Orientadora: Profª. Drª. Herberto José Chong Neto / Coorientador: Prof. Dr. Nelson Augusto Rosário Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva. Defesa: Curitiba,02/06/2017 / Inclui referências : f. 106-114 / Resumo: Anafilaxia é uma reação de hipersensibilidade generalizada ou sistêmica, reconhecida como uma das mais dramáticas condições emergenciais já identificadas. Tendo em vista que a abordagem apropriada pode representar a diferença entre a vida e a morte, o presente estudo teve como objetivos: 1) verificar o nível de conhecimento dos médicos sobre o manejo da anafilaxia nos serviços que atendem a urgências e emergências em Curitiba-PR, sendo estes: hospitais públicos ou privados e Unidades de Pronto Atendimento / Serviço de Atendimento Móvel de Urgência (UPA/SAMU), e 2) levantar informações acerca de treinamento periódico em serviço sobre este quadro clínico nas instituições participantes. Foram pesquisados cento e cinquenta e sete médicos que atuavam em oito hospitais e nove Unidades de Pronto Atendimento do município, por meio de questionário autoaplicável. Os resultados obtidos permitiram considerar o nível de conhecimento dos médicos de Curitiba superior ao encontrado em outras duas cidades brasileiras que utilizaram a mesma metodologia, no entanto, com importantes deficiências quando comparado a estudos internacionais que também adotaram métodos semelhantes. Os médicos que atuavam no segmento hospitalar demonstraram melhor conhecimento do que os que atuavam em UPA/SAMU na maioria dos aspectos pesquisados. Os participantes com tempo de formação de um a dez anos também obtiveram melhor desempenho quando comparados aos formados há mais de dez anos. No entanto, nenhum dos segmentos ou grupos obteve resultados considerados satisfatórios. As principais deficiências encontradas foram: conhecimento insuficiente quanto à adrenalina intramuscular e à possibilidade de reaplicação desta, desconhecimento sobre a utilização do glucagon e do posicionamento do paciente com membros inferiores elevados. O tempo de observação considerado pelos médicos após a resolução do quadro anafilático representou o único resultado visivelmente favorável encontrado nesta amostra. Verificou-se, ainda, que não existe treinamento periódico sobre a anafilaxia nos serviços pesquisados. Pretende-se, a partir disto, alertar os profissionais e gestores quanto à necessidade de conhecimento acerca deste quadro clínico potencialmente fatal, principalmente quando não tratado adequadamente. Descritores: anafilaxia, conhecimento, serviços médicos de emergência, epinefrina. / Abstract: Anaphylaxis is a generalized or systemic hypersensitivity reaction, recognized as one of the most dramatic emergency conditions ever identified. Considering that the appropriate approach may represent the difference between life and death, the present study aimed to: 1) verify the level of knowledge of physicians on the management of anaphylaxis in emergency services in Curitiba-PR, being: public or private hospitals and Emergency Care Units / Mobile Emergency Attendance Service, and 2) collect information about in-service periodic training on this clinical picture in the institutions surveyed. METHODS: One hundred fifty-seven physicians who worked in eight hospitals and nine Emergency Care Units in the city were surveyed using a self-administered questionnaire. The results obtained allowed to consider the level of knowledge of physicians from Curitiba better than that found in other two Brazilian cities that used the same methodology, however, with important deficits when compared to international studies which also adopted similar methods. The physicians who worked in the hospital group demonstrated better knowledge than those who worked in Emergency Care Units / Mobile Emergency Attendance Service in most of the aspects surveyed. Participants with training time from one to ten years also performed better when compared to those trained more than ten years ago. However, it should be clarified that none of the groups obtained satisfactory results. The main deficits were: insufficient knowledge about adrenaline intramuscular and the possibility of reapplication of this, lack of knowledge about the use of glucagon and the positioning of the patient with lower extremities elevated. The observance period considered by the physicians after a resolution of the anaphylactic case represents the only outcome visibly favorable found in this sample. It was also verified that there is no periodic training on anaphylaxis in the services surveyed. It is intended, therefore, to alert professionals as well as managers to the need of awareness about this potentially fatal clinical situation, especially when not treated properly. Keywords: anaphylaxis, knowledge, emergency medical services, epinephrine.

46 p. / Submitted by CARDOSO ALFREDO (alfredogbi@hotmail.com) on 2013-08-01T20:30:50Z No. of bitstreams: 1 Augusto Peixoto Lavinas II (1921).pdf: 4829248 bytes, checksum: e5adf290f7e700ab3b27ed595101025a (MD5) / Approved for entry into archive by Ribeiro Graça (graca.mr@hotmail.com) on 2013-08-07T16:28:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Augusto Peixoto Lavinas II (1921).pdf: 4829248 bytes, checksum: e5adf290f7e700ab3b27ed595101025a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-07T16:28:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Augusto Peixoto Lavinas II (1921).pdf: 4829248 bytes, checksum: e5adf290f7e700ab3b27ed595101025a (MD5) / Tese de Verificação de Título apresentada à Faculdade de Medicina da Bahia. É abordado o conceito de anafilaxia, descrevendo suas manifestações e teorias que explicam a gênese das hipersensibilidades, as aplicações dos conhecimentos a acerca desse tema na prática médica, da soroterapia antitetânica e antidifterica. Relata também, a doença do soro e as anafilaxias causadas pela ingestão de alguns alimentos.

BEZERRA, Camila Freitas. Propriedades toxicológicas e imunomoduladoras de proteínas laticíferas de Calotropis procera. 2017. 145 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PGBioquímica (pg@bioquimica.ufc.br) on 2017-08-25T14:33:47Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfbezerra.pdf: 4291809 bytes, checksum: 5247178968ce0e96ccc0cdf45a51171b (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-25T20:15:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfbezerra.pdf: 4291809 bytes, checksum: 5247178968ce0e96ccc0cdf45a51171b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-25T20:15:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfbezerra.pdf: 4291809 bytes, checksum: 5247178968ce0e96ccc0cdf45a51171b (MD5) Previous issue date: 2017 / Calotropis procera (Ait.) R.Br is a lactiferous plant, recognized for its pharmacological properties. The latex soluble proteins (LP) of this plant present anti-inflammatory, antitumor, anti-arthritis, among others activities. Despite the studies carried out regarding the phytotherapic potential of LP, knowledge about its toxicological and immunomodulatory properties is still incipient. Preliminary study on the immunomodulatory potential of PL by subcutaneous and oral route showed that this fraction was able to induce immune response subcutaneously, with production of IgE and symptoms of anaphylaxis, but with almost no immune response orally. The objective of this study was to determine the toxicological and immunomodulatory potential of the latex of Calotropis procera. LP was processed and characterized for use in vivo assays. The toxicity tests were performed in oral and intraperitoneal Swiss mice, evaluating the behavioral, hematological, biochemical and histological profile. Immunomodulatory activity was determined by oral tolerance protocol in BALB / c mice, and the level of antibodies, cytokines, DTH and hematological and histological analyzes were quantified. Animals given up to 5000 mg/Kg orally exhibited almost no adverse effects on physiological, biochemical and hematological parameters, with LD 50 above 5000 mg/kg. Death (20%) was documented when LP (75 mg/Kg) was given in the peritoneum. Minor doses (35 and 15 mg / kg) were administered and deaths were not documented. Accordingly, PL was classified in category 3 with LD50 in the range of 50 to 300 mg / kg (OECD, No. 423). Suppression of the immune response through the oral tolerance process was confirmed by the lowering of IgE and IgG in the serum, IL-4 and IFN- in spleen homogenates and the absence of anaphylaxis signs. PL, orally, showed low toxicity and immunogenicity according to the toxicity and immunomodulation tests performed. By intraperitoneal route, however, it presented high toxicity mainly due to the proteolytic activity of the sample. Although oral tolerance has been achieved at the different doses studied, further studies should be performed to establish the safe use of PL. / Calotropis procera (Ait.) R.Br é uma planta laticífera, reconhecida por suas propriedades farmacológicas. As proteínas solúveis do látex (PL) desta planta apresentam atividades anti-inflamatórias, antitumoral entre outras. Apesar dos estudos realizados a respeito do potencial fitoterápico de PL, ainda são incipientes os conhecimentos sobre suas propriedades toxicológicas e imunomoduladoras. Estudo prévio a respeito do potencial imunomodulador de PL por via subcutânea e oral, mostrou que esta fração foi capaz de induzir resposta imune por via subcutânea, com produção de IgE e sinais de anafilaxia, entretanto quase sem resposta imune por via oral. O objetivo do trabalho foi determinar o potencial toxicológico e imunomodulador das proteínas do látex de Calotropis procera. PL foi processada e caracterizada para utilização de ensaios in vivo. Os ensaios de toxicidade foram realizados em camundongos Swiss, por via oral e intraperitoneal, avaliando o perfil comportamental, hematológico, bioquímico e histológico. A atividade imunomoduladora foi determinada através de protocolo de tolerância oral em camundongos BALB/c, sendo quantificado o nível de anticorpos, citocinas, DTH e realizado análises hematológicas e histológicas. Os animais que receberam doses de até 5000 mg/kg por via oral, não exibiram praticamente nenhum efeito adverso nos parâmetros fisiológicos, bioquímicos e hematológicos, apresentando uma DL50 acima de 5000 mg/kg. Entretanto, 20% de mortes foram registradas para a dose de 75 mg/kg por via intraperitoneal. Doses menores (35 e 15 mg/kg) foram administrada e mortes não foram registradas. Consequentemente, PL foi classificada na categoria 3, com DL50 na faixa de 50 a 300 mg/kg (OECD, N°423). Uma possível modulação supressora da resposta imune, através do processo de tolerância oral, foi observada com a redução da IgE e IgG no soro, IL-4 e IFN-γ em homogenato de baço e ausência de sinais de anafilaxia. PL, por via oral, apresentou baixa toxicidade e imunogenicidade de acordo com os ensaios de toxicidade e imunomodulação realizados. Por via intraperitoneal, entretanto, apresentou alta toxicidade devido, principalmente, a atividade proteolítica da amostra. Embora a tolerância oral tenha sido alcançada nas diferentes doses estudadas, mais estudos devem ser realizados para o estabelecimento do uso seguro de PL.

Introducción: La anafilaxia es una reacción de instauración rápida y potencialmente mortal, donde los mediadores mastocitarios tienen un papel clave en su fisiopatología. El diagnóstico de la anafilaxia es clínico, ya que actualmente no se dispone de marcadores biológicos que nos permitan confirmar el diagnóstico. Recientemente, en un modelo murino se ha descrito el posible papel de la heparina derivada de los mastocitos en la activación del sistema de contacto, una cascada de proteasas que termina escindiendo el cininógeno de alto peso molecular (HK) para liberar bradicinina (BK), proteína con múltiples efectos inflamatorios. Objetivo: Esta Tesis Doctoral la componen dos trabajos. El objetivo del primer trabajo fue determinar las concentraciones de triptasa sérica seriada durante la anafilaxia y evaluar su utilidad como marcador diagnóstico y de gravedad, así como también los factores de riesgo para presentar una anafilaxia grave. El objetivo del segundo trabajo fue investigar el papel del sistema de contacto, de la coagulación y la correlación con la triptasa durante la anafilaxia. Métodos: Se trata de dos estudios prospectivos con pacientes que acudieron al Servicio de Urgencias del Hospital Vall d´Hebron con un episodio de anafilaxia. Se recogieron las características demográficas, los factores de riesgo de los pacientes, la etiología, las características clínicas y el tratamiento de la anafilaxia. Se midió la triptasa sérica a las 1-2 horas (T1), a las 4-6 horas(T2), a las 12-24 horas (T3) después del inicio de la anafilaxia y en condiciones basales (TB). En el segundo estudio, dado que se trataba de un estudio exploratorio, se compararon 10 pacientes durante la anafilaxia y en condiciones basales y con controles sanos ajustados por sexo y edad. Se determinó mediante inmunodetección la proteólisis plasmática del HK, de la calicreína plasmática (PK) y del factor XII (FXII). La heparina liberada por los mastocitos se determinó mediante la actividad del anti-Xa y se analizó la vía intrínseca de la coagulación midiendo los niveles de TTpa. Resultados: En el primer trabajo se incluyeron un total de 102 pacientes, 63 mujeres, de edad media de 47,4±19,1 años. La concentración de la triptasa a T1 (19.3±15.4µg/L) fue significativamente más alta que en T2, T3, TB (todos <11,4µg/L; P<0,0001). No obstante, la triptasa no se elevó en el 36,3% de los casos. Además, en el 60,6% de estos pacientes no se observaron cambios en los niveles de triptasa comparando T1 y TB (ΔT1-TB=0). La concentración de triptasa fue más elevada en las anafilaxias más graves (P<0,0001) y se correlacionaba positivamente con la gravedad (P<0,001; r=0,49). La anafilaxia fue más grave y la concentración de triptasa más elevada cuando la etiología eran los fármacos comparado con los alimentos tanto en T1 (P=0,045) como en TB (P=0,019). La edad y los factores de riesgo cardiovascular se asociaron a una anafilaxia más grave (P=0,001). En el segundo trabajo se observó una extensa proteólisis del HK, de la PK y del FXII en el plasma de los pacientes durante la anafilaxia, no observándose en los mismos en condiciones basales ni en los controles. El grado de escisión del HK se correlacionó con la gravedad de la reacción y con los niveles de triptasa. El TTpa estaba alargado en 3 pacientes y los niveles de anti-Xa fueron más altos durante la anafilaxia que a nivel basal (4 kIE/L, IQR 2,5-5,5 versus 1 kIE/L IQR 0,25-1,75, p < 0,005). Conclusiones: La triptasa es un biomarcador relacionado con la gravedad de la anafilaxia. No obstante, no es un marcador óptimo para el diagnóstico de la anafilaxia, ya que en un número no despreciable de pacientes se mantiene inalterada. La edad avanzada y los factores de riesgo cardiovascular estaban asociados a una anafilaxia más grave. Además, se ha demostrado una activación del sistema de contacto y de la coagulación, así como un aumento de la actividad del anti-Xa en los pacientes durante la anafilaxia. / Background: Anaphylaxis is a hypersensitivity reaction that is rapid in onset and potentially fatal, in which mast cell mediators play an important role in the physiopathology. The diagnosis of anaphylaxis is based on clinical history since no reliable biological marker is currently available to confirm the diagnosis. Recently, the potential role of mast-cell-driven heparine activating the plasma contact system has been described in a murine model, a protease cascade which proteolyzes high molecular weight kininogen (HK) to liberate bradykinin (BK), a protein with inflamatory effects. Objective: This thesis comprises two studies. The aim of the first study was to determine sequential serum tryptase concentrations during anaphylaxis and to evaluate its potential as a diagnostic marker and its relation to severity, as well as to evaluate risk factors for a severe anaphylaxis. The aim of the second study was to investigate the role of the plasma contact system, the coagulación system and the correlation with tryptase during anaphylaxis. Methods: Two prospective studies including patients with acute anaphylaxis (NDAID/FAAN criteria) attending the Emergency Department. Demographic characteristics, anaphylactic triggers, specific risk factors, clinical characteristics and management of anaphylaxis were recorded. Serum tryptase was measured at 1-2 hours (T1), 4-6 hours (T2) and 12-24 hours (T3) following onset of symptoms and in basal conditions (TB). In the second study, an exploratory research, plasma samples from ten patients with acute anaphylaxis were compared with baseline samples and with ten age- and sex- matched controls. The proteolysis of HK, plasma kalikrein (PK) and factor XII (FXII) were determined by immunoblotting. Mast cell activation and heparin release were determined by serum tryptase levels and anti-Xa activity and the intrisec pathway of the coagulation system with apTT. Results: A total of 102 patients were included in the first study, 63 females, mean age 47.4±19.1 years. Tryptase concentration at T1 (19.3±15.4µg/L) was significantly higher than at T2, T3 and TB (all<11.4µg/L; P<0.0001). Nevertheless, tryptase was not raised in 36.3% of cases. Furthermore, in 60.6% of these patients no changes were observed in tryptase levels comparing T1 and TB (ΔT1-TB =0). Tryptase was more frequently elevated in more severe anaphylaxis (P<0.0001) and positively correlated with the grades of severity (P<0.001, r=0.49). Anaphylaxis was more severe and tryptase concentration was higher when the causative agent was a drug compared to food both at T1 (P=0.045) and at TB (P=0.019). Age and coronary risk factors were associated with more severe anaphylaxis (P=0.001). In the second study, we noted extensive proteolysis of HK in the plasma of all anaphylactic patients at the onset of symptoms but not during remission and in none of 10 controls. Degree of HK breakdown correlated with the severity of anaphylactic reactions and with tryptase levels. All anaphylactic patients also showed activation of FXII and PK but not at baseline or in control patients. The apTT was prolonged in three patients and the levels of anti-Xa were higher during anaphylaxis compared with basal conditions or healthy controls (4 kIE/L, IQR 2.5-5.5 versus 1 kIE/L IQR 0.25-1.75, p < 0.005). Conclusion: Tryptase is a biomarker related to the severity of anaphylaxis. However, it is not an optimal marker, because its concentration remains unaltered in a considerable number of patients during acute anaphylaxis. Old age and coronary risk factors were associated with severe anaphylaxis. Furthermore, an activation of the contact and coagulation system, and an increase of activity of the anti-Xa was demonstrated in the patients.

A prevalência de alergias vem aumentando no mundo todo, em especial a asma alérgica que é considerada uma síndrome inflamatória pulmonar, que em sua forma clássica está associada ao descontrole da atividade de células T helper (Th) 2. As terapias correntes são em sua maioria sintomáticas. Porém, a imunoterapia específica (SIT, do inglês Specific-Immunotherapy ) é potencialmente curativa. A SIT consiste na adminsitração do alérgeno específico repetidamente em doses crescentes com o objetivo de promover a dessensibilização do paciente. O presente trabalho, utilizando a ovoalbumina (OVA) como alérgeno em modelo de asma alérgica experimental, investigou protocolos profiláticos e terapêuticos de SIT. Durante a realização do protocolo profilático, os animais foram sensibilizados com OVA adsorvida em hidróxido de alumínio (Alum) associada com diferentes agonistas de receptores do tipo toll (TLR, do inglês toll-like receptors ). O agonista de TLR 9 (CpG) foi o mais eficiente em inibir a sensibilização alérgica quando comparado aos demais agonistas de TLR testados. Esta inibição do desenvolvimento da inflamação alérgica pulmonar por CpG foi dependente da molécula IL-10 e da sinalização via MyD88 nas células dendríticas. Além disso, sabendo que a SIT terapêutica, administrada pela via subcutânea é capaz de desencadear uma reação anafilática, encapsulamos a OVA em lipossoma catiônico 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-sulfato (DOTAP) com o intuito de aumentar a segurança da formulação e paralelamente potencializar o efeito do CpG. Os resultados verificaram que o encapsulamento da OVA diminuiu a reação anafilática cutânea e sistêmica induzida por este alérgeno. Verificamos também que a SIT com alérgeno/CpG encapsulados no DOTAP (OVA&#43CpG/DOTAP ou BT&#43CpG/DOTAP) promove uma significativa inibição da inflamação alérgica pulmonar e produção de IgE Total. Essa inibição da alergia pulmonar foi associada com o aumento da produção de IL-10, mas não de IFN-g no lavado bronco-alveolar (BAL). Notavelmente, o efeito terapêutico inibitório de OVA&#43CpG/DOTAP não foi verificado em animais deficientes para as moléculas de MyD88, IL-10 ou IFN-g. Verificamos que a SIT terapêutica também era dependente da sinalização via MyD88 nas células dendríticas. Além disso, ao utilizarmos animais reconstituídos com células de animais doadores alérgicos, verificamos que o efeito terapêutico da SIT não foi encontrado em animais reconstituídos com células de animais IFN-gKO, e que animais reconstituídos com células de animais IL-10KO apresentavam aumento de IL-10 no BAL. A transferência de células de medula óssea de animais C57BL/6 (WT), mas não de animais IFN-gKO, tratados com OVA&#43CpG/DOTAP foi capaz de reverter o quadro inflamatório alérgico de animais WT e induzir o aumento de IL-10 no BAL. Esses resultados contribuem para a elucidação dos mecânismos envolvidos na ação anti-inflamatória da SIT e potenciais utilizações do CpG e DOTAP em processos alérgicos. / The prevalence of allergies is increasing worldwide, especially allergic asthma that is considere a pulmonary inflammatory syndrome, which in its classic form is associated with the lack of control of T helper cell (Th) 2 activity. Current therapies are mostly symptomatic. However, specific immunotherapy (SIT) is potentially curative. SIT consists of administering the specific allergen repeatedly in increasing doses in order to promote patient desensitization. The present study, using ovalbumin (OVA) as an allergen in an experimental allergic asthma model, investigated prophylactic and therapeutic SIT protocols. During the prophylactic protocol, the animals were sensitized with OVA adsorbed on aluminum hydroxide (Alum) associated with different toll-like receptors (TLR) agonists. The TLR 9 agonist (CpG) was the most efficient in inhibiting allergic sensitization when compared to the other TLR agonists tested. This inhibition mediated by CpG of the development of the allergic lung inflammation was dependent on the IL-10 molecule and the MyD88 signaling in dendritic cells. In addition, knowing that the therapeutic SIT, administered by the subcutaneous route is capable of triggering an anaphylactic reaction, we encapsulated OVA in 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium sulphate (DOTAP), a cationic liposome, in order to increase the safety of the formulation and in parallel potentiate the effect of CpG. The results showed that OVA encapsulation reduced the cutaneous and systemic anaphylactic reaction induced by this allergen. We also verified that SIT with the allergen and CpG encapsulated in DOTAP (OVA&#43 CpG/DOTAP or BT&#43CpG/DOTAP) promotes a significant inhibition of lung allergic inflammation and Total IgE production. This inhibition of lung inflammation was associated with increased production of IL-10 but not of IFN-g in the bronchoalveolar lavage (BAL). Notably, the inhibitory therapeutic effect of OVA&#43CpG/DOTAP was abrogate in animals deficient in the MyD88 or IL-10 or IFN-g molecules. We found that therapeutic SIT was also dependent on MyD88 signaling on dendritic cells. In addition, when we used animals reconstituted with cells from allergic donor animals, we found that the therapeutic effect of SIT was not found in animals reconstituted with cells from IFN-gKO animals, and that animals reconstituted with IL-10KO animal cells had increased IL -10 in the BAL. The transfer of bone marrow cells from C57BL/6 (WT) animals but not from IFN-gKO animals treated with OVA&#43CpG/DOTAP was able to reverse the lung allergic inflammation of WT animals and induce the increase of IL-10 in the BAL. These results contribute to the elucidation of the mechanisms involved in the anti-inflammatory effect of the SIT and potential uses of CpG and DOTAP in allergic processes.

As hipersensibilidades do tipo I são caracterizadas por um grupo heterogêneo de manifestações clínicas que atingem mais de 30% da população mundial. Novas reatividades a alérgenos regionais brasileiros têm sido descritas e muitas fontes ainda não são totalmente conhecidas. Dentre os alérgenos mais prevalentes estão os venenos de insetos. A vespa regional Polybia paulista (Hymenoptera vespidae) é endêmica no sudeste do Brasil e é responsável por acidentes graves, causando reações alérgicas que podem levar ao choque anafilático. Alguns componentes dos venenos de vespas de diferentes espécies apresentam mimetismo molecular ou biológico, podendo gerar reação imunológica cruzada, mas muitas vezes não são os responsáveis pelo desencadeamento da resposta alérgica. Isto ocasiona falha no diagnóstico e consequentemente no tratamento indicado, a imunoterapia alérgeno-específica. Diante desses fatos e do grande número de pacientes que procuram o Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do Hospital das Clínicas de São Paulo (HCFMUSP) com manifestações clínicas de alergias a ferroadas de insetos, foi desenvolvida uma sistemática de investigação clínica e laboratorial, com ênfase na abordagem proteômica, para identificar e caracterizar físico-química e imunologicamente novos alérgenos do veneno da vespa Polybia paulista e estudar potenciais reatividades cruzadas com alérgenos já conhecidos. Vinte e um pacientes com história de anafilaxia a venenos de vespa foram selecionados para participar do estudo. Foram realizados testes cutâneos e in vitro com veneno de Polistes spp. disponível comercialmente e com o veneno da Polybia paulista, produzido seguindo o protocolo padronizado anteriormente. Os resultados mostraram que a maioria dos pacientes apresentam IgE específica para os dois venenos com maior reatividade ao veneno de Polybia e que o padrão de proteínas reconhecidas entre os dois venenos é diferente, evidenciando a necessidade de veneno de Polybia paulista na prática clínica nas regiões cuja vespa está presente. Foram identificadas mais de 2000 proteínas no extrato total do veneno de Polybia paulista e algumas proteínas alergênicas ainda não descritas. Dentre elas foi identificada uma nova isoforma ao antígeno 5 da vespa Polybia scutellaris relatada como hipoalergênica. A molécula foi produzida na forma recombinante com conformação adequada, pela primeira vez em E. coli. O alérgeno, registrado na IUIS como Poly p 5, foi reconhecido por IgEs no soro dos pacientes testados e apresenta reatividade cruzada com outros antígenos 5 homólogos. Testes de desgranulação de basófilos em linhagem celular de ratos mostraram que o Poly p 5 induziu pouca desgranulação, indicando seu potencial hipoalergênico / Type I hypersensitivity is characterized by heterogeneous clinical manifestations and specialists estimate that today around 30% of the general population suffers from an allergic disease. New allergens are being reported and some sources are not yet identified. Insect venoms are amongst the most prevalent allergen sources. The social wasp Polybia paulista (Hymenoptera vespidae) is endemic in the southeastern of Brazil and is responsible for serious accidents due to their venomous stings, causing allergic reactions that can lead to anaphylactic shock. Several components presenting molecular or biological mimicry can be found in different species of wasps and lead to a cross-immunological reaction but they are not always responsible for the allergic manifestations. Therefore, diagnostic and consequently immunotherapy is unsuccessful, since specific allergen identification is crucial. Considering the high number of patients attended at the \"Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do Hospital das Clínicas de São Paulo\" with clinical manifestations of allergies not yet determined or barely studied, an approach involving a systematic clinical, laboratorial and investigative practice through a proteomic analysis was created to identify and characterize new allergens of Polybia paulista venom. Twenty-one patients with clinical history of anaphylaxis to Hymenoptera venoms were selected for this work. Cutaneous and in vitro tests were performed using Polistes venom commercially available as well as Polybia paulista venom, produced following a published protocol. The results shows that the majority of the patients has specific IgE for both venoms with biggest reactivity to Polybia paulista venom and the protein profile recognized in these venoms is different. More than 2000 proteins were identified in the whole venom extract of Polybia paulista and some of the allergenic proteins are not yet described in this venom. Among them, a new isoform that is similar to antigen 5 from Polybia scutellaris, already known as hypoallergenic. The molecule was produced as a recombinant properly folded for the first time in E. coli. The allergen, registered at IUIS as Poly p 5, was recognized by IgEs in the sera of 50% of the patients tested and has cross-reactivity with other homologs of antigen 5. Basophil degranulation tests in rat lineage cells showed that Poly p 5 induced little degranulation, indicating the hypoallergenic potential of this molecule

Está estabelecido que o processo de glicosilação é essencial para a conformação estrutural e função efetora dos anticorpos. Entretanto, não está completamente claro como diferenças nos carboidratos ligados aos anticorpos podem interferir na sua atividade biológica. Foi previamente descrito que anticorpos IgG1 murinos podem ser divididos em anafiláticos ou não-anafiláticos, de acordo com a sua capacidade de induzir in vivo reação de anafilaxia. Somado a isso, foi verificado que a cadeia de oligossacarídeos N-ligada à molécula de IgG1 é fundamental para a manutenção da sua função efetora. O objetivo do presente trabalho é estudar diferenças estruturais entre os subtipos de IgG murinos que poderiam determinar a sua atividade biológica. O seqüenciamento dos nucleotídeos que codificam os domínios CH2 e CH3 dos dois subtipos de IgG1 permitiu constatar homologia de 100% dessas regiões nas duas moléculas estudadas. Entretanto, ao analisar o padrão de carboidratos N-ligados aos anticorpos IgG1 foi observado maior conteúdo de ácido siálico e fucose na cadeia N-ligada ao anticorpo anafilático em relação à do não-anafilático. Contudo, a remoção de resíduos de ácido siálico por tratamento enzimático do anticorpo IgG1 anafilático resultou na perda da capacidade desta molécula de induzir desgranulação celular in vitro e reação anafilática in vivo, semelhante ao anticorpo IgG1 deglicosilado. Em contraste, a remoção de fucose não afetou a sua função anafilática. A análise por PCR em tempo real da expressão dos genes das enzimas envolvidas no processo de glicosilação das proteínas revelou menor expressão gênica de algumas glicosidases, principalmente as sialiltransferases, no hibridoma e linfócitos B secretores do subtipo IgG1 não-anafilático em relação ao obtido no hibridoma e linfócitos B que secretam a IgG1 anafilática. Além disto, foi observada menor atividade enzimática das sialiltransferases obtidas do hibridoma produtor da IgG1 não-anafilática em relação à do hibridoma que produz a IgG1 anafilática. Em conjunto, estes resultados comprovam que a capacidade de anticorpos IgG1 murinos de induzir anafilaxia é diretamente dependente do conteúdo de ácido siálico presente na cadeia de oligossacarídeos ligada à região Fc do anticorpo, além disso sugerem fortemente que essa maior sialilação observada no tipo anafilático seja resultante da maior expressão gênica destas enzimas e assim da sua atividade enzimática no momento da síntese dos anticorpos. / It is well established that the glycosylation process is essential for the structural conformation and effector function of the antibodies. However, it is quite clear how differences in the carbohydrates attached to the antibodies may interfere with their biological activities. It was previously reported that murine IgG1 antibodies can be divided into anaphylactic or nonanaphylactic according to their ability to induce anaphylaxis. Furthermore, it was demonstrated that the oligosaccharide chain N-linked to the IgG1 is essential for its conformation and biological activity. The objective of this work is to study structural differences between these subtypes of murine IgG1 that could determine their biological activity. The sequencing of the nucleotides encoding the CH2 and CH3 domains of these two subtypes of IgG1 showed 100% of homology in the Fc regions of these molecules. In contrast, the analysis of the carbohydrates N-linked to the IgG1 antibodies demonstrated higher sialic acid and fucose contents in the chain attached to the anaphylactic antibody than in the nonanaphylactic IgG1. However, the removal of sialic acid residues by enzymatic treatment of anaphylactic IgG1 antibody resulted in the abrogation of its ability to induce mast cells degranulation in vitro and anaphylactic reaction in vivo as observed to deglycosylated IgG1 antibody. On the other hand, the removal of fucose did not change the anaphylactic activity. The analysis by real time PCR of the gene expression of enzymes that are involved in the protein glycosylation showed lower gene expression of some glycosyltransferases, mainly sialyltransferases, in the hybridoma and B lymphocytes that produce the non-anaphylactic IgG1 compared to those verified in the hybridoma and B cells producer of the anaphylactic IgG1. Furthermore, it was verified lower enzymatic activity of sialyltransferases purified from the hybridoma producer of the non-anaphylactic IgG1 in relation to the hybridoma producer of the anaphylactic antibody. Together, these results prove that the ability of murine IgG1 to induce anaphylaxis is directly dependent of the sialic acid content in the carbohydrate core attached to the antibody Fc region. It is also strongly suggested that this higher sialylation observed in the anaphylactic IgG1 may be resultant of the higher gene expression and enzymatic activity of some sialyltransferases during the antibody synthesis.

Estudos anteriores mostraram um efeito supressivo do extrato de Ascaris suum (Asc) nas respostas humoral e celular a um antígeno heterólogo. O fracionamento deste extrato por gel filtração possibilitou a identificação de picos distintos, constituídos de proteínas de alto peso molecular (PI) e baixo peso molecular (Plll), sendo o efeito supressivo de Asc restrito aos componentes de PI. Com relação à produção de anticorpos contra estes componentes, verificou-se que PI é capaz de induzir preferencialmente a síntese de lgG1 não-anafilática e baixos títulos de lgE e de lgG1 anafilática. Considerando que estes resultados foram obtidos no 8º día após a imunização dos animais, propusemos-nos a estudar a indução de anticorpos anafiláticos por PI em fases mais tardias da resposta imune e sua regulação por citocinas. Os nossos resultados mostraram que a indução da lgG1 anafilática anti-PI é mais tardia e regulada parcialmente por IL-4, tanto na resposta primária como secundária. A produção de lgE é totalmente dependente de IL-4. Devido à heterogeneidade presente em nossos animais, pudemos constatar apenas uma tendência de regulação negativa de IL-12 e IFN -&#947; sobre a produção dos anticorpos lgG1 anafiláticos e lgE, no início da resposta primária. Entretanto, nossos resultados mostraram um efeito importante da IL-10, em conjunto com IFN-&#947;, na inibição da síntese de anticorpos anafiláticos anti-PI, tanto na resposta primária como secundária. Com relação à lgG1 não-anafilática anti-PI, sua indução parece depender de IFN-&#947; apenas na resposta primária. / Previous studies have shown a suppressive effect of Ascaris suum extract (Asc) on humoral and cell-mediated immune responses to a non-related antigen. After fractionation of this extract by gel filtration, two peaks were identified according to their molecular weights, and the suppressive effect was associated with proteins of high molecular weight (PI). PI induces high levels of non-anaphylactic lgG1 and low levels of lgE and anaphylactic lgG1. Since these results were obtained 8 days after immunization, the aim of this work was to follow the production of anti-PI anaphylactic antibodies during the primary as well as the secondary antibody response. We algo studied the modulation of the anaphylactic antibody production by cytokines. Pl-specific anaphylactic lgG1 was produced lately in the primary response and was partially dependent on IL-4, including the secondary response. lgE was not produced in the absence of IL-4 at any time. IL-12 and IFN- &#947; exerted a slight negative effect on Pl-specific anaphylactic lgG1 and lgE antibody production in the beginning of the primary response. In contrast, IL-10 together with IFN- &#947; had a profound inhibitory efíect on the synthesis of these antibodies in the primary and secondary responde. The production of Pl-specific non-anaphylactic lgG1 antibodies depended upon IFN- &#947; only in the prímary response.

As alergias podem ser desencadeadas por substancias químicas, medicamentos, proteínas de origem vegetal e animal como, por exemplo, ácaros, alimentos, fungos e venenos. Reações alérgicas desenvolvidas em resposta a venenos de animais marinhos vêm sendo pouco estudadas. Este é o primeiro estudo que descreve a indução de reação anafilática em camundongos pelo veneno de um peixe brasileiro, acompanhado da caracterização detalhada dos mediadores solúveis e celulares envolvidos no processo. Nossos resultados mostram que o veneno do peixe T. nattereri possui proteínas alergênicas capazes de desencadear um processo alérgico, caracterizado por anafilaxia mediada por IgE e IgG1 e inflamação eosinofílica de fase tardia dependente de citocinas Th2. Ainda demonstramos a regulação da resposta pela positiva pela citocina IL-4 e participação da IL-12 e IFN-<font face=\"Symbol\">g na resposta. / Allergies are a significant and widespread public health problem. Anaphylaxis reactions are inducing by foods, medications and venoms and are IgE mediated. In mice, allergy can be caused also by IgG1. The results presented here describe for the first time anaphylaxis induced by Brazilian fish venom, accompanied by detailed characterization of soluble and cellular mediators involved in the process. Together our results demonstrated that the venom of T. natereri has allergenic proteins that can trigger allergic process, a phenomenon IgE-IgG1 dependent, IL-4 mediated and regulated by IFN-<font face=\"Symbol\">g. Furthermore, we observed a positive participation of the cytokines IL-12 and IFN-<font face=\"Symbol\">g in the exacerbation of the late phase reaction.

Está estabelecido que o processo de glicosilação é essencial para a conformação estrutural e função efetora dos anticorpos. Entretanto, não está completamente claro como diferenças nos carboidratos ligados aos anticorpos podem interferir na sua atividade biológica. Foi previamente descrito que anticorpos IgG1 murinos podem ser divididos em anafiláticos ou não-anafiláticos, de acordo com a sua capacidade de induzir in vivo reação de anafilaxia. Somado a isso, foi verificado que a cadeia de oligossacarídeos N-ligada à molécula de IgG1 é fundamental para a manutenção da sua função efetora. O objetivo do presente trabalho é estudar diferenças estruturais entre os subtipos de IgG murinos que poderiam determinar a sua atividade biológica. O seqüenciamento dos nucleotídeos que codificam os domínios CH2 e CH3 dos dois subtipos de IgG1 permitiu constatar homologia de 100% dessas regiões nas duas moléculas estudadas. Entretanto, ao analisar o padrão de carboidratos N-ligados aos anticorpos IgG1 foi observado maior conteúdo de ácido siálico e fucose na cadeia N-ligada ao anticorpo anafilático em relação à do não-anafilático. Contudo, a remoção de resíduos de ácido siálico por tratamento enzimático do anticorpo IgG1 anafilático resultou na perda da capacidade desta molécula de induzir desgranulação celular in vitro e reação anafilática in vivo, semelhante ao anticorpo IgG1 deglicosilado. Em contraste, a remoção de fucose não afetou a sua função anafilática. A análise por PCR em tempo real da expressão dos genes das enzimas envolvidas no processo de glicosilação das proteínas revelou menor expressão gênica de algumas glicosidases, principalmente as sialiltransferases, no hibridoma e linfócitos B secretores do subtipo IgG1 não-anafilático em relação ao obtido no hibridoma e linfócitos B que secretam a IgG1 anafilática. Além disto, foi observada menor atividade enzimática das sialiltransferases obtidas do hibridoma produtor da IgG1 não-anafilática em relação à do hibridoma que produz a IgG1 anafilática. Em conjunto, estes resultados comprovam que a capacidade de anticorpos IgG1 murinos de induzir anafilaxia é diretamente dependente do conteúdo de ácido siálico presente na cadeia de oligossacarídeos ligada à região Fc do anticorpo, além disso sugerem fortemente que essa maior sialilação observada no tipo anafilático seja resultante da maior expressão gênica destas enzimas e assim da sua atividade enzimática no momento da síntese dos anticorpos. / It is well established that the glycosylation process is essential for the structural conformation and effector function of the antibodies. However, it is quite clear how differences in the carbohydrates attached to the antibodies may interfere with their biological activities. It was previously reported that murine IgG1 antibodies can be divided into anaphylactic or nonanaphylactic according to their ability to induce anaphylaxis. Furthermore, it was demonstrated that the oligosaccharide chain N-linked to the IgG1 is essential for its conformation and biological activity. The objective of this work is to study structural differences between these subtypes of murine IgG1 that could determine their biological activity. The sequencing of the nucleotides encoding the CH2 and CH3 domains of these two subtypes of IgG1 showed 100% of homology in the Fc regions of these molecules. In contrast, the analysis of the carbohydrates N-linked to the IgG1 antibodies demonstrated higher sialic acid and fucose contents in the chain attached to the anaphylactic antibody than in the nonanaphylactic IgG1. However, the removal of sialic acid residues by enzymatic treatment of anaphylactic IgG1 antibody resulted in the abrogation of its ability to induce mast cells degranulation in vitro and anaphylactic reaction in vivo as observed to deglycosylated IgG1 antibody. On the other hand, the removal of fucose did not change the anaphylactic activity. The analysis by real time PCR of the gene expression of enzymes that are involved in the protein glycosylation showed lower gene expression of some glycosyltransferases, mainly sialyltransferases, in the hybridoma and B lymphocytes that produce the non-anaphylactic IgG1 compared to those verified in the hybridoma and B cells producer of the anaphylactic IgG1. Furthermore, it was verified lower enzymatic activity of sialyltransferases purified from the hybridoma producer of the non-anaphylactic IgG1 in relation to the hybridoma producer of the anaphylactic antibody. Together, these results prove that the ability of murine IgG1 to induce anaphylaxis is directly dependent of the sialic acid content in the carbohydrate core attached to the antibody Fc region. It is also strongly suggested that this higher sialylation observed in the anaphylactic IgG1 may be resultant of the higher gene expression and enzymatic activity of some sialyltransferases during the antibody synthesis.