Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-07T16:58:40Z No. of bitstreams: 1 4. Tese Final RQ3Banca1.pdf: 2857998 bytes, checksum: 113972bf6018f1468776705c406f2b79 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-07T16:58:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4. Tese Final RQ3Banca1.pdf: 2857998 bytes, checksum: 113972bf6018f1468776705c406f2b79 (MD5) / Neste projeto, foram testados diferentes antígenos candidatos a padronização de novos métodos diagnósticos a serem usados nas diferentes fases da infecção esquistossomótica. Inicialmente, foram analisados os antígenos brutos do parasito visto que seu baixo custo e simplicidade de obtenção merecem novas abordagens. Assim, antígenos de vermes adultos, ovos e tegumento de esquistossômulos foram analisados com soro de pacientes submetidos a rigoroso diagnóstico parasitológico para determinação de infecção e/ou diagnóstico clínico e imunológico. Ao serem aplicados no método indireto de ELISA, estes antígenos apresentaram alta sensibilidade e especificidade em fases distintas da infecção murina. Através desses resultados foi possível confirmar que o uso de antígenos obtidos de diferentes formas evolutivas do parasito serve como ferramenta potencial para análise da evolução cronológica da infecção. Quando aplicados em amostras humanas, o uso de antígenos de vermes adultos mostrou-se promissor para o diagnóstico de pacientes residentes de áreas endêmicas que apresentavam baixa carga parasitária, com índices de sensibilidade e especificidade de 95%. Tendo sido, nestas condições, superior aos antígenos de ovos. O estudo de pacientes em fase aguda da infecção permitiu a validação da técnica indireta de ELISA com antígenos de tegumento de esquistossômulos. Esta técnica apresentou uma significativa sensibilidade na identificação de grande parte dos pacientes recentemente infectados. A outra abordagem adotada por este tarbalho envolveu o uso do Antígeno Catódico Circulante (CCA), antígeno este secretado/excretado por vermes jovens e adultos, que foram direcionados para o desenvolvimento de novas e promissoras metodologias diagnósticas. Para este propósito, o CCA foi utilizado em diferentes formas antigênicas: como glicoproteína purificada a partir de vermes, como proteína recombinante e como peptídeos imunogênicos de 20 aminoácidos. Estes antígenos foram usados na padronização do Método de Separação Imunomagnética, denominado IMS. O uso de CCA recombinante no método de IMS indireto levou aos índices mais significativos de sensibilidade e especificidade, sem que qualquer resultado falso-negativo fosse detectado. Por outro lado, o uso da glicoproteína CCA purificada demonstrou ser superior no diagnóstico para monitorização de cura. A partir destes resultados, mais promissores que a ELISA convencional, partimos para a padronização final desta técnica para a detecção direta do CCA nas mesmas amostras, de forma a permitir somente a identificação de infecções ativas. Para isto, anticorpos monoclonais específicos para a glicoproteína CCA foram produzidos e conjugados a marcadores. A escolha do clone foi baseada na reduzida especificidade deste pela porção responsável pelas reações cruzadas do CCA, a porção glicídica Lewis x. O novo método IMS para detecção direta demonstrou alta sensibilidade de 94% e especificidade de 100%, apresentando correlação direta com a carga parasitária destes pacientes determinada pela contagem de ovos nas fezes. Os excelentes resultados na detecção de antígeno circulante obtidos no presente trabalho, que contrapõem os obtidos em outros trabalhos publicados, se devem a nova metodologia empregada que utiliza a concentração destes antígenos ao invés da diluição de amostras. Por fim, idealizamos um último método, denominado FluoIMS, destinado a identificação qualitativa da presença de CCA através da microscopia de fluorescência. Este método, de detecção direta e de execução bastante simples, apresentou significativos índices de sensibilidade quando três lâminas individuais para cada amostra foram analisadas. Nossos resultados trazem grandes expectativas para a melhoria do diagnóstico dos muitos pacientes infectados por baixas cargas do Schistosoma mansoni, em diferentes fases da infecção, e apontam novas perspectivas para aplicação destes métodos no controle de cura pós-tratamento. / In this project, various candidate antigens for standardization of new diagnostic methods were tested for use at different phases of schistosome infection. Initially, the crude antigens of the parasite were analyzed, since their low cost and ease of obtaining deserve new approaches. Thus, antigens of adult worms, egg antigens, and tegument antigens of schistosomula were analyzed by means of sera of patients submitted to a rigorous parasitological diagnosis for determination of infection. When applied to the indirect method of ELISA, these antigens presented high sensitivity and specificity levels at different phases of murine infection. Based on these results, it was possible to confirm that the use of antigens obtained at different evolutive phases of the parasite acts as a potential tool for analysis of the chronological evolution of infection. When applied to human samples, the use of adult worm antigens was promising for diagnosis of patients living in endemic areas, and presenting low worm burden, with sensitivity and specificity levels of 95%. Under these conditions, they were considered superior than the egg antigens. The study related to tourists presenting acute phase of infection allowed the validation of the indirect technique of ELISA, with tegument antigens of schistosomula. This technique showed a significant sensitivity for identification of a large part of recently infected patients. Another approach used in this study involved the use of Circulating Cathodic Antigen (CCA), which was secreted/excreted by juvenile and adult worms, that were directed to development of new and promissing diagnostic methodologies. For this purpose, the CCA was used at different forms of antigens: as purified glycoprotein obtained from worms, as recombinant protein and as immunogenic peptides of 20 aminoacids. These antigens were used for standardization of the Immunomagnetic Separation Method, named IMS. The use of recombinant CCA in the indirect method of IMS showed the most significant levels of sensitivity and specificity, and no false-negative results could be detected. On the other hand, the use of purified glycoproteinCCA demonstrated to be superior for diagnosis of cure control. Based on these results, which were more promissing than the conventional ELISA, we started the final standardization of this technique for the direct detection of CCA in the same samples, in order to allow only the identification of active infections. For this purpose, specific monoclonal antibodies for glycoprotein CCA were produced and conjugated to merchandises. The choice of the clone was based on the lack of its specificity by the portion responsible for the cross-reactions of CCA, the glicidic portion Lewis x, and in order that a low level of cross-reactivity could be detected by this method, in future analyses. The new method IMS demonstrated high levels of sensitivity (94%) and specificity (100%), reaching superior levels than the ones showed by the current immunological methods, as well as presenting a direct correlation with those patients´worm burdens, which were obtained by fecal egg counts. The excellent results obtained in the present study regarding the detection of circulating antigen, that did not corroborate the results obtained in other published papers, are due to the new methodology used, that utilizes the concentration of these antigens and not the dilution of samples. Finally, we planned another method, named FluoIMS, for the qualitative identification of the presence of CCA by means of fluorescence microscopy. This method, offering direct detection and ease of execution, showed significant levels of sensitivity, when three individual glass-plates for each sample were analyzed. Our results offer great expectancy for the improvement of diagnosis of infected patients with low Schistosoma mansoni burdens, at different phases of infection, and indicate new perspectives for application of these methods in the post-treatment cure control

Orientadores: Ana Maria Marcondes, Newton Kara Jose / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:35:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Poterio_MarisaBraga_D.pdf: 773656 bytes, checksum: 72542a4d45c8aefe15115e27725a70ba (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da mitomicina C (MMC) a 0,02%, aplicada em dose única por 3 minutos, na proliferação e diferenciação das células do epitélio da córnea de coelhas. Durante o procedimento cirúrgico aplicou-se MMC ou soro fisiológico (SF) sendo a droga a ser utilizada em cada animal (nos 2 olhos) definida por sorteio. A solução sorteada foi aplicada topicamente na episclera da região limbar temporal, com o tecido epitelial da córnea íntegro (em um olho) e após a desepitelização parcial (no olho contra-lateral). Os animais foram distribuídos em lotes A (20 olhos), B (16 olhos) e C (14 olhos) e sacrificados respectivamente no 4º, 15º e 45º dia de experimento. Para estimular a proliferação celular, os animais do lote C foram submetidos à desepitelização da córnea central 3 dias antes do dia do sacrifício. Para o estudo da diferenciação do epitélio da córnea empregou-se anticorpos monoclonais (AE-1, AE-3 e AE-5). Para a análise da proliferação celular utilizou-se solução de 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), aplicada via endovenosa em todos os animais, 24 horas antes do sacrifício. Nas lâminas preparadas para o estudo com BrdU, sob microscopia óptica foram definidas as porções temporal, nasal e central da córnea. Em cada porção contou-se, o número de células com expressão positiva deste marcador, em 3 campos aleatórios, definidos com objetiva milimetrada. A média aritmética dos 3 campos foi utilizada para análise estatística. Os resultados das médias e desvios-padrão do número de células marcadas pela BrdU nos lotes A, B e C utilizando-se a técnica de desepitelização parcial prévia da córnea e solução fisiológica, nas regiões temporal, central e nasal foram respectivamente de 15,07 ± 12,18; 5,53 ± 5,11; 1,80 ± 2,37 no lote A, 11,17 ± 11,15; 8,50 ± 7,18; 9,67 ± 9,09 no lote B e 12,34 ± 9,02; 15,67 ± 5,84; 3,78 ± 2,80 no lote C. Com a mesma técnica cirúrgica usando-se a MMC, foram respectivamente: 6,60 ± 5,33; 3,80 ± 6,36 e 1,93 ± 2,14 no lote A, 3,09 ± 2,40; 4,34 ± 2,97 e 2,59 ± 0,63 no lote B e 5,83 ± 8,55; 6,17 ± 1,55; 4,42 ± 2,63 no lote C. Para a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução fisiológica as médias foram respectivamente: 13,80 ± 8,51; 7,47 ± 3,79; 3,07 ± 1,55 no lote A, 5,67 ± 4,49; 4,75 ± 2,13; 3,84 ± 3,45 no lote B e 6,78 ± 3,35; 11,67 ± 2,97; 3,78 ± 1,39 no lote C. Quando foi aplicado MMC e utilizada a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução, 8,73 ± 7,35; 7,60 ± 6,88; 3,27 ± 1,85 no lote A, 1,75 ± 0,78; 3,92 ± 3,06; 2,67 ± 1,98 no lote B e 2,83 ± 3,54; 2,50 ± 2,08; 8,75 ± 9,62 no lote C. As diferenças entre MMC e SF foram significativas nos animais dos lotes A, B e C, nas áreas central e temporal das córneas estudadas quando a técnica de desepitelização parcial prévia foi aplicada. Não houve diferença entre as drogas quando se utilizou a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução. Nas lâminas coradas com o AE1/AE3 e AE5 não houve interferência na diferenciação celular independentemente da droga ou da técnica. Esses resultados sugerem que a MMC a 0,02% em aplicação única episcleral por 3 minutos atua restritamente no local onde as células foram expostas e tem um efeito prolongado sobre a proliferação celular, na técnica de desepitelização parcial prévia / Abstract: This study was performed to evaluate the influence of 0,02% mitomycin C (MMC), applied on a single dose for 3 minutes, in proliferation and differentiation of the cornea rabbits epithelium cells. During the surgery procedure, MMC or 0,9% physiologic saline solution (SF) was applied and the solution for each animal (both eyes) was performed by raffle. A topic solution was applied at episclera of the temporal limbic area, with intact epithelial tissue (one eye) and after partial corneal desepithelization (other eye). The animals were arranged in a group A (20 eyes), group B (16 eyes) and group C (14 eyes). They were sacrificed respectively at 4th , 15th and 45th days of the post-operative. To stimulate cell proliferation, the animals of group C were submitted to central corneal desepithelization 3 days before the sacrifice day. Cellular differentiation markers (AE1, AE3 and AE5) were used for differentiation study of the corneal epithelium. A cellular proliferation marker 5-Bromo-2-Deoxyuridine (BrdU) was applied by intravenous injection in all of the animals, 24hs before the sacrifice. In the slides labeled with BrdU technique, the nasal, temporal and central areas were determined under optic microscopy. The number of labeled cells was counted in 3 different fields of each area using millimeter lenses. The arithmetic means of the 3 different fields was used for statistical analysis. The mean and standard deviation of the number of labeled cells with BrdU marker in A, B and C groups using previous partial corneal desepithelization technique and SF at temporal, central and nasal area were respectively 15.07 ± 12.18; 5.53 ± 5.11; 1.80 ± 2.37 in group A, 11.17 ± 11.15; 8.50 ± 7.18; 9.67 ± 9.09 in group B e 12.34 ± 9.02; 15.67 ± 5.84; 3.78 ± 2.80 in group C. Using the same technique and MMC the results were: 6.60 ± 5.33; 3.80 ± 6.36 e 1.93 ± 2.14 in group A, 3.09 ± 2.40; 4.34 ± 2.97 e 2.59 ± 0.63 in group B e 5.83 ± 8.55; 6.17 ± 1.55; 4.42 ± 2.63 in group C. For the corneal desepithelization surgical technique after SF application, the results were: 13.80 ± 8.51; 7.47 ± 3.79; 3.07 ± 1.55 in group A, 5.67 ± 4.49; 4.75 ± 2.13; 3.84 ± 3.45 in group B e 6.78 ± 3.35; 11.67 ± 2.97; 3.78 ± 1.39 in group C. When MMC was applied in the same surgical technique, the results were: 8.73 ± 7.35; 7.60 ± 6.88; 3.27 ± 1.85 in group A, 1.75 ± 0.78; 3.92 ± 3.06; 2.67 ± 1.98 in group B e 2.83 ± 3.54; 2.50 ± 2.08; 8.75 ± 9.62 in group C. The difference between MMC and SF were statistically significant at central and temporal areas when previous partial corneal desepithelization was performed in all groups. There was no difference between drugs when corneal desepithelization technique was used after solution application. There was no difference between differentiation cells in the slides labeled with AE1, AE3 and AE5 when drugs or surgical technique were analysed. These results suggests that 0,02% MMC applied for 3 minutes at the episclera, acts only at the exposed cells and have late effect under the cell proliferation, when the previous partial desepithelization surgery was applied. / Doutorado / Oftalmologia / Doutor em Ciências Médicas

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T13:16:58Z No. of bitstreams: 1 allan_j_guimaraes_ioc_bcm_0029_2006.pdf: 1714817 bytes, checksum: d2edc214a8508b65add7f8db0b664ce0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T13:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 allan_j_guimaraes_ioc_bcm_0029_2006.pdf: 1714817 bytes, checksum: d2edc214a8508b65add7f8db0b664ce0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. A infecção por este organismo é freqüentemente diagnosticada pela determinação da presence de anticorpos para a proteína M, imunodominante, mas o papel deste antígeno na patogênese da histoplasmose permanence obscuro. A função do antígeno M não é conhecida, mas geneticamente esta proteína é homologa catalases fúngicas. Em nosso estudo, nós procuramos determinar regiões imunodominantes do antígeno M, produzir um painel de anticorpos monoclonais contra esta proteína, caracterizá-los, usá-los para o mapeamento de epítopos, mostrar a localização do antígeno M na levedura do H. capsulatum, demonstrar a atividade de catalase desta proteína e desenvolver imunoensaios para a detecção de anticorpos contra esta proteína e entígeno M circulante nos fluidos corporais. Foi possível determinar peptídeos com maior atividade antigênica e suas localizações na molécula e caracterizá-los de acordo com as suas propriedades bioquímicas. Nós geramos três fragmentos que continham estes peptídeos e os utilizamos para avaliar a ligação dos anticorpos monoclonais e reconhecimento a cada fragmento separadamente. Um dos fragmentos, F3, mostrou maior ligação aos anticorpos monoclonais que os outros avaliados, entretanto estudos adicionais devem ser avaliados para um complete mapeamento. Para avaliar o papel do antígeno M na patogênese da histoplasmose, usando análise por imunoblot de um extrato de parede celular e membrana (CW/M) obtido de levedura, provamos que os mAbs gerados contra o antígeno M recombinante puderam reconhecer este antígeno no extrato utilizado. Estudos de imunofluorescencia também revelaram que os mAbs reconheciam proteínas na superfície da levedura. Adicionalmente, avaliamos a atividade de catalase usando diferentes frações celulares para sugerir a localização da enzima e confirmamos que a maior atividade de catalase estava presente nos extratos incluindo antígenos de superfície. A capacidade do antígeno M em funcionar como catalase sugere que esta enzima está provavelmente envolvida na proteção pelas leveduras contra o stress oxidativo na interior do fagolisossomo e escape dos mecanismos fungicidas nos macrófagos. A localização do antígeno M na superfície do Hc tem importantes implicações na antigenicidade da proteína já que está acessível ao sistema imunológico do hospedeiro e interações com os anticorpos. Adicionalmente, a ELISA para a detecção de anticorpos utilizando histoplasmina purificada e tratada (ptHMIN) mostrou uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de 96%, enquanto a ELISA para a detecção de antígenos mostrou uma sensibilidade de 80% e uma especificidade de 91%, provando que estas duas metodologias poderiam ser utilizadas no diagnóstico da histoplasmose. / Histoplasmosis is caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. Infection with this organism is often diagnosed by determining the presence of antibody to the immunodominant M antigen, but the role of the M antigen in the pathogenesis of histoplasmosis has previously not been elucidated. The function of the M protein is not known, but genetically it is homologous to fungal catalases. In our work, we sought to determine immunodominant regions of the M antigen, create a monoclonal antibodies panel, characterize them, use them for epitope mapping, show that the M antigen was located on the cell surface of H. capsulatum yeasts, demonstrate the catalase activity of the protein and developed an immunoassay to detect antibodies against this protein and another one to detect the circulating M antigen in body fluids. We could determine the peptides that have the most antigenic activity and their localization on the molecule, and characterize according to biochemical properties. We generated three fragments containing these peptides and used to evaluate the monoclonal antibodies binding and recognition to each fragment. We could see that one fragment, the F3, showed more binding to the mAbs than the other two, but additional studies have to be done to complete the epitope mapping. To evaluate the role of the M antigen on the pathognesis of histoplasmosis, using Western blot analysis of a detergent extract of cell walls and cell membranes (CW/M) from yeast cells, we found that mAbs generated to recombinant M antigen reacted with the CW/M preparations. Immunofluorescence studies also revealed that the mAbs to the M antigen labeled the yeast cell surface. Also, we assayed the catalase activity using different cell extract fractions for the localization of the enzyme and confirmed that the major activity was present in extracts including fungal surface antigens. The ability of the M antigen to function as a catalase suggests that this enzyme is probably involved in protecting the yeast cells against the oxidative stress within the phagolisossome and escaping of the fungicidal mechanisms in the macrophages. Localization of the M antigen to the cell surface of Hc has important implications for the antigenicity of the protein since it demonstrates that it is accessible to host immune cells and for antibody interactions. Also, the ELISA for antibody detection using purified and treated histoplasmin (ptHMIN) showed a sensitivity of 92% and a specificity of 96%, while the ELISA for antigen detection showed a sensitivity of 80% and a specificity of 91%, proving that these two methodologies could be used in the diagnosis of histoplasmosis.

A sílica SBA-15 devido às suas propriedades físico-química e estrutural tem demonstrado efeito adjuvante, carreando, protegendo e liberando antígenos. Nesse estudo avaliou-se o seu efeito sobre a atividade fagocítica de macrófagos; no recrutamento de células para órgãos linfóides; na expressão de moléculas MHC de classe II e co-estimuladoras pelas APCs; e a influência do tempo de contato imunógeno:SBA15 no potencial de adsorção e geração de anticorpos. Experimentos in vitro evidenciam que diferentes concentrações da SBA-15 não afetam a morfologia ou atividade de macrófagos. A SBA15 induz o recrutamento de macrófagos, células dendríticas, CD4+, CD8+ e B220+ para os linfonodos drenantes, promovendo aumento de expressão de moléculas co-estimuladoras. As análises da produção de anticorpos demonstram que o contato imunógeno:sílica é importante na adsorção e melhora da resposta imune. Esses resultados sugerem que o potencial adjuvante da SBA-15 relaciona-se com a capacidade de adsorver antígenos e liberá-los às APCs, influindo diretamente na reposta imunológica. / The SBA-15 silica is a polymer that due to its physico-chemical and structural properties has shown adjuvant effect, carrying, protecting and delivering antigens. In this study was evaluated the effect of SBA15 in the phagocytic activity of macrophages; recruitment of cells to lymphoid organs; expression of MHC class II and co-stimulatory molecules by the APCs, and the influence of contact time between immunogen:SBA-15 in potential for absorption and generation of antibodies. In vitro experiments showed that different concentrations of SBA-15 do not affect the morphology or macrophage activity. SBA-15 induces the recruitment of macrophages, dendritic cells, CD4+, CD8+ and B220+ to the draining lymph nodes, increasing the expression of co-stimulatory molecules. Analyses of antibody production showed that the contact immunogen:silica is important for adsorption and improves the immune response. These results suggest that the adjuvanticity of SBA-15 is related to its ability in antigens adsorption and release to APCs, directly influencing the immune response.

A sílica SBA-15 devido às suas propriedades físico-química e estrutural tem demonstrado efeito adjuvante, carreando, protegendo e liberando antígenos. Nesse estudo avaliou-se o seu efeito sobre a atividade fagocítica de macrófagos; no recrutamento de células para órgãos linfóides; na expressão de moléculas MHC de classe II e co-estimuladoras pelas APCs; e a influência do tempo de contato imunógeno:SBA15 no potencial de adsorção e geração de anticorpos. Experimentos in vitro evidenciam que diferentes concentrações da SBA-15 não afetam a morfologia ou atividade de macrófagos. A SBA15 induz o recrutamento de macrófagos, células dendríticas, CD4+, CD8+ e B220+ para os linfonodos drenantes, promovendo aumento de expressão de moléculas co-estimuladoras. As análises da produção de anticorpos demonstram que o contato imunógeno:sílica é importante na adsorção e melhora da resposta imune. Esses resultados sugerem que o potencial adjuvante da SBA-15 relaciona-se com a capacidade de adsorver antígenos e liberá-los às APCs, influindo diretamente na reposta imunológica. / The SBA-15 silica is a polymer that due to its physico-chemical and structural properties has shown adjuvant effect, carrying, protecting and delivering antigens. In this study was evaluated the effect of SBA15 in the phagocytic activity of macrophages; recruitment of cells to lymphoid organs; expression of MHC class II and co-stimulatory molecules by the APCs, and the influence of contact time between immunogen:SBA-15 in potential for absorption and generation of antibodies. In vitro experiments showed that different concentrations of SBA-15 do not affect the morphology or macrophage activity. SBA-15 induces the recruitment of macrophages, dendritic cells, CD4+, CD8+ and B220+ to the draining lymph nodes, increasing the expression of co-stimulatory molecules. Analyses of antibody production showed that the contact immunogen:silica is important for adsorption and improves the immune response. These results suggest that the adjuvanticity of SBA-15 is related to its ability in antigens adsorption and release to APCs, directly influencing the immune response.