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In humans of all ages, the cell wall-less and genome-reduced species Mycoplasma pneumoniae can cause infections of the upper and lower respiratory tract. The well-documented occurrence of major peaks in the incidence of community-acquired pneumonia cases reported world-wide, the multifaceted clinical manifestations of infection and the increasing number of resistant strains provide reasons for ongoing interest in the pathogenesis of mycoplasmal disease. The results of recent studies have provided insights into the interaction of the limited virulence factors of the bacterium with its host. In addition, the availability of complete M. pneumoniae genomes from patient isolates and the development of proteomic methods for investigation of mycoplasmas have not only allowed characterization of sequence divergences between strains but have also shown the importance of proteins and protein parts for induction of the immune reaction after infection. This review focuses on selected aspects of the humoral host immune response as a factor that might influence the clinical course of infections, subsequent protection in cases of re-infections and changes of epidemiological pattern of infections. The characterization of antibodies directed to defined antigens and approaches to promote their induction in the respiratory mucosa are also preconditions for the development of a vaccine to protect risk populations from severe disease due to M. pneumoniae.

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Trotz der längst etablierten und weit verbreiten Impfprophylaxe mit potenten Toxoidimpfstoffen sind dramatisch verlaufende Tetanusinfektionen noch immer im Alltag des Pferdepraktikers präsent. Dies gab Anlass, verschiedene Impfprotokolle und die daraus resultierende humorale Immunitätslage zu überprüfen. Kenntnis über die durch Vakzination erwirkte Tetanusimmunität ist im Falle der Versorgung von Verletzungen oder vor elektiven Eingriffen hinsichtlich der Entscheidung für oder gegen eine neuerliche aktive und/oder passive Immunisierung erforderlich. Weiterhin ermöglicht die Kontrolle auf Persistenz homologer maternaler Antikörper vor Durchführung der Erstvakzination eine optimale Impfprophylaxe. Für diese beiden Indikationen wurde der Fassisi® TetaCheck als direkt am Patienten anwendbarer Schnelltest entwickelt. Dieser Streifentest wurde mit besonderem Augenmerk auf der zuverlässigen Identifizierung nicht ausreichend geschützter Individuen und der Unempfindlichkeit gegenüber der Testdurchführung und Interpretation durch ungeschulte Personen evaluiert. Zunächst wurden 91 Serumproben von Klinikpatienten mit glaubhafter Impfanamnese mittels Doppel-Antigen-ELISA (DAE) untersucht. Neben der Bestimmung der Seroprävalenz protektiver Tetanustoxoid-Antikörperkonzentrationen (TTAK) von > 0,1 IE/ml in dieser Population wurden mögliche Einflussgrößen auf die Höhe der TTAK zum Zeitpunkt der Blutentnahme analysiert. Zu diesen zählten das Alter der Tiere, die Impfintervalle, der Zeitabstand zur letzten Vakzination und das gleichzeitige Verimpfen weiterer Komponenten. Der Tetanus-Streifentest (TST) wurde evaluiert, indem die durch zwei unabhängige Untersucher ermittelten qualitativen Resultate des Schnelltestes mit den mittels DAE quantifizierten Antitoxinkonzentrationen in 99 Serumproben retrospektiv verglichen wurden. Ergänzend erfolgte die objektive Quantifizierung der Farbreaktion im Testfeld des TST durch Fotografieren und anschließender Analyse mittels einer Bildbearbeitungssoftware. Die Seroprävalenz protektiver TTAK betrug 92,3 %. 89 % der untersuchten Pferde waren ihrem jeweiligen Alter entsprechend gemäß der ‚Leitlinie zur Impfung von Pferden‘, herausgegeben von der Ständigen Impfkommission Vet. des Bundesverbandes Praktizierender Tierärzte immunisiert. Fünf dieser Pferde waren jedoch nicht ausreichend geschützt. Hierzu zählten ein fünf Monate altes Fohlen, bei welchem die maternalen Antikörper bereits unter die Schutzgrenze abgefallen waren, zwei juvenile Pferde ohne abgeschlossene Grundimmunisierung und zwei adulte Pferde. Abweichungen von der Impfempfehlung bestanden ausschließlich in Form verlängerter Abstände der Wiederholungsimpfungen von drei bis zu acht Jahren. Trotzdem wiesen diese Tiere protektive TTAK auf. Unter alleiniger Betrachtung des Patientenalters wiesen alle geriatrischen Patienten (n = 12) TTAK weit oberhalb der Schutzgrenze auf. Hinsichtlich der Einhaltung unterschiedlicher Boosterintervalle unterschieden sich die TTAK nicht signifikant (p = 0,117). Der zeitliche Abstand zur letzten Tetanusimpfung ließ keine Prognose über die zu erwartenden TTAK zu. TTAK nach Impfung mit monovalenten Vakzinen unterschieden sich nicht signifikant von denen nach Durchführung einer Kombinationsimpfung (p = 0,63). Für den TST ergaben sich eine Sensitivität von 83,6 % und eine Spezifität von 100 %. Die Übereinstimmung der Untersucher hinsichtlich eines binären Resultats war fast vollkommen (K = 0,88). Die Durchführung des TST durch den jeweils anderen Untersucher hatte keinen maßgeblichen Einfluss auf die Auswertung des Teststreifens (K = 0,80 und K = 0,84). Durch Erweiterung des vom Hersteller vorgegebenen Bewertungsmaßstabes „negativ“, „schwach positiv“ und „positiv“ auf fünf unterschiedliche Farbintensitäten konnte eine bessere Differenzierung ungeschützter Individuen von Tieren mit belastbarer Immunität ermöglicht werden. Zwischen der objektiv gemessenen Farbintensität und der TTAK bestand ein positiver linearer Zusammenhang (r² = 0,74). Auf diesen Ergebnissen basierend sollte zur Vermeidung ineffektiver Immunisierungen vor der Erstvakzination eine Bestimmung der TTAK mit Vollendung des fünften Lebensmonats erfolgen. Hierzu erwies sich der Fassisi® TetaCheck aufgrund seiner Zuverlässigkeit und Unempfindlichkeit als überaus geeignet. Da auch das strikte Einhalten der Impfempfehlung keine ausreichende Seroprotektion garantiert und die Eintragungen im Pferdepass fehlerhaft sein können, kann nur über eine Bestimmung der TTAK Gewissheit über den tatsächlichen Immunstatus erlangt werden. Die routinemäßige Implementierung des TST in die Pferdepraxis kann dazu beitragen, die Notwendigkeit einer Immuntherapie zu diagnostizieren und damit unnötige und nebenwirkungsbehaftete TT- oder Antiserumgaben zu minimieren. Im zweijährlichen Abstand vorgenommene Wiederholungsimpfungen führen zu keiner besseren Immunitätslage gegenüber wesentlich längeren Impfintervallen. Die Impfempfehlung könnte daher ein acht- bis zehnjähriges Boosterintervall ausweisen. Die humorale Tetanusimmunität betreffend ergeben sich keine Nachteile bei gleichzeitiger Impfung weiterer Komponenten.

Systemisch applizierte Therapeutika können erhebliche Nebenwirkungen auslösen, welche auf Grund eines unspezifischen Transports oder einer hohen Dosis von appliziertem Wirkstoff auftreten. Daher bedarf es der Entwicklung neuartiger Wirkstoff-Transportsysteme (Drug Delivery Systems) welche in der Lage sind, Wirkstoffe in genau definierbaren Dosen gezielt in die adressierte Zelle zu transportieren. Ein vielversprechender Ansatz, welcher diesen Anforderungen nachkommt, findet sich in der Layer-by-Layer-Technik (LbL), d.h. der wechselseitigen Assemblierung von Polymeren/Wirkstoffen auf soliden sphärischen Templaten, eines funktionellen Supported Lipid Bilayers sowie der Oberflächenfunktionalisierung mit spezifischen Antikörpern. Dabei ist die Homogenität und Regularität des Supported Lipid Bilayers von großer Bedeutung, um in biomedizinischen Anwendungen eine ungewollte Interaktion mit Serumkomponenten sowie eine Opsonierung zu verhindern. Insbesondere die funktionelle Lipidkomponente besitzt allerdings maßgebliche Auswirkungen auf diese Parameter. In dieser Arbeit wurde die Idee der Oberflächenfunktionalisierung von LbL-beschichteten Silica-Mikropartikeln (SiO2) mit einem funktionellen Supported Lipid Bilayer aufgegriffen und weiterentwickelt, wobei insbesondere die Homogenität des Supported Lipid Bilayers auch auf sehr kleinen Längenskalen (wenige Nanometer) bestimmt wurde. In einem letzten Schritt konnte anhand zweier verschiedener Zelllinien (3T3 und Vero) die Adaptivität und Effektivität des entwickelten Drug Delivery Systems nachgewiesen werden.

Angiogenese ist an physiologischen Vorgängen wie der Embryogenese und der Wundheilung, aber auch bei pathologischen Abläufen wie bei Neoplasien und der Makula Degeneration beteiligt. Im Bereich des Tissue Engineering ist sie ebenfalls unersetzlich und ausschlaggebend für den Erfolg einer Gewebetransplantation. In dieser Studie wurde an 40 männliche Charles Lewis-Ratten das arteriovenöse (AV-) Loop-Modell angewandt, um spontane Angiogenese unter Einfluss wachstumshemmender Faktoren in vivo zu untersuchen. Der AV-Loop wurde in einer mit Fibrin gefüllten Teflonkammer gebettet. Für die statistische Auswertung wurde der Student t-Test mit ungepaarten Stichproben angewandt und das Signifkanzniveau betrug α=0,05. Multiple Testungen wurden nach der Bonferroni-Holm-Methode angepasst. In der Anfangsphase der Studie wurde der zeitliche Verlauf der AV-Loop assoziierten Angiogenese an 16 Tieren untersucht. Es wurde ein signifikanter Anstieg der Gefäßfläche über einen Zeitraum von 5 (n=2), 10 (n=3) und 15 Tagen (n=3) beobachtet und ebenfalls eine signifikant höhere Gefäßanzahl an Tag 15 im Vergleich zu Tag 5. Acht Tiere konnten nicht in die Studie miteingeschlossen werden infolge von Thrombosierungen des Loops. Diese erwartete Verlustrate trat aufgrund Lernkurve dieses komplexen mikrochirurgischen Modells, insbesondere zu Beginn des Projektes, auf. In der zweiten Phase der Studie wurde die Neoangiogenese auf drei unterschiedliche Verfahren gehemmt. Die Implantationszeit betrug bei allen Gruppen 15 Tage. In der ersten Gruppe (n = 6) wurde ein Inhibitor des Wachstumfaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) intravenös appliziert, nämlich der monoklonale Antikörper Bevacizumab. Hier konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (n = 6) bei der Gefäßfläche (94 432 ± 17 903 μm2 gegenüber 268 682 ± 63 575 μm2) und ebenfalls bei der Gefäßdichte (18 ± 5 Gefäße pro mm2 versus 40 ± 9 Gefäße pro mm2 in der Kontrollgruppe) gemessen werden. Dieser Befund ließ darauf schließen, dass die Neovaskularisation durch VEGF vermittelt wurde. Die direkte Bestrahlung von 2 Gy auf den venösen Graft in der zweiten Versuchsgruppe (n = 7) löste eine signifikante Verringerung von Gefäßanzahl (311 ± 73), -fläche (43 137 ± 10 225 μm2) und –dichte (15 ± 7 Gefäße pro mm2) im Vergleich zur Kontrollgruppe (776 ± 123, 268 682 ± 63 575 μm2 und 40 ± 9 Gefäße pro mm2) aus. Dieses Verfahren hatte somit starken Einfluss auf den Reifeprozess der Neoangiogenese. Bei der Kombinationsgruppe (Bevacizumab und Bestrahlung, n = 5) konnte nur bei der Gefäßfläche ein signifikant geringerer Unterschied in der Angiogenese erhoben werden. Dies ließ vermuten, dass das hier zu findende physiologische und somit geordnete Gefäßwachstum nicht auf diese hemmende Methode anspricht, wie es bei chaotischen Tumorgefäßsystemen der Fall ist und der vermutete Synergismus ausbleibt. Zusätzlich wurde im Zuge dieser Studie ein standardisiertes Auswertungsprogramm etabliert. Dabei handelt es sich um ein selbstentwickeltes Computerprogramm, das nicht nur die hier gesammelten aber auch 2-D-Aufnahmen anderer Angiogenese-Modelle benutzerunabhängig und standardisiert evaluieren kann. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das AV-Loop-Modell sich ausgezeichnet für die Untersuchung der Angiogenese im gesunden Gewebe eignet. Es bietet die Möglichkeit verschiedene angiogene und anti-angiogene Faktoren zu applizieren sowie deren Einfluss auf eine physiologische Neovaskularisation zu beobachten.:1 EINLEITUNG 1 1.1 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 3 2 LITERATURÜBERSICHT 5 2.1. ANGIOGENESE 5 2.1.1 PHYSIOLOGIE 5 2.1.1.1 Bildung von Blutgefäßen 5 2.1.1.2 Embryogenese 8 2.1.1.3 Angiogenese und Wundheilung 9 2.1.2 TUMOR-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 11 2.2 TISSUE ENGINEERING 22 2.3 DAS ARTERIOVENÖSE (AV) LOOP-MODELL 22 2.4 AUSWERTUNG VON ANGIOGENESEPROZESSEN 23 3 MATERIAL UND METHODEN 24 3.1 TIERE UND HALTUNG 24 3.2 OPERATIVE EINGRIFFE 24 3.2.1 KAMMER UND MATRIX 24 3.2.2 HERSTELLUNG DES AV-LOOPS 25 3.2.3 BESTRAHLUNG 29 3.3 EXPLANTATION 29 3.3.1 PERFUSION MIT INDIA INK 29 3.3.2 PERFUSION MIT MICROFIL® 31 3.4. HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE METHODEN 32 3.4.1 VORBEREITUNG DER SCHNITTE 32 3.4.2 HÄMATOXYLIN-EOSIN-FÄRBUNG 33 3.4.3 LEKTINFÄRBUNG 34 3.5 DATENVERARBEITUNG 36 3.5.1 MIKROSKOPISCHE AUFZEICHNUNGEN 36 3.5.2 AUSWERTUNG DER HISTOLOGISCHEN SCHNITTE 36 3.5.3 AUFNAHMEN DER MIKRO-CT-BILDER 41 3.5.4 AUSWERTUNG DER MIKRO-CT-BILDER 42 3.5.5 POWER ANALYSE 43 3.5.6 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 43 3.6 VERWENDETES MATERIAL 44 4 ERGEBNISSE 47 4.1 AV-LOOP-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 48 4.2 ZEITLICHER VERLAUF DER AV-LOOP-ASSOZIIERTEN ANGIOGENESE 50 4.3 HISTOMORPHOMETRISCHE ANGIOGENESE-CHARAKTERISIERUNG MITTELS HE- UND LEKTINFÄRBUNG 52 4.4 AUTOMATISCHE, COMPUTERGESTÜTZTE UND UNTERSUCHERUNABHÄNGIGE ANGIOGENESE- QUANTIFIZIERUNG 53 4.5 EINFLUSS VON VEGF AUF AV-LOOP-ANGIOGENESE 58 4.6 EINFLUSS VON BESTRAHLUNG AUF DIE NEOVASKULARISATION IM AV-LOOP-MODELL 62 4.7 WECHSELWIRKUNG VON VEGF UND IONISIERENDER BESTRAHLUNG AUF DIE ANGIOGENESE IM AV-LOOP-MODELL 65 5 DISKUSSION 71 6 ZUSAMMENFASSUNG 81 7 SUMMARY 83 8 LITERATURVERZEICHNIS 85 9 ANHANG 95 9.1 PROTOKOLL ZUR HERSTELLUNG DER PUFFER 95 9.1.1 CITRATPUFFER 95 9.1.2 TRISPUFFER 95 9.2 TABELLEN 95 9.3 ABBILDUNGEN 95 10 DANKSAGUNG 98 / Angiogenesis is evident in both physiological and pathological processes in the body. It is involved in events of embryogenesis and in wound healing as well as in neoplastic growth and macula degeneration. In the field of Tissue Engineering neovascularisation plays an irreplaceable role and determines the result of the transplantation. Here, an arterio-venous loop (AV-loop) model embedded in fibrin- filled teflon chambers in 40 Charles Lewis rats was applied to conduct in vivo investigations of the physiological processes of vessel growth in healthy tissue and to understand neovascularisation under the impact of anti-angiogenic factors such as monoclonal anti-bodies and ionizing radiation (IR). For statistical analysis the unpaired t-test was applied with a significance level of α = 0,05. Multiple testing was adapted according to the Bonferroni-Holm method. At the beginning of the study the AV-loop induced angiogenesis was examined on 16 animals and consecutively characterized. A significant increase in vessel area was observed over a time frame of 5 (n=2), 10 (n=3) and 15 days (n=3). Additionally the vessel count has increased significantly at day 15 in comparison to day 5. Eight of the animals had to be excluded due to thrombosis of the loop, which was expected due to the complex microsurgical model, especially at the onset of the project. In the second phase of the study three different anti-angiogenic procedures were investigated. Time of implantation was 15 days. In group one (n = 6) the monoclonal antibody of VEGF (vascular endothelial growth factor) named Bevacizumab was applied intravenously. As a result a significant lower vessel area (94 432 ± 17 903 μm2) and density (18 ± 5 vessels per mm2) could be measured in comparison to the control group (n = 6; 268 682 ± 63 575 μm2 respectively 40 ± 9 vessels per mm2). We concluded from these results that angiogenesis was mediated by VEGF. In comparison to the controlgroup direct IR of 2 Gy led in group two (n = 7) to a significant decrease in vessel number (311 ± 73 versus 776 ± 123), area (43137±10225μm2 versus 268682±63575μm2) and density (15±7 versus 40±9 vessels per mm2). Therefore this procedure has an obvious impact on the vessel maturation. In the combined group (n = 5) of both anti-angiogenic procedures (anti- VEGF and IR) a significant decrease was only evident in the vessel area. We assumed that this physiological and accordingly organized angiogenesis does not respond to the applied inhibiting methods, as it is observed in tumor vessel growth. Additionally, an evaluation program was established with the goal of designing a user-independent and standardized computer program to measure 2-D-images of both this and other angiogenesis models. In summary the AV-loop presents a proficient model to investigate angiogenesis in healthy tissue. It offers a variety of possibilities to apply pro- and anti-angiogenic factors and to examine their impact in vivo.:1 EINLEITUNG 1 1.1 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 3 2 LITERATURÜBERSICHT 5 2.1. ANGIOGENESE 5 2.1.1 PHYSIOLOGIE 5 2.1.1.1 Bildung von Blutgefäßen 5 2.1.1.2 Embryogenese 8 2.1.1.3 Angiogenese und Wundheilung 9 2.1.2 TUMOR-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 11 2.2 TISSUE ENGINEERING 22 2.3 DAS ARTERIOVENÖSE (AV) LOOP-MODELL 22 2.4 AUSWERTUNG VON ANGIOGENESEPROZESSEN 23 3 MATERIAL UND METHODEN 24 3.1 TIERE UND HALTUNG 24 3.2 OPERATIVE EINGRIFFE 24 3.2.1 KAMMER UND MATRIX 24 3.2.2 HERSTELLUNG DES AV-LOOPS 25 3.2.3 BESTRAHLUNG 29 3.3 EXPLANTATION 29 3.3.1 PERFUSION MIT INDIA INK 29 3.3.2 PERFUSION MIT MICROFIL® 31 3.4. HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE METHODEN 32 3.4.1 VORBEREITUNG DER SCHNITTE 32 3.4.2 HÄMATOXYLIN-EOSIN-FÄRBUNG 33 3.4.3 LEKTINFÄRBUNG 34 3.5 DATENVERARBEITUNG 36 3.5.1 MIKROSKOPISCHE AUFZEICHNUNGEN 36 3.5.2 AUSWERTUNG DER HISTOLOGISCHEN SCHNITTE 36 3.5.3 AUFNAHMEN DER MIKRO-CT-BILDER 41 3.5.4 AUSWERTUNG DER MIKRO-CT-BILDER 42 3.5.5 POWER ANALYSE 43 3.5.6 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 43 3.6 VERWENDETES MATERIAL 44 4 ERGEBNISSE 47 4.1 AV-LOOP-ASSOZIIERTE ANGIOGENESE 48 4.2 ZEITLICHER VERLAUF DER AV-LOOP-ASSOZIIERTEN ANGIOGENESE 50 4.3 HISTOMORPHOMETRISCHE ANGIOGENESE-CHARAKTERISIERUNG MITTELS HE- UND LEKTINFÄRBUNG 52 4.4 AUTOMATISCHE, COMPUTERGESTÜTZTE UND UNTERSUCHERUNABHÄNGIGE ANGIOGENESE- QUANTIFIZIERUNG 53 4.5 EINFLUSS VON VEGF AUF AV-LOOP-ANGIOGENESE 58 4.6 EINFLUSS VON BESTRAHLUNG AUF DIE NEOVASKULARISATION IM AV-LOOP-MODELL 62 4.7 WECHSELWIRKUNG VON VEGF UND IONISIERENDER BESTRAHLUNG AUF DIE ANGIOGENESE IM AV-LOOP-MODELL 65 5 DISKUSSION 71 6 ZUSAMMENFASSUNG 81 7 SUMMARY 83 8 LITERATURVERZEICHNIS 85 9 ANHANG 95 9.1 PROTOKOLL ZUR HERSTELLUNG DER PUFFER 95 9.1.1 CITRATPUFFER 95 9.1.2 TRISPUFFER 95 9.2 TABELLEN 95 9.3 ABBILDUNGEN 95 10 DANKSAGUNG 98

Der zu den bedeutendsten Ektoparasiten des Schweines gehörende Erreger der Schweineräude, Sarcoptes scabiei var. suis, ist weltweit verbreitet und von wirtschaftlichen Interesse für Schweinezucht- und Mastbetriebe. Ziel dieser seroepidemiologischen Studie war die Gewinnung neuer Erkenntnisse über die Bestandsdynamik klinischer Räudeerscheinungen und dem Titerverlauf von IgG-Antikörpern gegen Sarcoptes scabiei var. suis im Serum von Sauen in Abhängigkeit vom Reproduktionszyklus (Trächtigkeit, Laktation, Besamung) und von Saugferkeln während der Säugeperiode sowie Aufzucht. Schlussfolgernd aufgrund der Ergebnisse dieser Studie eignen sich für die Kontrolle und Überwachung sowie Diagnostik der Sarcoptes-Räude von Beständen serologische Untersuchungen von Ferkeln bis zur zweiten Lebenswoche von räudeverdächtigen Sauen, „Jungsauen erster und zweiter Wurf“ sowie Sauen während der Trächtigkeit (vor allem letztes Drittel) und Deckeber. Eine Vorselektion auf räudeverdächtige Hautveränderungen sowie gesteigerte Kratzaktivitäten erhöht die Wahrscheinlichkeit serologisch positive Tiere zu identifizieren.