LIGHT, un membre de la famille du TNF, déclenche la mort des motoneurones et contribue à la progression de la dégénérescence des motoneurones chez les souris modèles de la sclérose latérale amyotrophique. Étonnement, nous montrons que LIGHT peut également stimuler la croissance axonale in vitro et est nécessaire à la régénération axonale des motoneurones in vivo lors d'une lésion nerveuse périphérique. La compréhension des mécanismes dictant la bivalence de son récepteur mène à l'étude des effets de la régionalisation du signal LIGHT. Les chambres microfluidiques en isolant les axones des corps cellulaires, nous ont permis d'étudier la résultante fonctionnelle d'une stimulation axonale et somatique par LIGHT. Nous montrons que LIGHT active différentiellement la mort, quand il agit au niveau somatique, ou la régénération axonale, quand il stimule l'axone. L'ensemble de ces résultats mène à de nouvelles approches où l'administration de LIGHT au niveau du nerf lésé et du muscle correspondant nous renseignera sur le potentiel thérapeutique de LIGHT lors d'une lésion du système nerveux. / LIGHT, a member of the TNF superfamily, triggers death of motoneurons and contribute to the progression of motoneuron degeneration in an ALS mouse model. Interestingly, we demonstrate that LIGHT can elicit neurite outgrowth in vitro and contribute to axon regeneration in vivo following nerve injury. To better understand mechanisms governing the opposite effects of LIGHT on motoneurons we asked whether a regional activation of LIGHT pathway could trigger these opposite responses. Toward this goal we used microfluidic chambers to isolate the soma from the axon of motoneurons. We shows that LIGHT activates differentially motoneurons death when it acts at the soma and axon outgrowth when it acts at the level of the axon. Together, these results lead us to evaluate new therapeutic approaches to nerve injury.

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative au cours de laquelle les motoneurones meurent. Le premier dysfonctionnement des motoneurones est la rétractation de leurs jonctions neuromusculaires. La présence de vacuoles a été décrite dans l’axone et les dendrites des motoneurones avant la dénervation dans les souris SOD1G93A, modèle murin de la maladie. L’origine des vacuoles n’est pas connue. On peut toutefois se demander si elle pourrait résulter d’un stress excitotoxique. L’excitotoxicité pourrait provenir soit d’une hyperexcitabilité intrinsèque du motoneurone, soit d’une hyperexcitation (balance des entrées excitatrices et inhibitrices modifiées au profit d’une plus grande excitation). Or il a été montré que si les motoneurones sont hyperexcitables au stade embryonnaire dans les souris SOD1G93A, seuls les motoneurones résistants à la SLA (type S) sont hyperexcitables à la deuxième semaine postnatale tandis que les motoneurones vulnérables (types FF et FR) deviennent hypoexcitables avant leur dégénérescence chez l’adulte. Nous avons donc étudié les entrées synaptiques reçues par les motoneurones, pour savoir si la balance excitation/inhibition est déplacée et s’ils sont ainsi hyperexcités. Pour cela nous avons réalisé des enregistrements électrophysiologiques de motoneurones lors de la stimulation de circuits pré-moteurs, et des marquages intracellulaires de motoneurones combinés avec des marquages immunohistochimiques des boutons VGlut1, VGlut2 et Vgat. Nous avons montré que l’amplitude des PPSE monosynaptiques Ia était diminuée dans les souris SOD1, les PPSI di- et trisynaptiques étaient moins nombreux et les interneurones inhibiteurs moins excitables. Cette modification des entrées synaptiques n’était pas due à un changement du nombre de synapses. En revanche, les synapses sont particulièrement nombreuses aux domaines dendritiques qui se vacuolisent dans les souris SOD1, suggérant un lien entre l’activité synaptique et la vacuolisation. Des marquages intracellulaires de motoneurones de souris SOD1, montrent que les vacuoles grandissent avec l’évolution de la maladie, suggérant leur implication dans le processus de dégénération. Grâce à des révélations immunohistochimiques, nous avons montré que ces vacuoles apparaissent dans l’espace intermitochondrial lors de la dégénérescence des mitochondries. Le réticulum endoplasmique est également impliqué. Enfin, l’autophagie, mécanisme d’élimination des organites cellulaires, est déficient au moment de l’apparition des vacuoles, expliquant pourquoi elles s’accumulent avec le temps. Ces résultats amènent à reconsidérer l’hypothèse de l’excitotoxicité supposée comme mécanisme à l’origine de la mort des motoneurones. / Glutamate excitotoxicity arising from excessive entry of calcium in the cell, has long been suggested to contribute to the degeneration of motoneurons in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). This hypothesis is enhanced by the observation of vacuoles on motoneurones dendritic tree. Such vacuoles were previously observed on neurons under excitotoxic stress. Excitotoxicity may stem from an intrinsic hyperexcitability of the motoneurons or from a shift of the balance of excitatory / inhibitory inputs received by the motoneurons toward more excitation. Thanks to an in vivo preparation that allows us to make intracellular recordings of motoneurons in adult mice, it was shown that spinal motoneurons do not display an intrinsic hyperexcitability just prior to their degeneration in SOD1 G93A mice, the standard model of ALS. Thus, to study excitotoxicity hypothesis, we decided to study dendritic vacuoles and undersand their genesis, and then to study synaptic inputs on motoneurons, to decipher if there is a hyperexcitability. We have shown, with intracellular labelling and immunohistochemistry, that vacuoles grow with age, that they appear in the intermembrane space of mitochondria, and that deficiency in autophagy prevent their elimination. With electrophysiological recordings, we have shown that monosynaptic EPSP amplitude is reduced in SOD1 mice. IPSP were less numerous and inhibitory interneurons were less excitable. These alterations were not due to synapses numbers, however synapses are preferentially localised on dendritic places that vacuolate, suggesting a link between synaptic activity and vacuolation. These results suggest that excitotoxicity might not be the mecanism of motoneuron death.

La sclérose amyotrophique latérale (SLA) est une maladie neurodégénérative due à la dégénérescence des motoneurones supérieurs dans le cortex moteur et des motoneurones inférieurs situés dans la moelle épinière et le tronc cérébral. La perte des neurones moteurs provoque l’atrophie et la paralysie progressive des muscles. Notre laboratoire a démontré en 2013 que la dégénérescence associée à la SLA n’était pas limitée aux motoneurones mais aussi aux neurones sérotoninergiques chez les patients et les modèles animaux de SLA. L’objectif de ma thèse a été de caractériser le rôle des neurones sérotoninergiques dans la SLA. On a observé une augmentation de l’expression du gène codant pour le récepteur 2B de la sérotonine (5-HT2B) chez les modèles murins de SLA. L’analyse du rôle du récepteur 5-HT2B dans le cas de SLA a montré que ce dernier est un modulateur de la maladie. La perte du récepteur 5-HT2B accélère la progression de la maladie et modifie la régulation de la réponse inflammatoire. En plus, nos travaux ont révélé que la perte des neurones sérotoninergiques est à l’origine du développement de la spasticité, un symptôme douloureux chez les patients SLA. Ces résultats ouvrent la voie à des approches thérapeutiques qui ciblent cette population neuronale affectée lors de la maladie pour traiter la spasticité et la neuroinflammation au cours de la maladie. / Amyotrophic lateral sclerosis (SLA) is a neurodegenerative disease characterize by the loss of upper motor neurons in the motor cortex and lower motor neurons in the brainstem and spinal cord. The loss of motor neurons leads to muscle atrophy and progressive paralysis. In 2013 our laboratory identified a new neuronal population affected in ALS. They observed the degeneration of serotoninergic neurons in ALS patients and animal models. For this, the aim of my PhD is to identify the role of serotoninergic neurons in case of ALS. We observed an upregulation of serotonin receptor 5-HT2B in ALS mice models. The investigation of the role of 5-HT2B receptor in case of ALS showed its role as a disease modulator. The loss of 5-HT2B receptor accelerated disease progression and modulated neuroinflammatory response. Moreover, our results showed that the loss of serotoninergic neurons is responsible of the development of spasticity, a painful symptom observed in ALS patients. All these opened the way for therapeutic strategies targeting spasticity and neuroinflammation in case of ALS.

L'existence d'une contre-irritation dyspnée-douleur, c'est-à-dire l'inhibition d'une sensation douloureuse par une sensation de dyspnée, permet d'établie une analogie forte dyspnée - douleur. La dyspnée de type " effort inspiratoire excessif " inhibe le réflexe spinal de flexion, ce qui indique qu'elle est au moins en partie médiée par des fibres C. Cette thèse approfondit les connaissances dans ce domaine. Elle montre que la dyspnée de type soif d'air possède des propriétés analgésiques procédant de mécanismes centraux puisqu'elle interagit avec les potentiels évoqués laser qui sont le reflet des mécanismes corticaux mis en jeu au cours de stimulation douloureuse. Elle évalue l'effet d'un antalgique non opioïde de pallier 1, le nefopam, sur une dyspnée expérimentale de type " effort inspiratoire excessif " sans mettre en évidence d'interaction du nefopam avec la contre-irritation dyspnée douleur. / Dyspnea – pain counter – irritation, namely the inhibition of nociceptive sensation by dyspneic sensation, indicates that dyspnea and pain share some mechanisms. Dyspnea of the work/effort type inhibits the spinal flexion reflex, meaning that it involves C-Fibers. This thesis aims at improving knowledge in this field. It shows that dyspnea of the air hunger type has analgesics properties proceeding from central mechanisms: “air hunger” indeed inhibits laser evoked potentials that depends on the pain-related activation of cortical networks. It also evaluates the effect of a non-opioid first step analgesic, nefopam, on an experimental dyspnea of the “work-effort” type, and shows that although nefopam acts on C-fibers, it does not attenuate dyspnea and does not modify dyspnea-pain counter-irritation as evaluated by laser-evoked potentials. Finally, the thesis brings the first evidence of dyspnea-pain interactions in the clinical setting, by showing that ALS patients treated by non-invasive ventilation exhibit heightened pain sensitivity concomitant to the relief of dyspnea. These data advance the current understanding of dyspnea mechanisms and open new perspectives for treatment evaluation.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) se définit cliniquement par la dégénérescence combinée des neurones moteurs cortico-spinaux (NMCS) et des motoneurones bulbaires et spinaux (MnB et MnS). Quoique l’idée d’une origine corticale de la SLA soit de plus en plus considérée, la pathologie corticale, la dynamique spatio-temporelle de la dégénérescence des NMCS et les voies moléculaires impliquées restent peu connues. Ce travail de thèse a essentiellement cherché à pallier ce manque. Nous avons montré que chez les souris Sod1G86R, la perte des NMCS, qui semble se produire en l’absence de gliose réactionnelle majeure, se manifeste de manière somatotopique et précède l'apparition des symptômes moteurs et la dégénérescence des MnS. Nous avons purifié, grâce au développement d'un nouveau protocole, les NMCS adultes du cortex cérébral de souris saines ou malades à quatre stades de la maladie. L’analyse RNA-seq a permis d’identifier de nouveaux acteurs moléculaires précoces pouvant fournir une base pour le développement d'approches thérapeutiques fondées sur le maintien de NMCS sains et fonctionnels, et à long terme, à initier des stratégies thérapeutiques alternatives pour la SLA. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is clinically defined as the combined degeneration of the corticospinal motor neurons (CSMN) along with the bulbar and spinal motor neurons (BMN and SMN). While a growing body of evidence points to the cerebral cortex as the potential initiation site of ALS, little is known about the cortical pathology, the spatio-temporal dynamics of CSMN degeneration, and the molecular pathways involved. This thesis work aimed at filling this knowledge gap. In Sod1G86R, we showed that CSMN loss seems to take place without major gliosis, occurs in a somatotopic manner and precedes motor symptom appearance and SMN degeneration. We purified, thanks to the development of a novel protocol, adult CSMN from the cerebral cortex of healthy or diseased mice from early presymptomatic ages to the end stage of the disease. The RNA-seq analysis has made it possible to identify new and early molecular players in ALS. This would provide a foundation for the development of therapeutic approaches based on the maintenance of healthy and functional CSMN, and, on the long run, may in turn inform the development of alternative therapeutic strategies for ALS.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une pathologie neurodégénerative progressive se déclarant vers 50-60 ans. Elle est majoritairement de nature sporadique son incidence est estimée à 1 :1000. La SLA mène à une paralysie progressive et entraine généralement à la mort des patients de 2 à 5 ans suivant le diagnostic aux suite d’une fonte musculaire importante liée à la perte des neurones moteurs. Au cours des années, plusieurs mutations ont été identifiées autant chez les patients atteints de SLA sporadique que de SLA familiale. Ces mutations interfèrent avec la fonction de gènes variés, tels que DCTN1, codant pour la protéine dynactine1, sous-unité du complexe multimoléculaire dynactine. Ce complexe sert d’adaptateur au moteur moléculaire dynéine, chargé du transport axonal rétrograde, où sa fonction permettrait de régir l’activité du complexe moteur et sa capacité à lier divers cargos. Nous avons donc entrepris la caractérisation d’une lignée de poissons zèbre mutants pour dynactin1a (nommés mikre okom632, mokm632), plus particulière en terme du développement d’un type de neurone moteur primaire (les CaPs), afin de déterminer l’effet de la perte de fonction de ce gène sur l’axonogenèse, la formation et la stabilisation de la jonction neuromusculaire, sur le comportement de l’embryon, ainsi que sur le transport axonal.Nous suggérons que dynactin1 favorise la stabilité synaptique, où une perte de fonction de ce gène entraine des défauts de croissance, des anomalies éléctrophysiologiques et un comportement anormal. Ce rôle semble être indépendant des fonctions connues de régulateur du moteur dynéine. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset neurodegenerative disease, which is mainly sporadic in nature. This progressive pathology has an estimated incidence of 1:1000 and generally leads to death within 2-5 years of diagnosis due to muscle wasting and severe motor neuron loss. Over the last years, mutations have been identified in both sporadic and familial ALS patients, interfering with the function of many genes, including DCTN1, which encodes for a subunit of the motor protein complex subunit dynactin. The dynactin complex serves as an adaptor for the dynein motor complex, responsible for retrograde axonal transport, and it is believed to regulate dynein activity and the binding capacity for cargos. We set out to characterize a mutant zebrafish line for dynactn1a (named mikre okom632, mokm632), looking specifically at caudal primary motor neurons (CaPs), with regard to axonal development, formation and stability of the neuromuscular junction (NMJ) and the behavioral phenotype produced in embryos, as well as axonal transport metrics. We suggest a role for dynactin1 in synapse stability, where the loss-of-function of this gene leads to growth defects, electrophysiological abnormalities and behavioral deficits. This role appears to be independent of its known function as a regulator of dynein, its implication in axonal transport, or its regulation of microtubule dynamics. With this study, we hope to elucidate key molecular mechanisms in ALS etiology by revealing the role of dynactin1 in NMJ development and maintenance.

Ce travail a porté sur les remaniements corticaux précoces des circuits moteurs et extramoteurs dans la SLA grâce à l'étude des activations IRMf issues de tâches motrices et cognitives. La première partie de nos travaux nous a permis de montrer grâce des tâches simples d'activation motrice en IRMf (1) qu'alors que les patients SLA présentaient un déficit moteur discret, une augmentation des activations corticales est apparue dans les aires sensorimotrices bilatérales du cerveau. (2) Ces modifications précoces de l'activité neuronale étaient corrélées à la latéralisation du déficit moteur du membre ou la prédominance manuelle et surtout, (3) au taux de progression de la maladie à un an et à la survie, suggérant que ce remaniement de l'activité qui correspond probablement à de la plasticité cérébrale a des implications fonctionnelles. Enfin, (4) ce phénomène apparaissait actif puisqu'il s'est poursuivi pendant au moins onze mois. Dans la deuxième partie, nous avons montré lors d'une tâche de fluence verbale silencieuse que (1) les SLA présentaient une suractivation initiale des aires dévolues au processus sémantique avec un renforcement de la connectivité fonctionnelle entre les réseaux (CFR). (2) Au bout de onze mois et alors que l'atteinte des fluences était stable, ce phénomène de compensation s'épuisait avec une diminution conjointe de l'activation des réseaux et de la CFR. La tâche de 2-Back, réalisée alors que les patients ne présentaient pas d'atteinte de la mémoire de travail lors des tests psychométriques, nous a permis de montrer en outre que certains circuits non-moteurs se réorganisaient très précocement chez les patients, alors même qu'ils étaient asymptomatiques

Les études sur les souris transgéniques SOD1 utilisées comme modèle de sclérose latérale amyotrophique (SLA) montrent que les signes cliniques apparaissent quand la majorité des motoneurones (MNs) est déjà déconnectée de la périphérie et la force contractile de certains muscles diminuée de 80%. L'identification des mécanismes pathologiques précoces est une étape importante pour améliorer notre compréhension de la maladie et expliquer l'atteinte préférentielle des MNs observée pendant la SLA. Notre objectif était de rechercher la présence d'anomalies précoces dès la naissance dans un modèle souris de SLA. L'analyse comportementale suggère que dès la période postnatale, la mutation SOD1-G85R perturbe la maturation du système sensori-moteur des souris transgéniques et ralentit l'expression de réflexes moteurs comme le montrent les retards observés lors des tests de placement et d'agrippement des membres postérieurs et lors du test de retournement. Ces retards pourraient principalement résulter d'un dysfonctionnement des réseaux lombaires de la moelle épinière pendant la 1ère semaine postnatale. Pendant cette période, sur les préparations in vitro de moelle épinière / tronc cérébral, les réseaux lombaires SOD1 sont difficilement activables lors d'applications pharmacologiques. Les enregistrements électrophysiologiques réalisés pendant cette période appuient principalement la possibilité que la composante glutamatergique possède un rôle clé dans cette difficulté. Nos données suggèrent la possibilité d'un déséquilibre entre les récepteurs AMPA et NMDA dans les MNs SOD1 avec un défaut lors de l'activation des récepteurs NMDA. En 2ème semaine postnatale, les MNs lombaires SOD1 sont hypoexcitables et présentent une résistance d'entrée ainsi qu'un gain plus faibles. Nous montrons que l'augmentation anormale de la surface dendritique de ces MNs suffit à expliquer cette diminution de la résistance d'entrée alors que la baisse du gain indique plutôt des modifications de conductances ioniques qui restent à caractériser. Enfin l'analyse morphologique montre que les dendrites des motoneurones SOD1 sont anormalement développées et complexes. Il est important de souligner dans le cadre de la maladie que les segments de la moelle sacrée et les interneurones lombaires qui sont épargnés à l'âge adulte ne sont pas concernés par ces différences. Cela renforce l'idée que les anomalies que nous décrivons sont spécifiques de la maladie et que dès le plus jeune âge les MNs sont la cible privilégiée de la SLA. Dans ce travail, nous montrons des dysfonctionnements des MNs bien avant la dénervation périphérique et la dégénérescence des axones moteurs. La modification de l'excitabilité des motoneurones pendant la période de maturation des unités motrices pourrait fragiliser les jonctions neuromusculaires qui sont une des cibles principales de la SLA.

TDP-43 est une protéine multifonctionnelle possédant des rôles dans la transcription, l'épissage des pré-ARNm, la stabilité et le transport des ARNm. TDP-43 interagit avec d'autres hnRNP, incluant hnRNP A2, via son extrémité C-terminale. Plusieurs membres de la famille des hnRNP étant impliqués dans la réponse au stress cellulaire, alors nous avons émis l’hypothèse que TDP-43 pouvait y participer aussi. Nos résultats démontrent que TDP-43 et hnRNP A2 sont localisés au niveau des granules de stress, à la suite d’un stress oxydatif, d’un choc thermique, et lors de l’exposition à la thapsigargine. TDP-43 contribue à la fois à l'assemblage et au maintien des granules de stress en réponse au stress oxydatif. TDP-43 régule aussi de façon différentielle les composants clés des granules de stress, notamment TIA-1 et G3BP. L'agrégation contrôlée de TIA-1 est perturbée en l'absence de TDP-43. En outre, TDP-43 régule le niveau d`ARNm de G3BP, un facteur de granule de stress de nucléation. La mutation associée à la sclérose latérale amyotrophique, TDP-43R361S, compromet la formation de granules de stress. Ainsi, la fonction cellulaire de TDP-43 s'étend au-delà de l’épissage; TDP-43 est aussi un composant de la réponse cellulaire au stress central et un acteur actif dans le stockage des ARNs. / TDP-43 is a multifunctional protein with roles in transcription, pre-mRNA splicing, mRNA stability and transport. TDP-43 interacts with other hnRNPs, including hnRNP A2, via its C-terminus and several hnRNP family members are involved in the cellular stress response. This relationship led us to investigate the role of TDP-43 in cellular stress. Our results demonstrate that TDP-43 and hnRNP A2 are localized to stress granules, following oxidative stress, heat shock, and exposure to thapsigargin. TDP-43 contributes to both the assembly and maintenance of stress granules in response to oxidative stress and differentially regulates key stress granules components including TIA-1 and G3BP. The controlled aggregation of TIA-1 is disrupted in the absence of TDP-43. In addition, TDP-43 regulates G3BP mRNA levels, a stress granule nucleating factor. A mutation associated with amyotrophic lateral sclerosis, TDP-43R361S, compromises stress granule formation. Thus, the cellular function of TDP-43 extends beyond splicing and places TDP-43 as a participant of the central cellular response to stress and an active player in RNA storage.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative due à une dégénérescence des motoneurones. Plus de 40 mutations du gène TARDBP ont été identifiées chez des patients SLA. Les défauts biochimiques de ces mutations étant encore inconnus, les modèles animaux sont présentement la seule mesure possible d’un phénotype. Pour étudier les conséquences physiopathologiques d’une de ces mutations, nous avons développé deux lignées transgéniques de poisson zébré, exprimant le gène humain TARDBP soit de type sauvage, soit avec la mutation G348C liée à la SLA, sous le contrôle d’un promoteur de choc thermique. Ces lignées ont été étudiées sur trois générations, après avoir établi un protocole de choc thermique induisant une expression ubiquitaire du transgène. Les embryons transgéniques de la génération F2 de la lignée exprimant la mutation développent un phénotype moteur suite à un choc thermique de 38.5°C pendant 30 minutes lorsque les embryons sont à 18 heures post-fertilisation. 60% des embryons ont une réponse anormale au toucher. De plus, une réduction de 28% de la longueur de pré-branchement des axones des motoneurones est observée. Ces résultats indiquent que notre lignée exprimant la protéine mutante TDP-43 est un modèle génétique de la SLA prometteur, qui ouvre des perspectives pour la compréhension de la physiopathologie de la maladie et la découverte de molécules thérapeutiques. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease due to motoneurons degeneration. More than 40 mutations of the gene TARDBP, coding for the protein TDP-43 have been found in ALS patients. As the biochemical defects of these mutations are not known, in vivo models are currently the only windows onto the pathology. To study the pathophysiological consequences of one of these mutations, we have generated two stable zebrafish transgenic lines, expressing the human gene TARDBP, either the wild-type version, or the G348C mutated version linked to ALS, under the control of a heat shock promotor. These lines were studied for three generation, after establishing a heat shock protocol sufficient to induce a ubiquitous expression of the transgene. The transgenic embryos of the F2 generation of the line expressing the mutant protein develop a motor phenotype after a 38.5°C heat shock for 30 minutes when the embryos are 18 hours post-fertilization. 60% of these embryos have an abnormal touch escaped evoked response, and a 28% reduction of the pre-branching axonal length of the motoneurons axons. These results indicate that our line expressing the mutant TDP-43 protein is a promising genetic model of ALS, opening perspectives for the pathophysiological understanding of the disease, and the discovery of new therapeutics.