Influenza Viren stellen eine große Bedrohung der öffentlichen Gesundheit dar. Die saisonale Grippeschutzimpfung induziert Antikörper gegen den Kopfbereich des viralen Oberflächenproteins Hämagglutinin (HA), in dem verstärkt Antigendrift auftritt. Dadurch wird die Effektivität der saisonalen Grippeimpfung auf den Impfstamm beschränkt und es besteht kein ausreichender Schutz gegen virale Driftvarianten. Eine universellere Grippeimpfung wird dringend benötigt. Die Entdeckung breit reaktiver Antikörper gegen den konservierten HA-Stammbereich hat die Erforschung neuartiger Impfstrategien vorangetrieben. Mit Chimären oder Headless HA kann eine Fokussierung der Immunantwort auf immunsubdominante Bereiche im HA-Stammbereich erzielt werden. Auch innovative Impfstoffplattformen wie Adeno-assoziierte Virus (AAV)-Vektoren bergen ein immenses Potenzial, da sie zum einen für die Verwendung im Menschen zugelassen sind und zum anderen die Immunogenität des Antigens positiv beeinflusst. Die Immunisierung mit AAV-Vektoren, die wildtypisches HA, Chimäre HA oder Nukleoprotein exprimieren, führte in dieser Arbeit in Mäusen zur Induktion breit reaktiver Antikörper, nicht aber die Immunisierung mit AAV-Headless HA oder inaktiviertem Grippeimpfstoff. Die AAV-Vektor Impfstoffe führten zur robusten Induktion Fc-Gamma-Rezeptor-aktivierender Antikörper, die beispielsweise Antikörper-vermittelte zelluläre Zytotoxizität auslösen können. Nicht nur die Impfung mit AAV-Chimären HA, sondern auch mit AAV-wildtypischem HA induzierte Antikörper gegen den HA-Stammbereich. Somit kann anscheinend allein durch eine AAV-Vektor vermittelte Expression des Antigens die Immundominanz des HA-Kopfbereiches abgemildert werden. Abschließend konnte zum ersten Mal die Schutzwirkung einer AAV-Vektor Immunisierung gegen HA im Frettchen demonstriert werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse zeigen somit das große Potenzial von AAV-Vektoren als Impfvehikel für eine breit reaktive Grippeschutzimpfung auf. / Influenza viruses represent a severe threat to public health. A seasonal vaccine is available, which readily leads to the induction of antibodies against the head domain of the viral surface protein hemagglutinin (HA), which is prone to antigenic drift. Thus, seasonal vaccination induces only strain specific protection, while it is not effective against drifted virus strains. Hence, there is an urgent need for a universal influenza vaccine. The discovery of broadly reactive antibodies against the highly conserved HA-stalk domain has prompted great interest into research on vaccination strategies to induce broadly protective HA antibodies. Chimeric and headless HA have shown promising results with respect to re-focusing immunity towards immunosubdominant epitopes in the HA-stalk to induce protective HA-stalk antibodies. Also, innovative vaccine delivery platforms such as Adeno-associated virus (AAV)-vectors offer an attractive developmental perspective. AAV-vectors are licensed for use in humans and the AAV-vectored antigen expression positively influences its immunogenicity. In this thesis, immunization with AAV-vectors expressing wildtype HA, chimeric HA or nucleoprotein induced broad protection in mice, but not vaccination with AAV-vectors expressing headless HA or an inactivated influenza vaccine. Protection was associated with the ability of the AAV-vectored vaccines to induce Fc-gamma-receptor-activating antibodies, which might activate antibody-dependent cellular cytotoxicity. Not only chimeric HA but also wildtype HA induced antibodies against the HA-stalk, suggesting that AAV-vectored antigen expression can mitigate the immunodominance of virus strain-specific epitopes in the HA-head. Importantly, for the first time a protective effect AAV-vectored immunization towards HA could be shown in ferrets. Thus, results described in this thesis suggest a large potential for the development of AAV-vectors as carriers for a broadly protective influenza vaccine.

Multi-Antigen-Komplexe wurden in der Vakzinologie als effizientes Modell genutzt, um eine breite Impfstoffabdeckung gegen mehrere Stämme desselben Pathogens zu erzielen. Hier werden die Ergebnisse zur menschlichen B-Zell-Reaktion auf einen Multi-Antigen-Komplex (Bexsero) in drei Impfstoffen (Vax1, Vax2 und Vax3) dargestellt. Bexsero ist ein Impfstoff, der aus vier Antigenen (fHbp-GNA2091, NHBA-GNA1030, NadA und OMV (NZ98-254)) für Neisseria meningitidis (Nm) B besteht. Bei allen drei Impfstoffen konnten außerordentlich diverse Immunglobuline (Ig) beobachtet werden, die als Reaktion auf Bexsero mit einzigartigen Ig-Genselektionsmustern erzeugt wurden. Die Daten zeigen auch Igs, die eine Reihe von Spezifitäten aufweisen (Bexsero-spezifisch-reaktive Igs (nur Vax3) oder polyreaktive Igs (Vax2, Vax3 und Vax4)) und Affinitäten (hochbindende, mäßig bindende, schwach bindende und nicht reaktive Igs). Es wurde keine eindeutige Korrelation zwischen spezifischen Ig-Genmerkmalen und Ig-Reaktivitätseigenschaften beobachtet, obwohl Igs von allen Impfstoffen kollektiv unterschiedliche Affinitäten innerhalb/zwischen Cluster-Igs und zwischen Nicht-Clustern von Bexsero aufweisen, was potenzielle Vorteile für einen breiten Schutz mit sich bringt. Ig-Gen-Merkmale und Antigen-Reaktivitätseigenschaften von Igs, die gegen NHBA (22 Igs), fHbp (2 Igs) und NadA (2 Igs) erzeugt wurden, sind ebenfalls gezeigt. Diese Ig zeigten schwache Bindungsaffinitäten, wenn sie an endogen exprimierten Antigenen auf Nm mc58 getestet wurden, möglicherweise aufgrund eines ungeordneten N-Terminus von NHBA. Es wurde eine Anreicherung von hochmutierten polyreaktiven Ig beobachtet. Es werden unterschiedliche Immunoselektivitätsgrade für die verschiedenen Antigene beobachtet, was auf eine Antigenimmunodominanz sowie auf Hinweise auf eine Epitopmaskierung hindeutet. Mit einem kontrollierbaren System von 4 Antigenen eröffnen die Daten die Möglichkeit die menschliche B-Zell-Reaktion auf Multi-Antigen-Komplexe zu verstehen und zeigen, dass ein umfassendes Verständnis über die feinen zellulären und humoralen Einzelheiten der Immunantworten des Impfstoffs während klinischer Studien erforderlich ist. / Multi-antigen complexes have been exploited in vaccinology as an efficient model, to achieve broad vaccine coverage against multiple strains of the same pathogen. Here, the findings on the human B cell response to a multi-antigen complex (Bexsero) in three vaccinees (Vax1, Vax2 and Vax3) are shown. Bexsero is a vaccine comprising of four antigens (fHbp-GNA2091, NHBA-GNA1030, NadA and OMV (NZ98-254)) for Neisseria meningitidis (Nm) B. Immensely diverse (isotype distribution, IgVH and IgJH gene usage, CDR3 length distribution and clonal selection) immunoglobulins (Igs) generated in response to Bexsero with unique Ig gene selection patterns in all three vaccinees was observed. The data also shows Igs that exhibit a range of specificities {Bexsero-specific-reactive Igs (Vax3 Only) or polyreactive Igs (Vax2, Vax3 and Vax4)} and affinities (highly binding, moderately binding, weakly binding and unreactive Igs). No unique correlation between specific Ig gene features and Ig reactivity properties was observed, albeit Igs from all vaccinees collectively exhibit varied affinities within/between cluster Igs, and amongst non-clusters to Bexsero, with potential advantages for broad protection. Ig gene features and antigen-reactivity properties of Igs generated against NHBA (22 Igs), fHbp (2 Igs) and NadA (2 Igs) are also shown. These Igs exhibited weak binding affinities when tested on endogenously expressed antigens on Nm mc58, potentially due to disordered N-terminal of NHBA. Enrichment of highly mutated polyreactive Igs was observed. Varying degrees of immunoselectivity to the different antigens, suggesting antigen immunodominance as well as evidence of epitope masking are observed. With a controllable system of 4 antigens, the data opens a potential window to understanding the human B cell response to multi-antigen complexes and evinces the need for expansive understanding of the fine cellular and humoral details of vaccine immune responses during clinical trials.

In dieser Arbeit ein neues bioanalytisches Konzept untersucht, das nanoskalige Zeolith-Imidazolat-Frameworks (ZIFs) als Marker für antikörperbasierte Analysemethoden einsetzt, einschließlich Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) und Lateral Flow Immunoassay (LFIA). Der Vorteil von ZIFs als Marker gegenüber etablierten Materialien ist ihre vielseitige, einfache und kostengünstige Synthese. Dazu gehört die Möglichkeit, niedermolekulare Substanzen für zusätzliche Sensorzwecke zu verkapseln und für eine hohe Selektivität stabil an Biomakromoleküle zu konjugieren. Als modellhafter Zielanalyt von Relevanz wurden Phthalat-Acylester (PAEs) ausgewählt. Die Relevanz des Nachweises von PAEs ergibt sich aus ihren Eigenschaften als endokrin wirksame Chemikalien (EDCs) und krebserregend. In Kombination mit der Tatsache, dass PAEs aufgrund ihrer Verwendung als Weichmacher in Kindergeschirr, Spielzeug, Trinkflaschen und anderen Produkten auf Polyvinylchlorid-Basis in der Umwelt reichlich vorhanden sind, zeigt, wie wichtig der routinemäßige Nachweis von PAEs in Trinkwasser oder Lebensmitteln ist. / This work explores a new bioanalytical concept that employs nanosized Zeolite Imidazolate Frameworks (ZIFs) particles as labels for antibody-based analytical methods, including enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and lateral flow immunoassay (LFIA). The advantage of ZIFs as labels over established materials is their versatile, facile, and cheap synthesis. This includes the ability to encapsulate low molecular weight substances for additional sensing purposes and for stable conjugation to biomacromolecules for high selectivity. As a model target analyte of relevance Phthalate acyl esters (PAEs) have been selected. The relevance of the detection of PAEs is due to their properties as endocrine disrupting chemicals (EDCs) and carcinogenic. Combined with PAEs being abundant on the environment because of their use as plasticizers in plastic-made tableware for children, toys, drinking bottles and other polyvinylchloride-based products, shows the importance or their routine detection of drinking water or foods being so critical.

In dieser Arbeit wurden ungesättigte Vinyl- und Ethynylphosphonothiolate hergestellt und als Linker für Cystein-selektive Proteinmodifikationen verwendet. Zunächst wurde, ausgehend von ungesättigten Phosphoniten und elektrophilen Disulfiden als Startmaterialien, eine Syntheseroute zur Herstellung von ungesättigten Phosphonothiolaten entwickelt. Die hohe Chemoselektivität dieser Reaktion ermöglichte die Einführung von Vinylphosphonothiolaten auf ungeschützten Modellpeptiden und dem Protein Ubiquitin. Es konnte gezeigt werden, dass ungesättigte Phosphonothiolate unter neutralen bis leicht basischen Bedingungen selektiv mit Thiolen reagieren und sich daher als Linker für Cystein-selektive Proteinmodifikationen eignen. Die Vielseitigkeit der hier entwickelten Biokonjugationsmethode wurde in drei Anwendungen demonstriert. Ausgehend von dem Vinylphoshonothiolat-modifizierten Ubiquitin konnten homogene Ubiquitin-Protein-Konjugate erzeugt werden; zum einen ein nicht hydrolysierbares Diubiquitin-Konjugat und zum anderen ein Ubiquitin-α–Synuclein-Konjugat. Des Weiteren wurden ungesättigte Phosphonothiolate als Linker in Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten getestet. Hier zeigte sich, dass insbesondere Vinylphosphonothiolat-Linker Potential zur Herstellung von stabilen Antikörper-Konjugaten aufweisen. Schließlich wurden Vinylphosphonothiolate als Linker verwendet, um sowohl Chaperon-bindende Antikörper als auch Deubiquitinasen (DUBs) mit photoreaktiven Crosslinkern auszustatten um damit dynamische Protein-Interaktionen zu untersuchen. Insgesamt ermöglicht das hier entwickelte Verfahren die chemoselektive Umwandlung von elektrophilen Disulfiden in elektrophile Vinyl- und Ethynylphosphonothiolate, wodurch Reaktivität für eine Thioladdition induziert wird. Dadurch können zwei komplexe, thiolhaltige Moleküle selektiv konjugiert werden, was insbesondere für die Herstellung von homogen modifizierten Peptid- und Proteinkonjugaten von Bedeutung ist. / In this work, unsaturated vinyl- and ethynylphosphonothiolates were synthesised and used as linkers for cysteine-selective protein modifications. First, a synthetic route for the generation of unsaturated phosphonothiolates was developed, using unsaturated phosphonites and electrophilic disulfides as starting materials. The high chemoselectivity of this reaction enabled the introduction of vinylphosphonothiolates on unprotected model peptides and the protein ubiquitin. It could then be shown that unsaturated phosphonothiolates react selectively with thiols under neutral to slightly basic conditions and are therefore suitable as linkers for cysteine-selective protein modifications. The versatility of the herein developed bioconjugation method was demonstrated in three applications. First, starting from the vinylphosphonothiolate-modified ubiquitin, homogeneous ubiquitin-protein conjugates could be generated, in particular a non-hydrolyzable diubiquitin conjugate and a ubiquitin-α-synuclein conjugate. Second, the suitability of unsaturated phosphonothiolates as linkers for the generation of stable antibody-drug conjugates was tested. Vinylphosphonothiolate linkers thereby showed potential to produce stable antibody conjugates. Finally, vinylphosphonothiolates were used as linkers to conjugate both chaperone-binding antibodies and deubiquitinases (DUBs) to photo-reactive crosslinkers in order to investigate dynamic protein interactions. Overall, the herein developed methodology enables the chemoselective conversion of electrophilic disulfides into electrophilic vinyl- and ethynylphosphonothiolates, which in turn react selectively with thiols. As a result, two complex, thiol-containing molecules can be selectively conjugated, which is particularly important for the production of homogeneously modified peptide and protein conjugates.

In dieser Arbeit wurde eine neue Templat-gesteuerte fluorogene Peptidverknüpfung vorgestellt. Speziell modifizierte Peptidfragmente wurden durch die Bindung an ein Templatmolekül zu einer chemischen Reaktion befähigt, wodurch ein Fluoreszenzsignal erzeugt werden konnte. Das erlaubte eine Reaktionskontrolle in Echtzeit. Die fluorogene Peptidverknüpfung konnte erfolgreich mit einem Coiled-coil Peptid-Model etabliert werden. Dabei wurden Peptidthioester derart modifiziert, dass in räumlicher Nähe zur Thioestergruppe ein Fluorophor platziert wurde und die acetylierte Mercaptogruppe als Fluoreszenzlöscher agierte. Die modifizierten Thioester können nach dem Reaktionsmechanismus der nativen chemischen Peptidverknüpfung (NCL) unter der Bildung einer Amidbindung mit N-terminalen Cysteinylpeptiden reagieren. Die fluoreszenzlöschende Mercaptogruppe verlässt dabei den Peptidthioester als Nukleofug, wodurch ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt entsteht. Die Templat-gesteuerte Durchführung dieser fluorogenen nativen chemischen Peptidverknüpfung (fNCL) erlaubte die Reaktionsdurchführung bei sehr geringen Peptidkonzentrationen. Die Synthese der benötigten fluorogenen Thioester gelang zum einem durch die Anwendung der selbstreinigenden Thioestersynthese mit einer Tandem-Entschützungs-Kupplungs-Strategie und zum Anderen mit Hilfe eines synthetisierten fluorogenen Azid-Thioesterbausteins, welches mit einem Alkin-modifizierten Peptid zur Reaktion gebracht wurde. Neben Coiled-coil Peptiden, wurden auch doppelsträngige DNA und Antikörper als Template für die fNCL eingesetzt. Die fNCL konnte zur Durchführung eines Abstandsscreenings angewendet werden. Es wurde eine Abhängigkeit zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Abstand der Bindungsstellen im Templat für zwei reaktive Peptidbindungspartner gezeigt. Durch diese Untersuchung konnte die räumliche Abstandsgrenze zwischen zwei Bindungsstellen in einem Templatmolekül bestimmt werden, die keinen Templat-Effekt mehr beobachten lässt. / In this thesis a new template-controlled fluorogenic peptide linkage was presented. Specially modified peptide fragments were enabled to undergo a chemical reaction by binding to a template molecule, which resulted in a fluorescent signal. This allowed a reaction control in real time. The fluorogenic peptide linkage was successfully established using a coiled coil peptide model. Peptide thioesters were modified in such a way that a fluorophore was placed in close proximity to the thioester group and the acetylated mercapto group acted as fluorescence quencher. These modified thioesters can react with N-terminal cysteinyl peptides according to the reaction mechanism of the native chemical ligation (NCL) under the formation of an petide bond. The fluorescence-quenching mercapto group leaves the peptide thioester as a leaving group, resulting in a fluorescent reaction product. Template-controlled execution of this fluorogenic native chemical ligation (fNCL) allowed the reaction to be performed at very low peptide concentrations. The synthesis of the required fluorogenic thioesters was achieved on the one hand by applying a self-purifying thioester synthesis with a tandem-protective coupling strategy and on the other hand by using a synthesized fluorogenic azide thioester building block which was reacted with an alkine-modified peptide. In addition to the coiled coil peptides, double-stranded DNA and antibodies were used as templates for fNCL. Finally, the fNCL could be used to perform a distance screening. A dependence between the reaction rate and the distance between the binding sites in the template for two reactive peptide binding partners was shown. By this investigation a distance between two binding sites in a template molecule could be determined, which does not show a template effect anymore.

Das magenbesiedelnde Bakterium Helicobacter pylori gehört zu den am weitesten verbreiteten Infektionserregern. Obwohl die Infektion meist lebenslang symptomlos verläuft, kann H. pylori bei einigen Menschen schwere Erkrankungen bis hin zum Magenkarzinom verursachen. Ziele dieser Arbeit waren Magenkarzinom-assoziierte Antigene für einen diagnostischen Test zu finden und Methoden zur Untersuchung von Spotkompositionen mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie zu entwickeln. Im ersten Teil der Promotion wurden die Antigenerkennungsmuster von 30 Magenadenokarzinom- mit 30 Ulkus duodeni-Patienten mithilfe hochauflösender zweidimensionaler Immunoblots von H. pylori Lysat verglichen. Diese fokussierte Gegenüberstellung eignet sich gut für diese Fragestellung, da beide Erkrankungen von diesem Bakterium verursacht werden, aber nur sehr selten gemeinsam auftreten. Durch univariate statistische Analysen wurden 14 Magenkarzinom korrelierte Spots gefunden (p / The stomach-colonizing bacterium Helicobacter pylori is one of the most widespread infectious agents. Although infection mostly persists unnoticed, it may cause serious diseases like gastric carcinoma. Aims of this project were to find gastric carcinoma-associated antigens for a diagnostic test and to develop methods to analyze spot compositions using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. In the first part of this project antigen recognition patterns of 30 gastric carcinoma- and 30 duodenal ulcer- patients were compared using high-resolution two-dimensional immunoblots of H. pylori lysate. This focused comparison lent itself to this question because both diseases are caused by the bacterium but rarely occur conjointly. Utilizing univariate statistical tests 14 gastric carcinoma-associated spots were found (p

In dieser Arbeit wurde eine neue Markierungsstrategie von Antikörpern mit dem Markierungsreagenz MeCAT (Metal Coded Tag) unter physiologischen Reaktionsbedingungen, sowie deren Anwendung in einem 8-fach Multiplex-Immunoassay von in Formalin-fixierten und in Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten entwickelt. Für eine aussagekräftige LA-ICP-MS Detektion von MeCAT-modifizierten Antikörpern, wurde eine Standardisierung für biologische Proben auf NC-Membranen, basierend auf einer homogenen Aufbringung eines internen Standards und Kalibrierstandards durch einen kommerziell verfügbaren Tintenstrahldrucker entwickelt und mit der ICP-MS Analyse von Lösungen evaluiert. Die LA-ICP-MS wurde in zwei 8-fach Multiplex-Immunoassays von Tissue Micro Arrays vom Prostatakarzinom und in Maushirngewebeschnitten zur Einschätzung von neurogenerative Erkrankungen erfolgreich eingesetzt werden. Es konnte hierbei gezeigt werden, dass das Nachweisvermögen, der hier entwickelten Methode bereits ausreicht, um die gängigen klinischen Biomarker mit guter Ortsauflösung nachzuweisen. / In this work a new tagging strategy of antibodies with the tagging reagent MeCAT (Metal Coded Tag) was developed under physiological reaction conditions. Their application was proved in an 8-fold multiplex immunoassay of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections. For a significant LA-ICP-MS detection of MeCAT tagged antibodies standardization for biological samples owere developed. The standardization based on a homogeneous deposition onto the NC membrane via conventional CD-ink-jet printer was validated in addition with the ICP-MS analysis of solutions. The internal standardization of LA-ICP-MS was successfully applied in two 8-fold multiplex immunoassays for Tissue Micro Arrays (TMA) of prostate cancer and for detection of biomarkers for neurodegenerative diseases in mouse brain tissue sections. In both examples it could be shown that the detection capability of the new tagging strategy in combination with the printing standardization allows the detection of the clinical biomarker with good spatial resolutions.

Ungefähr 1% der Bevölkerung der westlichen Welt leidet an rheumatoider Arthritis (RA). In einem T-Zellrezeptor transgenen Mausmodell, dem K/BxN Modell, wird die ubiquitär exprimierte Glukose-6-phosphat Isomerase (G6PI) von autoreaktiven T- und B-Zellen erkannt. Diese Mäuse entwickeln spontan eine antikörpervermittelte Arthritis, die viele Gemeinsamkeiten mit der humanen RA aufweist. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Immunisierung mit G6PI eine Arthritis auch in nicht-transgenen Mäuse induzieren kann. Die Immunisierung mit heterologer humaner G6PI führte zur Entwicklung einer peripheren symmetrischen Polyarthritis in über 95% der DBA/1 Mäuse. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Immunreaktion gegen ein systemisches exprimiertes Antigen zur einer organspezifischen Erkrankung in normalen nicht-transgenen Mäusen führt. Die Tiere entwickeln nach 9 Tagen eine Arthritis, die bis Tag 15 ihr Maximum erreicht hat und dann langsam abnimmt. Histologisch ist die Arthritis durch eine frühe Synovitis charakterisiert, gefolgt von massiven Erosionen des Knorpel und Knochens und anschließenden Reparaturprozessen, inklusive Fibrose. Obwohl die Tiere hohe Antikörpertiter entwickeln, kann die Arthritis nicht durch aufgereinigte Antikörper kranker Mäuse transferiert werden. Trotzdem spielen Antikörper eine große Rolle, da FcR-gamma-Kette defiziente Mäuse eine Arthritis mit geringer Inzidenz und mildem Verlauf entwickeln. Die Depletion der CD4 positiven Zellen verhindert die Entwicklung der Arthritis völlig, und eine Depletion während der Erkrankung führt zur schnellen Heilung. Daneben ist für die Entwicklung der Arthritis auch das Komplementsystem und TNF-alpha entscheidend, was durch Depletion von C5 bzw. durch Blockade von TNF-alpha gezeigt wurde. Zusätzlich wurde die Rolle der G6PI bei der Pathogenese der RA im Menschen untersucht. RA-Patienten zeigten keine erhöhte Frequenz von CD4 positiven T-Zellen, die nach Restimulation mit G6PI TNF-alpha oder IFN-gamma produzierten. Außerdem konnten keine erhöhten anti-G6PI Titer in Patienten mit RA oder anderen rheumatischen Erkrankungen detektiert werden. / About 1% of the of the population of the western world suffers from rheumatoid arthritis (RA). In a T-cell receptor transgenic mouse model, the K/BxN model, the ubiquitously expressed glucose-6-phosphate isomerase (G6PI) is recognized by autoreactive T- and B-cells. These mice do develop an antibody dependent arthritis which show a lot of features of human RA. In this study it was examined whether arthritis could be induced in normal non-transgenic mice by immunization with G6PI. Immunization with heterologous human G6PI induces a symmetric polyarthritis in over 95% of DBA/1 mice. Therewith showing for the first time that an immune reaction against an systemic expressed antigen will lead to the development of an organ specific disease in normal non-transgenic mice. The mice develop arthritis 9d after immunization, reach their maximum at d15 and then arthritis slowly resolve. Histologically, the disease is characterized by early synovitis followed by massive cartilage destruction and erosions of the bones and later repair processes including fibrosis. Although antibody titers in the mice are high, transfer of purified anti-G6PI antibodies of sick mice alone do not transfer disease. Anyway, antibodies seem to play a major role since FcR-gamma-chain deficient mice develop disease with a much lower frequency and reduced severity. Depletion of CD4 positive T cells completely prevents disease and depletion during disease leads to an rapid resolution of arthritis. Aside this, complement and TNF-alpha is critical for the development of arthritis, which could shown by depletion of C5 and blockade of TNF-alpha. In addition, the role of G6PI in the pathogenesis of RA in humans was examined. RA patients do not show a higher frequency of CD4 positive T-cells which produce TNF-alpha and IFN-gamma after restimulation with G6PI. Furthermore, no elevated anti-G6PI titers could be detected in RA patients and in patients with other rheumatic diseases.

Obwohl B-Zellen in der Pathogenese der Rheumatoide Arthritis (RA) eine wichtige Rolle spielen, ist über ihre Aktivierung und Differenzierung im Synovialgewebe (SG) nicht viel bekannt. Ein Merkmal von RA ist das Auftreten von Autoantikörpern (auto-AK). Trotz dessen sind bisher kaum Daten über den Einfluss des SG auf die auto-AK-Produktion und die Frequenz autoreaktiver synovialer B-Zellen bekannt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung der synovialen B-Zell-Antwort und der Spezifität synovialer B-Lymphozyten. Dazu wurden B- und Plasmazellen (PC) aus dem Synovialgewebe von RA-Patienten mittels Mikrodissektion und Durchflusszytometrie isoliert und ihr Immunglobulin(Ig)-Repertoire bestimmt. Die Analyse der VH-Gene zeigte, dass sowohl naive als auch Gedächtnis-B-Zellen in das SG einwandern können. Ein Vergleich der VDJ-Rearrangements aus B-Zellen und PC belegte, dass hauptsächlich Gedächtnis-B-Zellen Antigen-abhängig aktiviert werden, klonal expandieren und zu PC differenzieren. Dabei können aktivierte B-Zellen ihre Ig-Klasse wechseln. Im Gegensatz dazu wurden nur rudimentäre Anzeichen somatischer Hypermutation nachgewiesen. Um die Spezifität synovialer B-Lymphozyten zu ermitteln, wurden rekombinante AK aus synovialen B-Zellen und PC generiert. Der Polyreaktivitätstest zeigte, dass naive B-Zellen aus dem SG einen hohen Anteil polyreaktiver Zellen besitzen. Im Gegensatz dazu ist die Frequenz von autoreaktiven Gedächtnis-B-Zellen und PC gegenüber naiven B-Zellen erhöht. Daneben konnten auch spezifische AK gegen bakterielle Antigene (insbesondere gegen Parodontitis-auslösende Bakterien) und gegen das Auto-Ag MCV identifiziert werden. Eine Affinitätsmessung des MCV-spezifischen Auto-AK zeigte, dass im SG sezernierte Auto-AK eine sehr hohe Affinität erreichen können. Die hier gewonnenen Daten verdeutlichen, dass B-Lymphozyten entscheidend an der Aufrechterhaltung oder gar Entstehung von RA beteiligt sind / Although B cells have an important impact on the pathogenesis of Rheumatoid arthritis (RA) still surprisingly little is known about their activation and differentiation within the inflamed synovial tissue (ST). A hallmark of RA is the presence of auto-antibodies (auto-Ab). However, still little is known about the frequency of self reactive synovial lymphocytes and it is unclear to which extent the inflamed ST contributes to auto-Ab production. These thesis deals with the characterization of the synovial B cell response and the specificity of synovial B lymphocytes. B and plasma cells (PC) from RA patients were isolated either by Laser Capture Microdissection or by FACS and their immunoglobulin(Ig)-repertoire was determined. The analysis of the VH-genes revealed that both naïve and memory B cells can immigrate the ST. A comparison of VDJ-rearrangements of B cells and PC showed that in ST without ectopic germinal centres mainly memory B cells become activated, expand clonally and differentiate into PC. During this process B cells can switch their Ig-class but do only hypermutate slightly. To determine the specificity of synovial B lymphocytes, recombinant Ab from synovial B cells and PC were generated. The polyreactivity assay showed that particularly naïve B cells were polyreactive. In contrast, the frequency of autoreactive memory B cells and PC was much higher than that of naïve B cells. In addition, Ab specific for bacterial antigens (especially for periodontal bacterias) and for the autoantigen MCV were identified. The affinity measurement of the MCV-specific autoantibody revealed that auto-Ab secreted in the ST can exhibit very high affinities. The data presented here show that B cells seem to play an important role in the maintenance and possibly the development of RA.

Thyronamine (TAM) sind eine neue Molekülklasse, die endokrinologische und metabolische Prozesse miteinander vereinen. Der biologisch aktive Metabolit 3-Iod-L-Thyronamin (3-T1AM) wird durch eine kombinierte Deiodierung und Decarboxylierung von Schilddrüsenhormonen (TH) gebildet. Existierende Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von 3-T1AM im menschlichen Serum sind immer noch umstritten. Auch die an der Biosynthese vermutlich beteiligte TH-Decarboxylase konnte noch nicht identifiziert werden. Für die Identifizierung und Quantifizierung von TH und TAM Profilen wurde die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) verwendet. In der bisherigen präanalytischen Aufarbeitung liefern weder Flüssig-Flüssig- noch Festphasenextraktionen reproduzierbare Ergebnisse des 3-T1AM-Gehalts im Serum. Mit der Entwicklung eines spezifischen Extraktionsverfahrens und nachfolgender Detektion mittels LC-MS/MS gelang der gleichzeitige Nachweis der häufigsten TH im humanen Serum. Parallel dazu wurden monoklonale Antikörper gegen 3-T1AM entwickelt, auf deren Basis ein quantitativer 3-T1AM Chemilumineszenz-Immunoassay entstand. Ergebnisse aus klinischen Kollektiven zeigen, dass 3-T1AM im Serum im nM Konzentrationsbereich vorkommt und dass 3-T1AM bei Patienten außerhalb der Schilddrüse produziert wird. Viele Forscher gehen davon aus, dass die aromatische L-Aminosäure Decarboxylase (AADC) die Synthese von TAM über Decarboxylierung von TH katalysiert. Diese Hypothese wurde durch Inkubation von rekombinanter humaner AADC mit TH getestet. In keinem der Experimente konnte AADC die Decarboxylierung von TH katalysieren. Zusammenfassend ist die Bestimmung von 3-T1AM im Serum mittels LC-MS/MS aufgrund der nicht reproduzierbaren präanalytischen Probenaufbereitung problematisch. In dieser Arbeit wird der erste MAb-basierte 3-T1AM assay vorgestellt, der 3-T1AM zuverlässig in humanem Serum quantifiziert. Die AADC ist wahrscheinlich nicht an der Biosynthese von TAM beteiligt. / Thyronamines (TAM) are a new class of molecules linking endocrinology and metabolism. Combined deiodination and decarboxylation of thyroid hormones (TH) generates a biologically active ‘cooling’ metabolite, 3-iodo-L-thyronamine (3-T1AM).. It remains controversial, which methods are able or not to reliably detect 3-T1AM in human serum, and the presumed TH decarboxylase is still elusive. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was used for the simultane-ous identification and quantification of TH and TAM profiles in biological samples. Several preanalytical methods were tested for complete extraction of 3-T1AM in human serum. Thus far, neither liquid-liquid nor solid-phase extraction methods allowed reproducible extraction of 3-T1AM from human serum samples in the preanalytical sample workup. Nevertheless, a rapid and sensitive extraction procedure was developed for detection of the major TH by LC-MS/MS in a single human serum sample. In parallel, monoclonal antibodies (MAb) targeting 3-T1AM were developed and characterized, and a highly specific quantitative 3-T1AM MAb-based chemiluminescence immunoassay was developed. Studies in clinical cohorts provide evidence that 3-T1AM is present in human serum in the nM concentration range and that 3-T1AM is produced extrathyroidally. Many researchers have reasoned that the aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) mediates TAM synthesis via decarboxylation of TH. This hypothesis was tested by incubating recombinant human AADC with several TH. In all tested conditions, AADC failed to catalyze the decarboxylation of TH. These in vitro observations are supported by the finding that 3-T1AM is also present in plasma samples of patients with AADC deficiency. In summary, 3-T1AM detection in serum using LC-MS/MS encounters preanalytical problems. The first MAb-based 3-T1AM CLIA is presented, which reliably quantifies 3-T1AM in human serum. AADC is likely not involved in TAM biosynthesis.