Tumor angiogenesis is essential for the growth of solid tumors as their proliferation and survival is dependent on consistent oxygen and nutrient supply. Anti-angiogenic treatments represent a therapeutic strategy to inhibit tumor growth by preventing the formation of new blood vessels leading to starvation of the tumor. One of the best characterized anti angiogenic therapeutics is the monoclonal antibody bevacizumab (Avastin), which targets and neutralizes VEGF leading to disruption of the VEGF signaling pathway. Until today, bevacizumab has found its way into clinical practice and has gained approval for treatment of different types of cancer including colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer and renal cell carcinoma. Signaling of VEGF is mediated through VEGF receptors, mainly VEGFR2, which are primarily located on the cell surface of endothelial cells. However, there has been evidence that expression of VEGF receptors can also be found on tumor cells themselves raising the possibility of autocrine and/or paracrine signaling loops. Thus, tumor cells could also benefit from VEGF signaling, which would promote tumor growth. The aim of this study was to investigate if bevacizumab has a direct effect on tumor cells in vitro. To this end, tumor cell lines from the NCI-60 panel derived from four different tumor types were treated with bevacizumab and angiogenic gene and protein expression as well as biological outputs including proliferation, migration and apoptosis were investigated. Most of the experiments were performed under hypoxia to mimic the in vivo state of tumors. Overall, there was a limited measurable effect of bevacizumab on treated tumor cell lines according to gene and protein expression changes as well as biological functions when compared to endothelial controls. Minor changes in terms of proliferation or gene regulation were evident in a single tumor cell line after VEGF-A blockade by bevacizumab, which partially demonstrated a direct effect on tumor cells. However, the overall analysis revealed that tumor cell lines are not intrinsically affected in an adverse manner by bevacizumab treatment. Besides the functional analysis of tumor cells, embryonic stem cell derived endothelial cells were characterized to delineate vascular Hey gene functions. Hey and Hes proteins are the best characterized downstream effectors of the evolutionary conserved Notch signaling pathway, which mainly act as transcriptional repressors regulating downstream target genes. Hey proteins play a crucial role in embryonic development as loss of Hey1 and Hey2 in mice in vivo leads to a severe vascular phenotype resulting in early embryonic lethality. The major aim of this part of the thesis was to identify vascular Hey target genes using embryonic stem cell derived endothelial cells utilizing a directed endothelial differentiation approach, as ES cells and their differentiation ability provide a powerful in vitro system to study developmental processes. To this end, Hey deficient and Hey wildtype embryonic stem cells were stably transfected with an antibiotic selection marker driven by an endothelial specific promoter, which allows selection for endothelial cells. ESC-derived endothelial cells exhibited typical endothelial characteristics as shown by marker gene expression, immunofluorescent staining and tube formation ability. In a second step, Hey deficient ES cells were stably transfected with doxycycline inducible Flag-tagged Hey1 and Hey2 transgenes to re-express Hey proteins in the respective cell line. RNA-Sequencing of Hey deficient and Hey overexpressing ES cells as well as ESC-derived endothelial cells revealed many Hey downstream target genes in ES cells and fewer target genes in endothelial cells. Hey1 and Hey2 more or less redundantly regulate target genes in ES cells, but some genes were regulated by Hey2 alone. According to Gene Ontology term analysis, Hey target genes are mainly involved in embryonic development and transcriptional regulation. However, the response of ESC-derived endothelial cells in regulating Hey downstream target genes was rather limited when compared to ES cells, which could be due to lower transgene expression in endothelial cells. The limited response also raises the possibility that target gene regulation in endothelial cells is not only dependent on Hey gene functions alone and thus loss or overexpression of Hey genes in this in vitro setting does not influence target gene regulation. / Tumorangiogenese ist essential für das Wachstum von Tumoren, da ihr Überleben und ihre Proliferation von einer dauerhaften Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen abhängig sind. Anti-angiogene Therapeutika inhibieren das Wachstum von Tumoren, indem sie die Bildung von neuen Blutgefäßen unterbinden, was zu einem „Verhungern“ des Tumors führt. Zu den am besten untersuchten anti-angiogenen Therapeutika gehört der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin), welcher den Wachstumsfaktor VEGF bindet und neutralisiert, was schließlich zu einer Unterbrechung des VEGF-Signalweges führt. Bevacizumab wird aktuell zur Behandlung verschiedener Tumortypen, unter anderem Colonkarzinom, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, Brustkrebs und Nierenzellkarzinom in der Praxis angewandt. VEGF bindet an VEGFR2 und andere VEGF-Rezeptoren, welche primär an der Oberfläche von Endothelzellen lokalisiert sind. Dennoch gibt es Hinweise, dass die Expression von VEGF-Rezeptoren nicht ausschließlich auf Endothelzellen begrenzt ist, sondern auch auf Tumorzellen nachgewiesen werden konnte. Die tumorale Expression von VEGF-Rezeptoren ermöglicht eine direkte autokrine und/oder parakrine Stimulation von Tumorzellen. Tumorzellen könnten dadurch selbst vom VEGF-Signalweg profitieren, was das Tumorwachstum fördern würde. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob Bevacizumab in vitro einen direkten Einfluss auf Tumorzellen ausübt. Dazu wurden verschiedene Tumorzelllinien von vier unterschiedlichen Tumortypen aus der NCI-60 Sammlung mit Bevacizumab behandelt und anschließend die Gen- und Proteinexpression von angiogenen Markern sowie biologische Funktionen wie Proliferation, Migration und Apoptose untersucht. Die Experimente wurden hauptsächlich unter Hypoxie durchgeführt, um den in vivo Status von Tumoren nachzuahmen. Insgesamt war ein direkter Effekt von Bevacizumab auf Tumorzellen im Vergleich zu Endothelzellen nicht nachweisbar. Gen- und Proteinexpression sowie biologische Funktionen waren in Tumorzellen nach Bevacizumab Behandlung bis auf wenige Ausnahmen unverändert. Geringe Veränderungen in der Proliferationsrate sowie in der Genregulation nach Inhibition von VEGF durch Bevacizumab konnten jeweils in einer einzelnen Zelllinie nachgewiesen werden, wodurch zumindest teilweise eine direkte Wirkung von Bevacizumab auf Tumorzellen gezeigt werden konnte. Dennoch zeigt die umfassende Analyse der verschiedenen Tumorzellen, dass die Bevacizumab-Behandlung sich insgesamt nicht negativ auf Tumorzellen auswirkt und diese nicht intrinsisch beeinflusst werden. Neben der funktionellen Analyse von Tumorzellen wurden Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen gewonnen wurden, charakterisiert, um anhand derer die Rolle der Hey Gene in der vaskulären Entwicklung näher zu bestimmen. Hey und Hes Proteine sind die am besten charakterisierten nachgeschalteten Effektoren des evolutionär konservierten Notch-Signalweges. Als Transkriptionsfaktoren sind Hey Proteine an der Regulation von Zielgenen beteiligt, wobei sie meist als transkriptionelle Repressoren fungieren. Hey Proteine spielen eine sehr wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, da der gemeinsame Verlust von Hey1 und Hey2 in Mäusen in vivo einen vaskulären Phenotyp hervorruft, der in sehr früher embryonaler Letalität endet. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, vaskuläre Hey Zielgene mit Hilfe von Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen differenziert wurden, zu identifizieren. Die Fähigkeit embryonaler Stammzellen verschiedene Zelltypen zu bilden, liefert dabei ein wertvolles in vitro System, um entwicklungsbiologische Prozesse zu analysieren. Dazu wurden Hey-defiziente und Hey-Wildtyp embryonale Stammzellen mit einem antibiotischen Selektionsmarker versehen, dessen Expression von einem Endothel spezifischen Promoter kontrolliert wird und daher die Selektion von Endothelzellen erlaubt. Die differenzierten Endothelzellen wiesen typische endotheliale Charakteristika auf, was durch Markergen-Expression, Immunfluoreszenzfärbungen und der Bildung netzwerkähnlicher Strukturen gezeigt werden konnte. In einem zweiten Schritt wurden Doxyzyklin-induzierbare Flag-markierte Hey1 bzw. Hey2 Konstrukte stabil in Hey-defiziente Zellen integriert, um Hey1 bzw. Hey2 kontrollierbar zu re-exprimieren. Die Zielgensuche mittels RNA-Seq Analyse lieferte viele Hey Zielgene in embryonalen Stammzellen, jedoch weitaus weniger Zielgene in ausdifferenzierten Endothelzellen. Zusammengefasst zeigten Hey1 und Hey2 eine redundante Regulation von Zielgenen in embryonalen Stammzellen, wobei einige wenige Gene alleine durch Hey2 reguliert wurden. Die Gen-Ontologie Analyse zeigte, dass diese Zielgene hauptsächlich an der embryonalen Entwicklung und der transkriptionellen Regulation von anderen Genen beteiligt sind. Dennoch war die Anzahl der Hey regulierten Gene in Endothelzellen weitaus geringer als in embryonalen Stammzellen. Das könnte auf eine geringere Transgen-Expression in Endothelzellen im Vergleich zu embryonalen Stammzellen zurückzuführen sein. Die weitaus geringere Anzahl an Hey Zielgenen in Endothelzellen lässt außerdem vermuten, dass die Regulation von Zielgenen in Endothelzellen nicht ausschließlich von der Funktion der Hey Gene abhängig ist. Die Regulation von Hey Zielgenen in Endothelien wurde durch den Verlust bzw. die Überexpression von Hey1 und Hey2 in dem angewandten in vitro System nur geringfügig beeinflusst.

Functionally active (conformational) autoantibodies directed against the β1-adrenergic receptor (β1-AR) are supposed to have a pathogenic relevance in human heart failure, particularly in idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM). Prevalence of anti-β1-autoantibodies (anti-β1-aabs) in the healthy population is almost negligible, whereas it amounts to up to 30% in heart failure patients with idiopathic DCM. As β1-ARs are not restricted to the heart and are also highly expressed in particular segments of the nephron, it is conceivable that such autoantibodies might also affect kidney function to some extent through the activation of renal β1-ARs. In the kidney, β1-ARs are highly abundant in the juxtaglomerular apparatus, the distal convoluted tubules, the collecting duct, and the renal arteries. However, the functional significance of β1-ARs at these particular sites along the nephron is poorly understood, as are the effects of conformational stimulating anti-β1-aabs on renal β1-ARs. From the available literature, it is well known that the β1-adrenergic system is involved in, e.g., the regulation of renin-secretion from juxtaglomerular cells. In addition, the β1-adrenergic system is thought to be involved in the regulation of the urine pH via type B-intercalated cells in the collecting duct. In contrast, the regulation of salt- and fluid-secretion in the medullary collecting duct appears to occur independently from the SNS. As a consequence, the present work aimed to unravel the potential pathophysiological links between renal function, alterations in the cardiovascular system, and circulating agonist-like anti- β1-abs. We analyzed possible renal effects of anti-β1-abs in a human-analogous rat model. After immunization with a GST-fusion protein containing the second extracellular loop (β1-ECII) of the human β1-AR, Lewis-rats develop functionally active, stimulating, conformational anti-β1-ECII-abs. Within the first 6 months, anti-β1-ECII-ab-positive animals develop a hypertensive phenotype, which after 9 months evolves into a DCM phenotype. In n=40 GST/ β1-ECII-immunized Lewis rats and n=40 age-matched, 0.9% NaCl-injected control animals, we sequentially (i.e. at months 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, and 18 after start of immunization) analyzed the changes in renal function on a molecular, functional, and structural level. We could show that the presence of stimulating anti-β1-ECII-abs – even though having detrimental effects on the heart – has only a minor impact on kidney function and structure. Within the first 3 months after induction of anti-β1-ECII-abs, the levels and activity of renin were significantly increased in immunized compared to corresponding control animals, which was confirmed by experiments on isolated perfused kidneys, in which anti-β1-ECII-abs were able to directly induce the liberation of renin. However, within several weeks the initial anti-β1-ECII-ab-mediated RAAS activation was counter-regulated by auto-regulatory mechanisms activated in the kidney. Similarly, glomerular filtration rate (GFR) and renal blood flow (RBF) were initially decreased in the presence of the stimulating anti-β1-ECII-abs, but returned to control values within 3 months after immunization of the animals. Although expression of several pro-fibrotic markers was significantly up-regulated in anti-β1-ECII-ab-positive rats, no significant differences were noted on a histomorphological level with regard to the occurrence of renal fibrosis, glomerular damage, tubular damage, and perivascular fibrosis. Only a mild decrease in glomerular filtration function was observed in the kidneys of anti-β1-ECII-ab-positive animals from immunization-month 12 on, apparent by increased levels of urinary protein. Even though anti-β1-ECII-abs were able to induce mild changes in renal function, their effects were not strong enough to critically damage the kidneys in our rat-model. Differences between immunized anti-β1-ECII-ab-positive and corresponding control rats at later time-points (that is, from immunization-month 12 on) are most likely secondary to the progressive heart failure phenotype that immunized animals develop in the course of the experiment. The present study is the first to focus on the effects of stimulating anti-β1-ECII-abs on the kidney, and on the prevalence of these effects for the heart (referred to as cardio-renal crosstalk). Although our results were obtained in a rat model, they might contribute to better understand the situation in anti-β1-AR-aab-positive human patients. Following the results of our experiments, treatment of such patients should focus on direct and specific neutralization/elimination of stimulating anti-β1-ECII-aab or at least comprise therapeutic strategies that counteract the anti-β1-ECII-aab-effects on the heart by standard treatment for heart failure (i.e. ACE inhibitors, AT1-receptor blockers, and β-blockers) according to current guidelines. / Funktionell aktive, konformationelle Autoantikörper, die gegen den β1-adrenergen Rezeptor (β1-AR) gerichtet sind, sind vermutlich pathologisch relevant bei Herzinsuffizienz, insbesondere bei der idiopathischen Dilativen Kardiomyopathie (DCM). Die Prävalenz solcher Antikörper ist in der gesunden Population vernachlässigbar, wohingegen sie bei der idiopathischen DCM 30% erreicht. Da β1-AR nicht nur im Herzen, sondern auch in der Niere stark exprimiert werden, ist naheliegend, dass solche Antikörper über eine Stimulation renaler β1-AR auch die Nierenfunktion beeinflussen können. In der Niere werden β1-AR überwiegend im juxtaglomerulären Apparat, im distalen Tubulus, in den Sammelrohren und in den renalen Arterien exprimiert. Die Bedeutung der in diesen Bereichen hohen Expression von β1-AR für die Nierenfunktion ist noch nicht vollständig geklärt, ebenso wie die renalen Effekte von stimulierenden β1-AR-Antikörpern. Aus der Literatur ist bekannt, dass das β1-adrenerge System unter anderem an der Renin-Sekretion der juxtaglomerulären Zellen beteiligt ist. Außerdem wird vermutet, dass das β1-adrenerge System in die Regulation des pH-Wertes des Urins über die Typ B-interkalierenden Zellen des Sammelrohrs eingreift, wohingegen die Regulation der Salz- und Wasserexkretion im medullären Sammelrohr wahrscheinlich unabhängig vom sympathischen Nervensystem abläuft. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die potentiellen pathophysiologischen Zusammenhänge zwischen renaler Funktion, Änderungen innerhalb des kardiovaskulären Systems und zirkulierenden, agonist-ähnlichen anti-β1-Autoantikörpern darzustellen. Wir haben die möglichen renalen Effekte der anti-β1-AK in einem human-ähnlichen Ratten-Modell untersucht. Nach Immunisierung mit einem GST-Fusionsprotein, welches den zweiten extrazellulären Loop des β1-AR beinhaltet, entwickeln Lewis-Ratten funktionell aktive, stimulierende Antikörper gegen β1-ECII. Anti-β1-ECII-AK-positive Tiere entwickeln nach ca. 6 Monaten einen hypertensiven Phänotyp, welcher nach 9 Monaten in einen DCM Phänotyp übergeht. Wir haben Änderungen der renalen Funktion auf molekularer, funktioneller, und struktureller Ebene in n=40 GST/ β1-ECII-immunisierten Lewis-Ratten und n=40 altersgleichen 0.9% NaCl-injizierten Kontrolltieren sequenziell (d.h. 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 und 18 Monate nach Beginn der Immunisierung) analysiert. Wir konnten zeigen, dass die stimulierenden anti-β1-ECII-Antikörper – obwohl sie eine schädigende Wirkung auf das Herz haben – die Nierenfunktion und -Struktur nur gering beeinflussen. In den ersten Monaten nach Induktion der anti-β1-ECII-AK stieg die Reninkonzentration und -aktivität in den immunisierten Tieren im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen signifikant an. Dieses Ergebnis konnte im Model der isolierten perfundierten Niere bestätigen werden, in dem anti-β1-ECII-AK eine direkte Freisetzung von Renin induzierten. Diese frühe AK-vermittelte Aktivierung des RAAS wurde jedoch innerhalb weniger Wochen durch autoregulatorische Mechanismen der Niere aufgehoben. Ebenso waren anfangs die glomeruläre Filtrationsrate und der renale Blutfluss in anti-β1-ECII-AK-positiven Ratten vermindert, kehrten jedoch nach 3 Monaten zu den Werten der Kontrolltiere zurück. Obwohl die Expression mehrerer pro-fibrotischer Marker signifikant erhöht war, konnten keine signifikanten Veränderungen auf histomorphologischer Ebene hinsichtlich des Auftretens renaler Fibrose, glomerulärer und tubulärer Schädigung, oder perivaskulärer Fibrose festgestellt werden. Lediglich die glomeruläre Filtrationsfunktion war ab dem 12. Immunisierungsmonat zunehmend beeinträchtigt, was sich an einer progredienten Proteinurie zeigte. Obwohl anti-β1-ECII-AK durchaus einen gewissen Effekt auf die Nierenfunktion haben, ist ihr Einfluss nicht stark genug um die Niere kritisch zu schädigen. Unterschiede zwischen immunisierten und Kontrolltieren, welche zu späteren Zeitpunkten (d.h. ab dem 12. Immunisierungsmonat) auftreten, sind wahrscheinlich sekundäre Effekte der progredienten Herzinsuffizienz, die die immunisierten Tiere im Verlauf des Experiments entwickeln. Unsere Studie ist die Erste, die sich mit den Effekten von stimulierenden anti-β1-AK auf die Niere und ihre Zusammenhänge mit der antikörper-induzierten Herzinsuffizienz (dem sogenannten kardio-renalen „Crosstalk“) befasst. Obwohl unsere Ergebnisse in einem Tiermodell erzielt wurden, könnten sie von großem Nutzen sein, um die Krankheitsentwicklung von anti-β1-Autoantikörper-positiven Patienten besser zu verstehen. Unseren Ergebnissen zufolge sollte die Behandlung von Autoimmun-DCM auf eine möglichst direkte und spezifische Neutralisierung/Eliminierung von anti-β1-Autoantikörpern abzielen und gleichzeitig alle kardio- und renal-protektiven Elemente der Standard-Therapie der Herzinsuffizienz (d.h. Gabe von ACE-Hemmern, AT1-Rezeptor-Inhibitoren und β-Blockern) einschließen.

Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B. In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response. These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages. / Als Charcot-Marie-Tooth (CMT) Typ 1 Erkrankungen bezeichnet man eine genetisch heterogene Gruppe von nicht behandelbaren, erblichen Neuropathien, die das periphere Nervensystem betreffen und letztendlich zu starken motorischen und sensorischen Defiziten führen. Anhand verschiedener Studien konnte gezeigt werden, dass sekundäre Entzündungsreaktionen, insbesondere des angeborenen und adaptiven Immunsystems, eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von zwei verschiedenen CMT1-Mausmodellen (CMT1B und CMT1X) spielen. Jedoch ist der genaue Mechanismus, in dem das adaptive Immunsystem zur Pathogenese beiträgt, nicht komplett bekannt. In einer veröffentlichten Studie wurden gebundenen endogenen Antiköpern eine wichtige Rolle beim raschen Myelinabbau nach Nervläsion während der Waller´schen Degeneration zugeschrieben. In Mäusen, die heterozygot defizient für P0 (P0het) sind und einige typische Merkmale der CMT1B Neuropathie aufweisen, sollte ein möglicherweise ähnlicher Mechanismus von endogenen Antikörpern untersucht werden, der zur Verstärkung der Krankheitsentwicklung führt. In dieser Studie konnte eine vermehrte Antikörperbindung in den betroffenen peripheren Nerven von P0het Myelinmutanten beobachtet werden. Anhand von Verkreuzungs-Experimenten von P0het Mutanten mit Mäusen, die keine B-Lymphozyten besitzen und daher keine Antikörper bilden können (JHD-/-), konnte zudem in den untersuchten 6 Monate alten Doppelmutanten eine verringerte Anzahl endoneuraler Makrophagen und eine deutliche Verbesserung der Demyelinisierung aufgezeigt werden. Zusätzlich konnte anhand von Rekonstitutions-Experimenten mit mausspezifischen-IgGs der neuropathische Phänotyp in peripheren Nerven wiederhergestellt werden, was die mögliche pathogenetische Rolle endogener Antikörper im frühen Stadium der Erkrankung bekräftigt. Unerwarteterweise führte die JHD-Defizienz jedoch in 12 Monate alten P0het Mausmutanten eher zu einer Verschlechterung der Neuropathie, zusammen mit einer verstärkten Entzündungsreaktion und M2-polarisierten Makrophagen-Aktivierung. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Fehlen von Antikörpern in einem etablierten Mausmodell für CMT1B unterschiedliche Folgen hat, da dies zu einer verringerten Makrophagen-vermittelten Demyelinisierung im frühen Erkrankungsverlauf führt, gleichzeitig aber im späteren Alter in einer verstärkten Entzündungsreaktion und einem vermehrten Nervschaden resultiert.

In Deutschland erkranken jährlich etwa 500.000 Menschen an Krebs, wovon circa 12.000 die Diagnose „Leukämie“ gestellt bekommen [1]. Unter den Leukämien weist die akute myeloische Leukämie (AML) die ungünstigste Prognose auf, sodass hier erheblicher Forschungsbedarf besteht. Zusätzlich schnitten viele potentielle Therapeutika, die sich in bisherigen präklinischen Testsystemen als vielversprechend erwiesen haben, in klinischen Studien schlecht ab [8]. Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung eines 3D in vitro Blutgefäß-/Gewebemodells als verbessertes präklinisches System zur Testung von Therapeutika, die zur erfolgreichen Behandlung von Leukämien beitragen sollen. Das 3D Blutgefäßmodell bestand aus humanen primären Endothelzellen, welche als Monolayer auf der Serosaseite einer dezellularisierten, porzinen, intestinalen Kollagenmatrix (SIS-Ser) wuchsen. Nach 14-tägiger Zellkultur wurden dem Versuchsansatz entsprechend nichtadhärente THP-1 Zellen (AML-M5-Zelllinie) und Tipifarnib oder entsprechende Kontrolllösungen beziehungsweise bimolekulare Antikörperkonstrukte mit PBMCs als Effektorzellen hinzupipettiert. Nach 5-tägiger Inkubation mit Tipifarnib beziehungsweise 24-stündiger Behandlung mit Antikörperkonstrukten wurde der therapiebedingte Anstieg der Apoptoserate in den malignen THP-1 Zellen mittels durchflusszytometrischer Analyse der Modellüberstände ermittelt. Zum Ausschluss verbliebener und durchflusszytometrisch zu analysierender Zellen wurde, stellvertretend für alle Suspensionszellen, eine Anti-CD13/DAB-Färbung durchgeführt, welche negativ ausfiel. Mögliche Kollateralschäden am Endothel wurden mittels histologischen Färbemethoden an Gewebeparaffinschnitten untersucht. In der Durchflusszytometrie zeigte Tipifarnib sowohl im 2D als auch im 3D Modell äquivalente, dosisabhängige und antileukämische Auswirkungen auf die THP-1 Zellen. Bei Applikation der Antikörperkonstrukte ließ lediglich die Kombination beider Hemibodies signifikante Effekte auf die THP-1 Zellen erkennen. Dabei zeigten sich bei konstanten Konzentrationen der Antikörperkonstrukte im 3D Modell deutlich höhere Apoptoseraten (58%) als im 2D Modell (38%). Stellt man Vergleiche von Tipifarnib mit den T-Zell-rekrutierenden Antikörperkonstrukten an, so ließen sich im 2D Modell ähnliche Apoptoseraten in den THP-1 Zellen erzielen (jeweils 38% bei Anwendung von 500 nM Tipifarnib). In den 3D Modellen erzielten jedoch die niedriger konzentrierten Antikörperkonstrukte bei kürzerer Inkubationsdauer eine noch höhere spezifische Apoptoserate in den THP-1 Zellen (im Mittel 58%) als 500 nM Tipifarnib (mittlere Apoptoserate 40%). Bezüglich der Nebenwirkungen ließ sich im 3D Modell nach Applikation von Antikörperkonstrukten kein wesentlicher Einfluss auf das Endothel erkennen, während Tipifarnib/DMSO als auch die mit DMSO versetzten Kontrolllösungen zu einer dosisabhänigen Destruktion des ursprünglichen Endothelzellmonolayers führten. Damit stellt die hier beschriebene, hoch spezifische, Hemibody-vermittelte Immuntherapie einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige onkologische Therapien dar. Mithilfe des etablierten humanen 3D in vitro Modells konnte im Vergleich zur konventionellen Zellkultur eine natürlichere Mikroumgebung für Zellen geschaffen und die Auswirkungen der Testsubstanzen sowohl auf maligne Zellen, als auch auf die Gefäßstrukturen untersucht werden. / In Germany every year about 500,000 people contract cancer whereof about 12,000 have leukemia [1]. Among all types of leukemia, acute myeloid leukemia (AML) has the worst prognosis so that there is an increased need for research. In addition many potential therapeutic agents, which had been very promising in previous preclinical tests, subsequently performed poorly in clinical studies [8]. The aim of this work was to establish a 3D in vitro blood vessel /tissue model as an enhanced preclinical test system for therapeutic agents, which could contribute to successful treatment of leukemia. The 3D blood vessel model consists of human primary endothelial cells growing as a monolayer on the serosa site of a decellularized porcine intestinal collagen matrix (called SIS-Ser). After 14 days in cell culture non-adherent THP-1 cells (AML-M5) and Tipifarnib or control solution, or other bimolecular antibody constructs and PBMC as effector cells were added to the experimental setting. After 5 days treatment with Tipifarnib or 24 hours with antibody constructs the therapy related effects on THP-1 cells were observed by flow cytometric analysis of the model remants. For exclusion of adherent suspension cells on the matrix an anti CD-13/DAB labeling was carried out, which was negative. Damaging effects on endothelial cells were assessed by histological staining of paraffin sections. In 2D as well as in 3D tipifarnib showed equivalent dose-dependent antileukemic effects on THP-1 by flow cytometry. After application of antibody constructs only the combination of both hemibodies showed significant effects on THP-1. While having constant concentrations in 2D and 3D the antibody constructs resulted in higher apoptotic rate in 3D (58%) than in 2D (38%). In comparison to tipifarnib, the t-cell recruting antibody constructs resulted in a similar apoptotic rate in THP-1 in 2D (38% when using 500 nM tipifarnib) whereas they had higher specific effects on THP-1 in 3D by a shorter incubation period and lower concentrations (58% versus 40% after incubation with 500 nM tipifarnib). Concerning side effects, the hemibodies had no significant influence on the endothelial monolayer whereas tipifarnib/DMSO and DMSO alone led to damage in a dose-dependent manner. So highly specific hemibody- mediated immunotherapy shows a promising approach for future cancer treatment. With this human 3D in vitro model a more natural mico-environment was created for the cells in comparison to conventional cell cultures and it is was possible to investigate the anti-leukemic effects of therapeutic drugs as well as their impact on the endothelial monolayer.

Chlamydien haben ein breites Wirtsspektrum und können vielfältige Krankheitssymptome hervorrufen. Obwohl übereinstimmend angenommen wird, dass Chlamydien Fruchtbarkeitsstörungen bei der Sau verursachen, sind zahlreiche Fragen ungeklärt. So ist bisher unbekannt, ob Chlamydien die Eileiter des Schweines besiedeln und krankhafte Veränderungen hervorrufen können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Eileiter reproduktionsgestörter Sauen auf Chlamydien zu untersuchen und deren mögliche Bedeutung als Infertilitätsursache zu eruieren. Zeitgleich wurden auch Uteri beprobt und diversen differenzialdiagnostisch relevanten Analysen unterzogen. Letztlich sollte durch die Bestimmung von Zearalenon in der Galle das differenzialdiagnostische Spektrum vervollständigt werden. Insgesamt wurden die Genitalorgane von 42 reproduktionsgestörten Sauen (Jungsauen: n=14; Altsauen: n=28; wiederholte Umrausche) aus drei Betrieben auf Chlamydien untersucht. Bei 20 Sauen (Gruppe 1) wurden ein Eileiter und der Uterus, bei weiteren 22 Sauen (Gruppe 2) Ampulle, Isthmus und uterotubale Verbindung beider Eileiter und der Uterus untersucht. Genitalien acht tragender Sauen dienten als Kontrollen. Zum Nachweis von Chlamydien kamen ein kommerzieller IFT (Chlamydia Direct IF Identification) und eine nested PCR (Nachweis des MOMP) mit anschließender Sequenzierung positiver PCR-Produkte zur Anwendung. Eileiter bzw. Eileitersegmente und Uteri wurden histologisch, Uteri fortpflanzungsgestörter Sauen zudem bakteriologisch untersucht. Bei 27 Sauen erfolgte eine Bestimmung von Gesamt-Zearalenon mittels HPLC in der Gallenflüssigkeit. Die IFT- und PCR-Ergebnisse differierten erheblich. Mit dem IFT wurden wesentlich mehr positive Ergebnisse als mit der PCR generiert. Bei 30 (60 %) der insgesamt 50 untersuchten Sauen wurden Chlamydien mittels PCR nachgewiesen. In Gruppe I waren 6 (30 %) der Uteri und 7 (35 %) der Eileiter Chlamydia-positiv, während in der Gruppe II 8 (36,4 %) der Uteri und 12 (54,5 %) der Eileiter als positiv befundet wurden. Tragende Tiere wiesen jeweils 3 (37,5 %) Chlamydia-positive Uteri und Eileiter auf. Nur in einem Fall (12,8 %) konnten Chlamydien ausschließlich im Eileiter detektiert werden. Chlamydien wurden uni- oder bilateral in einem oder mehreren Eileitersegmenten ohne oder mit zeitgleicher Besiedlung des Uterus nachgewiesen. Insgesamt wurden 41 spezifische PCR-Amplifikate aus Eileitersegmenten und Uteri von 26 reproduktionsgestörten Tieren der Gruppen I und II und 4 trächtigen Sauen sequenziert. Am häufigsten wurden Chlamydophila psittaci (n = 24) und Chlamydia suis (n = 10) detektiert. Seltener waren Chlamydophila abortus (n = 4) und Chlamydia trachomatis (n = 3) festzustellen. Insgesamt wiesen 34 (89,5 %) von 38 histologisch untersuchten Uteri entzündliche Veränderungen auf, die zu 94,1 % (n=32) chronisch waren. Entzündliche Infiltrationen mit Immunzellen wurden sowohl in Ampullen (47,9 %) als auch Isthmen (22,9 %) der Eileiter beobachtet. Die Uteri enthielten überwiegend zeitgleich mehrerer Bakterien, die als fakultativ bis obligat pathogen zu beurteilen waren. E. coli dominierte (78,0%). 21 (77,8 %) Sauen wiesen ≥ 50 ng/ml Gesamtzearalenon auf und wurden als positiv bewertet. Es bestanden keine Zusammenhänge zwischen den Chlamydienbefunden und Ergebnissen der übrigen Untersuchungen. Es ist zu schlussfolgern, dass Chlamydien unterschiedlichster Spezies Uterus und Eileiter kolonialisieren. Sie sind in der Schweinepopulation vermutlich weit verbreitet. Da auch tragende Sauen Chlamydien im Genitale enthielten, muss eine Infektion nicht zwangsläufig eine In- bzw. Subfertilität verursachen, noch für zu identifizierende Faktoren vermutlich prädisponierend wirken. Chronische Entzündungen der Uteri sind ähnlich häufig wie entzündlich veränderte Eileiter zu beobachten. Eine direkte Assoziation zwischen genitaler Entzündung und Infektion mit Chlamydien war nicht nachweisbar. Entzündungen von Eileiter und Uterus sind als Sterilitätsursache vermutlich bedeutend. Ob Chlamydien strukturelle und/oder funktionelle Eileiter- und Uterusveränderungen verursachen können, bleibt ebenso wie die Risiken für den Menschen abzuklären, die durch potenziell zoonotische Chlamydien wie Chlamydophila abortus entstehen können.

Glycosylation is a biochemical process leading to the formation of glycoconjugates by linking glycans (carbohydrates) to proteins, lipids and various small molecules. The glycans are formed by one or more monosaccharides that are covalently attached, thus offering a broad variety depending on their composition, site of glycan linkage, length and ramification. This special nature provides an exceptional and fine tunable possibility in fields of information transfer, recognition, stability and pharmacokinetic. Due to their intra- and extracellular omnipresence, glycans fulfill an essential role in the regulation of different endogenous processes (e.g. hormone action, immune surveillance, inflammatory response) and act as a key element for maintenance of homeostasis. The strategy of metabolic glycoengineering enables the integration of structural similar but chemically modified monosaccharide building blocks into the natural given glycosylation pathways, thereby anchoring them in the carbohydrate architecture of de novo synthesized glycoconjugates. The available unnatural sugar molecules which are similar to endogenous sugar molecules show minimal perturbation in cell function and - based on their multitude functional groups - offer the potential of side directed coupling with a target substance/structure as well as the development of new biological properties. The chemical-enzymatic strategy of glycoengineering provides a valuable complement to genetic approaches. This thesis primarily focuses on potential fields of application for glycoengineering and its further use in clinic and research. The last section of this work outlines a genetic approach, using special Escherichia coli systems, to integrate chemically tunable amino acids into the biosynthetic pathway of proteins, enabling specific and site-directed coupling with target substances. With the genetic information of the methanogen archaea, Methanosarcina barkeri, the E. coli. system is able to insert a further amino acid, the pyrrolysine, at the ribosomal site during translation of the protein. The natural stop-codon UAG (amber codon) is used for this newly obtained proteinogenic amino acid. Chapter I describes two systems for the integration of chemically tunable monosaccharides and presents methods for characterizing these systems. Moreover, it gives a general overview of the structure as well as intended use of glycans and illustrates different glycosylation pathways. Furthermore, the strategy of metabolic glycoengineering is demonstrated. In this context, the structure of basic building blocks and the epimerization of monosaccharides during their metabolic fate are discussed. Chapter II translates the concept of metabolic glycoengineering to the extracellular network produced by fibroblasts. The incorporation of chemically modified sugar components in the matrix provides an innovative, elegant and biocompatible method for site-directed coupling of target substances. Resident cells, which are involved in the de novo synthesis of matrices, as well as isolated matrices were characterized and compared to unmodified resident cells and matrices. The natural capacity of the matrix can be extended by metabolic glycoengineering and enables the selective immobilization of a variety of therapeutic substances by combining enzymatic and bioorthogonal reaction strategies. This approach expands the natural ability of extracellular matrix (ECM), like the storage of specific growth factors and the recruitment of surface receptors along with synergistic effects of bound substances. By the selection of the cell type, the production of a wide range of different matrices is possible. Chapter III focuses on the target-oriented modification of cell surface membranes of living fibroblast and human embryonic kidney cells. Chemically modified monosaccharides are inserted by means of metabolic glycoengineering and are then presented on the cell surface. These monosaccharides can later be covalently coupled, by “strain promoted azide-alkyne cycloaddition“ (SPAAC) and/or “copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“ (CuAAC), to the target substance. Due to the toxicity of the copper catalysator in the CuAAC, cytotoxicity analyses were conducted to determine the in vivo tolerable range for the use of CuAAC on living cell systems. Finally, the efficacy of both bioorthogonal reactions was compared. Chapter IV outlines two versatile carrier – spacer – payload delivery systems based on an enzymatic cleavable linker, triggered by disease associated protease. In the selection of carrier systems (i) polyethylene glycol (PEG), a well-studied, Food and Drug Administration approved substance and very common tool to increase the pharmacokinetic properties of therapeutic agents, was chosen as a carrier for non-targeting systems and (ii) Revacept, a human glycoprotein VI antibody, was chosen as a carrier for targeting systems. The protease sensitive cleavable linker was genetically inserted into the N-terminal region of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) without jeopardizing protein activity. By exchanging the protease sensitive sequence or the therapeutic payload, both systems represent a promising and adaptable approach for establishing therapeutic systems with bioresponsive release, tailored to pre-existing conditions. In summary, by site-specific functionalization of various delivery platforms, this thesis establishes an essential cornerstone for promising strategies advancing clinical application. The outlined platforms ensure high flexibility due to exchanging single or multiple elements of the system, individually tailoring them to the respective disease or target site. / Glykosylierung beschreibt einen auf biochemischen Reaktionen basierenden Prozess, welcher durch die Verknüpfung von Glykanen (Kohlenhydraten) mit Proteinen, Lipiden oder einer Vielzahl kleiner organischer Moleküle zur Bildung von Glykokonjugaten führt. Die Entstehung der Kohlenhydratketten erfolgt hierbei durch die kovalente Verknüpfung eines oder mehrerer verschiedener Einfachzucker, welche auf Grund unterschiedlicher Zusammensetzung der Bausteine, Verknüpfungsregion, Länge und Verzweigung eine hohe Diversität aufweisen. Diese Besonderheit ermöglicht eine außergewöhnliche Feinabstimmung im Bereich der Informationsübertragung, Erkennung, Stabilität und Pharmakokinetik. Aufgrund ihrer intra- und extrazellulären Omnipräsenz spielen Glykane zudem eine essentielle Rolle in der Regulierung verschiedenster körpereigener Prozesse (z.B. hormonelle Wirkung, Immunmodulation, Entzündungsreaktionen) und sind folglich ein zentraler Bestandteil bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Durch die Strategie des „Glycoengineering“ ist man in der Lage, strukturähnliche, aber chemisch modifizierte Zuckerbausteine in die natürlichen Glykosilierungswege einzubinden und diese somit in der Architektur der Kohlenstoffketten von neu-synthetisierten Glykokonjugaten zu verankern. Die hierfür zur Verfügung stehenden, unnatürlichen Zuckermoleküle führen auf Grund ihrer Ähnlichkeit zu körpereigenen Zuckern zu kaum relevanten Störungen der zellulären Funktion, bieten aber durch zahlreiche funktionelle Gruppen die Möglichkeit der gezielten Verknüpfung mit einer Zielsubstanz/-struktur und der Bildung neuer biologischer Eigenschaften. „Glycoengineering“ als chemisch-enzymatische Strategie bietet dabei eine wertvolle Ergänzung zu gentechnischen Ansätzen. Entsprechend beschäftigt sich diese Dissertation primär mit der Beschreibung potentieller Anwendungsgebiete des „Glycoengineering“ und dessen möglichen Einsatz in Klinik und Forschung. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt einen gentechnischen Ansatz, bei dem mit Hilfe von speziellen Escherichia coli Systemen chemisch modifizierbare Aminosäuren in den Biosyntheseweg von Proteinen eingebunden werden, wodurch anschließend eine spezifische und gerichtete Verknüpfung mit Zielsubstanzen ermöglicht wird. Hierbei benutzt das E. coli-System die genetische Information des methanbildenden Archaeas, Methanosarcina barkeri, mit der es in der Lage ist, eine weitere Aminosäure, das Pyrrolysin, bei der Translation eines Proteins am Ribosom einzufügen. Als Codon für diese neu gewonnene proteinogene Aminosäure fungiert das natürliche Stopp-Codon („amber codon“) UAG. Kapitel I beschreibt zwei Systeme für den Einbau von chemisch modifizierten Zuckern und zeigt Methoden für die Charakterisierung dieser Systeme auf. Es gibt zudem eine allgemeine Übersicht über den Aufbau und die Verwendung von Glykanen und veranschaulicht verschiedene Glykosilierungswege. Des Weiteren wird auch die Strategie des „metabolic glycoengineering“ erläutert. Hierbei wird der Aufbau der dabei verwendeten Grundbausteine dargestellt und auf die Epimerisierung der Zucker während deren Metabolismus eingegangen. Kapitel II überträgt das Konzept des „metabolic glycoengineering“ auf das extrazelluläre Netzwerk von Fibroblasten. Hierbei bietet der Einbau eines chemisch modifizierten Zuckerbausteins in die Matrix eine neue, elegante und biokompatible Möglichkeit der gezielten Verknüpfung von Zielsubstanzen. Die an der Neusynthese der Matrix beteiligten Bindegewebszellen sowie die isolierte Matrix wurden dabei im Vergleich zu nicht modifizierten Bindegewebszellen und Matrices charakterisiert. Durch den Aspekt des “metabolic glycoengineering” wird die natürliche Fähigkeit der Matrix erweitert und ermöglicht durch die Kombination verschiedener enzymatischer und bioorthogonal-chemischer Strategien die selektive Immobilisation einer Vielzahl von therapeutischen Substanzen. Dieser Ansatz erweitert das natürliche Spektrum der Extrazellulärmatrix (ECM), wie Bindung von spezifischen Wachstumsfaktoren, Rekrutierung von Oberflächenrezeptoren und damit einhergehend synergistische Effekte der gebundenen Stoffe. Durch die Auswahl des Zelltyps wird zudem ein breites Spektrum an verschiedenen Matrices ermöglicht. Kapitel III befasst sich mit der Möglichkeit, die Zellmembran von lebenden Fibroblasten sowie menschliche embryonale Nierenzellen gezielt zu verändern. Durch „metabolic glycoengineering“ werden auch hier chemisch modifizierte Zuckerbausteine eingefügt, die dabei auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Anschließend können diese Zucker mittels „ringspannungs-geförderter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“strain promoted azide-alkyne cycloaddition“, SPAAC) und „Kupfer(I)-katalysierter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“, CuAAC) umgesetzt werden, was eine kovalente Verknüpfung mit einer Zielsubstanz ermöglicht. Aufgrund der Toxizität des Kupferkatalysators in der CuAAC wurde anhand von zytotoxischen Untersuchungen nach einem in vivo vertretbaren Bereich für diese Reaktion gesucht, um die CuAAC auch für lebende Systeme verwendbar zu machen. Zuletzt wurde die Effizienz dieser bioorthogonalen Reaktionen miteinander verglichen. Kapitel IV beschreibt zwei vielseitig einsetzbare „carrier – spacer – payload“ Therapiesysteme (Träger-Verbindungsstück-Therapeutikum-Systeme), basierend auf einem Verbindungsstück (Linker), dessen Spaltung enzymatisch durch krankheitsspezifisch prävalente Proteasen ausgelöst wird. Bei der Auswahl der Trägersysteme wurde für das nicht-zielgerichtete System Polyethylenglycol (PEG) als Träger eingesetzt, eine gut untersuchte, „Food and Drug Administration“ zugelassene Substanz, welche als sehr gängiges Mittel zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften verwendet wird. Für das zielgerichtete System diente Revacept als Träger, ein humaner Glykoprotein VI-Antikörper. Der Protease-sensitive Linker wurde genetisch in der N-terminalen Region des Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 verankert, ohne dabei die Bioaktivität zu gefährden. Durch den Austausch der Protease-sensitiven Erkennungssequenz oder des Therapeutikums stellen beide Systeme einen vielversprechenden und anpassungsfähigen Ansatz für therapeutische Systeme dar, welche auf ein bereits bestehendes Erkrankungsbild genau zugeschnitten werden können. Zusammengefasst setzt diese Arbeit durch eine spezifische Funktionalisierung von verschiedenen Therapiesysteme einen wichtigen Meilenstein für vielversprechende Strategien zur Verbesserung der klinischen Anwendbarkeit. Durch den Austausch einer oder mehrerer Komponenten des Systems gewährleisten die hier beschriebenen Therapiesysteme eine hohe Anpassungsfähigkeit, wodurch sie individuell auf die jeweilige Krankheit oder den jeweiligen Zielort angepasst werden können.

Immune-mediated polyneuropathies like chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy or Guillain-Barré syndrome are rare diseases of the peripheral nervous system. A subgroup of patients harbors autoantibodies against nodal or paranodal antigens, associated with a distinct phenotype and treatment response. In a part of patients with pathologic paranodal or nodal immunoreactivity the autoantigens remain difficult or impossible to determine owing to limitations of the used detection approach - usually ELISAs (enzyme-linked-immunosorbent-assays) - and incomplete knowledge of the possible autoantigens. Due to their high-throughput, low sample consumption and high sensitivity as well as the possibility to display many putative nodal and paranodal autoantigens simultaneously, peptide microarray-based approaches are prime candidates for the discovery of novel autoantigens, point-of-care diagnostics and, in addition, monitoring of pathologic autoimmune response. Current applications of peptide microarrays are however limited by high false-positive rates and the associated need for detailed follow-up studies and validation. Here, robust peptide microarray-based detection of antibodies and the efficient validation of binding signals by on-chip neutralization is demonstrated. First, autoantigens were displayed as overlapping peptide libraries in microarray format. Copies of the biochips were used for the fine mapping of antibody epitopes. Next, binding signals were validated by antibody neutralization in solution. Since neutralizing peptides are obtained in the process of microarray fabrications, neither throughput nor costs are significantly altered. Similar in-situ validation approaches could contribute to future autoantibody characterization and detection methods as well as to therapeutic research. Areas of application could be expanded to any autoimmune-mediated neurological disease as a long-term vision. / Immunvermittelte Polyneuropathien wie die chronisch-inflammatorische demyelinisierende Polyradikuloneuropathie oder das Guillain-Barré-Syndrom sind seltene Erkrankungen des peripheren Nervensystems. Bei einem Teil dieser Patienten lassen sich Autoantikörper gegen nodale oder paranodale Antigene nachweisen, was mit einem bestimmten Phänotyp und Therapienansprechen assoziiert ist. Aufgrund der Einschränkungen verwendeter Detektionsansätze – üblicherweise ELISAs (Enzyme-linked Immunosorbent Assays) – sowie der unvollständigen Kenntnis potenzieller Autoantigene bleibt es bisher zum Teil schwierig bis unmöglich bei nachgewiesener pathologischer paranodaler bzw. nodaler Immunreaktivität die entsprechenden Autoantigene zu identifizieren. Die hohe Durchsatzleistung, der geringe Verbrauch an Probenmaterial, die hohe Sensitivität sowie die Möglichkeit zahlreiche mutmaßliche nodale und paranodale Autoantigene zeitgleich darzustellen machen Peptid-Microarray-basierte Ansätze zu wesentlichen Kandidaten für die Entdeckung neuer Autoantigene, für Point-of-Care-Diagnostik und darüber hinaus für das Monitoring pathologischer Autoimmunantworten. Durch die hohe Rate falsch positiver Ergebnisse sowie die damit verbundene Notwendigkeit detaillierter Folgestudien und Validierungen sind die gegenwärtigen Anwendungen von Peptid-Microarrays jedoch limitiert. In dieser Arbeit wird eine robuste, Peptid-Microarray-basierte Detektion von Antikörpern sowie eine effiziente Validierung der Bindungssignale mittels On-chip Neutralisation demonstriert. Zuerst wurden die Autoantigene als überlappende Peptidbüchereien im Microarray-Format dargestellt. Kopien der Biochips wurden für die Feinkartierung der Antikörper-Epitope verwendet. Mittels Antikörperneutralisation in Lösung wurden die Bindungssignale anschließend validiert. Da die neutralisierenden Peptide im Microarray- Herstellungsprozess gewonnen werden, ergeben sich weder beim Durchsatz noch bei den Kosten signifikante Änderungen. Vergleichbare In-situ-Validierungsansätze könnten zu künftigen Autoantikörper Charakterisierungen, Detektionsmethoden sowie zu therapeutischen Forschungsansätzen beitragen. Als langfristige Vision könnten die Anwendungsgebiete auf jede beliebige autoimmun-vermittelte neurologische Krankheit ausgeweitet werden.

Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Korrelation zwischen der Avidität der Anti-Masern-IgG-Antikörper und deren In-Vitro-Neutralisationsfähigkeit zu untersuchen, sowie mittels Datenbankanalyse die Seroprävalenz von schützenden Antikörpern gegen Masern und den Impfstatus der Kinder- und Jugendlichen festzustellen. Die lineare Korrelation zwischen Neutralisationsfähigkeit und Avidität war in dieser Stichprobe schwach (ρ=0,240, p=0,006). Für hohe IgG Konzentrationen über 1000 mIU/ml fand sich eine mittlere Korrelation zwischen Avidität und Neutralisationstiter (ρ=0,612; p<0,001). Bei den untersuchten Jahren von 1997 bis 2013 zur Seroprävalenz (n=8611) wiesen im Durchschnitt 93,4 % der Patienten IgG-Konzentrationen im positiven Bereich (>200 mIU/ml) auf. In allen Jahrgängen lag der Anteil über 90 %. Zur Ermittlung des Impfstatus wurde eine Stichprobe 2- bis 18-Jähriger aus dem Jahr 2012 untersucht. Insgesamt hatten 81,1 % die erste Masernimpfung erhalten. Die zweite Masernimpfung erhielten noch 59,7 % der Kinder und Jugendlichen.

Trotz aller Fortschritte bei der Etablierung spezifischer Autoantikörperassays ist das Screening auf antinukleäre Antikörper (ANA) mittels indirekter Immunfluoreszenz an HEp-2-Zellen für eine qualitätsgerechte Labordiagnostik von ANA-assoziierten rheumatischen Erkrankungen (AARE) weiterhin unabdingbar. Mit den Erkenntnissen zur Relevanz von DFS-Mustern und DFS70-Antikörpern eröffnen sich neue Möglichkeiten zur Optimierung der serologischen Stufendiagnostik bei Verdacht auf AARE. Das dicht-feingranuläre („dense fine speckled“, DFS) ANA-Muster ist relativ gut von den klassischen, mit dsDNAAntikörpern assoziierten „homogenen“ ANA-Mustern differenzierbar. Die wichtigste bei diesem Muster nachweisbare ANA-Spezifität ist der DFS70-Antikörper (Synonym: LEDGFAntikörper). Dieser Antikörper ist auch die häufigste bei ANA-positiven gesunden Personen nachweisbare ANA-Spezifität. Die Prävalenz von DFS70-Antikörpern in AARE-Patienten ist signifikant niedriger im Vergleich zur Prävalenz bei ANA gesunden Personen. Es besteht eine negative Assoziation der DFS70-Antikörper mit AARE, insbesondere wenn der Antikörper nicht in Begleitung von klinisch relevanten Autoantikörpern vorliegt. Isolierte DFS70-Antikörper findet man in weniger als 1% der AARE, aber in 5%–11% bei gesunden Personen. Beim Vorliegen eines isolierten DFS70-Antikörpers verringert sich die post-Test-Wahrscheinlichkeit für eine AARE deutlich. DFS70-Antikörper sind daher wertvolle neue Biomarker zur besseren Interpretation positiver ANA bei Negativität für AARE-assoziierte Autoantikörper und sollten in modifizierte Testalgorithmen zur Vermeidung unnötiger Überweisungen und Folgeuntersuchung von ANA positiven Personen integriert werden.

Der zu den bedeutendsten Ektoparasiten des Schweines gehörende Erreger der Schweineräude, Sarcoptes scabiei var. suis, ist weltweit verbreitet und von wirtschaftlichen Interesse für Schweinezucht- und Mastbetriebe. Ziel dieser seroepidemiologischen Studie war die Gewinnung neuer Erkenntnisse über die Bestandsdynamik klinischer Räudeerscheinungen und dem Titerverlauf von IgG-Antikörpern gegen Sarcoptes scabiei var. suis im Serum von Sauen in Abhängigkeit vom Reproduktionszyklus (Trächtigkeit, Laktation, Besamung) und von Saugferkeln während der Säugeperiode sowie Aufzucht. Schlussfolgernd aufgrund der Ergebnisse dieser Studie eignen sich für die Kontrolle und Überwachung sowie Diagnostik der Sarcoptes-Räude von Beständen serologische Untersuchungen von Ferkeln bis zur zweiten Lebenswoche von räudeverdächtigen Sauen, „Jungsauen erster und zweiter Wurf“ sowie Sauen während der Trächtigkeit (vor allem letztes Drittel) und Deckeber. Eine Vorselektion auf räudeverdächtige Hautveränderungen sowie gesteigerte Kratzaktivitäten erhöht die Wahrscheinlichkeit serologisch positive Tiere zu identifizieren.