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Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Compara las concentraciones de arsénico y cadmio en agua embotellada de consumo humano comercializada en Lima Metropolitana tomando 5 distritos de referencia. Para dicho estudio se decidió trabajar con la marca de agua embotellada de mayor aceptación por la población, para tomar esta decisión nos apoyamos en estudios de mercados de entidades reconocidas como IPSOS APOYO (Opinión y mercado), adicionalmente se hizo una encuesta de preferencia de aguas embotelladas. Se tomaron 40 unidades de agua embotellada de consumo humano comercializada en 5 distritos de Lima Metropolitana. Estudio realizado en total de las unidades muestreadas 20 fueron provenientes de la venta en supermercado y 20 de la venta ambulatoria de los 5 distritos de Lima Metropolitana. La concentración media de arsénico y cadmio en agua embotellada proveniente de venta ambulatoria fue de 1,7 ppb y 0,9 ppb respectivamente. La concentración media de arsénico y cadmio en agua embotellada proveniente de venta en supermercado fue de 1,8 ppb y 1,0 ppb respectivamente. No se encontró diferencias significativas entre las medias de la concentración de arsénico y cadmio en las aguas embotelladas de venta ambulatoria y venta en supermercados. Los resultados indican que las concentraciones de arsénico y cadmio presentes en las aguas embotelladas de consumo humano que se comercializan en cinco distritos de Lima Metropolitana, no superan los límites máximos permisibles dados por la Organización Mundial de la Salud y el Ministerio de Salud del Perú en el Reglamento de la Calidad del Agua para Consumo Humano 2010 (Decreto Supremo Nº 031-2010-SA). / Tesis

El objetivo de la tesis doctoral es la aplicación de metodologías quimiométricas multidimensionales al análisis de reacciones enzimáticas. Las reacciones enzimáticas estudiadas tienen aplicación en los campos del análisis químico en matrices biológicas y en los procesos de fermentación a escala industrial. En concreto:1) Estudio del mecanismo de reacción en matrices biológicas y cálculo de las constantes enzimáticas en reacciones complejas. Se estudia la catálisis de mezclas de hipoxantina, xantina y ácido úrico con xantina oxidasa; en un medio controlado y en orina humana. Además, se determina cuantitativamente los analitos anteriormente mencionados en orina humana. Los perfiles cinéticos se registraron usando un espectrofotómetro Ultravioleta-Visible equipado con un detector de diodos. A este espectrofotómetro se acopló un sistema de flujo interrumpido stopped-flow. Para mantener la temperatura constante se usó un módulo "Peltier".2) Establecimiento de una metodología para el control en tiempo real de bioprocesos. El sistema estudiado es la producción de enzimas lipasas por el microorganismo Pichia pastoris. Las medidas de fluorescencia se realizaron con un sensor de fluorescencia multidimensional conectado al bioreactor a través de una ventana de cuarzo.3) Un objetivo no relacionado con la monitorización de reacciones enzimáticas, es el desarrollo de una práctica de laboratorio dirigida a estudiantes de cursos superiores de la licenciatura de Ciencias Químicas para la introducción a los métodos de resolución de curvas y a la quimiometría en general.Se han obtenido las siguientes conclusiones generales:1) La introducción de la restricción del modelo cinético del sistema estudiado en el algoritmo MCR-ALS ha dado lugar a una nueva metodología de trabajo, denominada HS-MCR-ALS. Su aplicación al sistema cinético enzimático ha hecho posible:· El estudio del sistema enzimático en presencia de interferentes espectrales.· La elucidación del modelo cinético, ya que el anteriormente descrito en la bibliografía no contemplaba la degradación del ácido úrico.· La determinación de las constantes cinéticas del modelo postulado, tanto en un medio tamponado de composición conocida como en orina.2) Se han aplicado y comparado diferentes métodos, bi o tridimensionales, de análisis multivariable cuantitativo para la determinación de xantina, hipoxantina y ácido úrico en mezclas sintéticas y en orina humana dopada. Los resultados obtenidos en la aplicación cuantitativa del HS-MCR-ALS son comparables a los resultados obtenidos mediante otros algoritmos tridimensionales, 3W-PLS1 y 3W-PLS2, y a los algoritmos bidimensionales clásicos, PLS1 y PLS2, con una mínima cantidad de muestras patrón.3) Se ha establecido una nueva metodología de trabajo para el control en tiempo real de procesos monitorizados por fluorescencia. Se basa en el seguimiento no invasivo de la reacción mediante una sonda de fluorescencia multidimensional y en el tratamiento de la señal registrada mediante el algoritmo PARAFAC. A partir del modelo PARAFAC, aplicado a bioprocesos desarrollados en condiciones normales, se obtiene una estimación de los perfiles espectrales de los fluoróforos y de la evolución de su señal. El análisis de residuales de este modelo permite establecer límites de control (criterio Q). A partir de esa información, se monitorizó y controló en tiempo real un nuevo lote del bioproceso, siendo posible determinar el punto final de la producción de lipasas y metabolización total de sustrato sin necesidad de medidas off-line de los analitos de interés.4) Se ha estudiado la evolución espectrofotométrica del ácido 8-hidroxiquinolina-5-sulfónico con el pH como una práctica de laboratorio para la introducción del algoritmo MCR-ALS a estudiantes de cursos superiores de la licenciatura de Químicas. Esta práctica contiene instrucciones de cómo utilizar los datos obtenidos en la valoración para poder aplicar MCR-ALS de una manera sencilla y didáctica. / The main objective of this dissertation is the application of multidimensional chemometric methodologies to the kinetic analysis of enzymatic reactions. These enzymatic reactions have importance in analytical chemistry and in fermentation processes at industrial scale. This principal objective may be split into several partial objectives:1) The study of reactions related with the catalysis of mixtures of hypoxanthine, xanthine and uric acid with xanthine oxidase with the aim of studying the reaction mechanism in biological matrices and to calculate the enzymatic constants in complex reactions. In addition, the influence of the reaction media in the enzymatic mechanism will be studied in a controlled media and in human urine. Another objective is the quantitative determination of the above mentioned analytes in urine samples by means of their catalytic reaction with xanthine oxidase. In this work different algorithms will be applied and their advantages and disadvantages will be compared.2) Establishment of a methodology for the real time control of fermentation processes. In this sense, multidimensional tensor models will be applied to multidimensional spectrofluorimetry. The studied system will be the production of enzymes lipases throughout the microorganism Pichia pastoris.3) Another objective linked to this thesis is the divulgation of curve resolution methods. As an example of their use, a laboratory experiment directed to students of the last courses of Chemistry Degree is presented. Multivariate curve resolution with alternating least squares (MCR-ALS) will be applied to the spectrophotometric titration of 8-hydroxyquinoline-5-sulfonic acid and the evolution of the system will be discussed.The following conclusions have been obtained:1) The introduction in the algorithm of a restriction related with the kinetic model of the system gives raise to a new method, combining hard-modelling and soft-modelling in the HS-MCR-ALS algorithm. The following results have been obtained:· The study of the enzymatic mechanism in presence of a spectral interference.· The correct elucidation of the kinetic model.· The determination of the enzymatic constants of the proposed kinetic model in presence and absence of the interference of urine.2) Several methods have been applied to the quantitation of hypoxanthine, xanthine and uric acid in synthetic samples and urine and their results compared. The obtained results with HS-MCR-ALS were compared with those obtained by other three-way methodologies (3W-PLS1 and 3W-PLS2) and by the classical two-way methodologies (PLS1 and PLS2). The HS-MCR-ALS algorithm shows clear advantages, such as the small amount of standards needed (one or two standard samples are enough) and the fact that they can be prepared in aqueous solution, with no need to know or include the interferences present in the samples. Furthermore, the kinetic profiles and the spectra of the compounds involved are obtained. 3) A new working methodology applied to the control and fault diagnosis of fermentation processes in real time is presented. Multidimensional fluorescence collects a great amount of information in a short period of time, so the variability related with the fluorophores is recorded. From the PARAFAC model, built with bioprocesses in normal operating conditions, an estimation of the spectral profiles of the fluorophores and the evolution of their signal is obtained. Residual analysis of the model allows establishing control limits (using Q criterion). From this information, a new batch of the culture was monitored in real-time without needing reference off-line measurements.4) A laboratory experiment has been proposed to introduce the algorithm MCR-ALS to the upper-level students of the Chemistry Degree. The experiment includes a laboratory session were the spectrophotometric evolution of 8-hydroxyquinolin-5-sulfonic acid with pH is recorded, and other session were the students apply the MCR-ALS algorithm to the recorded data. This experiment contains instructions in how to use the obtained data using MCR-ALS in a simple and didactic manner.

El objetivo fundamental de la presente Tesis Doctoral ha sido comparar dos técnicas cromatográficas acopladas utilizadas en Cromatografía Líquida (acoplamiento LC-LC y acoplamiento SPE-LC), mediante su aplicación al análisis de residuos de diferentes familias de herbicidas en muestras de agua. El acoplamiento LC-LC con detección UV se ha utilizado para la determinación de residuos de bromacilo y diuron, de cuatro herbicidas triazínicos, y de atrazina junto a sus principales productos de transformación. Para ello, se han desarrollado tres procedimientos analíticos rápidos y selectivos basados en la inyección directa de 2 ml de muestra acuosa en el sistema LC-LC, con límites de detección entre 0.1 y 0.5 µg·l-1. La incorporación de una sencilla etapa previa de SPE "off-line" (en la determinación de triazinas y productos de transformación) permite disminuir los límites de detección hasta niveles inferiores a 0.1 µg·l-1, pudiendo aplicarse los métodos desarrollados a muestras de aguas potables. El acoplamiento "on-line" SPE-LC-DAD se ha llevado a cabo mediante modificación de un equipo instrumental originalmente diseñado para llevar a cabo SPE "off-line" (el ASPEC XL), habiéndose desarrollado procedimientos para la determinación de carbaril y su principal producto de transformación (1-naftol), bromacilo con cinco herbicidas ureicos, triazinas y TP´s, y finalmente, seis herbicidas fenilcarbamatos. Cabe destacar la completa automatización de los procedimientos desarrollados así como las altas sensibilidades obtenidas mediante preconcentración de volúmenes de muestra del orden de 50-100 ml. Complementariamente al desarrollo de metodología analítica, se han llevado a cabo estudios de degradación de carbaril a 1-naftol, así como de desmedifam y fenmedifam. En el caso de los fenilcarbamatos se detectaron varios TP´s, quedando pendiente una futura elucidación estructural de los mismos.Los procedimientos desarrollados se han utilizado para realizar control de plaguicidas en aguas superficiales de la Comunidad Valenciana, habiéndose detectado diferentes herbicidas como bromacilo, diuron y algunas triazinas (simazina, terbutilazina, terbutrina y terbumeton). Finalmente, se ha llevado a cabo un estudio comparativo de las dos modalidades de acoplamiento utilizadas en esta Tesis Doctoral, LC-LC y SPE-LC, destacándose las características más relevantes de cada una de ellas (rapidez, sensibilidad, selectividad y mayor o menor carácter multiresidual), mediante el apoyo de los datos experimentales obtenidos a partir de los métodos desarrollados para los distintos herbicidas analizados tanto por LC-LC como por SPE-LC.

El principal objetiu d'aquesta tesi consisteix en millorar la comprensió de com i en quina mesura els retardants de flama (RF), tant els heretats com els emergents, que estan incorporats en articles d'ús diari i materials de construcció, entren en els éssers humans. Per això, un grup de 48 mares i els seus fills/es (6-12 anys), residents a l'área metropolitana d'Oslo (Noruega), van participar en l'estudi. Es van recollir mostres biològiques, de sang (només de les mares) i orina, i mostres de pols i aire de l'interior de les viviendes. Per a la determinació de RF persistents en sang es va desenvolupar un mètode basat en GC-MS i un segon mètode, basat en UPLC-TOF, per a la determinació de metabòlits dels RFs excretats en l'orina. Els principals RF persistents detectats en sang van ser: anti-Dechlorane Plus (0.85 ng/g lípid) > BDE -153 (0.82 ng/g lípid) > BDE -47 (0.49 ng/g lípid) > syn-Dechlorane Plus (0.45 ng/g lípid). La suma dels RF emergents va resultar en concentracions comparables a la suma dels difenil èters polibromats, essent els productes alimentaris una de las fonts més importants de RF en aquest estudi. Els dos principals metabòlits detectats en l'orina dels fills/es i les mares van ser el difenil fosfat (1 ng/ml) i el bis(1,3-dicloro-2-propil) fosfat (0.2-0.3 ng/ml). Es va trobar una estreta relació entre les concentracions d'aquests dos metabòlits en l'orina dels fills/es i les concentracions dels RF a l'aire i la pols de las vivendes. Aquest descobriment suggereix que l'ambient interior influeix més significativament en els nivells d'organofosfats en els fills/es que altres fonts com podrien ser els productes alimentaris. / El objetivo principal de esta tesis consiste en mejorar la comprensión de cómo y en qué medida los retardantes de llama (FR), tanto los heredados como los emergentes, que están incorporados en los artículos de uso diario y materiales de construcción, entran en los seres humanos. Para ello, un grupo de 48 madres y sus hijos/as (6-12 años), resididentes en el área metropolitana de Oslo (Noruega), participaron en el estudio. Se recogieron muestras biológicas de sangre (sólo de las madres) y orina, y muestras de polvo y aire del interior de las viviendas. Para la determinación de FR persistentes en sangre se desarrollló un método basado en GC-MS y un segundo método basado en UPLC-TOF para la determinación de metabolitos de los FRs excretados en la orina. Los principales FR persistentes detectados en sangre fueron: anti-Dechlorane Plus (0.85 ng/g lípido) > BDE -153 (0.82 ng/g lípido) > BDE -47 (0.49 ng/g lípido) > syn-Dechlorane Plus (0.45 ng/g lípido). La suma de los FR emergentes resultó en concentraciones comparables a la suma de los difenil éteres polibromados, siendo los productos alimentarios una de las fuentes más importantes de FR en este estudio. Los dos principales metabolitos detectados en la orina de los hijos/as y las madres fueron difenil fosfato (1 ng/ml) y bis(1,3-dicloro-2-propil) fosfato (0.2-0.3 ng/ml). Se encontró una estrecha relación entre las concentraciones de estos dos metabolitos en la orina de los niños y las concentraciones de los FR en el aire y el polvo de las viviendas. Este hallazgo sugiere que el ambiente interior contribuye de manera más significativa en los niveles de organofosfatos en los hijos/as que otras fuentes, como podrían ser los productos alimentarios. / The main research goal of this thesis is to further understanding of how and to what extent flame retardant (FR) chemicals, both legacy and emerging, which are present in every-day consumer goods and construction materials enter in humans. To do so, a cohort of 48 mothers and their offspring (6-12 years) were recruited in the greater area of Oslo (Norway) and samples of blood (only from the mothers), urine, and samples of indoor dust and air were collected. For the determination of persistent FR in blood a method based on GC-MS was developed, and a second method, based on UPLC-TOF, was also developed for the determination of the non-persistent FR (organophosphates) in urine. The main persistent FRs detected in blood were anti-Dechlorane Plus (0.85 ng/g lipid) > BDE-153 (0.82 ng/g lipid) > BDE-47 (0.49 ng/g lipid) > syn-Dechlorane Plus (0.45 ng/g lipid). The sum of the emerging FRs were found in comparable concentrations to the sum of polybrominated diphenyl ethers, diet being one of the most important sources of FRs in this study group. The two main metabolites detected in urine from children and mothers were diphenyl phosphate (1 ng/mL) and bis(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (0.2-0.3 ng/mL). A strong relationship between the concentrations of these two metabolites in urine and the concentrations of the parent compounds in indoor air and dust for children was found. This finding suggests that the indoor environment contributes more importantly to the body burden of organophosphates in children from the cohort than other sources like diet.

En la present Tesi doctoral s’ha valorat el contingut fúngic d’un total de 18 mostres de compost: 7 procedents de la planta de compostatge de Manresa, 6 de la de Blanes, dues procedents de residu sòlid urbà processat a la planta de CESPA de Can Barba, (Vallès Occidental), dues de compost casolà de Pineda de Mar i, finalment, una procedent de femta de cavall obtinguda en un comerç especialitzat en productes de jardineria. Per a cada una de les mostres s’ha realitzat el càlcul de les unitats formadores de colònia de fong, ufc/g; s’han identificat els fongs de cada una de les mostres a nivell de gènere i se n’han seleccionat els Aspergillus i els Penicillium, que s’han incubat seguint el mètode de la FDA per a comprovar si poden produir les aflatoxines G2, G1, B2, B1 i l’OTA. Cap dels fongs potencialment micotoxigènics aïllats ha donat positiu en la producció de les toxines estudiades per sobre del límit de detecció quan s’han aplicat els mètodes cromatogràfics descrits en el treball. Per aquest motiu, s’estudia si el compost és un substrat adequat per a la producció d’aflatoxines incubant la soca de control Aspergillus parasiticus CECT 2681, descrita com a productora d’aflatoxines, sobre diferents proporcions de mescles d’arròs-compost. Després de comprovar que la soca control no pot produir les toxines quan el fong es desenvolupa sobre un 100% de compost, es comprova si pot continuar-ho fent sobre arròs. També es comprova si la soca control perd la seva capacitat micotoxigènica en ser incubada sobre compost i després sobre arròs. Per a realitzar aquesta anàlisi s’utilitza un mètode desenvolupat a la secció d’UHPLC-UV. Amb les diferents proves realitzades amb la soca de control Aspergillus parasiticus CECT 2681, es conclou que la soca control no perd la seva capacitat micotoxigènica en ser incubada primer sobre compost i després sobre arròs. També es pot concloure que el compost no és un bon substrat per a la producció d’aflatoxines ja que la producció d’aquestes disminueix en augmentar la proporció de compost en el substrat de creixement del fong. / En la presente Tesis doctoral se ha valorado el contenido fúngico de un total de 18 muestras de compost: 7 procedentes de la planta de compostaje de Manresa, 6 de la de Blanes, dos procedentes de residuo sólido urbano procesado en la planta de CESPA, Can Barba (Barcelona), dos de compost casero de Pineda de Mar y, finalmente, una procedente de heces de caballo obtenida en un comercio especializado en productos de jardinería. Para cada una de las muestras se ha realizado el cálculo de las unidades formadoras de colonia de hongo, ufc / g; se han identificado los hongos de cada una de las muestras a nivel de género y se han seleccionado los Aspergillus y Penicillium, que se han incubado siguiendo el método de la FDA, para comprobar si pueden producir las aflatoxinas G2, G1, B2, B1 y la OTA. Ninguno de los hongos potencialmente micotoxigénicos aislados ha dado positivo en la producción de las toxinas estudiadas por encima del límite de detección, cuando se han aplicado los métodos cromatográficos descritos en este trabajo. Por este motivo, se estudia si el compost es un sustrato adecuado para la producción de aflatoxinas incubando la cepa de control Aspergillus parasiticus CECT 2681, descrita como productora de aflatoxinas, sobre diferentes proporciones de mezclas de arroz - compost. Tras comprobar que la cepa control no puede producir las toxinas cuando el hongo se desarrolla sobre un 100% de compost, se comprueba si puede seguir haciéndolo sobre arroz. También se comprueba si la cepa control pierde su capacidad micotoxigénica al ser incubada sobre compost y luego sobre arroz. Para realizar este análisis se utiliza un método desarrollado en la sección de UHPLC-UV. Las diferentes pruebas realizadas con la cepa de control Aspergillus parasiticus CECT 2681, concluyen que la cepa control no pierde su capacidad micotoxigénica al ser incubada primero sobre compost y luego sobre arroz. También se puede concluir que el compost no es un buen sustrato para la producción de aflatoxinas ya que la producción de estas disminuye al aumentar la proporción de compost en el sustrato de crecimiento del hongo. / In this doctoral thesis we evaluated the fungal content of a total of 18 compost samples: 7 from the composting plant from Manresa, 6 from Blanes, 2 from urban solid waste from the processing plant CESPA, Can Barba (Vallès Occidental), two from homemade compost from Pineda de Mar and finally, one sample of fecal horse obtained in a trade specialized in gardening products. For each one of the samples the calculation of the fungus colony forming units, cfu / g, has been carried out; fungi have been identified for each of the samples at the level of genera. Aspergillus and Penicillium have been selected and have been incubated following the FDA method to verify if they can produce aflatoxins G2, G1, B2, B1 and OTA. Any of the isolated micotoxigenics fungi has positive production of the studied toxins over the detection limit when we have applied the chromatographic methods described in this work. For this reason, we study if compost is an appropriate substrate to produce aflatoxins by incubating control strain Aspergillus parasiticus CECT 2681, described as a producer of aflatoxins, in different proportions of rice-compost mixtures. After verifying that the control strain cannot produce toxins when the fungus grows on a 100% of compost, we verify if it can continue to produce toxins over the rice. It also verifies if the control strain loses its micotoxigenical capacity when it was incubated over compost and then over rice. To do this analysis we use a UHPLC-UV method developed in our section. To the different analyses realized with control strain Aspergillus parasiticus CECT 2681, we conclude that the strain does not lose its micotoxigenical capacity when being made on first and then incubated over rice. It can also be concluded that the compost is not a good substrate for aflatoxins production because the aflatoxins production decreases when the proportion of compost increases in the growth fungal substrate.

Specifically outlining the work achieved in this PhD thesis, the work is organised into separate articles that have been published, submitted or are under preparation for submission.Chapter 1 is an introduction, in which the state of the art and objectives are presented. In Chapters 2-4, different potential mediators that could be used for the catalytic interaction with the enzymatic product o-AP were evaluated and due to their well characterized properties, hydrazine, NADH and ascorbic acid were selected for further study. Hydrazine is used as an antioxidant and reducing agent; NADH plays an important rule in oxidoreductases and dehydrogenase systems and ascorbic acid (vitamin C) is an antioxidant whose detection is important in clinical and food applications. The electrocatalytic properties of o-aminophenol films grafted on glassy carbon surfaces have been employed for the electrochemical evaluation of hydrazine, NADH and ascorbic acid, to select the most relevant as a recycling mediator in the planned signal amplification strategy. To evaluate the best mediator, the reaction kinetics between mediators and the o-AP/o-QI were extensively studied using different techniques such as cyclic voltammetry, hydrodynamic voltammetry, double potential step chronoamperometry, and double potential step chronocoulometry. Of them, ascorbic acid was selected as the mediator for regeneration of the o-AP film and substrate recycling. We had thus demonstrated an interesting catalytic system for the oxidation of ascorbic acid, which is stable, sensitive and reproducible, and we decided to explore this system for clinical and food applications. In the first application, we targeted the determination of uric acid (UA) in the presence of ascorbic acid (AA), which commonly co-exist in biological fluids of humans, mainly in blood and urine (Chapter 4). In Chapters 5 and 6, the selective electrocatalytic properties of the grafted o-AP film toward ascorbic acid were also applied to its detection in real samples of fruits and vegetables using disposable one-shot screen printed electrodes. The o-AP modified screen printed electrodes showed high catalytic responses toward the electrocatalytic oxidation of ascorbic acid. The o-AP SPE sensor exhibited high sensitivity and selectivity toward ascorbic acid with excellent storage and operational stability, as well as a quantitatively reproducible analytical performance. In the second part of the thesis, different surface engineering strategies of antibody immobilization for immunosensor construction using a linker or via direct attachment onto a Au surface using a strategy of self assembly were evaluated and compared. An alternative strategy explored was the direct anchoring of the antibody with or without a linker via the electrochemical reduction of their diazonium cations.In Chapter 7, a comparison between these different surface chemistries methodologies for the construction of immunosensors towards the model analyte of coeliac toxic gliadin was carried out. Firstly, the self-assembled monolayer approach was evaluated based on the modification of gold surfaces with two bipodal carboxylic acid terminated thiols (thioctic acid and a benzyl alcohol disubstituted thiol, DT2). A stable SAM of DT2 was rapidly immobilized (3 h) on Au as compared with thioctic acid (100 h), although both surface chemistries resulted in highly sensitive electrochemical immunosensors for gliadin detection using an anti-gliadin antibody (CDC5), with detection limits of 11.6 and 5.5 ng/mL, respectively. The developed immunosensors were then applied to the detection of gliadin in commercial gluten-free and gluten-containing food products, showing an excellent correlation when compared to results obtained with ELISA. In Chapter 8, another approach was explored to further improve immunosensor sensitivity and stability and furthermore to reduce the time necessary for sensor preparation was investigated looking at the direct attachment of the SATA modified full length antibody, and their F(ab) fragments onto Au electrodes. Spontaneously adsorbed SAMs of Fab-SH and CDC5-SH onto Au were rapidly formed in less than 15 minutes. The amperometric immunosensors based on Fab fragments exhibited a vastly improved detection limit as compared to the thiolated antibody with a highly sensitive response toward gliadin detection (LOD, 3.29 ng/ml for amperometric detection and 0.42 g/ml for labelless (impedimetric) detection). Moreover, the self-assembled monolayer of F(ab) fragments was extremely stable with almost no loss in response after 60 days storage at 4oC.In Chapter 9, an alternative surface chemistry approach was explored for the modification of Au electrodes via electrochemical and spontaneous reduction of diazonium cations of a conjugate prepared from the monoclonal full length anti-gliadin antibody (CDC5) and the linker 3,5-bis(aminophenoxy)benzoic acid (DAPBA). Cylic voltammetry was chosen for surface modification via applying three potential cycles, but it was observed that an extensive washing process was necessary after each potential cycle to remove the non-specifically adsorbed molecules or formed multilayers. The affinity of the immobilized antibody toward gliadin was studied using EIS and amperometry. The modified CDC5-DAPBA surface showed a reasonable amperometric response after incubation with 5 g/ml gliadin, and exhibited excellent specificity with no response observed in the absence of the analyte.In Chapter 10, general conclusions and future work are presented. From the different surface chemistry strategies evaluated in this work we can conclude that the best approach is the immunosensor based on the spontaneous adsorption of thiolated F(ab) fragments on gold. This surface is easy and fast to prepare, very stable and sensitive and can be stored for long times in the appropriate conditions without lost of affinity. A good alternative to this approach seems to be the electrodeposition of antibody-diazonium conjugates, although further work is needed in order to optimize this system.Overall, this work has contributed significantly to the vision we have for an immunosensor that avoids washes and reagent addition, where we have selected an excellent mediator for co-encapsulation with alkaline phosphatase enzymes within liposome reporter molecules, for regeneration of surface immobilised substrate following enzymatic dephosporylation, facilitating substrate recycling and increase in sensitivity and reduction in detection limit. Furthermore, we have selected an optimum surface chemistry for co-immobilisation of capture antibody molecules and enzyme substrate via the formation of self-assembled monolayers of antibody fragments on gold surfaces. Future work will focus on combining the selected mediator and surface chemistry into a sandwich immunosensor with a target sensitive liposome reporter molecule, to demonstrate a reagentless, washless ultrasesensitive immunosensing platform. / El trabajo descrito en la presente tesis ha sido organizado en capitulos en los que se detallan diferentes artículos publicados, enviados para su publicación o en preparacion en los cuales esta basada la tesis. El Capitulo 1 es una introducción en la que se presenta el estado del arte del tema y los objetivos de la tesis. En los Capítulos 2 a 4 se evalúan las propiedades electrocatalíticas de diferentes mediadores (hidracina, NADH y ácido ascórbico) que podrían ser utilizados en reacciones de reciclado de substratos enzimáticos en estrategias de amplificación de señal en biosensores. La hidracina es usada como antioxidante y agente reductor, el NADH es fundamental para el funcionamiento de oxidorreductasas y deshidrogenasas y el ácido ascórbico (AA, vitamina C) es de gran importancia como antioxidante. Las propiedades electrocatalíticas de monocapas de o-aminofenol (o-AP) en superficies de carbón vítreo fueron empleadas en la caracterización electroquímica de estos mediadores con el objetivo de seleccionar el mediador más adecuado. Para ello se determinaron diferentes parámetros cinéticos asociados empleando voltametría cíclica e hidrodinámica, así como cronoamperometría y cronocoulometría de doble potencial, siendo el acido ascórbico es mas adecuado en términos de coste, respuesta electroquímica y estabilidad. Teniendo en cuenta estas propiedades del AA, se decidió explorar otras posibles aplicaciones clínicas y en análisis de alimentos de este sistema. En primer lugar se estudio la determinación de acido úrico en presencia de AA, el cual coexiste en diferentes fluidos biológicos y se estudió su determinación en muestras reales de orina (Capítulo 4). En los Capítulos 5 y 6 se detalla la utilización de electrodos desechables modificados con o-AP fabricados con la técnica de screen-printing en la determinación de AA de ácido ascórbico en una amplia variedad de frutas y vegetales frescos y zumos comerciales. La selectividad, reproducibilidad y estabilidad de estos electrodos fueron también estudiadas.En la segunda parte de la tesis se evalúan diferentes estrategias para la inmovilización de anticuerpos para la construcción de inmunosensores. Estas estrategias consisten en la deposición de los anticuerpos en superficies de oro mediante autoensamblaje de compuestos tiolados o la electrodeposición de sales de diazonio. En el Capítulo 7 se compara el uso de dos compuestos ditiolados para la modificación de superficies de oro. Estos compuestos se emplearon para la inmovilización de anticuerpos en la construcción de un inmunosensor electroquímico para la detección de gliadina en muestras reales.El Capítulo 8 es la continuación del trabajo anterior y está basado en la adsorción espontánea de fragmentos de anticuerpos o anticuerpos tiolados en superficies de Au para la detección de gliadina. Para ello se compararon las respuestas amperométricas de ambos sistemas, observándose una excelente sensibilidad en el caso de los fragmentos de anticuerpos, asi como una mayor estabilidad (hasta 60 dias a 4ºC) de este sistema. En el Capítulo 9, se estudia una alternativa consistente en la electrodeposición de sales de diazonio conjugadas a anticuerpos. Para ello se estudiaron diferentes métodos de deposicion (electroquímicos o adsorción espontánea), siendo la deposición empleando voltametría ciclica la más adecuada. Sin embargo, esta metodología requirió de un gran número de pasos de lavado para la eliminaciñon de compuestos adsorbidos no específicamente. A pesar de esto, el anticuerpo inmovilizado mostró una buena afinidad hacia la gliadina al ser evaluada por amperometría con una excelente especificidad.El Capítulo 10 consiste en las conclusiones generales y un plan de trabajo para el futuro.De forma general, este trabajo ha contribuido significativamente a la culminación de una estrategia que evita pasos de lavado y de adición de reactivo en el diseño de inmunosensores. Para ello se la seleccionado el mediador más adecuado para coencapsulación con fosfatasa alcalina en liposomas para la regeneración de sustratos inmovilizados en superficies, lo cual facilita su reciclado, así como incrementa la sensibilidad y disminuye los limites de detección. Paralelamente, se han estudiado diferentes superficies para la inmovilización de anticuerpos consistentes en la deposición de los anticuerpos y sus fragmentos en superficies de oro mediante autoensamblaje de compuestos tiolados o la electrodeposición de sales de diazonio. Se propone en el futuro combinar ambas estrategias en la construcción de plataformas inmunosensoras de fácil operatividad y ultrasensibles.

DETERMINATION OF ANTIBIOTICS IN BIOLOGICAL SAMPLES BY CAPILLARY ELECTROPHORESISThe main objective of this Thesis is the development of analytical methods for determining several antibiotic families by capillary electrophoresis. Other objective of this Thesis is the application of capillary electrophoresis as analytical technique for determining antibiotic residues in biological samples. These samples are very complex and for this reason we have developed pretreatment systems for extracting the compounds from the matrix and to diminish the amount of interfering substances. In the other way, one of the most important disadvantages in capillary electrophoresis is that usually we can not determine low concentrations. For this reason another objective of this Thesis is to study several ways to decrease detection limits of capillary electrophoresis system. Thus we have studied several on-column preconcentration systems, such as field amplified sample injection and capillary isotacophoresis. These systems are able to increase rapidly and simply the sensibility of the system several magnitude orders. By this way in this Thesis we have developed several analytical methods for determining several antibiotics and antibiotic families in different types of biological samples. We have studied the following antibiotic families: penicillins, quinolones, tetracyclines and aminoglycosides. Moreover, they have been analysed in several biological samples, such as plasma and different tissue samples (e.g. liver, kidney and muscle). All of these studies have been developed in animal samples except in one of them in which it was developed in human serum. This Doctoral Thesis is structured in four chapters. The first one includes an introduction in which is explained the antibiotic concept and is described the legislation which controls the administration of antibiotics in animals, and explains the necessity of developing analytical methods to determine residues at low levels in biological samples. The second one includes a review about several papers in which are developed the analysis of antibiotics in biological samples. There is described which are the systems more used in this kind of studies and the use of capillary electrophoresis as a real and suitable alternative. Moreover, this chapter includes a copy of work which analyzed antibiotics in biological samples by capillary electrophoresis. This work will be published in an international journal, Trends in Analytical Chemistry.The third chapter includes the experimental part of this Thesis. By this way, this chapter includes the eight works published in international journals (Electrophoresis, Journal of Chromatography B and Chromatographia). Before each paper there is included a brief explanation about the paper contents. Some of published papers are based in the study of several types of pretreatment systems. And the other works include comparative studies to determine which is the best system to increase system sensitivity. The last chapter describes the conclusions obtained through these works. / DETERMINACIÓ D´ANTIBIÒTICS EN MOSTRES BIOLÒGIQUES PER ELECTROFORESI CAPIL·LARL'objectiu fonamental de la present Tesi Doctoral ha estat desenvolupar mètodes analítics per dur a terme la determinació de diferents famílies d'antibiòtics per electroforesi capil·lar.Un altre objectiu de la present Tesi Doctoral ha estat aplicar l'electroforesi capil·lar com a tècnica analítica per a la determinació de residus d'antibiòtics en mostres biològiques. Degut a la complexitat d'aquestes mostres ha estat necessari desenvolupar sistemes de pretractament de les mostres per tal d'extreure els analits de la matriu i disminuir d'aquesta manera la quantitat de substàncies interferents degudes als components de la matriu de la mostra, els quals molts cops es troben a concentracions molt majors que els compostos d'interès.Per altra banda, un dels principals inconvenients de l'electroforesi capil·lar és que en molts casos no és una tècnica el suficientment sensible per tal de determinar concentracions baixes. És per això que un altre objectiu d'aquesta Tesi Doctoral ha estat estudiar maneres d'augmentar la sensibilitat del sistema. S'han estudiat sistemes de preconcentració on-column, com és la injecció de grans volums de mostra i la isotacoforesi capil·lar. Aquests sistemes es caracteritzen perque permeten augmentar de manera ràpida i simple la sensibilitat del sistema diversos ordres de magnitud.D'aquesta manera en la present Tesi Doctoral s'han desenvolupat diferents mètodes analítics per a la determinació de diferents antibiòtics i famílies d'antibiòtics en diferents tipus de mostres biològiques. Les famílies d'antibiòtics estudiades han estat les penicil·lines, les quinolones, les tetraciclines i els aminoglicòsids. I s'han analitzat en diferents tipus de mostres biològiques com són plasma i diferents teixits (fetge, ronyó i múscul). En tots els casos els estudis s´han realitzat en mostres animals, excepte en un cas en el que es va desenvolupar l´estudi en sèrum humà.Aquesta Tesi Doctoral s'ha estructurat en quatre capítols. En el primer es fa una introducció al concepte d'antibiòtic i es descriu la normativa que hi ha establerta per a la seva administració en animals així com la necessitat de desenvolupar estudis de residus que permetin determinar els antibiòtics a baixos nivells de concentració en les mostres biològiques. En el segon capítol es mostra una revisió actualitzada de l'estat d'investigació en el camp dels antibiòtics. Es descriu quins han estat els sistemes més utilitzats en aquestes anàlisis i l'alternativa que suposa l'ús de l'electroforesi capil·lar en aquests estudis degut a les seves característiques. Aquest capítol inclou els diferents sistemes de tractament de mostres així com es descriuen diferents sistemes de preconcentració on-column per electroforesi capil·lar. Aquest mateix capítol inclou una còpia del treball que serà publicat a la revista internacional "Trends in Analytical Chemistry" que va sorgir arrel de l'estudi bibliogràfic sobre l'anàlisi d'antibiòtics en mostres biològiques per electroforesi capil·lar.En el tercer capítol s'inclou la part experimental realitzada en aquesta Tesi Doctoral. Aquest capítol es divideix en vuit apartats que corresponen als vuit treballs publicats en revistes internacionals ("Electrophoresis", "Journal of Chromatography B" i "Chromatographia"). Cada apartat inclou una breu explicació del que s'ha estudiat en el treball així com una còpia del treball publicat. En alguns dels treballs s'han desenvolupat mètodes analítics basats en l'estudi de sistemes de pretractament de les mostres biològiques per tal de dur a terme l'anàlisi dels antibiòtics. S´ha determinat quins tipus de tractament és més adequat en funció de l´antibiòtic i de la mostra. També en aquests treballs s'han desenvolupat estudis comparatius per tal de determinar quins sistemes de preconcentració resulten més efectius per tal d'augmentar la sensibilitat del sistema i com varien els resultats en funció de la família d'antibiòtics que s'està estudiant.Finalment, en el quart capítol es descriu a quines conclusions s'ha arribat després de l'estudi de recerca realitzat així com dels resultats obtinguts a la part experimental.

L'objectiu principal d'aquesta tesi és el desenvolupament de mètodes analítics que permetin la determinació dels paràmetres establerts per la normativa, per aigües destinades al consum humà (índexs d'activitat alfa total i beta total i activitat de triti) així com, la caracterització d'un grup d'emissors gamma i els isòtops de l'urani i el tori, tant en mostres aquoses com en mostres sòlides. Per altra banda, a part del desenvolupament d'aquests mètodes, s'ha realitzat la caracterització d'aigües superficials, aigües embotellades, sediments, fangs i biota. Els treballs realitzats es troben, principalment, localitzats a l'últim tram de la conca del riu Ebre per avaluar la possible influència de les indústries localitzades en aquesta zona. Concretament, en aquest tram del riu Ebre es troben localitzades la central nuclear d'Ascó, la indústria de fosfat bicàlcic i finalment, la planta de tractament d'aigua potable a l'Ampolla. Aquestes indústries degut al seu funcionament, poden incrementar la presència de radionúclids tant d'origen natural com artificial en els diferents ecosistemes d'aquest riu. / El objetivo principal de esta tesis es el desarrollo de métodos analíticos que permitan la determinación de los parámetros establecidos por la normativa, para aguas destinadas al consumo humano (índices de actividad alfa total i beta total i actividad de tritio) así como, un grupo de emisores gamma i los isótopos del uranio y el torio, en muestras acuosas y en muestras sólidas. Por otro lado, a parte del desarrollo de estos métodos, se ha realizado la caracterización de aguas superficiales, aguas embotelladas, sedimentos, lodos y biota. Los trabajos realizados se encuentran principalmente localizados en el último tramo del río Ebro con la finalidad de evaluar la posible influencia de las industrias localizadas en esta zona. Concretamente, en este tramo del río Ebro se encuentran localizadas la central nuclear de Ascó, la industria de fosfato bicálcico y finalmente, la planta de tratamiento de agua potable en la Ampolla. Estas industrias debido a su funcionamiento, pueden incrementar la presencia de radionucleidos tanto de origen natural como artificial en los diferentes ecosistemas de este río.

El gran número y diversidad de analíticas que requieren los productos farmacéuticos hacen necesario el desarrollo de metodologías de análisis rápidas y fiables. Actualmente, la aplicación de nuevas técnicas instrumentales para control de calidad, que permitan la obtención de resultados de forma rápida y más económica, es un campo de investigación muy activo en la industria farmacéutica. En esta tesis se han utilizado dos técnicas de reciente aparición: la electroforesis capilar (EC) y la espectroscopia en el infrarrojo cercano (NIR) para desarrollar metodologías de análisis para productos farmacéuticos. Ambas técnicas, aunque muy diferentes, han sido aplicadas con éxito para cubrir distintas necesidades analíticas.EC se ha utilizado para el desarrollo y la validación de un método para la separación y determinación de los componentes de un preparado farmacéutico. Dado el carácter iónico de los componentes, se trabaja con la modalidad de electroforesis capilar de zona (CZE). La resolución y alta eficacia obtenidas permiten aplicar este método tanto a la determinación del contenido en principio activo como al seguimiento de la estabilidad del preparado. Para resolver los seis posibles isómeros posicionales de un producto derivado del preservante del fármaco se han comparado tres opciones: HPLC, CZE y la cromatografía electrocinética micelar (MEKC). Ésta última es la que permite obtener la mejor resolución, separando cinco de los seis isómeros posibles.NIR ha sido aplicado tanto en análisis cualitativo como en el análisis cuantitativo de distintos fármacos. La identificación se ha realizado desarrollando bibliotecas de espectros y para mejorar la discriminación entre productos semejantes se ha propuesto una estrategia de trabajo de bibliotecas en cascada (identificación en la biblioteca general y si es necesario en una segunda más restringida y discriminante) que permiten identificar completamente una muestra. También se ha utilizado la técnica NIR en el desarrollo de métodos para la determinación de los principios activos en dos preparados farmacéuticos con presentaciones distintas: un granulado y un gel. Para el granulado, se han comparado distintas estrategias posibles en el desarrollo del método, mientras que para el gel se han discutido las posibilidades para el registro de los espectros. Ambos métodos han sido desarrollados y validados con éxito.Las metodologías analíticas desarrolladas han demostrado su eficacia en la resolución de varios aspectos del control de calidad farmacéutico. Tanto la electroforesis capilar como la espectroscopia NIR poseen un gran potencial como alternativas a los métodos ya implantados, permitiendo optimizar tiempos y costes. / The high number and diversity of analytical tests required for pharmaceutical products encourages the development of expeditious and reliable analytical methods. Nowadays, the application of analytical techniques to obtain results more and economic and rapidly is a very active research field in pharmaceutical industry. In this work, two recently appeared techniques: capillary electrophoresis (CE) and near-infrared spectroscopy (NIR), have been used in the development of analytical methodologies for different drug products. Despite its differences, both techniques have been successfully applied to solve different analytical problems.CE has been used in the development and validation of a method for separation and determination of all components in a formulation. Due to ionic condition of all components, capillary zone electrophoresis (CZE) has been chosen as the better electrophoretic mode. The high resolution and efficiency obtained allow to apply this method not only in the determination of the active substance but also for stability control of the formulation. In order to resolve the six possible isomers of a product derived of the preservative in the formulation, three different options have been compared: HPLC, CZE and micellar electrokinetic chromatography (MEKC). Characteristics of the last, which includes a surfactant as pseudostationary phase, allow to obtain a higher resolution, resolving five of the six possible isomers.NIR has been applied in qualitative and quantitative analysis. In qualitative analysis, NIR has been used in the development of spectral libraries for identifying a vast number of products. A new strategy has been proposed, with the design of cascade libraries (a first identification in a general library and, if necessary, a second one in a more reduced and discriminating sub-library) for complete identification of a sample. In quantitative analysis, NIR has been employed in the development of methods for determining the active in two drug products with different presentations: a granulate and a hydrogel. In the granulate method, different calibration strategies have been compared, while in the hydrogel method the spectral register method has been discussed. Both methods have been successfully developed and validated, yielding very good results.Analytical methodologies developed have confirmed its usefulness for pharmaceutical quality control. Both CE and NIR show a great potential as alternative methods to conventional techniques, allowing the optimisation of costs and times of analysis.