Die vorliegende Habilitationsschrift faßt publizierte Ergebnisse zum Themenschwerpunkt der Immunszintigraphie mit Antigranulozyten-Antikörpern bzw. Antikörperfragmenten zur Entzündungsdiagnostik bei Problemindikationen und zur Knochenmarkszintigraphie zusammen. In der Diagnostik der subakuten Endokarditis und der Prothesenendokarditis ermöglichen Immunszintigraphie mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper und die transösophageale Echokardiographie zusammen einen zuverlässigen Entzündungsnachweis auch bei denjenigen Patienten, bei denen jeweils eine der beiden Methoden versagt. Bei Patienten mit Fieber unbekannter Genese ist die Immunszintigraphie der Sonographie und dem CT im frühen Nachweis abdomineller Abszesse überlegen. Bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen stellt der szintigraphische Ausschluß entzündlicher Herde eine wichtige Information auf dem Weg zur Diagnose einer seronegativen Autoimmunerkrankung dar. Schließlich erlaubt die Immunszintigraphie mit differenzierter Betrachtung photopenischer Läsionen im hämopoetisch aktiven Knochenmark bei Patienten mit einer metastasierenden neoplastischen Erkrankung als Fieberursache einen frühen Nachweis maligner Knochenmarkherde. Für die Diagnostik entzündlicher Darmerkrankungen sind die immunszintigraphischen Verfahren mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper und mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment wegen bei beiden Methoden vorliegender unspezifischer Darmaktivität und fallweise beobachteter, falsch negativer Ergebnisse nicht geeignet. Bei Patienten mit Low-grade-Entzündungen der Knochen und Gelenke und vorangegangenen Gelenkoperationen weist die Immunszintigraphie mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment eine überaus hohe Sensitivität, jedoch geringe Spezifität auf. Der klinische Nutzen dieser Immunszintigraphie könnte im Nachweis oder Ausschluß einer Low-grade-Entzündung im untersuchten Gelenk bei Patienten mit rheumatoider Arthritis oder anderen, zeitgleich vorliegenden Entzündungen außerhalb des Gelenkes liegen. In der Knochenmarkdiagnostik mittels der Immunszintigraphie mit dem NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper wurde eine hoch signifikante inverse Korrelation des Uptake-Index mit dem Alter der Probanden festgestellt. Bei Patienten mit Panzytopenie war der Uptake-Index im Vergleich zum altersentsprechenden Normalkollektiv signifikant erniedrigt und wies eine hohe Trennschärfe gegenüber dem Normalbereich auf. Als Alternative zum NCA-95-Antigranulozyten-Antikörper untersuchten wir die Immunszintigraphie mit dem NCA-90-Antigranulozyten-Antikörper-Fab'-Fragment in der Knochenmarkdiagnostik. Das Verfahren gestattet jedoch nur eine qualitative, unvollständige Darstellung einiger Areale hämopoetisch aktiven Knochenmarks, während der Fab'-Knochenmark-Uptake-Index für die klinische Anwendung nicht brauchbar ist. / The present habilitation thesis summarises the author´s own published results on the thematic focus of immunoscintigraphy using antigranulocyte antibodies or antibody fragments for diagnosing infection in problematic indications and for bone marrow scintigraphy. In diagnosing subacute infective endocarditis and prosthetic valve endocarditis the combined application of both immunoscintigraphy using the NCA-95-antigranulocyte antibodies and transesophageal echocardiography reliably proves infection even in patients with negative results in one of the methods applied. In patients with fever of unknown origin immunoscintigraphy is superior to both sonography and CT in the early detection of abdominal abscesses. In patients suffering from autoimmune diseases the scintigraphic exclusion of infection is an important step towards verifying a serologically negative autoimmune disease. Finally, immunoscintigraphy with differentiated analysis of photopenic lesions in the haemopoietically active bone marrow allows an early detection of malignant marrow involvement in patients with metastasising neoplastic disease. Immunoscintigraphy with either NCA-95-antigranulocyte antibodies or NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragments is not suitable for diagnosing inflammatory bowel disease because of nonspecific bowel activity encountered in either method and because of falsely negative results observed occasionally. In patients with low-grade bone-and-joint infection and previous joint surgery immunoscintigraphy using the NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragment is highly sensitive but lacks specificity. The clinical benefit of this method might consist of proving or excluding low-grade infection in the investigated joint in patients suffering from rheumatoid arthritis or other, contemporaneous inflammation outside of the joint under investigation. In investigating bone marrow diseases with the help of immunoscintigraphy using NCA-95-antigranulocyte-antibodies a highly significant inverse correlation of the uptake index with patient age was observed. In patients with pancytopenia the uptake index was significantly lower than in an age-matched normal group and displayed a clear-cut differentiation from the normal uptake range. The NCA-90-antigranulocyte antibody Fab´-fragment was investigated as an alternative to the NCA-95-antigranulocyte-antibody in diagnosing bone marrow disease. However, this method allows just a qualitative, incomplete evaluation of certain bone marrow regions, while the Fab´ uptake index is not suitable for clinical use.

Leishmaniosen gehören zu den tropischen Krankheiten und bedrohen geschätzte 350 Millionen Menschen in 88 Ländern weltweit. Die schwerste Form, viszerale Leishmaniose, betrifft die ärmsten Bevölkerungsschichten und ist die Ursache für circa 50 000 Todesfälle pro Jahr. Es wird angenommen, dass die Entwicklung eines Impfstoffs möglich ist, aber trotz aller Bemühungen, steht derzeit noch kein Impfstoff zur Verfügung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Impfstoff gegen viszerale Leishmaniose entwickelt und in vivo auf pre-klinischer Ebene getestet. Des Weiteren wurden rekombinante Membranvesikel konstruiert, um ein Boostreagenz zu erhalten. Die Herstellung sowohl des rekombinanten Salmonellenimpfstoffs als auch der Membranvesikel sollte, trotz des geringen Handelspreis, ökonomisch praktikabel sein, was besonders wichtig ist für Menschen in den betroffenen Entwicklungsländern. Der erste Schritt war die Auswahl neuartiger Antigenkandidaten aus einem Proteomics Datensatz, in dem beide Leishmania Lebensformen verglichen wurden. Der Schwerpunkt wurde auf abundante, hypothetische Proteine gelegt, die sowohl in Pro- als auch Amastigoten identifiziert wurden, in Leishmanienarten hochkonserviert sind aber gleichzeitig keine Sequenzhomologien zu humanen und murinen Proteinen besitzen. Diese Antigene wurden in unterschiedlicher Menge auf der Oberfläche und im Cytoplasma von S. typhimurium SL3261 und auch auf Membranvesikeln exprimiert. Impfstämme wurden selektiert in Hinsicht auf ihre bakterielle Fitness und Antigenexpression. Es konnte gezeigt werden, dass LinJ08.1140-, LinJ23.0410-exprimierende Impfstämme oder eine Mischung dieser in der Lage waren besonders anfällige BALB/c Mäuse vor L. major und wichtiger L. donovani Infektion zu schützen. Analyse der humoralen Immunantwort deutet darauf hin, dass der Impfschutz das Ergbnis einer TH1 Antwort war. Erste Schritte zur Aufklärung struktureller und funktioneller Eigenschaften von LinJ08.1140 wurden unternommen. Es wird allgemein angenommen, dass antigenspezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen am Schutz beteiligt sind. Daher wurde für LinJ08.1140 potentielle MHC-I Epitope mit Hilfe von bioinformatischen Programmen vorhergesagt. Zusätzlich deuten Fluoreszenz-färbungen mit antigenspezifischen Antikörpern in L. major Promastigoten darauf hin, dass LinJ08.1140 eine Rolle bei der Zellteilung spielt. / Leishmaniasis is a neglected tropical disease and currently an estimated 350 million people in 88 countries around the world are at risk. Its most severe form, visceral leishmaniasis, affects the poorest people in a population and causes an estimated 50 000 deaths every year. Vaccination is thought to be feasible but despite all efforts, no vaccine is yet available. Vaccines will mainly be targeted for people in developing countries such as India, thus focus has to be placed on affordability. In this thesis a vaccine against visceral leishmaniasis was designed and evaluated in vivo at pre-clinical level. Furthermore, recombinant outer membrane vesicles were developed in an attempt to create a booster reagent. Both, the recombinant salmonella vaccine and the preparation of outer membrane vesicles should be commercially viable, and can still be sold at low prices, which is crucial for people in developing countries. First, novel antigen candidates were selected using proteomics data comparing leishmania life stages. Abundant and hypothetic proteins, which have been identified in both parasite life stages and have high sequence homology throughout Leishmania species while lacking homologues in human and mouse, were selected. These antigens were differentially expressed on the surface or in the cytosol of S. typhimurium SL3261 and in the form of outer membrane vesicles. A two step procedure was developed to select optimised vaccine strains based on bacterial fitness and antigen expression. Selected salmonella strains expressing LinJ08.1140, LinJ23.0410 or an admixture of these strains are shown to protect susceptible BALB/c mice by reducing visceralisation of L. major and more importantly L. donovani infections. Analysis of vaccine specific antibody responses suggests that protection resulted from induction of a TH1 response. First steps were undertaken towards resolving functional and structural properties of the most protective antigen LinJ08.1140. Putative MHC-I epitopes of antigen LinJ08.1140 were predicted using bioinformatics since antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells are believed to be required. In addition, immunofluorescent staining of LinJ08.1140 in L. major promastigotes suggested a functional role for this antigen in parasite cell division, since especially dividing cells emmited a strong fluorescence signal.

Rituximab (IDEC C2B8) ist ein chimärer monoklonaler Antikörper, der gegen das CD20-Antigen auf B-Lymphozyten gerichtet ist. In klinischen Studien konnten Ansprechraten von 50 Prozent bei Patienten mit niedrigmalignen NHL erzielt werden [61, 62]. Bei den hochmalignen NHL waren die Ansprechraten geringer, doch auch hier konnte eine therapeutische Wirksamkeit von Rituximab nachgewiesen werden [108]. Der genaue Wirkungsmechanismus, durch welchen Rituximab seinen therapeutischen Effekt erzielt, ist weiterhin nicht vollständig geklärt. Hauptsächlich werden dabei Apoptose, Komplement-vermittelte zelluläre Zytotoxizität (CDC) und die Antikörper-vermittelte Zytotoxizität (ADCC) diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro die Proliferationsinhibition und die Komplement-vermittelte zelluläre Zytotoxizität durch Rituximab an verschiedenen humanen B-Zellinien geprüft. Anschließend wurde die in vivo-Komplementaktivierung während einer Rituximab-Infusion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Rituximab in vitro eine unterschiedliche Wirksamkeit bei verschiedenen Lymphomzellinien aufweist. Durch Zugabe von humanem Komplement konnte bei zwei Zellinien eine Rituximab-induzierte CDC beobachtet werden. Bei sechs von zehn Patienten mit unterschiedlichen NHL wurde in vivo ein Anstieg der C3a-desArg-Konzentration im Plasma beobachtet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das Komplementsystem ein wichtiger Mechanismus für die Wirkung von Rituximab zu sein scheint. Die klinischen Erfolge sind viel versprechend, zeigen jedoch auch, dass der therapeutische Nutzen von Rituximab als Monotherapie begrenzt ist. Derzeit laufende prospektive Studien untersuchen die Wirksamkeit von Rituximab in Kombination mit verschiedenen Chemotherapeutika [106, 107]. Erste Ergebnisse sind viel versprechend, doch es bleibt abzuwarten, ob sich diese Ergebnisse auch langfristig in einer Verbesserung der Überlebensrate widerspiegeln. / The chimeric anti-CD20 monoclonal antibody rituximab is a new therapeutic tool for treatment of relapsed B-cell lymphomas. Because rituximab mediates complement-dependent cellular cytotoxicity (CDCC) and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) in the lymphoblastoid cell line SB, it is suggested, that these two mechanisms are responsible for the in vivo antilymphoma effect. We tested the antiproliferative effect of rituximab in 6 CD20 positive human B cell lymphoma cell lines. In the follicular lymphoma cell line, DOHH-2, 1 µg/ml rituximab induces an inhibition of proliferation of 75.5 % (n=5), and in the diffuse large cell lymphoma cell line, Daudi, an inhibition of proliferation of 27.3 % (n=5). No effect was seen in the prelymphocytic leukemia cell line, JVM-2, the hairy cell leukemia cell line, Bonna-12, or the two high-grade lymphoma cell lines, Granta-519 and Raji. To test, whether complement increases the effect of rituximab, we studied the combination of rituximab plus complement. Guinea pig complement (dilution 1:10) increases the inhibitory effect of rituximab on the proliferation of Daudi cells. The degradation product C3a(desArg) is produced during complement cascade activation and could be used as a sensitive and specific marker of complement activation in vivo. So, we measured plasma C3a(desArg) concentration in two CLL patients receiving rituximab monotherapy. In one patient, no increase of plasma C3a(desArg) concentration could be measured during infusion of rituximab. In the other patient, in two treatment cycles C3a(desArg) increases drastically after 2 h of rituximab infusion. We conclude differential in vitro and in vivo effects of rituximab on CD20 positive lymphoma cells. Rituximab inhibits in vitro the proliferation of follicular and diffuse large cell lymphoma cells, which could be amplified by complement in Daudi cells. Furthermore, rituximab mediates in vivo complement cascade activation, highly suggestive of in vivo CDCC.

Die beständige Autoantikörperproduktion in Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes (SLE) suggeriert die Existenz eines autoreaktiven humoralen Gedächtnisses; die Häufigkeit selbstreaktiver Gedächtnis-B-Zellen in SLE wurde jedoch noch nicht ermittelt. Unter normalen Umständen exprimieren neu gebildete B-Zellen im Knochenmark Autoantikörper mit hoher Frequenz, darunter auch antinukleäre Antikörper. Diese autoreaktiven B Zellen unterliegen einer strengen Überwachung an zwei Kontrollpunkten für Selbsttoleranz, einer im Knochenmark und einer in der Peripherie. Im Gegensatz dazu steht SLE mit einem Defekt in Zusammenhang, der die Etablierung von B-Zell-Toleranz an diesen beiden Kontrollpunkten verhindert und somit einer hohe Anzahl selbstreaktiver naiver B-Zellen in der Peripherie. Das Ziel dieser Studie war die Bestimmung der molekularen Eigenschaften und Reaktivitäten von IgG Gedächtnis-B-Zell-Antikörpern in SLE. Mittels einer Einzelzell-PCR basierten Methode wurden 200 monoklonale Antikörper von einzelnen IgG+ Gedächtnis-B-Zellen vier unbehandelter SLE Patienten kloniert. Die generelle Häufigkeit an polyreaktiven und HEp-2 selbstreaktiven Antikörpern in dieser Population war vergleichbar mit der in gesunden Vergleichspersonen. 15% der Antikörper aus IgG+ Gedächtnis-B-Zellen eines Patienten mit Serum-Autoantikörpertitern derselben Spezifität waren hochreaktiv und spezifisch gegen die SLE-assoziierten löslichen Kernantigene Ro52 und La; nicht jedoch in den übrigen drei Patienten oder gesunden Vergleichspersonen. Die Keimbahnkonfigurationen dieser Antikörper gegen Kernantigen waren nicht-selbstreaktiv oder polyreaktiv mit schwacher Ro52-Bindung und untermauern die Theorie, dass somatische Mutationen zur Reaktivität und Spezifität von Autoantikörpern beitragen. Die Häufigkeitsvarianz, mit der Gedächtnis-B-Zellen SLE-assoziierte Antikörper exprimieren, legt nahe, dass dies eine wichtig Variable für den Erfolg von Therapien sein kann, die diese Population beseitigen. / Persistent autoantibody production in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) suggests the existence of autoreactive humoral immunological memory, but the frequency of self-reactive memory B cells in SLE has not been determined. Under normal circumstances, autoantibodies including antinuclear antibodies (ANAs) are frequently expressed by newly generated B cells in the bone marrow, but these autoreactive B cells are tightly regulated at two checkpoints for self-tolerance, in the bone marrow and the periphery, before maturation into naïve immunocompetent B cells. In contrast, SLE is associated with a failure to establish B cell tolerance at the two checkpoints leading to high numbers of autoreactive naïve B cells in the periphery. The aim of this study was to determine the molecular features and reactivities of IgG memory B cell antibodies expressed in SLE. A single-cell PCR based strategy was applied that allowed the cloning of the Ig heavy and Ig light chain genes of a single purified B cell and the in vitro expression of 200 recombinant monoclonal antibod-ies from single IgG+ memory B cells of four untreated SLE patients. The overall frequency of polyreactive and HEp-2 self-reactive antibodies in this compartment was similar to healthy controls (HC). 15% of IgG memory B cell antibodies were highly reactive and specific for SLE-associated extractable nuclear antigens (ENAs) Ro52 and La in one patient with serum autoantibody titers of the same specificity but not in the other three patients or healthy individuals. The germline forms of the ENA antibodies were non-self-reactive or polyreactive with low binding to Ro52 supporting the idea that somatic mutations contribute to autoantibody specificity and reactivity. Heterogeneity in the frequency of memory B cells expressing SLE-associated autoantibodies suggests that this variable may be important in the outcome of therapies that ablate this compartment.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Analytik eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch auf Cisplatin-behandelte DNA reagiert und bereits routinemäßig zu diagnostischen Zwecken bei der Krebstherapie mit ebendiesem Zytostatikum eingesetzt wird. Zu diesem Zweck wurden vor allem massenspektrometrische Methoden eingesetzt, um einerseits den genauen Aufbau sowie die Zusammensetzung des Antikörpers zu untersuchen und andererseits die Antigenspezifität einer genaueren Betrachtung zu unterziehen. Mit Hilfe von nano-ESI-MS konnte der Antikörper unter Erhalt der nativen Struktur in der Gasphase analysiert werden. Tandem-MS-Experimente lieferten nicht nur einen Einblick in typische Fragmentierungs-muster, sondern generierten z. T. auch Informationen über die Primärsequenz einiger Bereiche des Antikörpers. Die im Fc-Teil gebundenen Glycanstrukturen, die sowohl für die Struktur als auch die Funktionalität des Antikörpers eine entscheidende Rolle spielen, wurden nach enzymatischer Abspaltung separat mit Hilfe von MALDI-MS analysiert. Die vollständige Antikörpersequenz wurde durch proteolytische Spaltung des Antikörpers, Analytik mittels hochaufgelöster Tandem-MS und anschließendem Vergleich mit Daten aus der Sequenzierung auf DNA-Ebene bzw. bekannten Antikörpersequenzen aus Proteindatenbanken aufgeklärt. Im selben Zug konnten auf Peptidebene eine Vielzahl verschiedener posttranslationaler Modifikationen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Antikörper unter Erhalt seiner Struktur und der antigenbindenden Eigenschaften an den Zuckerstrukturen mit einem eigens synthetisierten Metallkomplex markiert werden kann. Die für die Spezifitätsstudie des Antikörpers notwendigen Antigene wurden durch Inkubation synthetischer einzel- und doppelsträngiger DNA-Oligomere mit Cisplatin erzeugt und analysiert. Anschließend wurden die verschiedenen Antikörper-Antigen-Komplexe unter nativen Bedingungen hergestellt und massenspektrometrisch charakterisiert. Um einen Eindruck von der Komplexstabilität zu erhalten wurden zusätzlich MS/MS-Untersuchungen des Komplexes mit der platinierten doppelsträngigen DNA durchgeführt. Wie bei der Analytik des freien Antikörpers konnten auch hier spezifische Fragmente detektiert werden. / The focus of the thesis was the characterization of a monoclonal antibody, which binds specifically to cisplatin-treated DNA and is already used for diagnostic purposes in cancer therapy. The structure and composition of the antibody, as well, as the antigen specificity were investigated by mass spectrometry. Using nano-ESI-MS it was possible to analyse the antibody in its native state. Tandem-MS experiments revealed not only specific antibody fragments but also gave information on the primary structure of the antibody. The Fc-bound glycans that are responsible for antibody structure and functionality, were cleaved enzymatically and studied with MALDI-MS. For a detailed determination of the primary structure, the antibody was proteolysed with different enzymes and analyzed via high resolution Tandem-MS. The data was evaluated by comparism with results from sequence analysis on DNA level and known antibody sequences from protein databases. Simultaneously many different posttranslational modifications were identified. Furthermore, the antibody was successfully labelled with a metal complex at its sugar structures without loss of its structure and function. For investigation of the antibody specificity antigens were generated by incubation of well-defined single and double stranded DNA oligomers with cisplatin. Antibody-antigen-complexes were synthesized and analyzed by mass spectrometry under native conditions. The stability of the complex with double stranded DNA was also investigated by MS/MS-experiments. Thus, it was also possible to determine the specific fragmentation behavior for the complex just as for the free antibody.

Mitochondria are an attractive target for the design of cancer therapy. One of the mechanisms by which chemotherapeutics destroy cancer cells is by inducing apoptosis through extrinsic or intrinsic apoptotic pathways. Extrinsic pathways target cell surface receptors whilst intrinsic pathways target mitochondria. Several studies have shown cancer cell destruction through the extrinsic pathways, which target cancer-specific overexpressed growth factor receptors on the cell membrane. Although the mitochondria dependent apoptotic process is well understood, its application in cancer therapy is still not well developed. Therefore, to design an effective cancer therapy targeting mitochondria, a good understanding in mitochondria dependent apoptotic process is required. Recent developments in nanotechnology have enabled live cell investigations and non-destructive methods to obtain cellular information. The availability of such information would assist to design methods of targeted apoptosis induction. In view of this, I report on studies towards development of cancer therapy where nanoparticles (NPs) were targeted to human cell mitochondria for two purposes: (a) development of cell-imaging tools to investigate the fundamental cell biological pathways inside cells and (b) induction of apoptosis by targeting nanoparticles to mitochondria. Current medical and biological fluorescent imaging methods are mainly based on dye markers, which are limited in light emission per molecule, as well as photostability. Consequently, NPs are gaining prominence for molecular imaging because of their strong and stable fluorescence. Additionally, in order to get insight of mitochondrial molecular information, I investigated the use of optical properties of gold nanoparticles (Au NPs) for surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). In this study, two types of Au NPs - nanospheres (Au NS) and nanorods (Au NR) were investigated. Results from this study showed the enhancement effect of Au NPs in Raman spectra of mitochondria, especially in the region from 1500 to 1600 cm-1. In this region, normal Raman spectra of mitochondria showed the presence of some understated Raman peaks probably due to the excitation wavelength dependence. Au NRs showed a larger enhancement effect than Au NS with respect to the penetration depth of the plasmonic nearfield enhancement effect. Although, the details of the enhancement mechanism are beyond the current studies, Au NPs could be enhancing vibrations of aromatic residues in proteins. This study therefore showed that Au NPs could enhance Raman spectra of mitochondria and in addition the shape of the nanoparticles had a significant effect on SERS spectra. In living cells, I investigated some transfection methods and targeting of NPs to mitochondria or cytosolic actin subunits. I tested the performance of three transfection reagents to deliver nanodiamonds (NDs) into living cells. Antibody functionalized NDs were targeted to mitochondria or cytosolic actin subunits. Three transfection reagents were used: cationic liposomes PULSin™, the cell penetrating peptide protamine, and oligosaccharide modified polypropylene imine (PPI) dendrimers. Fluorescence imaging results revealed that dendrimers were the most efficient in delivering ND conjugates to targeted organelles. Protamine-mediated transfections appeared to target ND conjugates to intended organelles, although there was a tendency of unfunctionalized NDs to be directed to the nucleus. PULSin™-mediated transfection formed ND aggregates regardless of the functionalization moiety. This reflected the unsuitability of the cationic liposome to mediate ND transfections. Further, I investigated the potential use of Au NPs for cell imaging and photothermal lysis of mitochondria inside cells. Just as above, I also tested the performance of the three-transfection reagents mentioned above on transfection capacity of Au NPs into living cells. Using transmission electron microscopy (TEM), oligosaccharide modified dendrimers showed the best transfection of functionalized Au NPs. Further experiments explored the use of the nearfield enhancement effect of Au NPs in combination with low-level laser irradiation (LLLI) to induce apoptosis in living cells. Analysis of the apoptotic process using cytochrome c release showed that Au NPs induced apoptosis most probably through mechanical disruption of the outer mitochondrial membrane. However, apoptosis was significantly accelerated in cells with mitochondrially targeted Au NRs than in cells without Au NRs. This study showed successful targeting of Au NPs to mitochondria in living cells, and demonstrated the potential of using Au NPs in combination with laser irradiation to induce the mitochondria dependent apoptotic pathway. In conclusion, the potential use of Au NPs in SERS of mitochondria and the application of NDs for cell imaging of intracellular organelles were demonstrated. Lastly, Au NPs were targeted to mitochondria in living cells and could induce apoptosis due to mechanical disruption of the outer mitochondrial membrane. Consequently, application of low-level laser irradiation to Au NP transfected cells accelerated the apoptotic process.

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Molecular and functional analysis of small molecule binding to protein can provoke insights into cellular signaling and regulatory systems as well as facilitate pharmaceutical drug discovery. In label free small molecule detection the displacement assay format can be applied. This assay format comprises the displacement of receptor molecules bond to immobilized ligand by a competition reaction with ligand in solution. This is beneficial because displacement of high molecular receptors is detected compared to low molecular ligand as in classical binding analysis therefore potentially lowering the method detection limit. It was hypothesized that with choosing appropriate measuring methods and theoretical modeling reaction rate constants can be determined separately in every kinetic stage of the assay format. Herein elucidating the dominant valence of antibody antigen binding in the established assay was of great importance. Using the Influenza Hemagglutinin (HA) peptid binding to mono or bivalent Anti-Hemagglutinin peptide antibody displacement assay formats could be established. The exact time resolved analysis of binding and dissolution of ligand HA and Anti-Hemagglutinin peptide antibody was achieved with surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. Mathematical models could be developed from kinetic equations of ligand binding to mono or bivalent antibody. With this, an accurate simulation of the SPR results was reached. The simulation plot had to be exactly adjusted to the SPR results to determine all kinetic rate constants defining ligand and receptor binding kinetics. Large variations in receptor concentration gave almost identical rate constants in binding; this proves the quality of SPR measurements and demonstrates consistence between measurement, simulation, and binding model. Maximum decline of SPR response could be used to determine ligand concentrations in analyte. Displacement dependence from antigen concentration was found to be exponential and was explained by rebinding. Kinetic data and models could be transferred for the simulation of almost stationary displacement assay formats realized with impedance and fluorescence spectroscopy. With the obtained results it was possible to detect the displacement of the bacterial signaling autoinducer AI-2 by a displacement assay format using periplasmic binding protein LuxP as receptor. Concluding it can be said that the hypothesis could be proved and the obtained results can facilitate the use of displacement assay formats in biosensing. Displacement assay formats should be especially interesting in small molecule detection and in compact integrated mass sensitive sensor designs suitable as mobile sensors in outdoor screening. / Die Analyse des Bindungsverhaltens niedermolekularer Liganden an Proteine ist für die Aufklärung von biologischen Regulationssystemen oder bei der Suche neuer medizinischer Wirkstoffe von Wichtigkeit. Ein markierungsfreies Detektions¬prinzip zur Erfassung niedermolekularer Liganden ist die Displacement- oder Replacement-Methode. Bei dieser tritt die Bindung des Rezeptors an den immobilisierten Liganden mit der Bindung an freien Liganden in Konkurrenz, sodass anstelle der niedermolekularen Liganden die hochmolekularen Rezeptoren detektiert werden können. In dieser Arbeit wurde von der Hypothese ausgegangen, dass durch die Auswahl geeigneter Messverfahren und der zugeordneten Modellierung die einzelnen kinetischen Stadien des Displacements separat zur Bestimmung der kinetischen Konstanten der Displacementprozesse genutzt werden können. Dabei sollte unter anderem auch eine Aussage über die dominierende Valenz der Antigen-Antikörper-Bindung erreicht werden. Hierzu wurden auf der Basis des Modellsystems Hämagglutinin-Peptid/ Hämagglutinin-Antikörper Displacement-Assays mit mono- und bivalenten Anti-körpern entwickelt, anhand derer eine genaue zeitaufgelöste Analyse des Bindungs- und Ablösungsverhaltens vom Liganden HA an den Anti-HA-Antikörper (Rezeptor) mittels Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Spektroskopie erzielt wurde. Ausgehend von den Reaktionsgleichungen zwischen Liganden und mono- und bivalenten Rezeptoren wurden mathematische Modelle entwickelt, die eine exakte Simulation der SPR-Ergebnisse ermöglichten. Durch genaues Anpassen der Simulationsplots an die Messplots konnten alle Ratenkonstanten, die die Kinetik der Reaktionen zwischen Liganden, Rezeptoren und ihren Komplexen bestimmen, ermittelt werden. Da auch für eine große Variation der Rezeptorkonzentrationen in der Analytlösung nahezu identische Werte für die Ratenkonstanten erhalten wurden, ergeben Messungen und Simulationen ein konsistentes Bild der Anbindungskinetik und bestätigen die Qualität der Messungen. Aus Messungen des maximalen Responsabfalles kann die Konzentration der freien Antigene beim Displacement ermittelt werden. Man findet eine exponentielle Abhängigkeit des Displacements von der Konzentration der freien Antigene, die sich durch den sogenannten „Rebindingeffekt“ erklären lässt. Die gewonnenen kinetischen Daten und entwickelten Modellierungsverfahren konnten zur Simulation quasistationärer Detektionsverfahren, die mit Fluoreszenz- und Impedanzspektroskopie durchgeführt wurden, erfolgreich angewandt werden. Die erzielten Erkenntnisse konnten auf ein wissenschaftlich herausforderndes biologisches System (LuxP/AI2) angewandt werden, bei dem das niedermolekulare Signalmolekül AI2 über ein Displacementassay detektiert wurde. Dieses System ermöglicht einen Einblick in die Intra- und Interspezieskommunikation bei Bakterien. Insgesamt zeigt sich, dass die hier formulierte Hypothese als bewiesen angesehen werden kann. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen verschiedene Einsätze der Displacementmethode in der Biosensorik. Insbesondere lassen sich damit kleine Moleküle markierungsfrei quantitativ bestimmen, ohne hoch präzise Analysengeräte einsetzen zu müssen. Damit ergibt sich die Möglichkeit, sehr kompakte integrierte massensensitive Sensoren, die nicht die Empfindlichkeit hochempfindlicher SPR-Spektrometer erreichen, zur Detektion kleiner Moleküle einzusetzen. Dies ist besonders für mobile Anwendungen von Interesse.

Molecular and functional analysis of small molecule binding to protein can provoke insights into cellular signaling and regulatory systems as well as facilitate pharmaceutical drug discovery. In label free small molecule detection the displacement assay format can be applied. This assay format comprises the displacement of receptor molecules bond to immobilized ligand by a competition reaction with ligand in solution. This is beneficial because displacement of high molecular receptors is detected compared to low molecular ligand as in classical binding analysis therefore potentially lowering the method detection limit. It was hypothesized that with choosing appropriate measuring methods and theoretical modeling reaction rate constants can be determined separately in every kinetic stage of the assay format. Herein elucidating the dominant valence of antibody antigen binding in the established assay was of great importance. Using the Influenza Hemagglutinin (HA) peptid binding to mono or bivalent Anti-Hemagglutinin peptide antibody displacement assay formats could be established. The exact time resolved analysis of binding and dissolution of ligand HA and Anti-Hemagglutinin peptide antibody was achieved with surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. Mathematical models could be developed from kinetic equations of ligand binding to mono or bivalent antibody. With this, an accurate simulation of the SPR results was reached. The simulation plot had to be exactly adjusted to the SPR results to determine all kinetic rate constants defining ligand and receptor binding kinetics. Large variations in receptor concentration gave almost identical rate constants in binding; this proves the quality of SPR measurements and demonstrates consistence between measurement, simulation, and binding model. Maximum decline of SPR response could be used to determine ligand concentrations in analyte. Displacement dependence from antigen concentration was found to be exponential and was explained by rebinding. Kinetic data and models could be transferred for the simulation of almost stationary displacement assay formats realized with impedance and fluorescence spectroscopy. With the obtained results it was possible to detect the displacement of the bacterial signaling autoinducer AI-2 by a displacement assay format using periplasmic binding protein LuxP as receptor. Concluding it can be said that the hypothesis could be proved and the obtained results can facilitate the use of displacement assay formats in biosensing. Displacement assay formats should be especially interesting in small molecule detection and in compact integrated mass sensitive sensor designs suitable as mobile sensors in outdoor screening.:Zusammenfassung i Summery iii Inhaltsverzeichnis v 1. Problemstellung 1 2. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit monovalenten Antikörpern 5 2.1 Kinetisches Modell 6 2.1.1 Grundgleichungen 6 2.1.2 Analytische Näherungslösung 8 2.1.3 Numerische Lösung 10 2.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 18 2.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 18 2.2.2 Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 36 2.2.3 Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 52 3. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit bivalenten Antikörpern 70 3.1 Kinetisches Modell 70 3.1.1 Grundgleichungen 70 3.1.2 Numerische Lösung 72 3.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 80 3.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 80 3.2.2 Impedanzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 88 4. Konklusionen und Ausblick 92 5. Anhänge 98 A1: Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie 98 A2: Aufbau der Messschichten und Messreihen eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 105 A3: Schichtaufbau zur Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 119 A4: Aufbau zur Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 125 A5: Impedanzspektroskopie 128 A6: Transferratenkonstanten 139 A7: Abkürzungsverzeichnis 141 6. Literatur 146 7. Danksagung 155 8. Selbständigkeitserklärung 157 / Die Analyse des Bindungsverhaltens niedermolekularer Liganden an Proteine ist für die Aufklärung von biologischen Regulationssystemen oder bei der Suche neuer medizinischer Wirkstoffe von Wichtigkeit. Ein markierungsfreies Detektions¬prinzip zur Erfassung niedermolekularer Liganden ist die Displacement- oder Replacement-Methode. Bei dieser tritt die Bindung des Rezeptors an den immobilisierten Liganden mit der Bindung an freien Liganden in Konkurrenz, sodass anstelle der niedermolekularen Liganden die hochmolekularen Rezeptoren detektiert werden können. In dieser Arbeit wurde von der Hypothese ausgegangen, dass durch die Auswahl geeigneter Messverfahren und der zugeordneten Modellierung die einzelnen kinetischen Stadien des Displacements separat zur Bestimmung der kinetischen Konstanten der Displacementprozesse genutzt werden können. Dabei sollte unter anderem auch eine Aussage über die dominierende Valenz der Antigen-Antikörper-Bindung erreicht werden. Hierzu wurden auf der Basis des Modellsystems Hämagglutinin-Peptid/ Hämagglutinin-Antikörper Displacement-Assays mit mono- und bivalenten Anti-körpern entwickelt, anhand derer eine genaue zeitaufgelöste Analyse des Bindungs- und Ablösungsverhaltens vom Liganden HA an den Anti-HA-Antikörper (Rezeptor) mittels Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Spektroskopie erzielt wurde. Ausgehend von den Reaktionsgleichungen zwischen Liganden und mono- und bivalenten Rezeptoren wurden mathematische Modelle entwickelt, die eine exakte Simulation der SPR-Ergebnisse ermöglichten. Durch genaues Anpassen der Simulationsplots an die Messplots konnten alle Ratenkonstanten, die die Kinetik der Reaktionen zwischen Liganden, Rezeptoren und ihren Komplexen bestimmen, ermittelt werden. Da auch für eine große Variation der Rezeptorkonzentrationen in der Analytlösung nahezu identische Werte für die Ratenkonstanten erhalten wurden, ergeben Messungen und Simulationen ein konsistentes Bild der Anbindungskinetik und bestätigen die Qualität der Messungen. Aus Messungen des maximalen Responsabfalles kann die Konzentration der freien Antigene beim Displacement ermittelt werden. Man findet eine exponentielle Abhängigkeit des Displacements von der Konzentration der freien Antigene, die sich durch den sogenannten „Rebindingeffekt“ erklären lässt. Die gewonnenen kinetischen Daten und entwickelten Modellierungsverfahren konnten zur Simulation quasistationärer Detektionsverfahren, die mit Fluoreszenz- und Impedanzspektroskopie durchgeführt wurden, erfolgreich angewandt werden. Die erzielten Erkenntnisse konnten auf ein wissenschaftlich herausforderndes biologisches System (LuxP/AI2) angewandt werden, bei dem das niedermolekulare Signalmolekül AI2 über ein Displacementassay detektiert wurde. Dieses System ermöglicht einen Einblick in die Intra- und Interspezieskommunikation bei Bakterien. Insgesamt zeigt sich, dass die hier formulierte Hypothese als bewiesen angesehen werden kann. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen verschiedene Einsätze der Displacementmethode in der Biosensorik. Insbesondere lassen sich damit kleine Moleküle markierungsfrei quantitativ bestimmen, ohne hoch präzise Analysengeräte einsetzen zu müssen. Damit ergibt sich die Möglichkeit, sehr kompakte integrierte massensensitive Sensoren, die nicht die Empfindlichkeit hochempfindlicher SPR-Spektrometer erreichen, zur Detektion kleiner Moleküle einzusetzen. Dies ist besonders für mobile Anwendungen von Interesse.:Zusammenfassung i Summery iii Inhaltsverzeichnis v 1. Problemstellung 1 2. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit monovalenten Antikörpern 5 2.1 Kinetisches Modell 6 2.1.1 Grundgleichungen 6 2.1.2 Analytische Näherungslösung 8 2.1.3 Numerische Lösung 10 2.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 18 2.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 18 2.2.2 Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 36 2.2.3 Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 52 3. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit bivalenten Antikörpern 70 3.1 Kinetisches Modell 70 3.1.1 Grundgleichungen 70 3.1.2 Numerische Lösung 72 3.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 80 3.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 80 3.2.2 Impedanzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 88 4. Konklusionen und Ausblick 92 5. Anhänge 98 A1: Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie 98 A2: Aufbau der Messschichten und Messreihen eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 105 A3: Schichtaufbau zur Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 119 A4: Aufbau zur Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 125 A5: Impedanzspektroskopie 128 A6: Transferratenkonstanten 139 A7: Abkürzungsverzeichnis 141 6. Literatur 146 7. Danksagung 155 8. Selbständigkeitserklärung 157

Mitochondria are an attractive target for the design of cancer therapy. One of the mechanisms by which chemotherapeutics destroy cancer cells is by inducing apoptosis through extrinsic or intrinsic apoptotic pathways. Extrinsic pathways target cell surface receptors whilst intrinsic pathways target mitochondria. Several studies have shown cancer cell destruction through the extrinsic pathways, which target cancer-specific overexpressed growth factor receptors on the cell membrane. Although the mitochondria dependent apoptotic process is well understood, its application in cancer therapy is still not well developed. Therefore, to design an effective cancer therapy targeting mitochondria, a good understanding in mitochondria dependent apoptotic process is required. Recent developments in nanotechnology have enabled live cell investigations and non-destructive methods to obtain cellular information. The availability of such information would assist to design methods of targeted apoptosis induction. In view of this, I report on studies towards development of cancer therapy where nanoparticles (NPs) were targeted to human cell mitochondria for two purposes: (a) development of cell-imaging tools to investigate the fundamental cell biological pathways inside cells and (b) induction of apoptosis by targeting nanoparticles to mitochondria. Current medical and biological fluorescent imaging methods are mainly based on dye markers, which are limited in light emission per molecule, as well as photostability. Consequently, NPs are gaining prominence for molecular imaging because of their strong and stable fluorescence. Additionally, in order to get insight of mitochondrial molecular information, I investigated the use of optical properties of gold nanoparticles (Au NPs) for surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). In this study, two types of Au NPs - nanospheres (Au NS) and nanorods (Au NR) were investigated. Results from this study showed the enhancement effect of Au NPs in Raman spectra of mitochondria, especially in the region from 1500 to 1600 cm-1. In this region, normal Raman spectra of mitochondria showed the presence of some understated Raman peaks probably due to the excitation wavelength dependence. Au NRs showed a larger enhancement effect than Au NS with respect to the penetration depth of the plasmonic nearfield enhancement effect. Although, the details of the enhancement mechanism are beyond the current studies, Au NPs could be enhancing vibrations of aromatic residues in proteins. This study therefore showed that Au NPs could enhance Raman spectra of mitochondria and in addition the shape of the nanoparticles had a significant effect on SERS spectra. In living cells, I investigated some transfection methods and targeting of NPs to mitochondria or cytosolic actin subunits. I tested the performance of three transfection reagents to deliver nanodiamonds (NDs) into living cells. Antibody functionalized NDs were targeted to mitochondria or cytosolic actin subunits. Three transfection reagents were used: cationic liposomes PULSin™, the cell penetrating peptide protamine, and oligosaccharide modified polypropylene imine (PPI) dendrimers. Fluorescence imaging results revealed that dendrimers were the most efficient in delivering ND conjugates to targeted organelles. Protamine-mediated transfections appeared to target ND conjugates to intended organelles, although there was a tendency of unfunctionalized NDs to be directed to the nucleus. PULSin™-mediated transfection formed ND aggregates regardless of the functionalization moiety. This reflected the unsuitability of the cationic liposome to mediate ND transfections. Further, I investigated the potential use of Au NPs for cell imaging and photothermal lysis of mitochondria inside cells. Just as above, I also tested the performance of the three-transfection reagents mentioned above on transfection capacity of Au NPs into living cells. Using transmission electron microscopy (TEM), oligosaccharide modified dendrimers showed the best transfection of functionalized Au NPs. Further experiments explored the use of the nearfield enhancement effect of Au NPs in combination with low-level laser irradiation (LLLI) to induce apoptosis in living cells. Analysis of the apoptotic process using cytochrome c release showed that Au NPs induced apoptosis most probably through mechanical disruption of the outer mitochondrial membrane. However, apoptosis was significantly accelerated in cells with mitochondrially targeted Au NRs than in cells without Au NRs. This study showed successful targeting of Au NPs to mitochondria in living cells, and demonstrated the potential of using Au NPs in combination with laser irradiation to induce the mitochondria dependent apoptotic pathway. In conclusion, the potential use of Au NPs in SERS of mitochondria and the application of NDs for cell imaging of intracellular organelles were demonstrated. Lastly, Au NPs were targeted to mitochondria in living cells and could induce apoptosis due to mechanical disruption of the outer mitochondrial membrane. Consequently, application of low-level laser irradiation to Au NP transfected cells accelerated the apoptotic process.