CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Sporotrichosis is a cosmopolitan subcutaneous mycosis, found mainly in tropical and subtropical areas of Latin America, caused by species of Sporothrix schenckii complex. The aim of this study was to demonstrate the capacity of Sporothrix schenckii complex to produce in vitro biofilms and to determine the profile of these biofilms against to classical antifungal drugs. Four species from Sporothrix schenckii complex were used: S. brasiliensis (n=10), S. schenckii sensu stricto (n=2), S. globosa (n=2) and S. mexicana (n=4). The formation of biofilms was performed by transferring inoculum of 2 x 105 conidia/mL for microdilution plates, which were incubated at 25 ÂC for 5 days. After each day of incubation, XTT and Crystal Violet assays were made to determine the metabolic activity and biomass of biofilm, respectively. For susceptibility tests, three different concentrations (planktonic MIC, 10 x MIC and 50 x MIC) of antifungals amphotericin B (AMB), caspofungin (CAS), ketoconazole (KTC), voriconazole (VRC) and fluconazole (FLC) were transferred to biofilm wells, which were incubated for 72 hours at 25 ÂC. The biofilms profile then antifungal drugs presence was determined by the XTT and crystal violet assays. Biofilms were produced in Thermanoxâ coverslips for viewing by optical microscopy with congo-red staining, scanning electron microscopy and confocal microscopy. It was found that all species from S. schenckii complex are strong biofilm-forming, with no difference formation between them. Absorbance of biofilm after drug exposure showed that biomass and metabolic activity was significantly reduced (p<0.05), mainly in S. brasiliensis. Antifungal drugs tested showed metabolic activity and biomass reduction, especially at concentrations 50 times higher than the planktonic MICs, demonstrating the protective increase in sessile form when compared for planktonic form. / A esporotricose à uma micose subcutÃnea cosmopolita, encontrada, principalmente, em Ãreas tropicais e subtropicais da AmÃrica Latina, sendo causada por espÃcies do complexo Sporothrix schenckii. O objetivo deste estudo foi demonstrar a capacidade de fungos do complexo S. schenckii de produzir biofilmes in vitro e determinar o perfil desses biofilmes frente Ãs drogas antifÃngicas clÃssicas. Foram utilizadas 4 espÃcies do complexo Sporothrix schenckii: S. brasiliensis (n=10), S. schenckii sensu stricto (n=2), S. globosa (n=2) e S. mexicana (n=4). A formaÃÃo dos biofilmes foi feita atravÃs da transferÃncia de inÃculos de 2 x 105 conÃdios/mL para placas de microdiluiÃÃo, que foram incubadas a 25 ÂC por 5 dias. ApÃs cada dia de incubaÃÃo, realizaram-se ensaios de XTT e Cristal violeta, para se determinar a atividade metabÃlica e biomassa dos biofilmes, respectivamente. Para os ensaios de sensibilidade, trÃs concentraÃÃes diferentes (MIC planctÃnico, 10 x MIC e 50 x MIC) dos antifÃngicos anfotericina B (AMB), caspofungina (CAS), cetoconazol (KTC), voriconazol (VRC) e fluconazol (FLC) foram transferidas para os poÃos com biofilmes, que foram incubados por 72 horas a 25 ÂC. O perfil dos biofilmes frente Ãs drogas antifÃngicas foi determinado atravÃs de ensaios de XTT e cristal violeta. Biofilmes foram produzidos em lamÃnulas de Thermanoxâ para visualizaÃÃo atravÃs de microscopia Ãptica com coloraÃÃo de vermelho-congo, microscopia eletrÃnica de varredura e microscopia confocal. Verificou-se que todas as espÃcies do complexo S. schenkii sÃo fortes formadoras de biofilme, nÃo havendo diferenÃa de formaÃÃo entre as espÃcies. A absorbÃncia dos biofilmes apÃs exposiÃÃo Ãs drogas demonstrou que a biomassa e a atividade metabÃlica foram reduzidas de forma significativa (p<0,05), principalmente, em S. brasiliensis. Os antifÃngicos testados mostraram reduÃÃo na atividade metabÃlica e biomassa, principalmente, em concentraÃÃes 50 vezes maiores que os MICs planctÃnicos, demonstrando o incremento protetivo que a forma sÃssil possui frente à forma planctÃnica.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As peroxidases estÃo presentes em todos os organismos vivos e constituem um grupo de enzimas multifuncionais com diversas aplicaÃÃes biotecnolÃgicas. Nesse grupo, as peroxidases de plantas classe III (POX) (EC 1.11.1.7) sÃo enzimas bem caracterizadas, com participaÃÃo na lignificaÃÃo, suberizaÃÃo, catabolismo de auxinas, cicatrizaÃÃo e defesa vegetal. Tais enzimas tÃm sido detectadas em diferentes partes do vegetal, inclusive no lÃtex. Esse trabalho teve como objetivo a purificaÃÃo, caracterizaÃÃo e avaliaÃÃo da atividade antifÃngica de uma peroxidase presente no lÃtex de Marsdenia megalantha, uma espÃcie endÃmica da Caatinga. O lÃtex foi coletado de plantas nativas da regiÃo do Quixadà CearÃ, Brasil, diluÃdo (1:2) em Tris-HCl 0,05 M, contendo NaCl 0,15 M, pH 8,0 e submetido à centrifugaÃÃo e diÃlise contra Ãgua. O sobrenadante foi aplicado em matriz de DEAE-Celulose, equlibrada com tampÃo acetato de sÃdio 0,05 M, pH 5,2, resultando nas proteÃnas nÃo retidas (FnRd) e nas proteÃnas retidas (FRd), essas Ãltimas eluÃdas com a adiÃÃo de NaCl 0,2 M no tampÃo inicial. A FnRd foi submetida à cromatografia em matriz de Superose 12 HR 10/30, originando duas fraÃÃes proteicas (S1 e S2). S1 se mostrou como uma proteÃna pura, com atividade peroxidÃsica, massa molecular aparente de 60 kDa, pI de 5,2 e identidade com outras POXs, que foi denominado de peroxidase de M. megalantha (Mm-POX). Mm-POX obedece à cinÃtica de Michaelis-Menten, apresenta alta afinidade pelo guaiacol e H2O2, estabilidade tÃrmica elevada (60 ÂC, 1 hora) e pH Ãtimo em torno de 6,0. A atividade catalÃtica da Mm-POX foi reduzida diante de inibidores clÃssicos de peroxidases, incluindo azida, DTT, EDTA e Na2S2O5 e de concentraÃÃes elevadas Na+, Mn2+ e Ãcido salicÃlico. Por outro lado, os Ãons Ca2+ e Mg2+, mesmo em baixas concentraÃÃes, foram capazes de potencializar a atividade enzimÃtica da Mm-POX. Testada contra fungos, Mm-POX (0,2 Âg/mL) foi capaz de inibir a germinaÃÃo de conÃdios de Fusarium oxysporum e F. solani, aÃÃo que provavelmente decorre de alteraÃÃo na membrana celular e induÃÃo de estresse oxidativo. Os dados em conjunto demonstram que a Mm-POX à uma peroxidase classe III, se constituindo na primeira proteÃna isolada de M. megalantha, com possibilidade de uso no controle de doenÃas vegetais ocasionadas por fungos, agregando valor biotecnolÃgico a essa enzima. / The peroxidases are present in all living organisms and constitute a group of multifunctional enzymes with several biotechnological applications. In this group, the class III plant peroxidases (POX) (EC 1.11.1.7) are enzymes well characterized, with involvement in lignification, suberization, auxin catabolism, wound healing and plant defense. These enzymes have been detected in different parts of the plant, including the latex. The aim of this work was the purification, characterization and antifungal activity evaluation of a peroxidase from Marsdenia megalantha latex, an endemic species of the Caatinga. The latex was collected from plant grown in QuixadÃ, CearÃ, Brazil, diluted (1:2) in 0.05 M Tris-HCl containing 0.15 M NaCl, pH 8.0, and subjected to centrifugation and dialysis against water. The supernatant was applied to a DEAE-Cellulose matrix previously equilibrated with 0.05 M sodium acetate buffer, pH 5.2 and two protein fractions were obtained. Elution of the non retained proteins (FnRd) was achivied by the equilibrium buffer, whereas the bound proteins (FRd) were eluted with 0.2 M NaCl in the same buffer. FnRd was subjected to a chromatography on Superose 12 HR 10/30 column, yielding two protein fractions (S1 and S2). S1 was shown to be a pure protein with peroxidasic activity, apparent molecular mass of 60 kDa, pI 5.2 and identity with other POXs, being named of M. megalantha peroxidase (Mm-POX). Mm-POX follows the Michaelis-Menten kinetics, with high affinity for guaiacol and H2O2, elevated thermal stability (60 ÂC, 1 hour) and optimum pH around 6.0. The catalytic activity of Mm-POX was reduced in the presence of classic peroxidases inhibitors, including azide, DTT, EDTA and Na2S2O5 and also in high concentrations of Na+, Mn2+ and salicylic acid. On the other hand, Ca2+ and Mg2+, even at low concentrations, were able to enhance the enzymatic activity of Mm-POX. In addition, Mm-POX was able to inhibit the Fusarium oxysporum and F. solani conidia germination. This action is probably due to changes in the cell membrane as well as induction of oxidative stress. The results reveal that Mm-POX is a class III peroxidase, being the first enzyme isolated from M. megalantha species, with potential use in the control of plant disease caused by fungi, adding biotechnological value to this enzyme.

nÃo hà / A atividade anti-inflamatÃria da prÃpolis à bastante descrita na literatura e alguns trabalhos sugerem que pode estar relacionada à presenÃa de flavonoides, os quais apresentam atividade inibitÃria sobre a ciclooxigenase e a lipoxigenase. Entretanto os resultados nÃo sÃo conclusivos e assim, inÃmeros pesquisadores tÃm investigado a atividade anti-inflamatÃria da prÃpolis em diversos modelos de inflamaÃÃo sugerindo possibilidade de vÃrios mecanismos de aÃÃo. Neste sentido, o presente trabalho realizou um estudo comparativo da atividade anti-inflamatÃria da prÃpolis vermelha, uma espÃcie nova, pouco estudada, oriunda do litoral de Pernambuco e da prÃpolis verde, de Minas Gerais em dois modelos animais de inflamaÃÃo, o edema de orelha induzido por Ãleo de crÃton em camundongos e o edema de pata induzido por carragenina em ratos. Foi observada atividade anti-inflamatÃria em ambos modelos, porÃm constatou-se uma maior efetividade para a prÃpolis vermelha. Uma outra atividade farmacolÃgica da prÃpolis bem conhecida popularmente e bem estudada cientificamente à sua aÃÃo antimicrobiana. Foi objetivo deste trabalho tambÃm investigar comparativamente a aÃÃo antifÃngica dos tipos de prÃpolis em vÃrias cepas de Candida. Embora, a constataÃÃo de cepas de Candida em qualquer microbiota do homem nÃo induza nenhum transtorno que possa favorecer patologia, as leveduras de Candida spp. talvez sejam o fungo mais oportunista descrito. Desse modo, esses processos estÃo relacionados a um grande nÃmero de doenÃas e mau funcionamento orgÃnico. Assim o aumento crescente das infecÃÃes por Candidas (sobretudo nosocomial) e de sua resistÃncia a antimicrobianos tem despertado a busca por novas alternativas terapÃuticas. Neste sentido, este estudo tambÃm testou a sensibilidade de sete espÃcies de Candida sp. de interesse clÃnico à aÃÃo da prÃpolis vermelha e verde. Os resultados do ensaio de inibiÃÃo em placas de Petri usando discos de papel impregnado de extrato de prÃpolis mostraram variÃveis nÃveis de inibiÃÃo, sendo que, uma discreta inibiÃÃo foi observada para a maioria das cepas. Em suma, esses estudos, embora preliminares, apontam diferenÃas de efetividade entre a prÃpolis verde e vermelha e despertam o interesse para a necessidade de anÃlise mais aprofundada do assunto, tendo em vista a escassez de estudos realizados para a prÃpolis vermelha. / The anti-inflammatory activity of propolis is fairly described in the literature and some studies suggest that may be related to the presence of flavonoids, which have inhibitory activity on the cyclooxygenase and lipoxygenase. However the results are not conclusive and thus, many researchers have investigated the anti-inflammatory activity of propolis in several models of inflammation suggesting possibility of multiple mechanisms of action. In this sense, this work has made a comparative study of anti-inflammatory activity of red propolis , a new species, little studied, came from coast of Pernambuco and green propolis, from Minas Gerais in two animal models of inflammation, swelling of the ear induced by Croton oil in mice and the paw edema induced by carrageenan in rats. Antiinflammatory activity was observed in both models, but there was a greater effectiveness for the red propolis. Another pharmacological activity of propolis popularly known and well scientifically studied is its antimicrobial activity. It was objective of this study also to investigatate and compare the action of anti-fungal activity of two types of propolis in several strains of candida. Although the finding of strains of Candida at any microflora of man does not induce any inconvenience that may promote disease, the yeast of Candida spp. are perhaps the most opportunistic fungus described. Thus, these cases are related to a large number of organic diseases and malfunctions. Thus the rising tide of infections caused by Candida (especially nosocomial) and its resistance to antibiotics has increased the search for new therapeutic alternatives. Accordingly, this study also tested the sensitivity of seven species of Candida sp. of clinical interest, to the action of red and green propolis. The test results of inhibition in Petri dishes using discs of paper impregnated with extract of propolis, showed varying levels of inhibition, with a slight inhibition been observed for most strains. In short, these studies, although preliminary, indicate differences in effectiveness between the red and green propolis and appeal to the need for more thorough analysis of the issue in view of the scarcity of studies for the red propolis.