Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-09-18T15:03:59Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Caroline Marques Caloi.pdf: 1667299 bytes, checksum: 818ef12f2884a1595534e6fe5023eb67 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-09-22T11:54:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Caroline Marques Caloi.pdf: 1667299 bytes, checksum: 818ef12f2884a1595534e6fe5023eb67 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-22T11:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Caroline Marques Caloi.pdf: 1667299 bytes, checksum: 818ef12f2884a1595534e6fe5023eb67 (MD5) Previous issue date: 2014-09-22 / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, causada pelo Mycobacterium leprae (M. leprae), parasita intracelular obrigatório que afeta, preferencialmente, macrófagos no tecido conectivo e células de Schwann nos nervos periféricos. O objetivo desse trabalho foi identificar as células mnonucleares presentes na pele de pacientes com hanseníase, com as formas clínicas tuberculóide-tuberculóide (TT), tuberculóide-borderline (TB), borderline-borderline (BB), virchowiano-borderline (BV) e virchowiano-virchowiano (VV); e mensurar a expressão dos mediadores anti-inflamatórios anexina-A1 (ANXA1) e interleucina-10 (IL-10), investigando seu possível papel na patogênese da doença. Após o diagnóstico clínico os pacientes foram submetidos à biópsia da lesão para análise histopatológica. Os cortes histopatológicos foram submetidos à técnica de imunofluorescência para detecção dos mediadores ANXA1 e IL-10. Os resultados demonstraram uma correlação na diferença dos tipos de leucócitos presentes nas diferentes formas clínicas dos pacientes com hanseníase com os níveis dos mediadores ANXA1 e IL-10 produção diferencial de mediadores reguladores do processo infeccioso. Os dados demonstraram que os histiócitos, células T CD4+ e T CD8+ dos pacientes com as formas clínicas BV e VV apresentavam uma expressão aumentada da proteína ANXA1, assim como nos níveis da citocina IL-10. Além disso, pode-se verificar uma correlação positiva na expressão da ANXA1 e nos níveis de IL-10 nos pacientes BB, BV e VV, indicando possivelmente que essa proteína possa contribuir com a regulação da produção dessa citocina durante o processo infeccioso induzido por M. leprae. Em conclusão, a proteína ANXA1 foi caracterizada como um possível regulador do processo infeccioso induzido por M. leprae, indicando que, a presença dessa proteína poderia estar reduzindo o potencial pró-inflamatório nos pacientes BB, BV e VV, levando a disseminação do M. leprae. Do contrário, em pacientes TT e BT, a proteína ANXA1 apresenta-se reduzida, o que poderia contribuir com a ativação dos leucócitos e a eliminação das bactérias. / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae (M. leprae), a intracellular obligate parasite that affects mainly macrophages and Schwann cells. This study’s goal was to identify monocytic cells present in the skin of leprosy patients with tuberculoid- tuberculoid clinical forms (TT), tuberculoid-borderline (TB), borderline-borderline (BB), borderline-lepromatous (BV) and lepromatous (LL); and evaluating the expression of annexin-A1 (ANXA1), and anti-inflammatory mediators interleukin-10 (IL-10), evaluating its potential role in pathogenesis disease. After the clinical diagnosis, the patients underwent biopsy for histopathological analysis. Histopathological cuts were submitted to immunofluorescence staining for detection of mediators ANXA1 and IL-10. The results showed a difference in the of leukocytes’s profile in patients with different clinical forms of leprosy, that is essential to allow the differential production of regulatory mediators of the infectious process. The data showed that the histiocytes, CD4 + and CD8 + T cells of patients with clinical forms BV and VV had a higher expression of ANXA1 protein as well as high levels of IL-10. Furthermore, it can be seen a positive correlation in expression of ANXA1 and IL-10 in BB, BV and VV patients, possibly indicating that this protein may contribute to the regulation of this cytokine production during the infectious process induced by M. leprae. In conclusion, ANXA1 protein was characterized as a possible regulator of the infectious process induced by M. leprae, indicating that the presence of this protein could be reducing the pro-inflammatory potential in BB, BV and VV patients taking the spread of the bacterium M. leprae. Otherwise, patients in TT and BT, ANXA1 protein comes in lower levels, which could contribute to more effective activation of pro-inflammatory action of the immune system, favoring the elimination of bacterias.

Submitted by Caroline de Freitas Zanon (carolfzanon@yahoo.com.br) on 2018-07-19T18:02:39Z No. of bitstreams: 1 TESE VERSAO FINAL.pdf: 2398136 bytes, checksum: a2ce0aa2c7a816d48d27d6f13d6a0fec (MD5) / Rejected by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: Problema 01) As páginas pré-textuais não estão na ordem correta, a ordem correta das páginas pré-textuais (capa, folha de rosto, ficha catalográfica, folha de aprovação, dedicatória, agradecimentos, epígrafe, resumo na língua vernácula, resumo em língua estrangeira, listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e sumário). Problema 02) Nos agradecimentos consta também a FAPESP, então deve constar o nome dela também na folha de rosto e de aprovação com o número de processo e nos agradecimentos precisa constar o número do processo também, é norma do convênio, coloque também os números do processo da CNPQ. Problema 03) No repositório você colocou o nome de Caroline de Freitas Zanon e na tese está Caroline de Freitas Zanon de Carvalho, se esse é o seu nome atual por favor coloque também este nome no repositório. Sua submissão será rejeitada para que você possa fazer as correções Lembramos que o arquivo depositado no repositório deve ser igual ao impresso, o rigor com o padrão da Universidade se deve ao fato de que o seu trabalho passará a ser visível mundialmente. Agradecemos a compreensão. on 2018-07-19T19:04:58Z (GMT) / Submitted by Caroline de Freitas Zanon de Carvalho (carolfzanon@yahoo.com.br) on 2018-07-21T14:52:58Z No. of bitstreams: 1 TESE VERSAO FINAL.pdf: 2394414 bytes, checksum: 6f54895bda93635e996f95a66bf389be (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2018-07-23T13:58:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carvalho_cfz_dr_sjrp.pdf: 2370535 bytes, checksum: d8d49b7c960d1ac32653f9d268eda5df (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-23T13:58:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carvalho_cfz_dr_sjrp.pdf: 2370535 bytes, checksum: d8d49b7c960d1ac32653f9d268eda5df (MD5) Previous issue date: 2018-06-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os avanços recentes nos mecanismos de inflamação e a descoberta de vários mediadores endógenos anti-inflamatórios levaram a novas investigações sobre as possibilidades terapêuticas. A demonstração, em estudos científicos, da ação anti-inflamatória da proteína anexina A1 (ANXA1) e do seu peptídeo mimético Ac2-26, têm sido fonte de sucesso para o desenvolvimento de novos fármacos. A descoberta da interação biofísica da piplartina (PL) com a região N-terminal da ANXA1 abriu um novo e instigante campo de investigação para o nosso grupo de pesquisa. Diante destas considerações, o objetivo do presente trabalho foi investigar a atuação da PL nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), ativadas pelo lipopolissacarídeo (LPS). Ainda, se a interação Ac2-26/PL influência nas ações anti-inflamatórias da PL, favorecendo ou atenuando os seus efeitos nos processos inflamatórios. Inicialmente foi utilizada a Espectroscopia de Absorbância UV-Vis e de Fluorescência para investigar as interações entre o ligante PL e Ac2-26. In vitro, as células HUVEC foram ativadas pelo LPS (10 μg/mL), nos tempos de 8, 24, 48 e 72 horas, seguido pelos tratamentos com Ac2-26 (1µM) e/ou PL (10µM), demonstrando resultados expressivos em 24 e 72 horas. Os efeitos foram avaliados nos seguintes aspectos: proliferação celular, viabilidade celular, dosagens da quimiocina MCP-1 e das citocinas IL-8 e IL-1β e expressão da proteína α-tubulina. A presença de um anel trimetoxiaromático na estrutura da PL, o que pode favorecer uma interação com a tubulina, motivou as análises de Western blotting, as quais demonstraram que a PL inibiu a síntese da proteína endógena α-tubulina, em todas as condições experimentais. Nossos resultados mostraram efeitos pró-proliferativos do peptídeo Ac2-26 e, por outro lado, antiproliferativos e pró-apoptóticos da PL. Os níveis das citocinas pró-inflamatórias confirmaram o papel anti-inflamatório do Ac2-26 nas células ativadas pelo LPS, com redução dos níveis de MCP-1 e IL-8, em 24 horas. O tratamento PL reduziu os níveis de MCP-1 nas células ativadas pelo LPS, e aumentou IL-8, inclusive no tratamento associado Ac2-26/PL. Em conjunto, os resultados com as células HUVEC indicam que a PL inibe a proliferação por meio da ativação da apoptose celular, regulada pela inibição da polimerização da α-tubulina e dos níveis elevados da citocina IL-8. A PL e o Ac2-26 mostraram ações anti-inflamatórias, e a interação Ac2-26/PL parece ser neutra em relação às propriedades anti-inflamatórias da PL. / Recent advances in inflammation mechanisms and the discovery of several endogenous anti-inflammatory mediators have led to further investigations into the therapeutic possibilities. The demonstration, in scientific studies, of the annexin A1 protein (ANXA1) anti-inflammatory action and its peptide mimetic Ac2-26, have been a source of success for the development of new drugs. The discovery of the biophysical interaction of piplartin (PL) with the N-terminal region of ANXA1 opened a new and exciting field of investigation for our research group. In view of these considerations, the objective of the present study was to investigate the role of PL in lipopolysaccharide (LPS) activated human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Also, if the interaction Ac2-26/PL influences the anti-inflammatory actions of PL, favoring or attenuating its effects on inflammatory processes. Initially, UV-Vis Absorbance Spectroscopy and Fluorescence were used to investigate the interactions between the PL ligand and Ac2-26. In vitro, HUVEC cells were activated by LPS (10 μg/mL) at 8, 24, 48 and 72 hours, followed by treatments with Ac2-26 (1μM) and/or PL (10μM), demonstrating expressive results in 24 and 72 hours. The effects were evaluated in the following aspects: cell proliferation, cell viability, MCP-1 chemokine and IL-8 and IL-1β cytokines and α-tubulin protein expression. The presence of a trimethoxyaromatic ring in the PL structure, which may favor an interaction with tubulin, motivated Western blotting analyzes, which demonstrated that PL inhibited endogenous α-tubulin protein synthesis in all experimental conditions. Our results showed pro-proliferative effects of the peptide Ac2-26 and, on the other hand, antiproliferative and pro-apoptotic of PL. Proinflammatory cytokine levels confirmed the anti-inflammatory role of Ac2-26 in LPS-activated cells, reducing MCP-1 and IL-8 levels within 24 hours. PL treatment reduced MCP-1 levels in LPSactivated cells, and increased IL-8, including in the treatment associated with Ac226/PL.Taken together, the results with HUVEC cells indicate that PL inhibits proliferation through the activation of cellular apoptosis, regulated by the inhibition of α-tubulin polymerization and elevated IL-8 cytokine levels. PL and Ac2-26 showed anti-inflammatory actions, and the Ac2-26/PL interaction appears to be neutral in relation to the anti-inflammatory properties of PL. / CNPq: 142274/2014 / CNPq UNIVERSAL: 474596/2013-3

Orientador: Flávia Cristina Rodrigues-Lisoni / Coorientador: Sonia Maria Oliani / Banca: Eny Maria Goloni Bertollo / Banca: Cristiane Damas Gil / Resumo: O carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) representa o sexto câncer mais comum em todo o mundo, sendo o câncer na cavidade oral o mais comum entre as regiões anatômicas de abrangência do CECP. Há evidências de que o desenvolvimento e a progressão do câncer dependem não somente de suas características genéticas, mas também de interações de suas células com as células do microambiente tumoral. A carcinogênese também está relacionada com angiogênese e processos inflamatórios, que podem ser controlados pela ação de mediadores anti-inflamatórios, e entre esses, destacamos a proteína anti-inflamatória anexina A1 (ANXA1). Mas os mecanismos pelos quais a ANXA1 atua na tumorigênese e a sua relação com a interação entre células endoteliais e tumorigênicas não são bem conhecidos e, considerando seu papel na inflamação, compreendem um alvo importante para estudo. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo, analisar a interação de células endoteliais e tumorigênicas juntamente com a ação do peptídeo sintético Ac2-26 da proteína ANXA1(ANXA1Ac2-26) em linhagem de carcinoma de cabeça e pescoço, verificando como o peptídeo atua junto ao meio condicionado de células endoteliais e/ou de células tumorais, elucidando como os fatores excretados por ambas as células e o peptídeo atuam no processo tumorigênico. Para isso, a observação da morfologia foi realizada em microscópio invertido, o índice de proliferação pela curva de crescimento, a viabilidade celular foi determinada pelo... / Abstract: Head and Neck Squamous Cells Carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the world, being cancer in the oral cavity the most common among the anatomical regions of HNSCC. There is evidence that the development and progression of cancer depends not only on its genetic characteristics, but also because of the interactions of cells, cancer and tumor microenvironment cells. Carcinogenesis is also related to angiogenesis and inflammatory processes which can be controlled by the action of anti-inflammatory mediators, among which we highlight the anti-inflammatory protein annexin A1 (ANXA1). But the mechanisms that ANXA1 acts in tumorigenesis and its relation to the interaction between endothelial and tumorigenic cells are not well known and considering their role in inflammation, comprise an important target for study. Therefore, the present study aimed to analyze the interaction of endothelial and tumorigenic cells with the action of the synthetic peptide Ac2-26 of the ANXA1 protein (ANXA1Ac2-26) in head and neck carcinoma cell line, verifying how the peptide acts with the conditioned medium of endothelial cells and/or tumor cells, elucidating how the factors excreted by both cells and the peptide acts in the tumorigenic process. For this, the morphology observation was performed under inverted microscope, proliferation index by growth curve, cell viability was determined by the colorimetric method MTS (IC50), cell migration by transwell bilayer method, genotoxicity by ... / Mestre

A inflamação é fundamental para a manutenção da homeostasia e para a resposta do organismo à injúria. A resposta inflamatória deve ser adequada aos estímulos agressores; no sistema nervoso central, sua inadequação conduz à gênese de diferentes doenças neurodegenerativas. A proteína anexina A1 (ANXA1) e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) controlam a inflamação, pois ambos inibem o desenvolvimento da inflamação e aceleram sua resolução. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a ANXA1 modula a expressão de PPARγ em macrófagos. Assim, o presente trabalho investigou a modulação da expressão do PPARγ e das suas funções em células da microglia pela ANXA1. Foram empregadas células imortalizadas da linhagem BV2 (microglia murina), inalteradas ou transfectadas para redução da expressão de ANXA1, tratadas com ANXA1 exógena (recombinante - rANXA1) ou com agonista ou antagonista de PPARγ (pioglitazona e GW9662, respectivamente). Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamento com rANXA1 aumenta as expressões gênica (RT-PCR) e proteica (Western Blotting) de PPARγ, e ambas as expressões estão reduzidas em células com deficiência endógena de ANXA1, sendo que tal efeito foi revertido pela ação da rANXA1; 2) tratamento com rANXA1 não induz a expressão dos fatores de transcrição ligados a expressão de PPARγ: proteínas ligantes de elementos de resposta ao cAMP - CREB - e transdutores de sinais e ativadores de transcrição - STAT6 - (Western Blotting), mas os níveis de ambos os fatores estão reduzidos em células transfectadas, e tal efeito não foi revertido pelo tratamento com rANXA1; 3) tratamento com pioglitazona ou com rANXA1 individualmente aumenta a fagocitose de células PC12 apoptóticas (citometria de fluxo), mas o tratamento simultâneo não altera a fagocitose induzida por pioglitazona ou rANXA1; no entanto, tratamento com GW9662 inibiu a fagocitose induzida pelo tratamento com rANXA1; 4) o tratamento com rANXA1 aumenta a expressão de CD36 (citometria de fluxo); a expressão de CD36 está reduzida em células transfectadas e tal expressão não é revertida pelo tratamento com rANXA1. Em conjunto, os dados obtidos mostram a modulação da ANXA1 sobre PPARγ em células da micróglia, com possível ação sobre a fagocitose de células apoptóticas, e que a redução da expressão de ANXA1 reduz acentuadamente a expressão dos fatores de transcrição STAT6 e CREB, bem como a expressão de CD36. A elucidação dos efeitos resultantes destas alterações desencadeadas pela deficiência de ANXA1 endógena poderá contribuir para compreensão da fisiopatologia da neuroinflamação. / Inflammation is a key process in maintaining homeostasis and is essential for the body\'s response to injury. The inflammatory response must be proportional to the aggressor stimuli; in the central nervous system, a failed proper modulation leads to the development of different neurodegenerative diseases. Protein annexin A1 (ANXA1) and peroxisome proliferated-activated receptors (PPAR) control inflammation, as both inhibit development of inflammation and accelerate its resolution. Our research group has demonstrated that ANXA1 modulates PPARγ expression in macrophages. Thus, the present work investigated the modulation of PPARγ expression and its functions in microglia cells by ANXA1. In order to assess such, immortalized cells from cell line BV2 (murine microglia), either unadulterated or transfected for reduced expression of ANXA1, were treated with exogenous ANXA1 (recombinant protein - rANXA1) or either with PPARγ agonist or antagonist (pioglitazone and GW9662, respectively). The obtained results demonstrated that: 1) treatment with rANXA1 increases both gene (RT-PCR) and protein (Western Blotting) expressions of PPARγ, and also that both expressions are reduced in cells with endogenous deficiency of ANXA1, and such effect was reversed by the actions of rANXA1; 2) treatment with rANXA1 does not promote the expression of transcription factors associated with PPARγ expression: cAMP response element binding protein - CREB - and signal transductor and activator of transcription 6 - STAT6 (Western Blotting), but the expression levels of both factors are reduced in transfected cells, and such effect was not reversed by treatment with rANXA1; 3) individual treatment with pioglitazone or rANXA1 increases phagocytosis of apoptotic PC12 cells (flow cytometry), but simultaneous treatment does not affect pioglitazone/rANXA1-induced phagocytosis; however, treatment with GW9662 inhibited rANXA1-induced phagocytosis; 4) treatment with rANXA1 increases CD36 expression (flow cytometry); the expression of CD36 is reduced in transfected cells, and such expression is not reversed by treatment with rANXA1. The obtained data demonstrate the modulation ANXA1 exerts upon PPARγ in microglia cells, with a possible action upon phagocytosis of apoptotic cells, and that reduction of ANXA1 expression greatly reduces the expression of transcription factors STAT6 and CREB, as well as the expression of CD36. Elucidation of such effects that arise from a deficiency of endogenous ANXA1 will contribute to a better comprehension of the pathophysiology of neuroinflammation.

Submitted by SARA DE SOUZA COSTA null (sarah_sc_0705@hotmail.com) on 2017-03-30T13:36:06Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Sara de Souza Costa.pdf: 2766240 bytes, checksum: 20b447fe5bf3c49e40aa0b5fdf4dff1f (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-04-06T13:29:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 costa_ss_me_sjrp.pdf: 2766240 bytes, checksum: 20b447fe5bf3c49e40aa0b5fdf4dff1f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T13:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 costa_ss_me_sjrp.pdf: 2766240 bytes, checksum: 20b447fe5bf3c49e40aa0b5fdf4dff1f (MD5) Previous issue date: 2017-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As lesões uterinas são causas importantes de desconforto, infertilidade e óbito entre as mulheres no Brasil e no mundo. O câncer de endométrio é um tumor maligno frequente e sua incidência vem aumentando nas últimas décadas. Enquanto, o tumor uterino benigno mais comum, o leiomioma, acomete cerca de 40% das mulheres na idade reprodutiva, sendo relacionado à menorragia, dismenorreia e infertilidade. Investigações indicam que o microambiente tumoral é crucial para o avanço do câncer, sendo caracterizado, principalmente, pela composição alterada da matriz extracelular, alta densidade de microvasos e abundância de células inflamatórias, como mastócitos (MCs). MCs desgranulados liberam fatores quimiotáticos e proteases, como triptase e quimase, para o meio extracelular, contribuindo na degradação da matriz extracelular, promoção da angiogênese, propiciando ambiente favorável para invasão tumoral e remodelação tecidual por meio de proteólises seletivas na matriz e ativação de metaloproteinases. Outro aspecto importante no crescimento tumoral é a proteína anti-inflamatória Anexina A1 (ANXA1), relacionada à regulação dos processos de crescimento e migração/invasão celular, sendo seus efeitos mediados por receptores para peptídeos formilados (FPRs), especialmente FPR1 e FPR2. Diante da importância dos MCs e da ANXA1/FPR no desenvolvimento tumoral, o objetivo desta investigação foi analisar a heterogeneidade dos MCs e a expressão das proteínas ANXA1, FPR1 e FPR2 em biópsias humanas das variáveis clínico-patológicas de útero normal: hiperplasia endometrial simples (HES), adenomiose, leiomiomas e adenocarcinoma (ADC) endometrial de graus I e II. Os MCs foram quantificados de acordo com seu estado de ativação e expressão das proteases triptase e quimase. A expressão da ANXA1 e seus receptores FPR1 e FPR2 nos MCs e tecidos uterinos foram analisadas nas diferentes biópsias estudadas. Nossos resultados mostraram MCs intactos e desgranulados, no endométrio e miométrio normais e aumentados na HES, margens tumorais nos leiomiomas, adenomiose e ADC endometrial de graus I e II, e diminuídos significantemente na região tumoral do leiomioma. Com relação à heterogeneidade, os MCs triptase-positivos foram observados em maior quantidade. As expressões endógenas da ANXA1 e do FPR1 foram observadas nos tecidos uterinos e MCs, com ausência para o FPR2. As modulações dos MCs, da proteína ANXA1 e de modo específico do receptor FPR1, nas variáveis clínico-patológicas das lesões uterinas investigadas indicam o envolvimento dessas células e a interação ANXA1/FPR1 no desenvolvimento de inflamação e neoplasia uterina. / Uterine lesions are important causes of discomfort, infertility and death among women in Brazil and in the world. Endometrial cancer is a frequent malignant tumor and its incidence has been increasing in the last decades. Besides, the most common benign uterine tumor, leiomyoma, affects about 40% of women at reproductive age, being related to menorrhagia, dysmenorrhea and infertility. Investigations indicate that the tumor microenvironment is crucial for the advancement of cancer, being characterized mainly by the altered composition of the extracellular matrix, high microvessel density and abundance of inflammatory cells, such as mast cells (MCs). Degranulated MCs release chemotactic and protease factors, such as tryptase and chymase, to the extracellular medium, contributing to the degradation of the extracellular matrix, promoting angiogenesis, providing a favorable environment for tumor invasion and tissue remodeling through selective proteolysis in the matrix and activation of metalloproteinases. Another important aspect of tumor growth is the anti-inflammatory protein Annexin A1 (ANXA1), related to the regulation of growth and migration / invasion processes, and its effects mediated by receptors for formylated peptides (FPRs), especially FPR1 and FPR2. The objective of this investigation was to analyze the heterogeneity of the MCs and the expression of the ANXA1, FPR1 and FPR2 proteins in human biopsies of clinical-pathological variables of normal uterus: simple endometrial hyperplasia (HES), adenomyosis, leiomyomas and endometrial adenocarcinoma (ADC) of grades I and II. MCs were quantified according to their state of activation and expression of tryptase and chymase proteases. Expression of ANXA1 and its FPR1 and FPR2 receptors in the MCs and uterine tissues were analyzed in the different biopsies studied. Our results showed intact and degranulated MCs in the normal endometrium and myometrium and increased MCs in HES, tumor margins in leiomyomas, adenomyosis and endometrial ADC of grades I and II, but significantly decreased in the leiomyoma tumor region. In relation to the heterogeneity, it was observed that the tryptase-positive MCs were observed in greater quantity. Endogenous expressions of ANXA1 and FPR1 were observed in uterine tissues and MCs, but absent for FPR2. Modulations of MCs and ANXA1 protein expression and the specificity of FPR1 receptor immunolabeling in the clinical-pathological variables of the investigated uterine lesions indicate the involvement of these cells and the interaction ANXA1/FPR1 in the development of inflammation and uterine neoplasia.

A inflamação é fundamental para a manutenção da homeostasia e para a resposta do organismo à injúria. A resposta inflamatória deve ser adequada aos estímulos agressores; no sistema nervoso central, sua inadequação conduz à gênese de diferentes doenças neurodegenerativas. A proteína anexina A1 (ANXA1) e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) controlam a inflamação, pois ambos inibem o desenvolvimento da inflamação e aceleram sua resolução. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a ANXA1 modula a expressão de PPARγ em macrófagos. Assim, o presente trabalho investigou a modulação da expressão do PPARγ e das suas funções em células da microglia pela ANXA1. Foram empregadas células imortalizadas da linhagem BV2 (microglia murina), inalteradas ou transfectadas para redução da expressão de ANXA1, tratadas com ANXA1 exógena (recombinante - rANXA1) ou com agonista ou antagonista de PPARγ (pioglitazona e GW9662, respectivamente). Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamento com rANXA1 aumenta as expressões gênica (RT-PCR) e proteica (Western Blotting) de PPARγ, e ambas as expressões estão reduzidas em células com deficiência endógena de ANXA1, sendo que tal efeito foi revertido pela ação da rANXA1; 2) tratamento com rANXA1 não induz a expressão dos fatores de transcrição ligados a expressão de PPARγ: proteínas ligantes de elementos de resposta ao cAMP - CREB - e transdutores de sinais e ativadores de transcrição - STAT6 - (Western Blotting), mas os níveis de ambos os fatores estão reduzidos em células transfectadas, e tal efeito não foi revertido pelo tratamento com rANXA1; 3) tratamento com pioglitazona ou com rANXA1 individualmente aumenta a fagocitose de células PC12 apoptóticas (citometria de fluxo), mas o tratamento simultâneo não altera a fagocitose induzida por pioglitazona ou rANXA1; no entanto, tratamento com GW9662 inibiu a fagocitose induzida pelo tratamento com rANXA1; 4) o tratamento com rANXA1 aumenta a expressão de CD36 (citometria de fluxo); a expressão de CD36 está reduzida em células transfectadas e tal expressão não é revertida pelo tratamento com rANXA1. Em conjunto, os dados obtidos mostram a modulação da ANXA1 sobre PPARγ em células da micróglia, com possível ação sobre a fagocitose de células apoptóticas, e que a redução da expressão de ANXA1 reduz acentuadamente a expressão dos fatores de transcrição STAT6 e CREB, bem como a expressão de CD36. A elucidação dos efeitos resultantes destas alterações desencadeadas pela deficiência de ANXA1 endógena poderá contribuir para compreensão da fisiopatologia da neuroinflamação. / Inflammation is a key process in maintaining homeostasis and is essential for the body\'s response to injury. The inflammatory response must be proportional to the aggressor stimuli; in the central nervous system, a failed proper modulation leads to the development of different neurodegenerative diseases. Protein annexin A1 (ANXA1) and peroxisome proliferated-activated receptors (PPAR) control inflammation, as both inhibit development of inflammation and accelerate its resolution. Our research group has demonstrated that ANXA1 modulates PPARγ expression in macrophages. Thus, the present work investigated the modulation of PPARγ expression and its functions in microglia cells by ANXA1. In order to assess such, immortalized cells from cell line BV2 (murine microglia), either unadulterated or transfected for reduced expression of ANXA1, were treated with exogenous ANXA1 (recombinant protein - rANXA1) or either with PPARγ agonist or antagonist (pioglitazone and GW9662, respectively). The obtained results demonstrated that: 1) treatment with rANXA1 increases both gene (RT-PCR) and protein (Western Blotting) expressions of PPARγ, and also that both expressions are reduced in cells with endogenous deficiency of ANXA1, and such effect was reversed by the actions of rANXA1; 2) treatment with rANXA1 does not promote the expression of transcription factors associated with PPARγ expression: cAMP response element binding protein - CREB - and signal transductor and activator of transcription 6 - STAT6 (Western Blotting), but the expression levels of both factors are reduced in transfected cells, and such effect was not reversed by treatment with rANXA1; 3) individual treatment with pioglitazone or rANXA1 increases phagocytosis of apoptotic PC12 cells (flow cytometry), but simultaneous treatment does not affect pioglitazone/rANXA1-induced phagocytosis; however, treatment with GW9662 inhibited rANXA1-induced phagocytosis; 4) treatment with rANXA1 increases CD36 expression (flow cytometry); the expression of CD36 is reduced in transfected cells, and such expression is not reversed by treatment with rANXA1. The obtained data demonstrate the modulation ANXA1 exerts upon PPARγ in microglia cells, with a possible action upon phagocytosis of apoptotic cells, and that reduction of ANXA1 expression greatly reduces the expression of transcription factors STAT6 and CREB, as well as the expression of CD36. Elucidation of such effects that arise from a deficiency of endogenous ANXA1 will contribute to a better comprehension of the pathophysiology of neuroinflammation.

Proteomic techniques were used to analyze the protein expression profile of the early-stage differentiation of pig embryonic stem cells (ES cells). The pig ES cells were induced to develop to neuronal cells by all-trans retinoic acid (ATRA) in vitro by Tainan Livestock Research Institute. The ES cells were cultured with ATRA and collected at time intervals of 0, 1, 2, 4, 8 and 10 days. The cell lysates were analyzed by two-dimensional electrophoresis, and the differentially expressed proteins are identified by MALDI-TOF. Our data shows that the expression profile of pig ES cells is similar to other mammalian models but with some differences. Preliminary pig ES cells 2D database was set up. Six spots each with up or down-regulation in neurogenesis were identified by MS. These proteins may become the good markers of pig ES cells into neural cells by RA. Among those proteins, vimentin, prohibitin and annexin A10 were up-regulated, zinc finger protein 482 (ZNF482), fyn-related kinase (FRK) and annexin A1 were down-regulated during differentiation of pig ES cells to neural cells. Addtionally, we ultilized RT-PCR technique to investigate mRNA expression during neurogenesis, vimentin and prohibitin was up-regulated, anxa1(annexin A1) was slightly down-regulated, neuroD1 and neurogenin 2 were high expression on day 10, beta-catenin was high expression on day 8 to 10.

Submitted by NATHÁLIA MACIEL MANIEZZO STUCHI null (nmmbiomedica@hotmail.com) on 2016-07-28T14:13:21Z No. of bitstreams: 1 Tese capa dura.pdf: 5464428 bytes, checksum: f53c801765e2d85e4f507ebaaebe4625 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-07-28T15:52:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 stuchi_nmm_dr_sjrp.pdf: 5464428 bytes, checksum: f53c801765e2d85e4f507ebaaebe4625 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T15:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 stuchi_nmm_dr_sjrp.pdf: 5464428 bytes, checksum: f53c801765e2d85e4f507ebaaebe4625 (MD5) Previous issue date: 2016-05-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Apesar do declínio da incidência, o câncer gástrico ocupa ainda a terceira posição em causa de morte por câncer no mundo, tendo como principal fator de risco a bactéria Helicobacter pylori. Esta bactéria pode levar a uma inflamação persistente através da produção de citocinas pró-inflamatórias e de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, estimulando a proliferação celular bem como outros processos envolvidos na carcinogênese. Ainda envolvidos nestes processos tem sido observada a participação de microRNAs, que exercem papel importante na regulação pós-transcricional, influenciando processos fisiológicos normais da célula bem como aqueles ligados às doenças, como por exemplo o câncer gástrico. Alguns miRNAs podem atuar como oncogenes, genes supressores de tumor e biomarcadores para diversas patologias, podendo alvejar genes relacionados com inflamação e câncer como o gene ANXA1 (Anexina-A1). A Anexina-A1 é uma proteína anti-inflamatória e com ação anti-proliferativa, que se liga à receptores do tipo formil peptídeo como por exemplo FPR1 e FPR2, ambos sabidamente relacionados com a progressão de doenças como o câncer. Desta forma o presente trabalho teve como objetivos avaliar a expressão da proteína Anexina A1 e seus receptores FPR1 e FPR2, bem como avaliar a expressão do RNAm da ANXA1 e de miRNAs que possam modular a expressão desse gene (hsa-mir-27a, hsa-mir-196a e hsa-mir-222) em adenocarcinoma gástrico e correlacionar estes resultados com os aspectos clínico-patológicos. Foram avaliadas 31 amostras de adenocarcinoma gástrico, assim como as regiões metaplásica ou normal adjacentes ao tumor. A quantificação relativa (RQ) do RNAm da ANXA1 e miRNAs foi realizada por PCR quantitativo em tempo real utilizando ensaio TaqMan, e a expressão proteica da AnxA1, FPR1 e FPR2 por imuno-histoquímica e análise densitométrica. Em relação à expressão gênica relativa foram observados o aumento da expressão da ANXA1 nos tumores (RQ=1,374; p<0,001), assim como do miR-196a que apresentou aumento de expressão tanto no tecido metaplásico (RQ= 4,784; p=0,0016) e tumoral (RQ=16,99; p< 0,001) em relação ao tecido normal. O miR-27a não se apresentou diferencialmente expresso nos diferentes tecidos e houve diminuição da expressão do miR-222 (RQ=0,687; p=0,01) no tecido tumoral em relação ao tecido normal. Apenas o miR-196a e a ANXA1 apresentaram correlação significantemente inversa (r= -0,55; p=0,003), e este miRNA foi o único que apresentou associação com o sexo feminino, devido aumento de expressão em mulheres. Quando se comparou a expressão relativa aos parâmetros clínico-patológicos e tumorais não foram encontradas diferenças significativas. Quanto à expressão proteica o FPR2 não apresentou marcação no tecido normal, metaplásico e tumoral. Contudo a AnxA1 e FPR1 apresentaram imunomarcação positiva amplamente distribuída no tecido tumoral e positivamente correlacionados tanto no epitélio (r=0,87; p<0,0001) como estroma (r=0,62; p=0,004). Portanto, nossos resultados sugerem que a ANXA1 é modulada pelo miR-196a em câncer gástrico, e evidenciam que tanto a AnxA1 como o FPR1 também estão envolvidos no processo de carcinogênese gástrica. Tais achados podem abrir possibilidades para futuros estudos sobre novos alvos terapêuticos já que AnxA1 e FPR1 são possíveis alvos farmacológicos, e as terapias baseadas em microRNAs tem sido amplamente pesquisadas. / Gastric cancer still ranks third in cause of cancer death worldwide, despite the decline in its incidence, being Helicobacter pylori the main risk factor for this disease. This bacterium can lead to persistent inflammation via the production of proinflammatory cytokines and reactive oxygen and nitrogen species, stimulating cell proliferation and other processes involved in carcinogenesis. Still involved in this process, it has been observed the participation of miRNAs, which play an important role in post- transcriptional regulation, influencing normal physiological processes of the cell as well as those linked to diseases such as gastric cancer. Some miRNAs can act as oncogenes, tumor suppressor genes and biomarkers for various diseases, can targetting genes linked to inflammation and cancer such as ANXA1 gene (Annexin A1). Annexin A1 is an anti-inflammatory protein with anti-proliferative action that binds to formyl peptide receptors such as, FPR1 and FPR2, both known to be related to the progression of diseases such as cancer. Thus, the present study aimed to evaluate the expression of Annexin A1, FPR1 and FPR2 receptors, and the expression of mRNA ANXA1 and miRNAs (hsa-mir-27a, hsa-mir-196a and hsa-miR 222) in gastric adenocarcinoma, also correlate these results to the clinicopathological features. 31 adenocarcinoma samples were evaluated, as well as normal or metaplastic region adjacent to the tumor. Relative quantification (RQ) of miRNA and mRNA ANXA1 was evaluated by TaqMan assay and protein expression AnxA1, FPR1 and FPR2 by immunohistochemistry and densitometry analysis. Regarding the relative expression the following results were observed, increased expression in tumors of ANXA1 (RQ = 1.374; p < 0.001) and miR- 196a that showed increased expression it he metaplastic tissue (RQ = 4.784; p = 0.0016) and tumor (RQ = 16.99; p < 0.001) compared to normal tissue. The miR- 27a did not appear differentially expressed in different tissues and there was a decrease of miR -222 expression (RQ = 0.687; p = 0.01) in tumor tissue compared to normal tissue. Only the miR-196a and ANXA1 presented a significant inverse correlation (r = -0.55; p = 0.003), and this miRNA was the only one that showed association to female gender, due to increased expression in women when comparing the relative expression to clinicopathological parameters and tumor features. The FPR2 was not expressed in normal, metaplasic and tumor tissue. However, the AnxA1 and FPR1 were widely distributed positive immunostaining in tumor tissue and positively correlated both in the epithelium (r = 0.87 ; p < 0.0001) and stromal (r = 0.62 ; p = 0.004). Thus, our results suggest that ANXA1 is modulated by miR-196a in gastric cancer, and evidencing that both AnxA1 and FPR1 are also involved in gastric carcinogenesis process. These data open the possibility for future studies on new therapeutic targets since AnxA1 and FPR1 are adjustable pharmacological targets, and microRNAs ` therapies have been widely researched. / FAPESP: 2012/15036-8 / CNPq: 474776/2013-1

A úlcera gástrica é uma doença crônica, de alta prevalência, e a eficácia dos tratamentos farmacológicos disponíveis é limitada pela alta incidência de efeitos adversos. Neste trabalho é mostrado o mecanismo de ação terapêutica e os efeitos toxicológicos da molécula indol-tiazolidínica LYSO-7 em diferentes modelos experimentais de úlcera gástrica. Camundongos Swiss machos foram tratados com veículo, LYSO-7 (5, 25 ou 50 mg/kg, v.o.) ou bezafibrato (25 ou 50 mg/kg, v.o.) 1 hora antes da administração oral de Et/HCl (60%/0,03 M) ou indometacina (100 mg/kg). Em outro conjunto de ensaios, animais foram pré-tratados com GW9962, um antagonista PPAR&#947; (2 mg/kg, i.p.); anticorpo anti-granulócito (50 &#181;L, i.p.), ou L-NAME (70 mg/kg, i.p) 1 hora antes dos tratamentos com veículo ou LYSO-7. Uma hora após administração da solução de Et/HCl, os neutrófilos foram quantificados no sangue e medula óssea, a rede microcirculatória gástrica foi estudada em in situ, utilizando a técnica de microscopia intravital; o tecido gástrico foi utilizado para quantificar a percentagem de área lesada, atividade da MPO, a expressão gênica e proteica de PPAR&#947;, expressão proteica de iNOS e eNOS, e a atividade das enzimas catalase, SOD, GPx, GR e GST. Uma hora após a administração de indometacina, o tecido gástrico foi removido para avaliar a eficácia do tratamento e a secreção de mediadores inflamatórios. Ensaio de úlcera crônica, induzida por ácido acético, foi realizado em camundongos Balb/c WT ou ANXA1-/-, aplicando-se 20&#181;L de ácido acético na camada subserosa do estômago e 24 horas após a indução, os animais foram tratados, uma vez ao dia, durante sete dias com LYSO-7 (50 mg/kg), bezafibrato (50 mg/kg) ou veículo. Foram realizados ensaios com macrófagos recrutados para o peritônio pela ação do tioglicolato de sódio (3%, i.p.) e com neutrófilos recrutados pela ação do glicogênio de ostra (1%, i.p.). Ensaios de toxicologia aguda, crônica e mutagenicidade também foram realizados. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com LYSO-7 reduz a área lesada, o influxo de neutrófilos e a estase da rede microcirculatória provocada pela administração de Et/HCl. Os efeitos protetores foram revertidos em animais pré-tratados com GW9962, indicando a participação do PPAR&#947; no efeito. O influxo de neutrófilos é determinante para a lesão, uma vez que a depleção destas células reduziu a ulceração gástrica, e indica que o bloqueio da mobilização de neutrófilos da medula óssea para o sangue e destes para o tecido lesado pela LYSO-7 pode ser um mecanismo de ação gastroprotetora desta molécula. A reversão da estase vascular na microcirculação, mas não o influxo de neutrófilos, é mediado pelo NO, pois o pré-tratamento com L-NAME aboliu os efeitos da LYSO-7 no restabelecimento do fluxo sanguíneo da microcirculação. Este efeito pode ser dependente da maior e menor expressão proteica de eNOS e iNOS, respectivamente. A LYSO-7 foi capaz de alterar favoravelmente a atividade das enzimas antioxidantes no tecido gástrico. Ainda, a LYSO-7 diminuiu a área lesada e reduziu a concentração de TNF&#945; e aumentou a de IL-10 no tecido gástrico lesado pela indometacina. Na resolução do processo inflamatório, o tratamento com LYSO-7 diminuiu a percentagem de área lesada, aumentou a apoptose de neutrófilos e a eferocitose de neutrófilos por macrófagos peritoneais, inibiu a secreção de TNF&#945; e aumentou a secreção de IL-10, TFG-1&#946; e VEGF para o sobrenadante de macrófagos em fagocitose. A resolução de lesão gástrica, bem como a indução da fagocitose pela LYSO-7 foi reduzida em animais ANXA1-/-. As investigações destes últimos dados mostraram a relação da ANXA1 e PPAR&#947;, já que a expressão do receptor é reduzida em macrófagos obtidos de animais depletados de ANXA1. Os estudos toxicológicos mostraram que a LYSO-7 apresenta baixa toxicidade aguda e crônica in vivo, além de não ocasionar mutagenicidade em eritrócitos da medula óssea. Os dados obtidos mostram que a molécula LYSO-7 atua como agonista PPAR&#947; na modulação da úlcera gástrica e modula a migração de neutrófilos e o fluxo sanguíneo na microcirculação. A transativação e transrepressão de eNOS e iNOS, respectivamente, o bloqueio da migração de neutrófilos para a lesão e a inibição da atividade de enzimas oxidativa, ativação de enzimas antioxidantes no epitélio gástrico e a inibição da secreção de mediadores inflamatórios parecem ser os mecanismos de ação da LYSO-7 na citoproteção gástrica. Adicionalmente, a LYSO-7 atua na resolução do processo inflamatório promovendo downregulation na secreção de mediadores inflamatórios, aumento na apoptose de neutrófilos e eferocitose de neutrófilos apoptóticos. / Gastric ulcer is a chronic disease that presents high prevalence, and effectiveness of pharmacological treatments available is limited by several adverse effects. In this study is shown the mechanism of action and toxicological effects of the molecule indole-thiazolidine LYSO-7 in different models of gastric ulcer. Male Swiss mice were treated with vehicle LYSO-7 (5, 25, or 50 mg/kg, p.o.) or bezafibrate (25 or 50 mg/kg, p.o.) 1 hour before the oral administration of Et/HCl (60%/0.03 M) or indomethacin (100 mg/kg). In another set of assays, animals were pre-treated with GW9962, a PPAR&#947; antagonist (2 mg/kg, i.p.), anti-granulocyte antibody (50 &#181;L, i.p.) or L-NAME (70 mg/kg, i.p.) 1 hour before the treatment with vehicle or LYSO-7. One hour after administration of the Et/HCl solution, neutrophils were quantified in the blood and bone marrow, the gastric microcirculatory network was studied in situ by intravital microscopy, in the gastric tissue were quantified the percentage of injured area, MPO activity, PPAR&#947; gene and protein expression, iNOS and eNOS protein expression, and catalase, SOD, GPx, GR and GST activity. One hour after indomethacin administration, gastric tissue was removed to verify the efficacy of LYSO-7 on inflammatory mediator secretion. Chronic ulcer assay induced by acetic acid was carried out in Balb/c WT or ANXA1-/-, applying 20&#181;L of acetic acid in the subserosal layer of the stomach and 24 hours after induction, animals were treated during seven days, once a day, with LYSO-7 (50 mg/kg), bezafibrate (50 mg/kg) or vehicle. Assays were performed with macrophages recruited to the peritoneum by sodium thioglycollate (3%, i.p.) and neutrophils by oyster glycogen (1%, i.p.). Acute and chronic toxicological and mutagenicity assays were also conducted. The results obtained show that LYSO-7 treatment decrease the injured area, neutrophil influx and microcirculatory stasis evoked by Et/HCl administration. Protective effects were reversed in animals pretreated with GW9962, indicating the involvement of PPAR&#947;. Neutrophil influx is a determinant of the gastric lesion, once the depletion of these cells decreased the gastric damage, indicating that in the neutrophil mobilization blockade from the bone marrow to blood and to injured tissue may be a gastroprotective mechanism of LYSO-7. The vascular stasis reversion in the microcirculation is mediated by NO, but not the neutrophil influx, since the pretreatment with L-NAME abolished the effects of LYSO-7 on blood flow. This effect was dependent on increase and decrease of eNOS and iNOS protein expression, respectively. LYSO-7 positively altered the activity of antioxidant enzymes in the gastric tissue. Furthermore, LYSO-7 reduced the injured area and the concentration of TNF&#945; and increased IL-10 in the gastric tissue in the indomethacin-induced ulcer model. In the resolution of inflammation, LYSO-7 treatment decreased the percentage of the injured area, increased the neutrophils apoptosis and the efferocytosis of apoptotic neutrophils by peritoneal macrophages, inhibited the TNF&#945; release and increased the secretion of IL-10, IL-1&#946; and VEGF in the supernatant of phagocytosis assay. The resolution of gastric lesions, as well as, the induction of phagocytosis by LYSO-7 was reduced in animals ANXA1-/-. This data shown the relation of PPAR&#947; and ANXA1, as PPAR&#947; expression is reduced in macrophages obtained from ANXA1-/- animals. Toxicological studies showed that LYSO-7 has low acute and chronic toxicity in vivo, and did not cause mutagenicity in bone marrow erythrocytes. The data obtained show that LYSO-7 acts as PPAR&#947; in the modulation of gastric ulcer and modulate neutrophil migration and blood flow in the microcirculation. The transactivation and transrepression of eNOS and iNOS, respectively, blocking the neutrophil influx into the injury, antioxidant enzymes activation in the gastric epithelium and inhibition of inflammatory mediators release seem to be the mechanisms action of LYSO-7 in gastric cytoprotection. Additionally, LYSO-7 operates in the resolution of inflammation promoting downregulation in the secretion of inflammatory mediators and increases the neutrophil apoptosis and efferocytosis of apoptotic neutrophils.

A úlcera gástrica é uma doença crônica, de alta prevalência, e a eficácia dos tratamentos farmacológicos disponíveis é limitada pela alta incidência de efeitos adversos. Neste trabalho é mostrado o mecanismo de ação terapêutica e os efeitos toxicológicos da molécula indol-tiazolidínica LYSO-7 em diferentes modelos experimentais de úlcera gástrica. Camundongos Swiss machos foram tratados com veículo, LYSO-7 (5, 25 ou 50 mg/kg, v.o.) ou bezafibrato (25 ou 50 mg/kg, v.o.) 1 hora antes da administração oral de Et/HCl (60%/0,03 M) ou indometacina (100 mg/kg). Em outro conjunto de ensaios, animais foram pré-tratados com GW9962, um antagonista PPAR&#947; (2 mg/kg, i.p.); anticorpo anti-granulócito (50 &#181;L, i.p.), ou L-NAME (70 mg/kg, i.p) 1 hora antes dos tratamentos com veículo ou LYSO-7. Uma hora após administração da solução de Et/HCl, os neutrófilos foram quantificados no sangue e medula óssea, a rede microcirculatória gástrica foi estudada em in situ, utilizando a técnica de microscopia intravital; o tecido gástrico foi utilizado para quantificar a percentagem de área lesada, atividade da MPO, a expressão gênica e proteica de PPAR&#947;, expressão proteica de iNOS e eNOS, e a atividade das enzimas catalase, SOD, GPx, GR e GST. Uma hora após a administração de indometacina, o tecido gástrico foi removido para avaliar a eficácia do tratamento e a secreção de mediadores inflamatórios. Ensaio de úlcera crônica, induzida por ácido acético, foi realizado em camundongos Balb/c WT ou ANXA1-/-, aplicando-se 20&#181;L de ácido acético na camada subserosa do estômago e 24 horas após a indução, os animais foram tratados, uma vez ao dia, durante sete dias com LYSO-7 (50 mg/kg), bezafibrato (50 mg/kg) ou veículo. Foram realizados ensaios com macrófagos recrutados para o peritônio pela ação do tioglicolato de sódio (3%, i.p.) e com neutrófilos recrutados pela ação do glicogênio de ostra (1%, i.p.). Ensaios de toxicologia aguda, crônica e mutagenicidade também foram realizados. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com LYSO-7 reduz a área lesada, o influxo de neutrófilos e a estase da rede microcirculatória provocada pela administração de Et/HCl. Os efeitos protetores foram revertidos em animais pré-tratados com GW9962, indicando a participação do PPAR&#947; no efeito. O influxo de neutrófilos é determinante para a lesão, uma vez que a depleção destas células reduziu a ulceração gástrica, e indica que o bloqueio da mobilização de neutrófilos da medula óssea para o sangue e destes para o tecido lesado pela LYSO-7 pode ser um mecanismo de ação gastroprotetora desta molécula. A reversão da estase vascular na microcirculação, mas não o influxo de neutrófilos, é mediado pelo NO, pois o pré-tratamento com L-NAME aboliu os efeitos da LYSO-7 no restabelecimento do fluxo sanguíneo da microcirculação. Este efeito pode ser dependente da maior e menor expressão proteica de eNOS e iNOS, respectivamente. A LYSO-7 foi capaz de alterar favoravelmente a atividade das enzimas antioxidantes no tecido gástrico. Ainda, a LYSO-7 diminuiu a área lesada e reduziu a concentração de TNF&#945; e aumentou a de IL-10 no tecido gástrico lesado pela indometacina. Na resolução do processo inflamatório, o tratamento com LYSO-7 diminuiu a percentagem de área lesada, aumentou a apoptose de neutrófilos e a eferocitose de neutrófilos por macrófagos peritoneais, inibiu a secreção de TNF&#945; e aumentou a secreção de IL-10, TFG-1&#946; e VEGF para o sobrenadante de macrófagos em fagocitose. A resolução de lesão gástrica, bem como a indução da fagocitose pela LYSO-7 foi reduzida em animais ANXA1-/-. As investigações destes últimos dados mostraram a relação da ANXA1 e PPAR&#947;, já que a expressão do receptor é reduzida em macrófagos obtidos de animais depletados de ANXA1. Os estudos toxicológicos mostraram que a LYSO-7 apresenta baixa toxicidade aguda e crônica in vivo, além de não ocasionar mutagenicidade em eritrócitos da medula óssea. Os dados obtidos mostram que a molécula LYSO-7 atua como agonista PPAR&#947; na modulação da úlcera gástrica e modula a migração de neutrófilos e o fluxo sanguíneo na microcirculação. A transativação e transrepressão de eNOS e iNOS, respectivamente, o bloqueio da migração de neutrófilos para a lesão e a inibição da atividade de enzimas oxidativa, ativação de enzimas antioxidantes no epitélio gástrico e a inibição da secreção de mediadores inflamatórios parecem ser os mecanismos de ação da LYSO-7 na citoproteção gástrica. Adicionalmente, a LYSO-7 atua na resolução do processo inflamatório promovendo downregulation na secreção de mediadores inflamatórios, aumento na apoptose de neutrófilos e eferocitose de neutrófilos apoptóticos. / Gastric ulcer is a chronic disease that presents high prevalence, and effectiveness of pharmacological treatments available is limited by several adverse effects. In this study is shown the mechanism of action and toxicological effects of the molecule indole-thiazolidine LYSO-7 in different models of gastric ulcer. Male Swiss mice were treated with vehicle LYSO-7 (5, 25, or 50 mg/kg, p.o.) or bezafibrate (25 or 50 mg/kg, p.o.) 1 hour before the oral administration of Et/HCl (60%/0.03 M) or indomethacin (100 mg/kg). In another set of assays, animals were pre-treated with GW9962, a PPAR&#947; antagonist (2 mg/kg, i.p.), anti-granulocyte antibody (50 &#181;L, i.p.) or L-NAME (70 mg/kg, i.p.) 1 hour before the treatment with vehicle or LYSO-7. One hour after administration of the Et/HCl solution, neutrophils were quantified in the blood and bone marrow, the gastric microcirculatory network was studied in situ by intravital microscopy, in the gastric tissue were quantified the percentage of injured area, MPO activity, PPAR&#947; gene and protein expression, iNOS and eNOS protein expression, and catalase, SOD, GPx, GR and GST activity. One hour after indomethacin administration, gastric tissue was removed to verify the efficacy of LYSO-7 on inflammatory mediator secretion. Chronic ulcer assay induced by acetic acid was carried out in Balb/c WT or ANXA1-/-, applying 20&#181;L of acetic acid in the subserosal layer of the stomach and 24 hours after induction, animals were treated during seven days, once a day, with LYSO-7 (50 mg/kg), bezafibrate (50 mg/kg) or vehicle. Assays were performed with macrophages recruited to the peritoneum by sodium thioglycollate (3%, i.p.) and neutrophils by oyster glycogen (1%, i.p.). Acute and chronic toxicological and mutagenicity assays were also conducted. The results obtained show that LYSO-7 treatment decrease the injured area, neutrophil influx and microcirculatory stasis evoked by Et/HCl administration. Protective effects were reversed in animals pretreated with GW9962, indicating the involvement of PPAR&#947;. Neutrophil influx is a determinant of the gastric lesion, once the depletion of these cells decreased the gastric damage, indicating that in the neutrophil mobilization blockade from the bone marrow to blood and to injured tissue may be a gastroprotective mechanism of LYSO-7. The vascular stasis reversion in the microcirculation is mediated by NO, but not the neutrophil influx, since the pretreatment with L-NAME abolished the effects of LYSO-7 on blood flow. This effect was dependent on increase and decrease of eNOS and iNOS protein expression, respectively. LYSO-7 positively altered the activity of antioxidant enzymes in the gastric tissue. Furthermore, LYSO-7 reduced the injured area and the concentration of TNF&#945; and increased IL-10 in the gastric tissue in the indomethacin-induced ulcer model. In the resolution of inflammation, LYSO-7 treatment decreased the percentage of the injured area, increased the neutrophils apoptosis and the efferocytosis of apoptotic neutrophils by peritoneal macrophages, inhibited the TNF&#945; release and increased the secretion of IL-10, IL-1&#946; and VEGF in the supernatant of phagocytosis assay. The resolution of gastric lesions, as well as, the induction of phagocytosis by LYSO-7 was reduced in animals ANXA1-/-. This data shown the relation of PPAR&#947; and ANXA1, as PPAR&#947; expression is reduced in macrophages obtained from ANXA1-/- animals. Toxicological studies showed that LYSO-7 has low acute and chronic toxicity in vivo, and did not cause mutagenicity in bone marrow erythrocytes. The data obtained show that LYSO-7 acts as PPAR&#947; in the modulation of gastric ulcer and modulate neutrophil migration and blood flow in the microcirculation. The transactivation and transrepression of eNOS and iNOS, respectively, blocking the neutrophil influx into the injury, antioxidant enzymes activation in the gastric epithelium and inhibition of inflammatory mediators release seem to be the mechanisms action of LYSO-7 in gastric cytoprotection. Additionally, LYSO-7 operates in the resolution of inflammation promoting downregulation in the secretion of inflammatory mediators and increases the neutrophil apoptosis and efferocytosis of apoptotic neutrophils.