and cGMP in COCs, 3) rate of blastocyst development and 4) activation of MAPK in oocytes and cumulus cells. The results of the first experiment showed that the PDE3 inhibitor is more effective (p &lt;0.05) in delaying meiosis resumption, at nine hours of maturation, but was not capable of altering cAMP levels (p&gt; 0.05) either alone or in combination with the PDE8 inhibitor. In experiment two, the PDE5 inhibitor alone did not affect the meiosis resumption (p&gt; 0.05), however, when associated with PDE3 and PDE8 inhibitors it delayed their resumption (p &lt;0.05) and also altered cGMP and cAMP levels of (p &lt;0.05) in the early hours of maturation. The third experiments showed the influence of FSHr during IVM, which stimulated the resumption of meiosis, but in combination with PDE5 and PDE8 inhibitors meiosis was delayed (p &lt;0.05). Furthermore, FSHr causes increased levels of cAMP and its association with PDE5 and PDE8 inhibitors caused an additional increase (p &lt;0.05). Culture conditions studied in experiment four showed that induced maturation (pre-IVM for two hours with agents to elevate cAMP followed by 22 hours IVM with FSH associated with PDE inhibitors) delayed the resumption of meiotic maturation at nine hours, but has no effect on meiosis progression at 24, 28 and 30 hours. The treatments, however, did not improve oocyte competence after in vitro fertilization and caused minor variations in the activation of MAPK in oocytes and cumulus cells.