Die Modifizierung von Proteinsequenzen unter anderem durch den Austausch von Aminosäuren ist ein zentraler Aspekt in evolutionären Prozessen. Solche Prozesse ereignen sich nicht nur innerhalb großer Zeiträume und resultieren in der Vielfalt des Lebens, das uns umgibt, sondern sind auch täglich beobachtbar. Diese mikroevolutionären Prozesse bilden eine Grundlage zur Immunabwehr höherer Wirbeltiere und werden durch das humorale Immunsystem organisiert. Im Zuge einer Immunantwort werden Antikörper wiederholt der Diversifizierung durch somatische Hypermutation unterworfen. Ziele dieser Arbeit waren, neue Kenntnisse über die Mikroevolution von Antikörpern während der Immunantwort zu gewinnen und die Beziehung zwischen Aminosäureaustauschen und Affinitätsänderungen zu verstehen. Zu diesem Zweck wurde zunächst gezeigt, dass die SPOT Synthese eine präzise Methode ist, um Signalintensitäten drei verschiedenen Bindungsaffinitätsklassen zuzuordnen. Antikörper-Peptid Bindungsdaten, die aus SPOT Synthese Experimenten generiert wurden, bildeten die Grundlage zur Konstruktion der Substitutionsmatrix AFFI - der ersten Substitutionsmatrix, die ausschließlich auf Bindungsaffinitätsdaten beruht. Diese bildete die Grundlage für die Gewinnung eines reduzierten Aminosäuresatzes. Durch einen theoretischen Ansatz konnte gezeigt werden, dass der reduzierte Aminosäuresatz eine optimale Basis für die Epitopsuche darstellt. Für den Prozess der somatischen Hypermutation und Selektion wurde ein neuer Ansatz präsentiert, um für die Affinitätsreifung relevante Mutationen zu identifizieren. Die Analyse zeigte, dass das Spektrum der selektierten Mutationen viel umfangreicher ist als bisher angenommen wurde. Die Tatsache, dass auch einige stille Mutationen stark bevorzugt werden, deutet darauf hin, dass entweder die intrinsische Mutabilität stark unterschätzt wurde oder, dass Selektion nicht nur auf Affinitätsreifung von Antikörpern basiert sondern auch auf ihrer Expressionsrate. / A central task of the evolutionary process is the alteration of amino acid sequences, such as the substitution of one amino acid by another. Not only do these amino acid changes occur gradually over large time scales and result in the variety of life surrounding us, but they also happen daily within an organism. Such alterations take place rapidly for the purposes of defense, which in higher vertebrates, is managed by the humoral immune system. For an effective immune response, antibodies are subjected to a micro-evolutionary process that includes multiple rounds of diversification by somatic hypermutation resulting in increased binding affinity to a particular pathogen. The goal of this work was to provide insights into the microevolution of antibodies during the immune response, including the relationship between amino acid substitutions and binding affinity changes. A preliminary step in this work was to determine the accuracy of the SPOT synthesis technique, which could be shown to be an accurate method for assigning measured signal intensities to three different binding affinity classes. A substitution matrix based on data produced with these binding experiments was constructed and named AFFI. AFFI is the first substitution matrix that is based solely on binding affinity. A theoretical approach has additionally revealed that an AFFI-derived reduced set of amino acids constitutes an optimal basis for epitope searching. For the process of somatic hypermutation and selection, a novel approach to identify mutations relevant to affinity maturation was presented. The analysis revealed that the spectrum of mutations favored by the selection process is much broader than previously thought. The fact that particular silent mutations are strongly favored indicates either that intrinsic mutability has been grossly underestimated, or that selection acts not only on antibody affinity but also on their expression rates.

Die Transplantation von porzinen Organen könnte eine Lösung des akuten Mangels von Allotransplantaten in der Transplantationsmedizin darstellen. Bevor die Xenotransplantation klinische Realität werden kann, sind jedoch zahlreiche Hürden zu überwinden. Insbesondere die mögliche Übertragung porziner endogener Retroviren (PERVs), die integraler Bestandteil des porzinen Genoms sind, stellt ein mikrobiologisches Risiko dar. PERVs können humane Zellen in vitro produktiv infizieren. Mögliche Strategien zur Abwehr von Xenosen sind die Verwendung von PERV-knockout Tieren oder die Entwicklung eines effektiven Impfstoffes, durch den der Transplantatrezipient vor einer möglichen Übertragung geschützt werden kann. Dazu wurden Antiseren gegen die Hauptstrukturproteine von PERV generiert. Es konnte gezeigt werden, dass in Ziegen und Ratten durch Immunisierung mit der rekombinant generiereten Ektodomäne des transmembranen Hüllprotein p15E neutralisierende Antikörper induziert werden konnten. Die Epitopkartierung der induzierten Antikörper zeigt eine Bindung an eine Domäne im N-terminalen, nahe des Fusionspeptids (E1, GPQQLEK) und eine Domäne im C-terminalen, membranproximalen (E2, FEGWFN) Bereich der p15E-Ektodomäne. Diese Sequenzen sind in allen PERVs identisch und innerhalb der Gammaretroviren hochkonserviert. Aus AIDS-Patienten isolierte neutralisierende Antikörper (mAb2F5: ELDKWA, mAb4E10: LWNWFN) binden ebenfalls an den C-terminalen Bereich der Ektodomäne des Transmembranproteins gp41. Der Bindungsmechannismus dieser Antikörper wurde in ELISA-Experimenten und in vitro-Inhibitionsassays analysiert. Die Ergebnisse legen die Bindung eines Konformationsepitopes nahe, das aus der E1 und der E2 Domäne gebildet wird. Die Aufklärung des Bindungsmechnismus breit neutralisierender Antikörper gegen Transmembranproteine von Retroviren könnte die Basis für neue Impfstoffansätze darstellen. / Porcine xenotransplants may offer a potential solution to the problem posed by the limited supply of allotransplants. However, xenotransplantation may be associated with the risk of transmission of microorganisms, in particular of porcine endogenous retroviruses (PERVs) that are an integral part of the porcine genome and able to infect human cells in vitro. Possible strategies to prevent virus transmission include the development of PERV knockout animals or of effective vaccines. When antisera prepared against the main structural proteins of PERV were screened, goat and rat antisera against the recombinant ectodomain of the transmembrane envelope protein p15E were found to neutralize PERV infectivity. Epitope mapping using overlapping peptides revealed two epitopes, one near the fusion peptide (E1, GPQQLEK) and the other near the transmembrane domain (E2, FEGWFN). These sequences are identical for all PERVs and are highly conserved among all gammaretroviruses. Interestingly, neutralizing antibodies isolated from AIDS patients that recognize regions partially homologous with E2 (mAb4E10, LWNWFN) or located in close proximity to E2 (mAb2F5, ELDKWA) are known to neutralize a broad range of HIV-1 strains. The binding mechanisms of these HIV neutralizing antibodies were analyzed in ELISA experiments and in vitro inhibition assays. The results indicate that the two most broadly reactive HIV-1 envelope gp41 human mAbs are specific for a discontinuous epitope composed of the E1 and the E2 domain. If so, these two transmembrane protein domains in different retroviruses act as effective targets for neutralizing antibodies and may provide the basis for effective antiretroviral vaccines.

Apoptoseresistenzmechanismen spielen bei der Pathogenese maligner Lymphome eine zentrale Rolle. So konnte bei Hodgkin/Reed-Sternbergzellen eine Deregulation des Transkriptionsfaktors NF-_B beobachtet werden, die zu verstärkter Apotoseresistenz führt und so zum malignen Wachstum dieser Zellen wahrscheinlich entscheidend beiträgt. Es konnte gezeigt werden, dass die selektive Blockade von NF-_B sowohl zu erhöhter Apoptosesensitivität als auch zur Inhibition der Zellzyklusprogression in kultivierten Hodgkinzellen führt. Der genaue molekulare Mechanismus der NF-_B-Deregulation in Hodgkinzellen ist jedoch noch unklar. Apoptoseresistenzmechanismen sind nicht nur bei der Pathogenese maligner Lymphome, sondern auch bei der Entstehung von Therapieresistenz von Bedeutung. So konnte gezeigt werden, dass die Überexpression proapoptotischer Gene der bcl-2 Familie in resistenten malignen Zellen sowohl die Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika als auch gegenüber Antikörperbehandlung wiederherstellen kann. Neben der bcl-2 Familie spielt wahrscheinlich auch das Apo-I/Fas-System eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Zytostatikaresistenz und immunologischer Resistenz. Somit stellt neben der Überexpression des P-Glykoproteins (MDR1), das als transmembranes "Pumpenprotein" Zytostatika aus der Tumorzelle heraustransportieren kann, die Deregulation Apoptose-steuernder Gene einen weiteren wichtigen Therapie-Resistenzmechanismus dar. Eine Möglichkeit, intrazelluläre Resistenzmechanismen zu umgehen, stellt die indirekte Induktion von Zelltod mit Hilfe bispezifische Antikörper dar. Durch diese Moleküle kann eine T-Zell-vermittelte Zellyse von Lymphomzellen erreicht werden. / Resistance towards apoptosis plays an important role in the pathogenesis of malignant lymphomas. It could be demonstrated that deregulation of the transcription factor NF-kB is a common molecular defect of Hodgkin/Reed-Sternberg cells that leads to enhanced resistance towards apoptosis and therefore probabaly contributes to the malignant growth of these cells. It couldbe shown that blocking of NF-kB leads to increased sensitivity towards apoptosis and decreased cell cycle progression. The precise molecular mechanism that leads deregulation of NF-kB is still unknown. Besides its role in the pathogenesis of malignant lymphoma resistance towards apoptosis plays an important role in the development of drug resistance. It could be shown that overexpression of pro-apoptotic members of the bcl-2 family in resistant tumor cells can restore sensitivity towards both cytotoxic drugs as well as antibody treatment. In addition to the bcl-2 family the Apo-I/Fas system is also involved in the development of drug resistance. Thus, besides overexpression of p-glycoprotein (MDR-1) that might pump cytotoxic drugs out of a malignant cell deregulation of apoptosis regulating genes is another important mechanisms of drug resistance development. One possibility to overcome drug resistance is the induction of cell death via bispecific antibodies. These molecules can induce T cell mediated lysis of lymohoma cells.

CD4+ T-Helferzellen (Th) entwickeln sich zu Th1 und Th2 Zellen, die nach ihrer Funktion und Zytokinexpression eingeteilt werden. Die differentielle Induktion von Th Zellen, die Th1 oder Th2 Zytokine exprimieren, ist der Schlüssel zur Regulation von Immunantworten bei Infektionskrankheiten, Allergien und Autoimmunerkrankungen. Daher können stabil exprimierte Oberflächenmoleküle, die spezifisch für die funktionell unterschiedlichen Th Zellen sind, von besonderer Bedeutung für die Analyse und selektive funktionelle Modulation von Th Subtypen sein und erlauben es neue therapeutische Strategien für die Behandlung von allergischen und Autoimmunerkrankungen zu etablieren. TIM-3 wurde kürzlich identifiziert als ein Molekül, welches selektiv auf der Oberfläche von Th1 Zellen exprimiert wird und welches möglicherweise eine Rolle bei der Induktion von Autoimmunerkrankungen spielt. Um monoklonale Antikörper gegen humanes TIM-3 zu produzieren, wurde die humane TIM-3 cDNA von in vitro generierten dendritischen Zellen kloniert. Der extrazelluläre Teil des Gens wurde in den prokaryotischen Expressionsvektor pQE100S insertiert und in E.coli BL21(DE3) exprimiert. Die gesamte codierende Sequenz wurde in den eukaryotischen Expressionsvektor pIRES2EGFP subkloniert und auf der Oberfläche von Säugetierzellen exprimiert. Stabile Transfektanten der CHO-K1 und HEK293 Zelllinie wurde etabliert. Die Balb/c Mäuse wurden mit löslichem und unlöslichem rekombinanten humanem TIM-3 sowie mit stabilen Transfektanten für humanes TIM-3 immunisiert. Milzzellen dieser Tiere wurden mit der Myelomzelllinie P3 X 63 Ag8.653 fusioniert. Die entwickelten Hybridome wurden im ELISA und mittels FACS auf Spezifität gegen humanes TIM-3 hin untersucht. Ein Klon der generierten Hybridome war positiv im ELISA zeigte jedoch kein Signal gegen TIM-3 auf der Oberfläche von Zellen. / CD4+ T helper (Th) cells develop into effector Th1 and Th2 cells, which are frequently categorized according to their function and cytokine expression. The differential induction of Th cells expressing Th1 or Th2 cytokines is key to the regulation of immune responses by infectious diseases, allergies and autoimmnune diseases. Thus, stably expressed surface molecules, significant for functionally different types of Th cells could be of utmost importance for the analysis and selective functional modulation of Th subsets and provide new therapeutic strategies for the trestment of allergic or autoimmune diseases. TIM-3 was recently identified as a molecule that is selectively expressed on the surface of Th1 cells and that may have a role in the induction of autoimmune disease. To produce monoclonal antibody of human TIM-3, the human TIM-3 cDNA was cloned from in vitro generated dendritic cells. The extracellular domain of human TIM-3 was inserted into prokaryotic expression vector pQE100S and expressed in E.coli BL21(DE3). The whole coding region was subcloned into eukaryotic expression vector pIRES2EGFP and expressed on the surface of mammalian cells. The stable transfectants of CHO-K1 and HEK-293 cell line was established. The BALB/c mice were immunized with soluble and insoluble recombinant human TIM-3 and also with stable transfectants. Splenocytes were fused with P3 X 63 Ag8.653 myeloma cells. The generated hybridomas were tested in ELISA and FACS for specificity against human TIM-3. A generated clone was positive in ELISA but did not respond to the TIM-3 molecule on the cell surface.

Therapeutische Erfolge von IVIG sind gut dokumentiert, aber die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch nicht vollständig erforscht. Molekulare Analysen unseres Labors über die Interaktion von IVIG mit Fabs von Patienten, die an einer autoimmunen Thrombozytopenie (ITP) leiden zeigten, dass die am häufigsten selektierten Fab von den V3-23 und V3-30 VH-Keimbahngenen abstammten. Eine weitere Studie mit IgG und IgM Phagen-Display Bibliotheken von einem gesunden Spender zeigten ebenfalls eine bevorzugte Reaktivierung von IVIG mit Fabs vom Ursprung der V3-23 und V3-30 Gene. Es konnte gefolgert werden, dass diese Interaktion von IVIG mit Fabs von diesen zwei VH-Genen weder alleine auf den Gesundheitsstatus des Spenders zurückzuführen war, noch auf eine zuvor erfolgte Behandlung mit IVIG. Diese Dissertation wurde unter Verwendung der Phagen-Display Technologie unternommen, um die molekulare Interaktion von IVIG mit Antikörpern zu erforschen, die von einem Patienten kloniert wurden, der an einem systemischen Lupus erythematodes und rheumatischem Fieber leidet. Die Resultate waren mit den früheren Studien zu vergleichen, insbesondere mit den Daten eines Patienten, der zu der ITP einen Lupus entwickelte. 23 Fabs, welche 7 unabhängige Klone repräsentierten, wurden isoliert. Im Gegensatz zu von Patienten mit ITP abstammenden Klonen reagierte keines von den in dieser Studie selektierten Fabs mit Thrombozyten. Die über IVIG gebundene Fab-Phagen stammten hierbei ausschließlich von den V3-23 und V3-30 VH-Genen ab. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass von diesen Fabs verschiedene CDR3 Regionen einschließlich verschiedenen D- und JH-Gensegmenten benutzt wurden. Die Ergebnisse zeigten weiterhing, dass die Bindung von IVIG an die Fabs unabhängig von der Leichten Kette war. Ihrem Keimbahngen-Ursprung entsprechend hatten die Fabs Aminosäuren an Positionen in den FR1, FR3 und im 3'-Ende von CDR2, die dafür bekannt sind, dass sie für die Bindung des B-Zell-Superantigens Staphylococcus Protein A (SpA) essentiell sind. Es wurde gezeigt, dass sich zwar einige von den Fabs stark an SpA banden, aber keine Korrelation in der Intensität zur Bindung mit IVIG vorlag. Einige Fabs zeigten eine schwache Bindung an HIV gp120, einem anderen B-Zell-Superantigen. Zusammenfassend lässt sich aus der vorliegenden Studie und den vorherigen Ergebnissen schließen, dass ein Anteil von IVIG wie ein B-Zellen Superantigen funktionieren könnte, das für die Bildung und Regulation des normalen B-Zellen Repertoires wichtig ist. Der Bindungsmechanismus scheint ähnlich, aber nicht identisch mit dem der anderen getesteten B-Zellen-Superantigene zu sein. / The beneficial therapeutic effects of IVIG are well documented, but the underlying molecular mechanisms are not fully understood. Recent investigations from our laboratory into the molecular analysis of Fabs bound by IVIG from patients suffering from autoimmune thrombocytopenia revealed that the most frequently selected Fabs originated from the V3-23 and V3-30 VH germline genes. A subsequent study with IgG and IgM phage display libraries from a healthy donor also demonstrated a preferential reactivity of IVIG to Fabs of V3-23 and V3-30 origin. That study revealed that the unique reactivity of IVIG to Fabs of these two VH gene loci was not restricted to the autoimmune nature of the donors, neither to previous treatment with IVIG. One of the thrombocytopenia patients developed lupus. This study was undertaken to study the molecular interaction of IVIG with antibodies selected from a patient suffering from systemic lupus erythematosus and rheumatic fever using phage display technology, and to compare the results with the previous studies. Twenty-three Fabs representing seven independent clones were isolated. In contrast to ITP-derived clones, none of the Fabs selected in this study reacted with platelets. The Fab phages bound by IVIG were sequenced in order to determine their VH gene usage and clonal relatedness. V3-23 and V3-30 VH genes were found to be exclusively utilized by the Fab phages bound by IVIG. Moreover, different CDR3 regions including different D and JH gene segments were observed to be used by these Fabs. The results further showed that the binding of IVIG to the Fabs was independent of the light chain since different light chains were observed to be associated with the VH3 immunoglobulins. Detailed sequence analysis of the Fabs revealed the presence of amino acid residues at positions within FR1, FR3, and the 3' end of CDR2 that are known to be contacted by the B cell superantigen Staphylococcus protein A (SpA). Some of the Fabs were shown to bind strongly to SpA, but there was no correlation with the binding-intensity to IVIG. Some bound very weakly to HIV gp120, another B cell superantigen. This study, together with previous results, suggests that a subset of IVIG may function as a B cell superantigen that may significantly shape the B cell repertoire. The binding mechanism appears to be similar but not identical to the other tested B cell superantigens.

Die humorale Immunantwort eines Organismus auf ein Pathogen äußert sich in einer Veränderung des Antikörperrepertoires. Eine quantitative Untersuchung dieses Prozesses erfordert aufgrund der enormen Komplexität des Immunsystems, die Verwendung von Hochdurchsatztechniken, wie Peptid-Mikroarrays. Bisher gibt es nur wenige Studien, die die Verlässlichkeit von Mikroarray-Bindungsmessungen untersuchen. In dieser Arbeit werden Bewertungskriterien für die Qualität von Antikörper-Peptid-Bindungsstudien unter Verwendung der Peptid-Mikroarraytechnologie herausgearbeitet, mit dem Ziel, diese Hochdurchsatzmethode für qualitative und quantitative Antikörper-Peptid-Bindungsmessungen zu optimieren. Anhand eines Modellsystems, das aus dem monoklonalen anti-p24 (HIV-1) Antikörper CB4-1 und 26 verschiedenen Peptiden, die mit unterschiedlicher Affinität an CB4-1 binden, besteht, werden systematisch die Bindungsdissoziationskonstanten der jeweiligen Antikörper-Peptid-Komplexe mit den durch Peptid-Mikroarray-Bindungsmessungen erhaltenen Signalintensitäten verglichen. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit die Messung von Serumantikörperbindungsprofilen gegenüber Zufallspeptidbibliotheken als Methode der serologischen Diagnostik verwendet. Anhand dreier Beispieldatensätze wird die serologische Diagnose von Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten und von Krebs mittels Zufallspeptid-Mikroarrays demonstriert. Mithilfe von Merkmalsselektion werden Peptide selektiert, die besonders geeignet sind, um zwischen gesunden und kranken Individuen zu unterscheiden. Besondere Bedeutung wird der Untersuchung der Robustheit der Methode gegenüber schwankenden experimentellen Bedingungen beigemessen. Die vorliegende Arbeit gibt Aufschluss über vorhandene Probleme der Mikroarray-Technologie, stellt Lösungsansätze vor und arbeitet bedeutende Weiterentwicklungen auf dem Weg hin zu einer minimal-invasiven serologischen Diagnostik heraus, die kein a priori Wissen über Antigene voraussetzt. / The humoral immune response to a pathogen is associated with specific changes in the antibody repertoire. Because of the enormous complexity of the immune system, a quantitative determination of this process requires high-throughput measuring tools, such as the peptide microarray technology. There are only few reports that determine the technological reliability of peptide microarray studies. By using a model system, composed of the anti-p24 (HIV-1) monoclonal antibody CB4-1 and an array of 26 different peptides for which the CB4-1 binding affinity has independently been measured, the dissociation constants of antibody-peptide complexes are systematically compared with obtained signal intensities. The assignment of serum-antibody binding profiles using random peptide microarrays for the purpose of serological diagnostics constitutes a major part of this work. By means of three sample data sets, the ability of random peptide microarrays to serve as method of serological diagnosing infectious diseases, autoimmune diseases and cancer is demonstrated. By means of feature selection, the peptides that are exceptionally appropriate to discriminate between the investigated groups are identified. This study attaches special importance to the reliability and robustness of extracted microarray data. This thesis indicates present problems of the peptide microarray technology and presents further developments on the way to minimal-invasive serological diagnostics that do not require any a priori knowledge about antigens, and thus about the investigated diseases.

Homogene Immunoassays sind immunologische Testverfahren, bei deren Durchführung vollständig auf Separations- und Waschschritte verzichtet werden kann. Der Substrate Channeling Immunoassay beruht auf der Weitergabe eines Substrates in einem immunologischen Komplex aus zwei Enzymen. Das Produkt des ersten Enzyms dient dem zweiten Enzym als Substrat zur Generierung eines photometrisch nachweisbaren Produktes. Voraussetzung für diese Weitergabe ist die enge räumliche Nähe beider Enzyme. Diese Nähe wird durch eine Bindung zwischen Analyt und anti-Analyt Antikörper vermittelt. Ein solcher Substrate Channeling Immunoassay wurde unter Verwendung der Enzyme Glucoseoxidase und Peroxidase aufgebaut. Das so etablierte System war funktionstüchtig, jedoch blieb seine Sensitivität hinter der normaler, heterogener Immunoassays zurück. Die Grundlage eines Fluorescence Quenching Immunoassays ist der gegenseitige Ausschluß zweier Antikörper bei der Bindung eines Dihapten-Konjugates. Das Konjugat besteht dabei aus dem Analyten und einem Fluorophor. Die beiden um die Konjugatbindung konkurrierenden Antikörper sind ein anti-Analyt Antikörper und ein anti-Fluorophor Antikörper, der zudem über die Eigenschaft verfügt, bei Bindung des Fluorophors dessen Fluoreszenz zu löschen. Externe Gaben des freien Analyten verschieben das eingestellte Gleichgewicht in Richtung Fluorophor-Bindung und damit Fluoreszenz-Löschung. Die Änderung der Fluoreszenz ist direkt an die Konzentration des freien Analyten gekoppelt und dient zu deren Bestimmung. Ein solcher Fluorescence Quenching Immunoassays wurde für die Konzentrationsbestimmung des Herbizides Diuron etabliert. Die erreichten Sensitivitäten erlauben die praktische, immundiagnostische Anwendung des Systems. Ein Dihapten-Konjugat wurde ebenfalls zum Aufbau eines Verfahrens zur Selektion Antikörper produzierender Zellen eingesetzt. Die Selektion der Antikörper produzierenden Zellen erfolgt unter Verwendung eines Toxinkonjugates. Dieses Konjugat besteht aus einem Liganden und einem Toxin. Die Antikörperbindung des Liganden behindert sterisch die Wechselwirkung der Toxinkomponente im Konjugat mit deren Zielstruktur in oder auf der Zelle. Nur Zellen die einen geeigneten Antikörper sezernieren, überleben die Selektion und reichern sich in der Kultur an. Das Selektionsverfahren wurde erfolgreich für die Selektion von E.coli Zellen eingesetzt, die einen rekombinanten, Fluorescein bindenden Antikörper produzierten. Das hierfür synthetisierte Toxinkonjugat bestand aus Fluorescein (Ligand) und Ampicillin (Toxinkomponente). Eine Ablösung der bisher für diese Aufgabe gebräuchlichen, außerordentlich kostenintensiven, Screening Methoden wird damit möglich. / Homogeneous immunoassays are test systems which do not depend on separation steps. The substrate channeling immunoassay is based on the product/substrate transfer in an immunological complex built up by two enzymes. The product of the first enzyme functions as substrate for the second enzyme. The second enzyme generates a photometrically detectable product. The close proximity of these two enzymes is the basis of the substrate channeling. This proximity is created by antibody binding to the corresponding analyte. The enzymes glucose oxidase and peroxidase were used for the development of such an assay system. The established homogeneous immunoassay was functional. But the sensitivity of the assay was much lower than that of conventional heterogeneous immunoassays. The principle of a fluorescence quenching immunoassay is based on the fact that two antibodies exclude each other from binding to a dihapten conjugate. The conjugate consists of the analyte and the fluorophore. The two antibodies which compete for the conjugate binding are an anti-analyte antibody and an anti-fluorophore antibody. This anti-fluorophore antibody quenches the fluorescence of the fluorophore after binding. The addition of free analyte alters the equilibrium of the system so that the anti-fluorophore antibody is bound to the fluorophore and the fluorescence is quenched. The change in fluorescence is therefore an indicator of the concentration of free analyte added. A homogeneous fluorescence quenching immunoassay was established for the determination of the herbicide diuron. The sensitivities obtained allow the practical immunodiagnostic application of the system. A dihapten conjugate was also employed for the development of a selection method for antibody-producing cells. Toxin conjugates were used in this system. Each conjugate consisted of a ligand and a toxin. Antibody binding to the ligand sterically inhibits the toxin component to interact with its target structure. Only cells secreting a binding antibody will survive the selection and will accumulate in culture. The system was applied to the selection of E.coli cells producing a recombinant fluorescein-binding antibody. The toxin conjugate used in experiment consisted of fluorescein (ligand) and ampicillin (toxin component). This selection procedure allowed the isolation of recombinant antibody-producing E.coli cells. It has the potential to replace the time-consuming and labour-intensive methods used so far.

Trotz der längst etablierten und weit verbreiten Impfprophylaxe mit potenten Toxoidimpfstoffen sind dramatisch verlaufende Tetanusinfektionen noch immer im Alltag des Pferdepraktikers präsent. Dies gab Anlass, verschiedene Impfprotokolle und die daraus resultierende humorale Immunitätslage zu überprüfen. Kenntnis über die durch Vakzination erwirkte Tetanusimmunität ist im Falle der Versorgung von Verletzungen oder vor elektiven Eingriffen hinsichtlich der Entscheidung für oder gegen eine neuerliche aktive und/oder passive Immunisierung erforderlich. Weiterhin ermöglicht die Kontrolle auf Persistenz homologer maternaler Antikörper vor Durchführung der Erstvakzination eine optimale Impfprophylaxe. Für diese beiden Indikationen wurde der Fassisi® TetaCheck als direkt am Patienten anwendbarer Schnelltest entwickelt. Dieser Streifentest wurde mit besonderem Augenmerk auf der zuverlässigen Identifizierung nicht ausreichend geschützter Individuen und der Unempfindlichkeit gegenüber der Testdurchführung und Interpretation durch ungeschulte Personen evaluiert. Zunächst wurden 91 Serumproben von Klinikpatienten mit glaubhafter Impfanamnese mittels Doppel-Antigen-ELISA (DAE) untersucht. Neben der Bestimmung der Seroprävalenz protektiver Tetanustoxoid-Antikörperkonzentrationen (TTAK) von > 0,1 IE/ml in dieser Population wurden mögliche Einflussgrößen auf die Höhe der TTAK zum Zeitpunkt der Blutentnahme analysiert. Zu diesen zählten das Alter der Tiere, die Impfintervalle, der Zeitabstand zur letzten Vakzination und das gleichzeitige Verimpfen weiterer Komponenten. Der Tetanus-Streifentest (TST) wurde evaluiert, indem die durch zwei unabhängige Untersucher ermittelten qualitativen Resultate des Schnelltestes mit den mittels DAE quantifizierten Antitoxinkonzentrationen in 99 Serumproben retrospektiv verglichen wurden. Ergänzend erfolgte die objektive Quantifizierung der Farbreaktion im Testfeld des TST durch Fotografieren und anschließender Analyse mittels einer Bildbearbeitungssoftware. Die Seroprävalenz protektiver TTAK betrug 92,3 %. 89 % der untersuchten Pferde waren ihrem jeweiligen Alter entsprechend gemäß der ‚Leitlinie zur Impfung von Pferden‘, herausgegeben von der Ständigen Impfkommission Vet. des Bundesverbandes Praktizierender Tierärzte immunisiert. Fünf dieser Pferde waren jedoch nicht ausreichend geschützt. Hierzu zählten ein fünf Monate altes Fohlen, bei welchem die maternalen Antikörper bereits unter die Schutzgrenze abgefallen waren, zwei juvenile Pferde ohne abgeschlossene Grundimmunisierung und zwei adulte Pferde. Abweichungen von der Impfempfehlung bestanden ausschließlich in Form verlängerter Abstände der Wiederholungsimpfungen von drei bis zu acht Jahren. Trotzdem wiesen diese Tiere protektive TTAK auf. Unter alleiniger Betrachtung des Patientenalters wiesen alle geriatrischen Patienten (n = 12) TTAK weit oberhalb der Schutzgrenze auf. Hinsichtlich der Einhaltung unterschiedlicher Boosterintervalle unterschieden sich die TTAK nicht signifikant (p = 0,117). Der zeitliche Abstand zur letzten Tetanusimpfung ließ keine Prognose über die zu erwartenden TTAK zu. TTAK nach Impfung mit monovalenten Vakzinen unterschieden sich nicht signifikant von denen nach Durchführung einer Kombinationsimpfung (p = 0,63). Für den TST ergaben sich eine Sensitivität von 83,6 % und eine Spezifität von 100 %. Die Übereinstimmung der Untersucher hinsichtlich eines binären Resultats war fast vollkommen (K = 0,88). Die Durchführung des TST durch den jeweils anderen Untersucher hatte keinen maßgeblichen Einfluss auf die Auswertung des Teststreifens (K = 0,80 und K = 0,84). Durch Erweiterung des vom Hersteller vorgegebenen Bewertungsmaßstabes „negativ“, „schwach positiv“ und „positiv“ auf fünf unterschiedliche Farbintensitäten konnte eine bessere Differenzierung ungeschützter Individuen von Tieren mit belastbarer Immunität ermöglicht werden. Zwischen der objektiv gemessenen Farbintensität und der TTAK bestand ein positiver linearer Zusammenhang (r² = 0,74). Auf diesen Ergebnissen basierend sollte zur Vermeidung ineffektiver Immunisierungen vor der Erstvakzination eine Bestimmung der TTAK mit Vollendung des fünften Lebensmonats erfolgen. Hierzu erwies sich der Fassisi® TetaCheck aufgrund seiner Zuverlässigkeit und Unempfindlichkeit als überaus geeignet. Da auch das strikte Einhalten der Impfempfehlung keine ausreichende Seroprotektion garantiert und die Eintragungen im Pferdepass fehlerhaft sein können, kann nur über eine Bestimmung der TTAK Gewissheit über den tatsächlichen Immunstatus erlangt werden. Die routinemäßige Implementierung des TST in die Pferdepraxis kann dazu beitragen, die Notwendigkeit einer Immuntherapie zu diagnostizieren und damit unnötige und nebenwirkungsbehaftete TT- oder Antiserumgaben zu minimieren. Im zweijährlichen Abstand vorgenommene Wiederholungsimpfungen führen zu keiner besseren Immunitätslage gegenüber wesentlich längeren Impfintervallen. Die Impfempfehlung könnte daher ein acht- bis zehnjähriges Boosterintervall ausweisen. Die humorale Tetanusimmunität betreffend ergeben sich keine Nachteile bei gleichzeitiger Impfung weiterer Komponenten.

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