Die akute Graft-versus-Host-Krankheit (GvHD) ist eine der Hauptkomplikationen nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation, die die Effizienz der Therapie und deren Einsatz limitiert. Aktuelle Präventionsstrategien und Therapien beinhalten systemisch wirkende Immunsuppressiva. Diese haben oft zahlreiche Nebenwirkungen und erhöhen die Rate von Tumorrezidiven und schweren Infektionen. Therapierefraktäre Verläufe der GvHD sind häufig und können mit einer schlechten Prognose vergesellschaftet sein. Neuartige Präventions- und Behandlungsansätze sind daher Gegenstand intensiver Forschung. Eine zentrale Rolle in der Pathogenese der akuten GvHD spielen CD4+ T Zellen. Alloreaktive T Zellen vermitteln eine proinflammatorische Immunantwort, produzieren entsprechende Zytokine und aktivieren weitere Effektorzellen. Diese Immunkaskade induziert eine systemische Entzündungsreaktion und führt zu Organ- und Gewebsschädigung. Der spezifischen Modulation dieser alloreaktiven CD4+ T Zellen hin zu einer Toleranzentwicklung gegenüber dem Empfängergewebe wird eine große Bedeutung in der Entwicklung innovativer GvHD-Präventionsstrategien beigemessen. Es konnte in murinen Modellen gezeigt werden, dass die ex vivo-Behandlung eines allogenen bzw. xenogenen Transplantats mit dem CD4-gerichteten nicht-depletierenden Antikörper MAX.16H5 zu einer verminderten GvH-Reaktion führte. Eine Beeinträchtigung des Graft-versus-Leukämie-Effekts war nicht nachweisbar. Toleranzinduktionen durch monoklonale Antikörper gegen Oberflächenrezeptoren von Immunzellen im Rahmen von Autoimmunerkrankungen und GvHD werden in zahlreichen Studien untersucht. Darüber hinaus ist bekannt, dass in der GvHD-Pathogenese bestimmte microRNAs, 17 bis 25 Nukleotide lange, nicht kodierende, einzelsträngige RNA-Moleküle, eine Schlüsselrolle spielen. Die molekularen Mechanismen, die der Toleranzentwicklung des MAX.16H5 Antikörpers zugrunde liegen, sind jedoch nicht abschließend geklärt. Daher war es Ziel der vorliegenden Doktorarbeit (i) ein in vitro Stimulationsmodell für weitergehende Untersuchungen am MAX.16H5 Antikörper zu etablieren und (ii) durch Quantifizierung der microRNA-Expression unter T Zellstimulierung zur Aufklärung von molekularen Mechanismen der Toleranzinduktion des Antikörpers beizutragen. Das etablierte in vitro Stimulationsmodell diente zur Analyse und Phänotypisierung von CD4+ T Zellen nach Antikörperinkubation und Stimulation. Es konnte gezeigt werden, dass eine MAX.16H5-Behandlung zu einer verminderten Aktivierung (CD25-Expression) von T Zellen nach 24 h und 72 h in Kokultur mit murinen Milzzellen bei einem 10:1 bzw. 8,2:1 Verhältnis (humane CD4+ T Zellen zu murinen Milzzellen) führte. Dieses Modell kann als Grundlage für weitere in vitro Studien dienen, um Prozesse der Toleranzinduktion durch monoklonale Antikörper zu untersuchen, und liefert einen wichtigen Beitrag für die präklinische Analyse des MAX.16H5 Antikörpers im Hinblick auf die Entwicklung funktioneller Tests. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Expression von microRNAs in CD4+ T Zellen nach Bindung des MAX.16H5 Antikörpers untersucht. Hierzu wurden humane CD4+ T Zellen mit dem MAX.16H5 Antikörper behandelt und (i) ohne Stimulation, (ii) mit murinen Milzzellen bzw. (iii) mit Phytohämagglutinin inkubiert. Das microRNA-Expressionsprofil wurde mit Next Generation Sequencing bestimmt. In dieser Screeninganalyse wurden zahlreiche microRNAs gefunden, die unter den verschiedenen Stimulationsbedingungen nach MAX.16H5-Inkubation differentiell exprimiert waren. Die Expression der miR-18a-3p und miR-598-3p wurde anschließend mit qPCR näher untersucht. Eine statistisch signifikante Regulation konnte für miR-598-3p nach 72 h Inkubation nachgewiesen werden. Es ist der bisher einzige Hinweis auf einen molekularen Effekt der MAX.16H5-Behandlung auf CD4+ T Zellen. Ob dieser Unterschied funktioneller Natur, im Sinne eines Toleranz-induzierenden Phänotyps ist, werden zukünftige Studien zeigen. Zudem wird aktuell die miR-598-3p als potenzieller Biomarker für den Nachweis einer erfolgreichen Inkubation mit MAX.16H5 untersucht, was für zukünftige klinische Studien von großer Wichtigkeit ist.:1. Einleitung 1 1.1 Literaturübersicht 1 1.1.1 Die hämatopoetische Stammzelltransplantation 1 1.1.2 Die allogene Stammzelltransplantation 2 1.1.3 Die Graft-versus-Host-Krankheit 5 1.1.4 Die Prävention und Behandlung der akuten GvHD 8 1.1.5 Neue Strategien zur GvHD-Behandlung und -Prävention 10 1.1.6 Der Graft-versus-Leukämie-Effekt 13 1.1.7 Der CD4-gerichtete MAX.16H5 Antikörper zur Prävention der GvHD 14 1.1.8 Die Toleranzinduktion durch monoklonale Antikörper 16 1.1.9 Die microRNA 19 1.1.10 Die Rolle von miRNAs in der GvHD 20 1.1.11 Die Rationale für die Untersuchung von miR-18a-3p 21 1.1.12 Die Rationale für die Untersuchung von miR-598-3p 22 2 Fragestellung und Experimentdesign 23 3 Material und Methoden 25 3.1 Materialien 25 3.1.1 Verwendete Zellen 25 3.1.2 Geräte 25 3.1.3 Chemikalien, Medien und Reagenzien 26 3.1.4 Verbrauchsmaterialien 27 3.1.5 Oligonukleotide 28 3.1.6 Antikörper 28 3.1.6.1 Antikörper für Durchflusszytometrie 28 3.1.6.2 Antikörper für Zellinkubation 29 3.2 Methoden 29 3.2.1 Schematische Darstellung der methodischen Arbeitsschritte 29 3.2.2 Zellkulturarbeiten 31 3.2.2.1 Auftauen von Zellen 31 3.2.2.2 Konservierung von Zellen 31 3.2.2.3 Bestimmung der Zellzahl von PBMCs und Splenozyten 32 3.2.3 Isolation humaner PBMCs aus Spenderblut 32 3.2.4 Isolation muriner Milzzellen 33 3.2.5 Isolation humaner CD4+ T Zellen und MACS-Separation humaner und muriner Zellen 33 3.2.6 Inkubation mit dem murinem MAX.16H5 IgG1 Antikörper 35 3.2.7 Inkubation humaner CD4+ T Zellen 35 3.2.8 Durchflusszytometrie 36 3.2.9 RNA-Isolation 37 3.2.10 RNA-Fällung 38 3.2.11 Next Generation Sequencing von miRNAs 38 3.2.12 Next Generation Sequencing – Analyseschema 41 3.2.13 Reverse Transkription und qPCR 41 3.2.13.1 Reverse Transkription 42 3.2.13.2 qPCR 43 3.2.14 Statistische Analyse, Tabellen und Abbildungen 44 4. Ergebnisse 46 4.1 Etablierung eines in vitro Stimulationsmodells zur Analyse humaner CD4+ T Zellen nach Antikörperinkubation 46 4.2 Next Generation Sequencing zur miRNA-Expressionsanalyse in CD4+ T Zellen nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation 50 4.2.1 FACS-Analyse isolierter CD4+ T Zellen vor und nach Antikörperinkubation 50 4.2.2 Separation muriner Milzzellen von humanen CD4+ T Zellen 53 4.2.3 NGS-miRNA-Expressionsanalyse in stimulierten und unstimulierten CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 55 4.2.3.1 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und PHA-Stimulation 57 4.2.3.2 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und Stimulation mit murinen Milzzellen 59 4.2.3.3 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und ohne Stimulation 61 4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der NGS-Analyse 63 4.3 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 24 h und 72 h Inkubation 64 4.3.1 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 24 h Inkubation 64 4.3.2 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 67 4.4 Validierung der Kandidaten-miRNA mittels qPCR 72 4.4.1 Expression von miR-18a-3p und miR-598-3p nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation in CD4+ T Zellen nach 72 h 72 4.4.1.1 FACS-Analyse isolierter CD4+ T Zellen vor und nach Antikörperinkubation 72 4.4.1.2 FACS-Analyse der CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 74 4.4.1.3 Separation muriner Milzzellen von humanen CD4+ T Zellen 78 4.4.1.4 Expression von miR-18a-3p und miR-598-3p 80 5. Diskussion 85 5.1 Die Expression von miR-18a-3p und der miR-17–92 Cluster 86 5.2 Die Expression von miR-598-3p 88 5.3 Die Differentielle Expression weiterer miRNAs 90 5.3.1 miR-223 90 5.3.2 Let-7d 91 5.3.3 miR-21 91 5.3.4 miR-181c 91 5.3.5 miR-10a 92 5.3.6 miR-150 92 5.3.7 miR-199a 92 5.3.8 miR-155 93 5.4 Die miRNA-Expressionsanalyse mit Next Generation Sequencing 93 5.5 Die Etablierung eines in vitro Stimulationsmodells 96 5.6 Verminderte T Zell-Aktivierung durch MAX.16H5 IgG1 98 6 Zusammenfassung der Arbeit 101 7 Literaturverzeichnis 104 A Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 129 B Erklärung über die Vorbehaltlichkeit der Verfahrenseröffnung zur Verleihung des Titels Dr. med. 130 C Darstellung des wissenschaftlichen Werdegangs 131 D Danksagung 133

The second meeting for the International Consensus on Antinuclear antibody (ANA) Pattern (ICAP) was held on 22 September 2015, one day prior to the opening of the 12th Dresden Symposium on Autoantibodies in Dresden, Germany. The ultimate goal of ICAP is to promote harmonization and understanding of autoantibody nomenclature, and thereby optimizing ANA usage in patient care. The newly developed ICAP website www.ANApatterns.org was introduced to the more than 50 participants. This was followed by several presentations and discussions focusing on key issues including the two-tier classification of ANA patterns into competent-level versus expert-level, the consideration of how to report composite versus mixed ANA patterns, and the necessity for developing a consensus on how ANA results should be reported. The need to establish on-line training modules to help users gain competency in identifying ANA patterns was discussed as a future addition to the website. To advance the ICAP goal of promoting wider international participation, it was agreed that there should be a consolidated plan to translate consensus documents into other languages by recruiting help from members of the respective communities.

Um Terroranschläge zu verhindern, werden schnelle, hochempfindliche Detektoren für Sprengstoffe benötigt. Neben Sprengstoffen ist auch der Drogenhandel ein großes gesellschaftliches Problem, welcher kriminelle Organisationen finanziert. Da bereits geringe Mengen an TNT oder Kokain einen Hinweis auf einen Anschlag oder auf Drogenschmuggel darstellen, muss der verwendete Detektor schnell aber dabei gleichzeitig sensitiv und selektiv sein. In dieser Arbeit wurde daher ein Biosensor zur Drogen und Sprengstoff Detektion, der auf auf einem Immunoassay basiert, entwickelt. Um die Performance sicherzustellen, wurden die genutzten Antikörper gründlich auf Eignung untersucht. Für die Affinitätssäule wurden monolithische Säulen hergestellt, welche eine hohe Oberfläche aufweisen. Zur Beschichtung der Säulen wurden Protein-Konjugate synthetisiert. Die Affinitätssäulen waren robust und zeigten eine sehr hohe Binde-Effizienz. Als Detektor wurde ein Fluoreszenz-Mikroskop aus kommerziellen Bauteilen konstruiert. Für den genutzten Fluoreszenzfarbstoff wurde eine Nachweisgrenze von 2 pM sowie ein dynamischer Bereich bis 1000 pM erreicht. Für die Fluidik wurden eine Spritzenpumpe sowie mikrofluidische Bauteile genutzt, welche eine Detektionszeit von 1.5 Minuten ermöglichten. Für TNT wurde mit dem Biosensor eine Nachweisgrenze von 130 pM erzielt. Der Biosensor zeigte außerdem keine Kreuzreaktivität mit gängigen Sprengstoffen. Für Kokain wurde eine Nachweisgrenze von 15 pM im Biosensor erreicht. Zusätzlich wurde für Kokain ein Wischtest entwickelt, welcher in drei Minuten Kokainmengen von 300 pg detektieren kann. Der entwickelte Biosensor gehört zu den besten Sensoren zur TNT- und Kokaindetektion und zeigt eine vergleichbare oder bessere Performance als Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung. Die Flexibilität beim Analyten sowie der Verzicht auf Lösungsmittel machen diesen Biosensor zu einem interessanten Kandidaten für hochempfindliche Messsysteme. / The fast detection of explosives is essential to prevent terror attacks. Besides explosives, the trafficking of illegal drugs is a major problem, which must be addressed to reduce criminal organizations’ revenue streams. As low amounts of these substances may indicate trafficking or a bomb threat, sensitive, selective and fast detection methods are required. Therefore, a biosensor was developed in this work, which relies on an immunoassay. To ensure sensitive and selective performance the used antibodies were characterized in depth. To obtain affinity columns, glass columns were manufactured and used. As column coating affinity conjugates were synthesized. The affinity columns showed efficient antibody trapping and were long-term stable. As a detector an epi-fluorescence microscope was built to monitor the sample. The sensor features consumer-grade parts rendering it easily accessible. For the used fluorophore a limit of detection (LOD) of 2 ppt with a linear range up to 1000 pM was achieved. Due to the use of a syringe pump and an injection valve a continuous fluidic for the biosensor was obtained. The used microfluidic parts resulted in detection times of only 1.5 min. For TNT a LOD of 130 pM was achieved. Additionally, the biosensor showed no cross-reactivity with common high explosives. For cocaine a LOD of 15 pM in solution was achieved and a surface wipe sampling method was demonstrated, which was able to detect 300 pg cocaine on surfaces within three minutes reliably. This biosensor belongs to the fastest and most sensitive cocaine and TNT detectors with sensitivity on par or better than liquid chromatography coupled with mass spectroscopy. Furthermore, the biosensor is affordable, very modular analyte-wise and requires no solvents or microplastic carriers. Therefore, it is a fascinating approach for future high-sensitivity monitoring applications.

In der vorliegenden Arbeit wird eine modulare Reaktionssequenz von zwei aufeinanderfolgenden chemoselektiven Umwandlungen vorgestellt: Es wird gezeigt, dass Vinyl- und Ethynylphosphonamidate chemoselektiv mit Cysteinen von Proteinen und Antikörpern reagieren. Weiterhin wird gezeigt, dass elektrophile Phosphonamidate durch eine vorhergehende chemoselektive Staudinger-Phosphonit Reaktion zwischen Aziden und ungesättigten Phosphoniten in das gewünschte Molekül eingebaut werden können. Hierbei wird ein elektronenreiches Phosphonit in ein elektronenarmes Phosphonamidat umgewandelt, welches somit für die nachfolgende Thiol-Addition aktiviert wird. Die beschriebene Methode erweitert das bestehende Repertoire von Biokonjugationen durch die Einführung eines neuen Konzepts: Eine chemoleselektive Reaktion, die Reaktivität für eine nachfolgende Biokonjugation induziert. Da Phosphonamidat-Konjugationen an Cysteine herausragende Eigenschaften, wie hohe Selektivität für Cysteine, saubere Reaktionsprodukte und eine hervorragende Stabilität mitbringen, wird im zweiten Teil beschrieben wie Phosphonamidate für die Anbindung von zytotoxischen Wirkstoffen an tumor-bindende Antikörper genutzt werden können um Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) herzustellen. Ein einfaches Syntheseprotokoll für die Herstellung, ausgehend von einem nicht gentechnisch veränderten Antikörper mit nur geringen Überschüssen des Wirkstoffs wird vorgestellt. Phosphonamidat-verbundene ADCs zeigen im direkten Vergleichen zum zugelassenen, Maleimid-verbundenen Adcetris überlegende Eigenschaften, wie eine erhöhte Stabilität in Serum und eine erhöhte in vivo Wirksamkeit in einem Tumor Mausmodel. Zusammenfassend verbindet die hier vorgestellte Methode einen einfachen synthetischen Zugang mit hoher Selektivität, überragender Konjugat-Stabilität und der Möglichkeit hochwirksame Wirkstoffkonjugate herzustellen und wird daher aller Voraussicht nach einen großen Beitrag zum Gebiet der zielgerichteten Therapie leisten. / The present work introduces a modular reaction sequence of two chemoselective manipulations in a row. It is shown that vinyl- and ethynylphosphonamidates react selectively with cysteine residues on proteins and antibodies. Most importantly, those electrophilic phosphonamidates can be incorporated into a given molecule in another preceding chemoselective Staudinger-phosphonite reaction (SPhR) from unsaturated phosphonites and azides. During this reaction, an electron-rich phosphonite is transformed into an electron-deficient phosphonamidate that is thereby activated for the subsequent thiol addition. The described technique thereby extends the existing repertoire of bioconjugations by introducing a new concept in protein synthesis: A chemoselective reaction that induces reactivity for a subsequent bioconjugation. Since phosphonamidate conjugations to cysteine hold outstanding features such as high selectivity for cysteine, clean reaction products and excellent stability of the protein adducts in biological environments, it is described in the second part of the present work how ethynylphosphonamidates can be employed for the conjunction of tumor-sensing antibodies and cytotoxic drugs to generate Antibody-Drug-Conjugates (ADCs). A simple synthetic protocol starting from unengineered antibodies, using only a slight excess of the desired drug in a one-pot synthesis protocol is introduced. In a direct comparison to the maleimide containing FDA-approved Adcetris, phosphonamidate linked ADCs show a superior behaviour in terms of linkage stability in serum, combined with an increased in vivo efficacy in a tumor xenograft mouse model. Taken together, the method described herein combines simple synthetic access with high selectivity, superior conjugate stability and the possibility to synthesize highly efficacious drug conjugates and is therefore likely to have a great contribution to the field of targeted therapeutics.

In humans of all ages, the cell wall-less and genome-reduced species Mycoplasma pneumoniae can cause infections of the upper and lower respiratory tract. The well-documented occurrence of major peaks in the incidence of community-acquired pneumonia cases reported world-wide, the multifaceted clinical manifestations of infection and the increasing number of resistant strains provide reasons for ongoing interest in the pathogenesis of mycoplasmal disease. The results of recent studies have provided insights into the interaction of the limited virulence factors of the bacterium with its host. In addition, the availability of complete M. pneumoniae genomes from patient isolates and the development of proteomic methods for investigation of mycoplasmas have not only allowed characterization of sequence divergences between strains but have also shown the importance of proteins and protein parts for induction of the immune reaction after infection. This review focuses on selected aspects of the humoral host immune response as a factor that might influence the clinical course of infections, subsequent protection in cases of re-infections and changes of epidemiological pattern of infections. The characterization of antibodies directed to defined antigens and approaches to promote their induction in the respiratory mucosa are also preconditions for the development of a vaccine to protect risk populations from severe disease due to M. pneumoniae.

Systemisch applizierte Therapeutika können erhebliche Nebenwirkungen auslösen, welche auf Grund eines unspezifischen Transports oder einer hohen Dosis von appliziertem Wirkstoff auftreten. Daher bedarf es der Entwicklung neuartiger Wirkstoff-Transportsysteme (Drug Delivery Systems) welche in der Lage sind, Wirkstoffe in genau definierbaren Dosen gezielt in die adressierte Zelle zu transportieren. Ein vielversprechender Ansatz, welcher diesen Anforderungen nachkommt, findet sich in der Layer-by-Layer-Technik (LbL), d.h. der wechselseitigen Assemblierung von Polymeren/Wirkstoffen auf soliden sphärischen Templaten, eines funktionellen Supported Lipid Bilayers sowie der Oberflächenfunktionalisierung mit spezifischen Antikörpern. Dabei ist die Homogenität und Regularität des Supported Lipid Bilayers von großer Bedeutung, um in biomedizinischen Anwendungen eine ungewollte Interaktion mit Serumkomponenten sowie eine Opsonierung zu verhindern. Insbesondere die funktionelle Lipidkomponente besitzt allerdings maßgebliche Auswirkungen auf diese Parameter. In dieser Arbeit wurde die Idee der Oberflächenfunktionalisierung von LbL-beschichteten Silica-Mikropartikeln (SiO2) mit einem funktionellen Supported Lipid Bilayer aufgegriffen und weiterentwickelt, wobei insbesondere die Homogenität des Supported Lipid Bilayers auch auf sehr kleinen Längenskalen (wenige Nanometer) bestimmt wurde. In einem letzten Schritt konnte anhand zweier verschiedener Zelllinien (3T3 und Vero) die Adaptivität und Effektivität des entwickelten Drug Delivery Systems nachgewiesen werden.

Antikörper gegen Circumsporozoite protein (CSP), ein Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum (Pf), können sterile Immunität hervorrufen und dadurch die Entwicklung von Malaria im Tierversuch verhindern. Im Menschen werden protektive B-Zell Gedächtnisantworten gegen CSP durch natürliche Malariaerkrankung bzw. Vakzinierung jedoch nur unzureichend erzeugt. - Für die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen stellt die Affinitätsreifung, welche durch somatische Immungobulin Hypermutation sowie der nachfolgenden Selektion von B-Zellen mit verbesserter Antigenaffinität charakterisiert ist, eine Schlüsselfunktion in der Generierung von protektiven Immunantworten dar. Wie Affinitätsreifung gegen CSP im Menschen stattfindet ist jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit wird die Affinitätsreifung von CSP Gedächtnis B-Zellen auf Einzelzellebene im Menschen über drei kontrollierte Infektionen mit Pf Sporozoiten unter Chemoprophylaxe untersucht. Durch Hochdurchsatz-Einzelzell-Sequenzierung der Immunoglobulin (Ig) gene loci und der Produktion von rekombinanten monoklonalen Antikörpern gewährt diese Arbeit Einsicht in die Selektion und Affinitätsreifung von humanen Gedächtnis-B-Zell Antworten gegen komplexe Proteinantigene und identifiziert Keimbahn kodierte Immunglobulin Charakteristika, die mit hoher CSP-Affinität und Pf-Inhibition einhergehen. Überraschenderweise zeigen die Daten, dass initiale klonale Selektion von hochaffinen B Zellen eine weitaus wichtigere Rolle als Affinitätsreifung in dieser Infektion spielt. Diese Arbeit zeigt fundamentale Eigenschaften von humanen Gedächtnisantworten in einer komplexen Parasiteninfektion und liefert die Grundlage für ein mögliches Design von neuartigen Immunogenen um hoch-affine B-Zellen gegen CSP effizienter zu induzieren. / Antibodies against the major Plasmodium falciparum (Pf) sporozoite surface protein, circumsporozoite protein (CSP), can mediate sterile immunity thereby preventing malaria disease symptoms as shown by passive transfer in animal models. However, protective anti- CSP memory antibody responses are not efficiently induced by natural Pf exposure or vaccination. Affinity maturation, i.e. the diversification of antigen-activated naïve precursor B cells by a somatic immunoglobulin (Ig) gene mutation process and the subsequent selection of B cells expressing antigen receptors with improved antigen affinity in germinal center reactions is considered key to the formation of protective memory B cell responses. However, how the anti-PfCSP memory B cell response matures in humans is not known. To address this question, the clonal evolution of the human anti-Pf CSP memory B cell response over three successive controlled Pf infections under chemoprophylaxis was assessed at single cell level by high throughput paired full-length Ig gene sequencing and recombinant monoclonal antibody production. The work provides basic insights in the longitudinal development of human memory B cell responses and identified germline-encoded Ig gene features that were associated with high anti-CSP affinity and Pf inhibitory antibody activity. The clonal selection of germline B cells expressing such antibodies, rather than affinity maturation, was associated with high quality anti-PfCSP memory B cell responses. The data provide insights into the evolution of antibody response to a complex protein antigen during infection and a strong rational for the design of novel CSP immunogens to target naïve B cell precursors expressing potent anti-CSP antibodies for the induction of protective memory B cell responses by vaccination.

Ein charakteristisches Merkmal des humoralen Immunsystems ist die Produktion vieler verschiedener Antikörper. Geläufige diagnostische Tests für den Nachweis von Krankheit-spezifischen Serumantikörpern nutzen Antigene zum Nachweis der Krankheit via Antikörperbindung. Derartige diagnostische Tests setzen jedoch die Kenntnis von Krankheit-spezifischen Antigenen voraus. Die vorliegende Arbeit berücksichtigt die unterschiedlichen Bindungsreaktivitäten ganzer Antikörperrepertoires verschiedener Gruppen von Individuen. Dazu werden die Serumantikörperbindungen gegenüber Zufallsbibliotheken gemessen. Die Moleküle dieser beliebigen Bibliotheken müssen keine Verwandtschaft zu den Antigenen der Krankheit haben. Mit modernen Herstellungsverfahren von Peptidarrays auf Glasträgern können mit einmal synthetisierten Peptiden hunderte von Träger-Replikas produziert werden. Die Suche nach hochaffinen Bindern zur Diagnose von Krankheiten mit unbekannten Antigenen oder mit Kreuzreaktivitäten zwischen gesunden und kranken Individuen könnte überflüssig werden. Gestützt auf die beschriebenen Voraussetzungen zeigt die vorliegende Arbeit, dass die Messung von Serumantikörper-Bindungen gegenüber Peptidbibliotheken mit zufälligen Sequenzen die Unterscheidung zwischen Gruppen von gesunden und kranken Individuen für unterschiedliche Krankheiten ermöglicht. Eine unerwartet kleine Anzahl von Peptiden ist ausreichend für eine zuverlässige Vorhersage der untersuchten Gruppen. Der unvoreingenommene Ansatz ermöglicht eine ebenso gute Unterscheidung von gesund und krank, wie sie auch mit voreingenommenen Bibliotheken gezeigt worden sind. Wir vermuten, dass der vorliegende Ansatz ein wichtiger Schritt in Richtung zuverlässiger Diagnose darstellt, insbesondere für Krankheiten mit noch unbekannten Antigenen. Ausserdem bietet die hohe Spezifizität der Detektone und deren kleinen Mitgliederzahl eine Grundlage für die gleichzeitige Diagnose von verschiedenen Krankheiten auf einem einzigen Peptid-Mikroarray. / A characteristic trait of the humoral immune system is the production of lots of different antibodies. Commonly used diagnostic tests for the detection of disease-specific serum-antibodies successfully exploit these antibody reactivities against disease eliciting antigens. Such diagnostic tests do however need the knowledge of disease specific antigen as a prerequisite. The presented work looks at the binding reactivities of whole antibody repertoires of different groups of individuals. Therefore the binding of serum-antibodies are measured against arbitrary probe molecule libraries. The arbitrary molecules of such libraries do not need to be related to the antigens of the disease to be diagnosed. Modern synthesis and printing processes of peptides on glass chips arrays allow the production of hundreds or peptide-chip replicas with small amounts of uniquely synthesized peptides. The search for high-affinity binders for the diagnosis of diseases with no known antigens might become redundant. Based on the described premises the presented work demonstrates the differentiation of different diseases by means of antibody serum reactivity differences towards arbitrary peptide libraries between healthy and diseased individuals. The number of peptides necessary for reliable prediction of the investigated groups of individuals are unanticipated small. The unbiased approach of the library design works as well as it possibly could with intended libraries, like whole-proteome arrays, used in recent other works. We presume our approach to be an important step forward towards reliable diagnosis, in particular for diseases caused by yet unknown antigens. Furthermore, the high specificity of the detectons and their smallness in size might provide a basis for simultaneous diagnosis of various diseases on a single peptide microarray.

Interaktionen zwischen Zellen sowie deren Aktivierung werden im Immunsystem durch verschiedene Zelloberflächenmoleküle reguliert. Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des kürzlich identifizierten Rezeptor-Ligand-Paares BTLA und HVEM. Zunächst wurden diverse BTLA-spezifische monoklonale Antikörper generiert, mit deren Hilfe erstmals die Lokalisation BTLA-tragender Zellen im Gewebe gezeigt werden konnte. Bei umfassenden Expressionsanalysen fiel auf, dass BTLA auf nahezu allen Leukozytenpopulationen der lymphatischen Organe konstitutiv vorhanden ist, und mit seinem Liganden HVEM koexprimiert wird. Beide Moleküle werden auf verschiedenen Zellpopulationen differenziell exprimiert und aktivierungsabhängig reguliert. Funktionelle Analysen in vitro als auch in vivo ergaben, dass die BTLA-HVEM-Interaktion durch Suppression der T-Zellaktivierung und –proliferation wesentlich zur negativen Regulation der Immunantort beiträgt. Die negative Wirkung von BTLA zeigte sich sowohl bei der Initiation als auch bei bereits fortgeschrittener Aktivierung, unabhängig von der Beteiligung positiver kostimulatorischer Signalwege. Durch Stimulation von T Zellen mit unterschiedlicher BTLA-Oberflächenexpression (verschiedene Subpopulationen oder aus transgenen Mäusen) konnte die strikte Korrelation der negativen Funktion mit der BTLA-Menge auf den Zellen gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass BTLA essentiell für die HVEM-vermittelte Suppression ist und eine wesentliche Beteiligung weiterer HVEM-Interaktionspartner (z.B. CD160) nicht vorliegt. Die Beobachtung von veränderten Lymphozytenpopulationen in BTLA-transgenen Mäusen im Ruhezustand weist zudem auf einen zentralen Beitrag des negativen BTLA-Signals zur Aufrechterhaltung der Homöostase hin. Die ubiquitäre Expression von HVEM und BTLA in Kombination mit der gegenseitigen Modulation beider Interaktionspartner ermöglicht eine flexible Reaktion des Immunsystems auf äußere Einflüsse unter anderem über die negative Regulation durch BTLA / Activation of immune cells is regulated by various cell surface molecules during cell-cell interactions. The aim of this work was the characterization of the recently identified receptor-ligand-pair BTLA and HVEM. Initially, several BTLA-specific monoclonal antibodies were generated. With these antibodies, the localization of BTLA expressing cells in the tissues has been determined for the first time. Further detailed flow cytometric analysis revealed a strong constitutive expression of BTLA on nearly all leukocytes in lymphoid organs. Interestingly, all BTLA-expressing cells co-expressed its ligand HVEM. However, both molecules were differentially expressed on different cell populations in the steady state, but were also regulated in an activation-dependent way. Functional analyses in vitro and in vivo (in an antigen-specific adoptive transfer system) revealed a substantial contribution of the BTLA-HVEM interaction for negative regulation of immune responses by suppressing T cell activation and proliferation. Inhibitory signals of BTLA affect the initial and ongoing activation, irrespective of simultaneous positive signals from other co¬stimulatory pathways. Using wildtype and BTLA-transgenic primary T cells, a strictly linear relationship between the inhibitory function of BTLA and its cell surface levels was observed. The data clearly demonstrate that BTLA expression determined the strength of HVEM-mediated suppression, but also that BTLA is essential for this negative co-stimulation, whereas other HVEM-interaction partners were apparently not involved. Finally, the observed changes in lymphoid cell populations of the BTLA-transgenic mice even in the resting state indicate a prominent role for negative BTLA signals to maintain homeostasis. The ubiquitous expression of HVEM and BTLA together with the reciprocal modulation of both interaction partners supports flexible reaction and regulation of the immune system particularly via the inhibitory function of BTLA.

Neutralisierende Antikörper sind entscheidend in der Eindämmung der Virusinfektion, indem sie den Eintritt in die Wirtszelle hemmen bzw. die Aktivierung der Komplementkaskade initiieren. Distinkte wirtseigene Oberflächenrezeptoren für die Fc-Domäne von IgG (FcyR) sind für die Kommunikation von humoraler und zellulärer Immunantwort verantwortlich. Auch Mitglieder der Herpesviren kodieren für Fc-bindende Proteine, die Kandidaten für immunevasive Funktionen darstellen könnten. Der Nachweis der HCMV-kodierten Fc-bindenden Proteine gp34 und gp68 als Bestandteil der Virushülle lies auf eine immunevasive Funktion hinsichtlich neutralisierendem IgG und Komplement-vermittelter Virolyse schließen, wie für den HSV-1-kodierten FcyR gE beschrieben. Weder für gp34 noch für gp68 konnte in vitro ein hemmender Effekt auf Neutralisation und Virolyse beobachtet werden. In unserem Labor wurde jedoch gezeigt, dass gp34 und gp68 selektiv die IgG-abhängige Aktivierung zellulärer FcyR inhibieren. Die glykosylierungsunabhängige Ligandenbindung von gp34 und gp68 wies auf unterschiedliche Interaktionsmechanismen zwischen den zellulären und den viralen FcyR hin. Mithilfe eines mutierten Fc-Fragments konnte für gp68 eindeutig eine mit HSV-1 gE überlappende Bindestelle an IgG identifiziert werden. Die für die Ligandenbindung erforderlichen Aminosäuren 71-292 von gp68 binden Fc in einer 2:1 Stöchiometrie, wobei die N-, nicht aber die O-Glykosylierung des vFcyRs essentiell sind. Darüber hinaus formt gp34 auf infizierten Zellen und auf der Virushülle kovalente Homooligomere. gp34-Cysteinpunktmutanten auf Basis der für die Bindung notwendigen Aminosäuren 24-140 lassen vermuten, dass die Oligomerisierung Voraussetzung für die Fc-Bindung ist. Im Gegensatz zu gp68 scheint der Mechanismus der Fc-Bindung von gp34 einzigartig unter den bekannten Fcy-Rezeptoren zu sein. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass trotz redundanter Expression der HCMV-FcyR der Bindungs- und Wirkungsmechanismus selektiv ist. / Neutralizing IgGs play a key role in diminishing virus infectivity by inhibiting the entry into host cells. Additionally, IgG-bound particles may be inactivated by virolysis through the activation of complement. Surface receptors specific for the Fc domain of IgG represent host proteins, connecting humoral and cellular immune responses. Also members of the herpes virus family code for proteins with Fc binding properties, implying functions that could intervene with antibody-dependent effector mechanisms. The presence of gp34 and gp68 on the virion membrane raised the question whether they are able to inhibit neutralising IgG and complement-mediated virolysis. The HSV-1-encoded FcyR gE was described to affect neutralisation and virolysis. Despite extensive analysis, there were no implications found that gp34 or gp68 interfere with neutralising IgG or virolysis in vitro. However, our lab could demonstrate that gp34 and gp68 selectively inhibit the IgG-dependent activation of the different host FcyRs. In contrast to the cFcyRs Fc recognition by gp34 and gp68 occurs independently of N-linked glycosylation of IgG, which points to a different binding mechanism among host and viral FcyRs. By taking advantage of a mutated Fc fragment, overlapping binding regions of the HSV-1 gE and gp68 were identified. For gp68 the amino acids 71-292 including the N-glycans are strictly required for Fc binding in a 2:1 stoichiometry. Interestingly, gp34 forms covalently linked homo-oligomers in infected cells and on the virion. Based on the minimal binding domain comprising the amino acids 24-140 of gp34, targeted cysteine exchange mutants revealed that oligomer formation by gp34 is absolutely required for Fc binding. In contrast to gp68, the Fc binding characteristics of gp34 appears to be unique among the known FcyRs. These findings allow us to postulate that even if the HCMV-encoded FcyRs are redundantly expressed the mechanistic details and binding properties are selective.