Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2009-09-23T18:00:26Z No. of bitstreams: 1 2008_MarcioHedilODaCosta.pdf: 2562342 bytes, checksum: 5b4237444604dc352067182980ce6e57 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T13:47:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_MarcioHedilODaCosta.pdf: 2562342 bytes, checksum: 5b4237444604dc352067182980ce6e57 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T13:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_MarcioHedilODaCosta.pdf: 2562342 bytes, checksum: 5b4237444604dc352067182980ce6e57 (MD5) Previous issue date: 2008 / Este trabalho objetivou construir um vetor baculoviral modificado capaz de expressar proteínas heterólogas fusionadas à poliedrina e à cauda de hexahistidina e utilizar esse vetor para expressão e purificação da proteína capsidial de vírus do complexo viral do alho. Via PCR, foi sintetizado o fragmento PH (gene da poliedrina fusionado a uma cauda de hexa-histidina). Entre a poliedrina e a cauda de histidina foi inserido um sítio de NcoI. Na primeira tentativa de obtenção do fragmento PH, em vez do gene da poliedrina, a reação de PCR amplificou uma parte do genoma de Escherichia coli. Na segunda tentativa de obtenção do fragmento PH, o gene da poliedrina foi amplificado, contudo foi verificado que havia um erro no “primer” 5’ utilizado, que gerou alteração da fase do fragmento PH. Somente na terceira tentativa (reação de PCR) o fragmento PH correto foi obtido. O fragmento PH foi clonado no vetor pFastBac1 (Invitrogen), gerando o vetor pFastPH. Um baculovírus recombinante vAcPH expressando a proteína PH foi construído via transposição sítio-específica utilizando o kit “Bac-to-Bac” (Invitrogen). Foi realizada análise da expressão de proteínas de células Tn5B infectadas com vAcPH (72 hpi). SDS-PAGE mostrou presença de uma proteína de peso molecular superior ao da poliedrina nativa e compatível com o esperado para a proteína PH. Western Blot mostrou que essa proteína é reconhecida tanto por anticorpo contra a poliedrina quanto por anticorpo contra a cauda de hexahistidina. Além da obtenção do fragmento PH correto, também foram sintetizados, via PCR, genes da capa protéica (de vírus presentes no complexo viral do alho:GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV) flanqueados por sítios de NcoI. Esses genes foram comprovados por análise do padrão de restrição. Futuramente, tais genes poderão ser clonados no pFastPH para gerar baculovírus recombinantes expressando uma proteína de fusão “poliedrina + proteína capsidial + cauda de hexa-histidina” que poderá ser utilizada para produção de anticorpos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work goal was the production of a modified baculovirus vector capable of expressing an heterologous protein fused to the polyhedrin and to an hexahistidin tag. The PH fragment (polyhedrin gene with an NcoI site and a histidin tag at its 3’ end) was synthesized through PCR reaction. In the first attempt to obtain the PH fragment, instead of the polyhedrin gene, PCR reaction amplified a fragment of Escherichia coli genome. In the second attempt, the problem was the 5’ “primer”, which had an extra nucleotide and disrupted the PH fragment reading frame. In the third attempt, the correct PH fragment was obtained and cloned into pFastBac1 vector (Invitrogen), generating pFastPH. A recombinant baculovirus (vAcPH) expressing the PH protein was obtained through site-specific transposition (“Bac-to-Bac” kit, Invitrogen). SDS-PAGE showed the presence of a protein with molecular weight (MW) superior to the native polyhedrin MW (28,6 KDa). In Western Blot experiment, PH protein was recognized by antibody against polyhedrin and by antibody against hexahistidin tag, proving that the PH protein was being expressed. Also, this work attempted to use the modified baculovirus vector to express and purify the capsid protein of viruses present in the garlic virus complex (GarMbFV, GarV-C, GarV-D, LYSV, OYDV, GarCLV). NcoI sites were added, through PCR, to both ends of these genes. In the future, these genes these genes may be cloned in pFastPH vector to generate baculovirus expressing these virus coat proteins fused to the PH gene. The purified fusion proteins may then be used in experiments to obtain antibodies against them.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-11-13T12:10:17Z No. of bitstreams: 1 2015_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 10554380 bytes, checksum: c4726fab647d5720ce837769e74fec6d (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-02T12:40:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 10554380 bytes, checksum: c4726fab647d5720ce837769e74fec6d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-02T12:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 10554380 bytes, checksum: c4726fab647d5720ce837769e74fec6d (MD5) / O sistema imune é constituído de uma complexa rede de células, tecidos e órgãos que trabalham em conjunto para a proteção do organismo. Um importante componente do sistema imunológico é o linfócito T. Há dois tipos principais de linfócitos T: T CD4+ (T auxiliares) e T CD8+ (T citotóxicos). Os linfócitos T auxiliares podem estar envolvidos com a proteção do organismo contra microorganismos ou no desenvolvimento de algumas doenças. O receptor de linfócitos T está associado ao complexo da molécula CD3. Estimulação dessa complexo com anticorpos anti-CD3 induz a ativação dos linfócitos T. Depois da ativação, o linfócito T pode se diferenciar em subpopulações envolvidas com respostas inflamatórias para eliminação de patógenos (Th1, Th2 e Th17) ou antiinflamatórias (Tregs) para a manutenção da homeostase do organismo. Anticorpos anti-CD3 pode induzir a diferenciação dos linfócitos T nos subgrupos de Tregs e pode ser usado como moléculas terapêuticas para tratar doenças autoimunes e processos de rejeição a transplantes. No presente estudo foi analisado o efeito imunomodulatório in vitro de versões humanizadas de anti-CD3 (FvFc R, T e M) comparando com o anticorpo murino anti-CD3 (OKT3) usando sequenciamento de alto desempenho (RNA-Seq). RNA-Seq foi realizado em linfócitos T não estimulados e estimulados com as diferentes versões de anti-CD3. Diversos genes envolvidos com imunorregulação foram regulados positivamente após o tratamento com os anti-CD3. Alguns desses genes codificam marcadores exclusivos de Tregs, tais como, CD25, FOXP3, CTLA4 e GITR. Outros genes codificavam importantes proteínas envolvidas com a função supressora das células Tregs (Ex. GZMB). Por outro lado, alguns marcadores de células Th17 também foram regulados positivamente. Citocinas de perfil Th17, tais como, IL17 e IL17F foram induzidas por todos os tratamentos. Porém, IL21 e IL22 foram regulados positivamente somente em OKT3. Embora os anticorpos anti-Cd3 humanizados apresentaram um efeito imunomodulatório, mais estudos são necessários para compreender os mecanismos envolvidos nessa imunomodulação. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The imune system is made up of network of cells, tissues and organs that work together to protect the body. An important component of immune system is T cell. There are two kinds of T cell: T CD4+ (T helper) and T CD8+ (T cytotoxic). T helper cells can be involved with organism protection against microorganism or in the development of some diseases. The receptor of T cells is associated with the CD3 molecule complex. Stimulation of this complex with anti-CD3 antibodies induces T cell activation. After activation antigen-dependent T cell drives the differentiation into subpopulation involved with inflammatory response to eliminate patogens (Th1, Th2 and Th17) or antiinflamatory reponse (Tregs) to maintain organism hemeostasis. Antibodies anti-CD3 can induce differentiation of T cell into Treg subsets and can be used as terapeutic molecules to treat autoimune diseases and allograft rejection. We studied immunomodulatory effect in vitro of humanized version of anti-CD3 (FvFc R, T and M) comparing with comercial murine anti-CD3 antibody (OKT3) using deeping sequencing (RNA-Seq). RNA-Seq was performed in T cells not stimulated or stimulated with anti-CD3. We found several genes involved with immunorregulation that were upregulated after treatment with anti- CD3 antibodies. Some of genes encodes exclusive markers of Tregs, such as, CD25, FOXP3, CTLA4 and GITR. Some others encodes important proteins involved with supressive function of Tregs (eg. GZMB). Otherwise, some markers of Th17 cells were also upregulated. Th17 cytokines profile, such as IL17 and IL17F were upregulated in all treatment. But, IL21 and IL22 were upregulated only with OKT3. Despite of the humanized anti-CD3 presented an immunomodulatory effect further studies are necessary in order to understand the mechanisms of this effect.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-05-12T12:48:47Z No. of bitstreams: 1 2014_LayssaMirandadeOliveira.pdf: 2324003 bytes, checksum: 14a8b4dda3a090b7582596c99233f6f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-23T16:05:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LayssaMirandadeOliveira.pdf: 2324003 bytes, checksum: 14a8b4dda3a090b7582596c99233f6f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T16:05:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LayssaMirandadeOliveira.pdf: 2324003 bytes, checksum: 14a8b4dda3a090b7582596c99233f6f5 (MD5) / Os Norovírus (NoV) são a principal causa de gastroenterites aguda não bacteriana no mundo. O genoma dos NoV consiste de um RNA fita simples o qual codifica uma poliproteína (clivada em seis proteínas não estruturais) e duas proteínas estruturais. A estrutura da proteína do capsídeo (VP1) é dividida dentro de dois principais domínios: O shell (S) e o protruding (P). Devido à incapacidade de cultivar estes vírus, o estudo morfológico e estrutural tem sido restrito a habilidade da VP1 de se montar em partículas semelhantes a vírus (VLP) as quais são morfológicas e antigenicamente indistinguíveis dos vírions nativo. O desenvolvimento do método de diagnóstico eficaz deste vírus, mesmo ocorrendo mutação rápida, tem desafiado a produção de anticorpos monoclonais (MAb) que reagem com epítopos de vários genótipos de NoV. Aqui foi relatado a produção de MAb contra a VLP de NoV GII.4 e a sua caracterização à partir dos domínios S, P1 e P2 expressos em sistema procariótico. Nesta abordagem, os MAb foram selecionados basea-se em sua reatividade obtida no ELISA utilizando VLP e MAb selecionados foram testados por Western blotting contra os domínios S, P1 e P2 expresso em E.coli. Nossos resultados demonstraram que todos os MAb selecionados nesse estudo reconheceram o domínio S, embora a densidade óptica obtida no ELISA indireto demonstraram baixa afinidade. Este resultado sugeriu que uma possível desnaturação ou degradação da VLP foi responsável pela fraca ligação observada no ELISA. Em conclusão, nossos resultados mostram uma possibilidade de que a preservação da VLP intacta consiste em etapa essencial para a seleção de MAb que possuem boa sensibilidade para posteriormente serem utilizado no diagnóstico de NoV por ELISA. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Norovirus (NoV) is the main cause of acute non-bacterial gastroenteritis worldwide. NoV genome consists of a single-stranded RNA which encodes one polyprotein (which is cleaved into six non-structural proteins) and two structural proteins. The capsid protein (VP1) structure is divided into two major domains: The Shell (S) and Protruding (P) domains. Due to the inability to propagate the virus in cell cultures, the structural and morphological study have been restricted using self-assembled virus-like particles (VLP) by expressing VP1 which are morphological and antigenically indistinguishable from native virions. The development of effective method of diagnosis of this virus, even occurring rapidly changing, has challenged aiming to produce monoclonal antibodies (MAb) that react to several different genotypes of NoV. Here, we report the production of MAb raised against the VLP of a NoV GII.4, and the selected MAb were characterized by Western blotting against S, P1 and P2 domains prepared through the prokaryotic expression system. Our results demonstrated that all MAb selected in this study recognized the S domain, however the optical density values achieved by the indirect ELISA demonstrated low affinity of MAb to the prepared VLP. This result suggests that possible denatured or degraded VLP were responsible for low reactivity in the ELISA. In conclusion, our results show a possibility that the preservation of intact VLP is an essential step to select MAb and posterior detection of NoV by ELISA for good sensibility.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-12-22T16:08:56Z No. of bitstreams: 1 2015_MariaPaulaCarneirodeOliveira.pdf: 2795508 bytes, checksum: f87fe327937046df96f6c8ac252f327d (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-01-20T14:01:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MariaPaulaCarneirodeOliveira.pdf: 2795508 bytes, checksum: f87fe327937046df96f6c8ac252f327d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-20T14:01:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MariaPaulaCarneirodeOliveira.pdf: 2795508 bytes, checksum: f87fe327937046df96f6c8ac252f327d (MD5) / Nos últimos 20 anos, a utilização de anticorpos monoclonais para fins terapêuticos tem sido um grande aliado para o tratamento de diversas enfermidades. Anticorpos anti-CD3 são utilizados na prevenção de órgãos transplantados e apresenta potencial para tratar enfermidades autoimunes. Entretanto, a utilização desses anticorpos, apesar de eficientes geram uma resposta imunogênica, pois a maioria deles possui origem murina, quando administrado impossibilitando o uso frequente, como o OKT3. A humanização de anticorpos, que é realizada por meio de manipulações genicas, tem sido uma solução pratica para esse problema, atenuando a resposta imunogênica desencadeada pelo uso de anticorpos murinos. A partir de uma biblioteca de anticorpos humanos construída a partir da técnica de Phage Display é possível a construção de novos anticorpos humanos com maior eficiência de ligação resultando menos efeitos adversos, auxiliando na clínica dessas doenças e melhorando a qualidade de vida dos pacientes. No presente estudo, a partir de uma construção sintética scFvRVL_gen3 contendo VH e VL humanizado e a sequência genica codificadora da proteína 3 (gene 3) foi possível construir um plasmídeo utilizando o vetor pCIgRM (plasmídeo anti- CD3 contendo VH e VL murino), resultando em 4 clones positivos para a construção pCIgRVL_G3. Para a amplificação dos genes VL da biblioteca de anticorpos humanos no vetor pCOMB 3X após o teste de 23 sistemas de reações distintas de PCR, foi estabelecido a otimização assim como as condições para que o mesmo acontecesse. O produto então foi clonado no vetor pGEM®T para o estudo da eficiência da reação de amplificação e diversidade da biblioteca. Os dados obtidos nesse estudo são ferramentas uteis para a clonagem das várias sequencias de VL amplificadas no vetor pCIgRVL_G3 substituindo o VL sintético pela biblioteca de VL humanos, e assim possibilitando passo à frente para a construção de um anticorpo monoclonal humano anti-CD3. T / Over the past 20 years, the use of monoclonal antibodies for therapeutic purposes has been a great ally for the treatment of various diseases. Anti-CD3 antibodies are used in the prevention of transplant organs and have the potential to treat autoimmune diseases. However, the use of these antibodies, although efficient generate an immune response because most of them have murine origin, when administered preventing the frequent use, such as OKT3. The humanization of antibodies, which is performed by means of gene manipulation, it has been a practical solution to this problem, reducing the immunogenic response elicited by the use of murine antibodies. From a human antibody library constructed from a phage display technique it is possible to build new human antibodies with the highest binding efficiency resulting in less adverse effects in helping these clinical diseases and improving the quality of life of patients. In this study, from a synthetic construct scFvRVL_gen3 containing humanized VH and VL gene and the coding sequence of the protein 3 (gene 3) was constructed using a plasmid vector pCIgRM (plasmid containing anti-CD3 murine VH and VL), resulting 4 positive clones for pCIgRVL_G3 construction. For amplification of VL of the human antibody gene library in vector pComb 3X after the 23 different test systems PCR reactions, thereby optimizing the conditions has been established for it to happen. The product was then cloned into the vector pGEM®T to study the efficiency of the amplification reaction and library diversity. The data obtained in this study are useful tools for cloning of various sequences of the amplified VL pCIgRVL_G3 VL vector by replacing the synthetic human VL library, thus allowing step forward for the construction of a human monoclonal anti-CD3 antibody.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-10T13:50:26Z No. of bitstreams: 1 2014_MaryaniAndressaGomesBezerra.pdf: 4392987 bytes, checksum: 2d620e2e34486b05d19113128ecd6494 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2017-01-17T13:50:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MaryaniAndressaGomesBezerra.pdf: 4392987 bytes, checksum: 2d620e2e34486b05d19113128ecd6494 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-17T13:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MaryaniAndressaGomesBezerra.pdf: 4392987 bytes, checksum: 2d620e2e34486b05d19113128ecd6494 (MD5) / O anticorpo anti-CD3 humano OKT3 foi utilizado por décadas na prevenção da rejeição aguda em transplantes, mas por acarretar o desenvolvimento de uma resposta imunogênica severa, seu uso foi descontinuado. A humanização desse anticorpo e a engenharia molecular de sua porção Fc têm sido instrumentos valiosos para desenvolvimento de uma nova geração de anticorpos anti-CD3 humano, os quais também vêm sendo considerados para o tratamento de doenças autoimunes. Os melhores candidatos deverão induzir a inativação de células T através de mecanismos não-líticos, promovendo apoptose, anergia e/ou expansão de células T regulatórias. Em nosso grupo, estamos trabalhando com anticorpos recombinantes anti-CD3 humanizados com potencial imunoregulatório. Nesse trabalho, buscamos aprofundar a caracterização das atividades ligante e efetora de versões humanizadas e quimera do anticorpo anti-CD3 humano na forma de FvFc e IgG. Todos os anticorpos recombinantes foram capazes de se ligar à superfície das células T CD4+ e CD8+. Somente os FvFcs recombinantes foram capazes de competir pela ligação à molécula CD3 com o anticorpo parental OKT3. As versões FvFc humanizadas apresentaram uma menor mitogenicidade em células T CD4+ e CD8+ comparadas à versão FvFc quimérica. Os FvFcs recombinantes induziram uma menor produção de citocinas inflamatórias comparada as do anticorpo OKT3. As versões FvFc R e FvFc M induziram o aumento da expressão de Fas nas populações CD4+ e CD8+ de forma dose-dependente, sendo a versão humanizada FvFc R a que revelou o maior aumento. Isso sugere que a humanização pode ter tornado o anticorpo anti-CD3 humano mais pró-apoptótico. A presença dos FvFcs recombinantes também aumentou o número de células positivas para alguns marcadores de células T regulatórias (CD25, GARP e CTLA-4) dentro das populações CD4+ e CD8+. A versão humanizada FvFc R foi a que revelou o maior aumento de células CD25+ GARP+, sugerindo a indução de um fenótipo imunoregulatório. Esses resultados mostram que anticorpos na forma de FvFc e a versão humanizada FvFc R do anticorpo anti-CD3 humano são promissoras em procedimentos onde um ambiente imunoregulatório é requerido. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The anti-human CD3 antibody OKT3 had been used for decades on acute transplant rejection prevention, but due to its severe immunogenic reaction, its use was discontinued. Antibody humanization and molecular engineering of the Fc portion have been valuable tools in the development of a new generation of anti-human CD3 antibodies, that have also been considered for the treatment of autoimmune diseases. Best candidates may induce T-cell inactivation through non-lytic mechanisms, promoting apoptosis, anergy and/or regulatory T cell expansion. Our group is working with humanized recombinant anti-CD3 antibodies with immunoregulatory potential. In this work, we pursued the binding and effector activities characterization of humanized and chimeric versions of the anti-human CD3 antibody, in FvFc and IgG formats. All recombinant antibodies were capable of bind to CD4+ and CD8+ T cells surface. Only recombinant FvFcs were able to compete to CD3 molecule with the parental antibody OKT3. The humanized FvFc versions showed low mitogenicity on CD4+ and CD8+ T compared to chimeric FvFc version. Recombinants FvFcs induced lower production of inflammatory cytokines compared to OKT3 antibody one. FvFc R and FvFc M versions induced the increase of Fas expression on CD4+ and CD8+ populations in a dose-dependent manner, being the humanized FvFc R version the one with the highest increase. This suggests that the humanization may have turned the anti-human CD3 FvFc R more pro-apoptotic. Recombinant FvFcs presence also increased the number of positive cells to some regulatory T cell markers (CD25, GARP e CTLA-4) inside CD4+ and CD8+ populations. The humanized FvFc R version was the one with the highest increase of CD25+ GARP+ cells, suggesting an immunoregulatory phenotype induction. These data shows that the FvFc molecules and the humanized FvFc R version are promising in procedures where an immunomodulatory environment is required.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-09T18:12:04Z No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-11T19:32:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / A estratégia de humanização de anticorpos tem sido eficiente para melhorar o uso clínico desses biofármacos. Porém, a manipulação da cadeia polipeptídica, eventualmente, leva a uma perda de afinidade, reduzindo sua eficácia. Este estudo é uma continuação dos testes necessários para a melhoria da afinidade de ligação, de um anticorpo humanizado pelo Grupo de Imunologia Molecular da UnB. Em trabalhos anteriores descritos pelo grupo, um anticorpo anti-CD3 humanizado para fins clínicos, foi comparado com o anticorpo original murino quanto a sua capacidade de ligação ao antígeno humano CD3. Os resultados sugeriram que parte da afinidade foi perdida durante o processo de humanização. Então, este estudo visa compreender a interação química e estrutural entre o anti-CD3 humanizado e seu antígeno. Para isto, foram realizadas mutagêneses sítio-dirigidas por PCR overlap, no anticorpo humanizado, com base na estrutura cristalina do complexo OKT3-CD3, que identificou a participação de ligação dos resíduos de aminoácidos chave envolvidos na ligação. Os anti-CD3 com as mutações de interesse foram produzidos em células de ovário de hamster chinês (CHO) na forma de fragmento de anticorpo FvFc (scFv ligado diretamente aos domínios CH2-CH3 de IgG 1 humana). Purificamos estas proteínas e, em paralelo, produzimos um CD3 de cadeia única recombinante usando um sistema de expressão de antigenos solúveis em bactéria. Os anticorpos mutados e o antígeno, serão usados em testes de afinidade, competição, bloqueio e proliferação usando as técnicas de ELISA e FACS. O mapeamento detalhado dos resíduos chave envolvidos intimamente com a ligação ao antígeno, permitirá o desenvolvimento mais eficaz de anticorpos anti-CD3 para uso clínico no futuro. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The strategy of antibody humanization has been effective in improving the clinical use of biopharmaceuticals. Thus, the manipulation of the polypeptide chain, eventually leads to an affinity loss, reducing its effectiveness. This study is a continuation of the tests needed to improve the binding affinity of an antibody humanized by the Group of Molecular Immunology, UnB. In previous work described by the group, a humanized anti-CD3 antibody for clinical purposes, was compared with the original murine antibody and its ability to bind to the human CD3 antigen. The results suggested that part of the affinity was lost during the process of humanization. So, this study aims to understand the chemical and structural interaction between the anti-CD3 humanized antibody and its antigen. With this pourpose, we performed site-directed mutagenesis in the humanized antibody, based on the crystal structure of the complex CD3-OKT3 (a murine monoclonal antibody), which identified the participation of key binding residues involved in binding. Some amino acids residues of the humanized anti-CD3, were selected and modified by PCR overlap. Mutants were produced Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in the form of antibody fragment FvFc (a scFv linked to human IgG1 CH2-CH3 domains). We purified this protein and in parallel, produced a scFv CD3  recombinant expression system that permits the purification of soluble bacterial antigens. The recombinant molecules will be used in assays for affinity, competition, blocking and proliferation using the ELISA and FACS. The detailed mapping of key residues intimately involved with binding to the antigen, will allow the development of more effective anti-CD3 antibody for clinical use in the future.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-13T13:46:35Z No. of bitstreams: 1 2016_RonnyPettersonSantosAraujo.pdf: 1362154 bytes, checksum: f4231cced2ff5b8be7ef3e639674c8b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-27T14:14:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RonnyPettersonSantosAraujo.pdf: 1362154 bytes, checksum: f4231cced2ff5b8be7ef3e639674c8b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T14:14:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RonnyPettersonSantosAraujo.pdf: 1362154 bytes, checksum: f4231cced2ff5b8be7ef3e639674c8b0 (MD5) / Os anticorpos anti-ácidos nucleicos são importantes no desenvolvimento de doenças autoimunes como o lúpus eritematoso sistêmico (LES). Porém, muito pouco se sabe sobre a origem e manutenção desses anticorpos pelo organismo e das interações desses anticorpos com seus antígenos. Foi observado na literatura e em trabalhos anteriores do grupo de Imunologia Molecular (UnB), que as sequências anotadas em banco de dados da família VH10 formadora da região variável da cadeia pesada de anticorpos era composta em sua maioria de sequências formadoras de moléculas anti-DNA. Além disso, através de uma abordagem experimental observou-se que essa família apresenta uma certa independência da CDR H3 para esta afinidade. Baseando-se nesses achados, nós desenhamos quatro fragmentos de anticorpos, no formato scFv (single-chain fragment variable), fragmento que preserva o sítio de ligação ao antígeno, composto de uma cadeia pesada (VH) ligada a uma cadeia leve, conhecida surrogate light chain (SLC) na tentativa de simular o reconhecimento antigênico em momento específico do desenvolvimento dos linfócitos B, onde a auto-reatividade é usada em prol do desenvolvimento normal dessas células. Levando-se também em conta a independência da CDR H3 para a ligação ao antígeno, nós iremos avaliar também através dessas construções o papel da CDR H2 para a ligação. Após clonagem das sequências em plasmídeo para a expressão heteróloga, esses scFvs foram produzidos em cepas de Escherichia coli BL21(DE3) pLysS. Até o momento, após padronização das condições para a produção de scFvs solúveis, condições favoráveis de duas das quatro construções foram estabelecidas. Estas construções irão permitir a análise do papel do segmento gênico V, mais especificamente da CDR2, para a afinidade ao DNA por anticorpos originados do segmento germinal de VH10. Além disso, será possível simular a interação antigênica de cadeias pesadas auto-reativas e não auto-reativas em um momento específico do desenvolvimento dos linfócitos B, onde a auto-reatividade parece ser utilizada em prol do desenvolvimento dessas células. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / The anti-nucleic acids antibodies are important in the development of autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE). However, very little is known about the origin and maintenance of these antibodies by the body and interactions of these antibodies with their antigens. Studies in the literature and previous work of the Molecular Immunology team (UnB) show that the annotated sequences in database of the VH10 family that is part of the variable region of the heavy chain antibodies consisted mostly of sequences of anti-DNA molecules. Furthermore, through an experimental approach it was observed that this family has a certain independence from CDR H3 for this affinity. Based on these findings, we designed four antibody fragments in scFv format (single-chain fragment variable), this fragments preserves the antigen binding site that comprises a heavy chain (VH) connected to a light chain, known surrogate light chain (SLC) in an attempt to simulate the antigen recognition in a specific moment in the development of B lymphocytes, where autoreactivity is used to promote the normal development of these cells. Also taking into account the independence of the H3 CDR for binding to antigen, we will also access through such constructions the role of CDR H2 for binding. After cloning the sequences into a plasmid for heterologous expression, these four scFvs were produced in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. To date, after standardization of the conditions for soluble scFv production, conditions favorable for two of the four constructs were established. These constructions will enable the analysis of the role of the V gene segment, more specifically CDR2, for affinity to DNA antibodies originating from the germline segment VH10. In addition, you can simulate the antigen interaction of autoreactive and not autoreactive heavy chains at a specific time of the development of B lymphocytes, where self-reactivity seems to be used for the development of these cells.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:59:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1997 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Introdução: A febre reumatica (FR) ainda e um problema de Saúde publica no Brasil. A deteccao de anticorpos anti-estreptolisina O (ASLO) no soro dos pacientes e importante no diagnostico e surtos de agudizacao da FR. Na literatura, o limite superior de normalidade dos anticorpos ASLO varia de acordo com a regiao do mundo. As diferencas climaticas e condicao socioeconomica de cada populacao impedem a adocao de um limite superior de normalidade universal para anticorpos ASLO. OBJETIVO: Determinar o limite superior de normalidade dos anticorpos ASLO em individuos osadioso, na faixa etaria de 2 a 17 anos, residentes na cidade de São Paulo-SP, Brasil. METODO: 484 criancas (sem sinais clinicos de infeccao estreptococica), entre 2 e 17 anos, foram consecutivamente selecionadas do Ambulatorio de Pediatria da UNIFESP (puericultura) e do Colegio da Policia Militar de São Paulo (1o. e 2o. graus). Secrecao da orofaringe para cultura e sangue foram colhidos em 2 ocasioes, com um intervalo de 1 mes. Individuos que apresentaram cultura positiva para estreptococo beta-hemolitico do grupo A (EBHA) foram excluidos. A deteccao de anticorpos ASLO foi realizada pela reacao de aglutinacao e a leitura realizada por 2 observadores independentes. Soros (colhidos nas 2 ocasioes) de 121 individuos, selecionados ao acaso, foram tambem testados pela reacao de neutralizacao. RESULTADOS: 379 completaram o estudo. 16 com cultura positiva para EBHA e 89 que nao retornaram para a 2ª visita, foram excluidos. A media de idade da amostra foi de 7,7 anos. 51,7% eram do sexo masculino, 71% frequentavam a escola ou creche e 36,5% dividiam o dormitorio com um numero superior a 2 individuos. O limite superior de normalidade dos anticorpos ASLO, correspondente ao percentil 97,5, foi de 320 UI. Os coeficientes intra-classe para determinar a reprodutibilidade do teste (resultado da 1a. e 2a. visitas lidos pelo mesmo observador) e entre-observadores (mesmo teste lido por 2 observadores independentes) foram de 0,789 (p < 0,001) e 0,98 (p < 0,001), respectivamente. Os coeficientes de correlacao entre as tecnicas (validade de criterio), para as amostras obtidas na 1ª e 2ª visitas foram de 0,69 (p < 0,05) e 0,77 (p < 0,05), respectivamente. CONCLUSAO:O limite superior de normalidade dos anticorpos ASLO para a populacao de São Paulo, Brasil e de 320 UI. A reacao de aglutinacao apresentou resultados validos (titulos comparaveis aos obtidos com o padrao ouro, a reacao de neutralizacao) / BACKGROUND: Rheumatic fever (RF) remains a public health problem in Brazil. The serologic detection of anti-streptolysin O antibodies (ASO) is important in RF diagnosis and disease activity. In the literature, the upper limit of ASO antibodies varies across world areas. Differences in social economic status and climatic conditions prevent the adoption of an universal upper limit for ASO antibodies. OBJETIVE: To determine the upper limit of normal ASO antibodies in “healthy” subjects, between the ages of 2 and 17, living in the city of Sao Paulo, Brazil. METHODS: 484 children (with no clinical signs of streptococcal infection) between the ages of 2 and 17, were consecutively selected from the pediatric preventive health care outpatient clinic of UNIFESP and also from a Military Police School (from kindergarten to high school age). Oralpharyngeal secretion for culture and blood were collected on 2 separate occasions, with an interval of 1 month. Patients presenting positive culture for group A betahemolytic streptococcus (GABHS) were excluded. The detection of ASO antibodies was carried out using the latex agglutination test and the result was rated by 2 independent observers. Sera (from the 2 occasions) from 121 subjects, randomly selected, were also submitted to the neutralization test. RESULTS: 379 completed the study. 16 with positive culture for GABHS and 89 who did not returned for the 2nd visit were excluded. The mean age of the sample was of 7.7 years. 51.7% were male, 71% were in school or daycare and 36.5% sharing the same bedroom with more than 2 subjects. The upper limit of ASO antibodies, corresponding to the 97.5 percentile, was 320 IU. The intraclass correlation coefficients calculated to determine the test-retest (result from 1st and 2nd visit read by the same observer) and inter-observer reliability (same test read by 2 independent observers), were 0.789 (p < 0.001) and 0.98 (p < 0.001), respectively. The Spearman correlation coefficients to compare both techniques (criterion validity) for the 1st and 2nd visits were 0.69 (p < 0.05) and 0.77 (p < 0.05), respectively. CONCLUSION: The upper limit of normal ASO antibodies for residents in the city of Sao Paulo, Brazil is 320 IU. The latex agglutination test presented a valid result (as comparared to the gold standard, the neutralization test). / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-06-10T16:55:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Camila Brandão.pdf: 1719574 bytes, checksum: 88d3f5ffc68d62268cbbbc0e858b902e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-10T16:55:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Camila Brandão.pdf: 1719574 bytes, checksum: 88d3f5ffc68d62268cbbbc0e858b902e (MD5) / FAPESB / O CAEV é um vírus envelopado cuja cápside é formada por uma tripla camada protéica, dentro da qual se encontra a p28, proteína de maior número de unidades repetidas. Os AcM consistem em ferramentas de grande uso para fins diagnósticos ou de pesquisa para agentes virais. Neste trabalho AcM para a p28 do CAEV foram analisados na sua reatividade e característica imunológica. Dentre as características imunológicas, foi demonstrada que a imunoglobulina predominante foi a IgG, de cadeia leve κ, sem atividade precipitante segundo o ensaio de Imunodifusão. A atividade ou reatividade destes AcM em substratos celulares infectados com CAEV foi baixa, o que foi demonstrado pela imunofluorescência indireta. Por outro lado, a atividade destes AcM está direcionada para a p28 e seus precursores protéicos virais. O epítopo reconhecido na p28 poderia ser do tipo seqüencial pela maior reatividade ao desnaturar a proteína que o contém (Western-blot). Entretanto, a depender dessa desnaturação o reconhecimento do epítopo pode ser afetado, como demonstrado nos tratamentos do antígeno viral com agente surfactante (SDS) ou β-Mercaptoethanol. Estes resultados mostraram que o epítopo na p28 seria afetado com ambos os tratamentos, porém foi mais notável com o β-Mercaptoethanol, o que sugeriria que este determinante antigênico é rico em resíduos Cys. / Salvador

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-08-14T19:25:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Nayara de Sá Oliveira.pdf: 5733900 bytes, checksum: f0c0c981923cca5d8657a1b86859e181 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-14T19:25:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Nayara de Sá Oliveira.pdf: 5733900 bytes, checksum: f0c0c981923cca5d8657a1b86859e181 (MD5) / FAPESB;CAPES / O Norovírus (NoV), considerado uma das maiores causas de gastrenterite aguda não-bacteriana, é um vírus eliminado em pouca quantidade nas fezes e não cultivável em células, o que dificulta a obtenção de antígeno para produção de anticorpos monoclonais (AcM). Este trabalho propõe a obtenção desse antígeno diretamente de fezes, com uma metodologia de semi-purificação viral, através de filtrações esterilizantes e precipitação com polietileno glicol (PEG). O NoV precipitado com PEG manteve a sua antigenicidade, oferecendo excelentes condições para a produção e obtenção de seis AcM. Os AcM foram caracterizados pela técnica de Western Blot, onde foi demonstrada uma forte reatividade com uma banda de 60KDa, compatível com a proteína viral VP1, principal proteína que forma o capsídeo. Os AcM também foram capazes de detectar o vírus em amostras fecais coletadas de pacientes com gastrenterite aguda, utilizando-se a técnica de Dot-blot. O Dot-blot, quando comparado ao RT-PCR, padrão ouro para o diagnóstico do NoV, apresentou uma sensibilidade de 74% e especificidade de 47%. Este trabalho demonstra que os AcM reagiram fortemente com a proteína viral VP1 e que podem ser úteis na detecção do NoV nas fezes através da técnica de Dot-blot. Novos estudos devem ser realizados para verificar o potencial uso desses AcM para o diagnóstico do NoV. / Salvador