Desde o início do processo de africanização das abelhas Apis mellifera nas Américas em 1957, as abelhas africanizadas têm sido alvo de muitos estudos, sendo a variabilidade populacional um destes focos. Neste trabalho, populações Neotropicais de Apis mellifera do Brasil e do Panamá foram avaliadas quanto a sua variabilidade morfológica por morfometria tradicional, morfometria geométrica e pelo software de identificação automática de abelhas ABIS (Automatic Bee Identification System). Foram ainda avaliadas quanto à origem do DNA mitocondrial encontrado atualmente nas populações, bem como mudanças temporais nos perfis morfométricos e de DNA mitocondrial nas populações de Ribeirão Preto e do Panamá. Os resultados mostram que as populações brasileiras amostradas apresentam um gradiente de variação de tamanho, sendo que as abelhas do sul são significantemente maiores que as do norte do país, assim como as abelhas do princípio do processo de africanização em Ribeirão Preto e no Panamá são maiores que as populações atuais. Essas diferenças de tamanho podem refletir diferentes graus de mistura das populações ancestrais e também fatores ecológicos e ambientais. Entretanto, nenhuma correlação significante foi encontrada entre as medidas de tamanho de asa e altitude da localidade amostrada, fato este que nos indica que em nossas amostras, a variável altitude não interferiu no tamanho das asas das abelhas. No que diz respeito à variabilidade do formato das nervuras das asas das abelhas africanizadas, esta se mostra pequena e, apesar de distinto do formato de Apis mellifera scutellata, o formato das nervuras das abelhas africanizadas é mais parecido com o destas abelhas do que das demais subespécies formadoras do híbrido. O DNA mitocondrial das populações brasileiras de abelhas africanizadas apresentou-se quase que totalmente como sendo de origem africana à exceção de três colônias que apresentaram DNA mitocondrial como sendo de origem de subespécies do leste europeu. Quando a morfometria geométrica e o ABIS foram testado no quesito identificação populacional, ambos mostraram um desempenho muito fraco em identificar as populações de abelhas africanizadas, provavelmente devido ao alto fluxo gênico entre os grupos. Entretanto, quando tratamos de grupos mais distantes, como subespécies e populações isoladas, como é o caso da população de abelhas italianas (A. m. ligustica) de Fernando de Noronha, os dois métodos morfométricos se mostraram muito eficientes, com as taxas de acerto girando entre 85% e 100% na identificação de colônias de diferentes subespécies e da população de Fernando de Noronha. A população de Fernando de Noronha apresentou ainda um perfil morfométrico completamente diferenciado de Apis mellifera ligustica, subespécie que foi introduzida na ilha em 1984, podendo estas diferenças serem resultado de inbreeding, adaptação ambiental ou mesmo efeito gargalo das matrizes introduzidas. Desta maneira, as novas metodologias morfométricas utilizadas neste trabalho, embora não sejam precisas ou as mais apropriadas para identificar o grau de africanização das populações de abelhas africanizadas, se mostram muito promissoras no estudo da identificação das subespécies de Apis mellifera e mesmo de outras espécies de abelhas. / Since the release of the African bee Apis mellifera scutellata in Brazil in 1957, Africanized honey bees have been widely studied, though there are still unresolved questions about population variability. We examined the temporal and spatial variability of Apis mellifera populations from Brazil and Panama, using mitochondrial DNA, traditional morphometrics, geometric morphometrics and an Automatic Bee Identification System (ABIS). The populations from Ribeirão Preto, Brazil and Panamá were examined for temporal changes in their morphometric profiles and in mitochondrial DNA patterns. Bees from south Brazil were found to be significantly larger than those from the north and northeast. Bees collected at the beginning of the Africanization process were also found to be bigger than those collected recently. These differences in size may reflect different degrees of admixture of the founder subspecies and also environmental and ecological factors. No significant correlation was observed between the size of the wings and the altitude where the bees were sampled. When the patterns of wing venation were compared among the Africanized populations, we found little variation; though Africanized bees were found to be distinct from (African) A. m. scutellata, this group was most similar to the African pattern. The mtDNA of the Africanized populations was found to be almost completely of African origin, except for three of 394 colonies, which had the east European pattern. This nearly complete displacement may have been caused by nest usurpation by Africanized bees or due to a competitive disadvantage of hybrids with European maternity. We did not get good discrimination or identifications of the populations with ABIS and geometric morphometrics, probably due to the high rates of gene flow among the groups. However, when tested in more distinct groups, for example, subspecies and isolated populations, such as the Italian bees on Fernando de Noronha island, these two methods were very efficient, with identification rates of around 85% and 100%, respectively. The population of Italian bees (A.m. ligustica) on Fernando de Noronha presented a morphometric profile very different from that of A. m. ligustica, the subspecies introduced to the island in 1984. These differences could be a result of inbreeding, environmental adaptations or bottleneck effects. The two new morphometric methodologies, though they did not provide good discrimination of the Africanized populations, are very promising for studies of Apis mellifera subspecies and for identification of other bee species.

A alimentação diferencial durante o desenvolvimento das abelhas Apis mellifera desencadeia respostas endógenas em vias de sinalização e sistema endócrino, que promovem o desenvolvimento de fenótipos alternativos nas castas femininas. Rainhas e operárias diferem em sua fisiologia, morfologia, longevidade, função na colônia, comportamento, e principalmente, na ativação do sistema reprodutivo. Em relação aos ovários, resultados prévios baseados em ensaios de microarranjos revelaram um conjunto de genes como diferencialmente expressos (DEGs) em larvas de rainhas e operárias. Esse trabalho teve como objetivo analisar os padrões de expressão desses DEGs em mais detalhe em ovários larvais de rainhas e operárias. Com esse objetivo, foram selecionados 18 DEGs para validação por RTqPCR. Estas análises foram realizadas em ovários dissecados de rainhas e operárias em quatro estágios larvais que representam fases críticas no desenvolvimento ovariano (L4, L5F1, L5F2 e L5F3). Dentre os 18 DEGs candidatos, 11 foram confirmados como de fato diferencialmente expressos. Entre esses, quatro genes que codificam enzimas: short chain dehydrogenase reductase (GB54419), 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), SCPEP1-like gene (GB11273) e glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902), exibiram um pico de expressão em L5F1 em ovários de operárias. Dentre os dois genes relacionados à estocagem ou transporte de proteínas, o gene apolipoprotein III (GB20117) encontrou-se mais expresso em operárias enquanto que hexamerin 70b (GB10869) se mostrou superexpresso em ovários de rainhas. Os genes relacionados à tradução de mRNA e vias de sinalização: elongation factor 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) e mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) estavam significativamente superexpressos em ovários de rainhas. O gene OCLP-1 (GB19297), que possui uma função hipotética como inibidor de cistina foi encontrado como superexpresso em ovários de operárias. A fim de avaliar a modulação desses genes por hormônio juvenil, foi realizado o tratamento in vivo de larvas de operárias com aplicação tópica do hormônio. Após seis horas de tratamento, os ovários foram dissecados e as amostras analisadas por RT-qPCR. Dos onze DEGs testados para resposta a HJ, seis se mostraram significativamente modulados pelo hormônio Dois genes, short chain dehydrogenase reductase e heat shock protein 90, que também respondem a ecdisona, são up-regulados por HJ, enquanto os genes OCLP-1, hexamerin 70b, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase e apolipoprotein III eram downregulados. A expressão diferencial desses genes que codificam enzimas, proteínas de transporte/estocagem e fatores de vias de sinalização, indica que estes genes são importantes no desenvolvimento casta-especifíco dos ovários, uma vez que sua expressão está fortemente modulada durante os estágios em que ocorre a morte celular programada em ovários de operárias. / Differential feeding during larval development of the honey bee (Apis mellifera) triggers endogenous responses in signaling pathways and the endocrine system which promote the development of alternative phenotypes in the female castes. Queens and workers differ in physiology, morphology, longevity, function in the colony, behavior, and, especially so, the activation of the reproductive system. Concerning the ovaries, previous results based on microarray assays revealed a set of differentially expressed genes (DEGs) in queen and worker larvae.This project now aimed to further analyze the expression patterns of DEGs in the ovaries of larval workers and queens. From the microarray assays we selected a set of 18 DEGs for validation by qPCR. These analyses were performed on ovaries dissected from queens and workers of four larval stages representing critical phases of ovary development (L4, L5F1, L5F2, L5F3). Among the 18 DEG candidates, 11 were confirmed as differentially expressed. Four genes that code for enzymes: a short chain dehydrogenase reductase (GB54419), a 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), an SCPEP1-like gene (GB11273) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902) exhibited an expression peak at L5F1 in worker ovaries. Among the two genes encoding storage or transport proteins, apolipoprotein III (GB20117) was more expressed in workers and hexamerin 70b (GB10869) was overexpressed in queen ovaries. Among the genes related to mRNA translation and signaling pathways: elongation fator 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) and a mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) were found significantly overexpressed in queen ovaries. The gene OCLP-1 (GB19297), which has a hypothetical function as an inhibitor cystine knot peptide, was found higher expressed in worker ovaries. So as to evaluate the modulation of these genes by juvenile hormone, an in vivo treatment of workers larvae was performed with cuticular application of the hormone. After six hours of treatment, the ovaries were dissected and the samples analyzed by RTqPCR. Of the eleven DEGs tested for response to JH, six were significantly modulated by the hormone. Two genes, short chain dehydrogenase reductase and heat shock protein 90, which also respond to ecdysone, were up-regulated by JH, while OCLP-1 hexamerin 70b, 15- hydroxyprostaglandin dehydrogenase and apolipoprotein III were down-regulated.The differential expression of these genes encoding enzymes, storage/transport and signaling pathway proteins indicates that they are important in caste-specific ovary development, as their expression is strongly modulated during stages when programmed cell death takes place.

Os insetos desenvolveram um sistema imune eficiente contra parasitas e patógenos, que compreende a resposta celular e a humoral. Os mecanismos celulares envolvem a fagocitose e a encapsulação pelos hemócitos, enquanto que as respostas humorais incluem a ativação da Profenoloxidase, e a síntese pelo corpo gorduroso dos peptídeos antimicrobianos, que são liberados na hemolinfa. Duas vias de sinalização intracelular, Toll e Imd, controlam a expressão dos genes codificadores dos peptídeos antimicrobianos. A análise do Genoma da abelha Apis mellifera permitiu a identificação dos genes dessas vias. No entanto, pouco se conhece do mecanismo de resposta imune nessas abelhas. Desta maneira, nos propusemos analisar a transcrição de genes efetores da resposta imune (abaecina, hymenoptaecina, defensina, transferrina, profenoloxidase), assim como os genes integrantes das vias de sinalização, tais como os genes de reconhecimento de microorganismos (PGRP, GNBP) e ainda, os de sinalização (cactus, relish, dorsal 1-B). Avaliamos também possíveis proteínas implicadas na resposta imune, como as proteínas de estocagem Vitelogenina, Hexamerina 70a, Lipoforina I/II e Lipoforina III. Finalmente, analisamos o efeito da nutrição e do envelhecimento sobre a imunidade em abelhas. Para análise da expressão dos genes das vias de sinalização, as abelhas foram infectadas com bactérias Serratia marcescens ou Micrococcus luteus por injeção ou via alimentação. A infecção com esses microorganismos provocou a transcrição de peptídeos antimicrobianos e de transferrina em altas quantidades após 3 e 12 horas de tratamento, além da alteração na quantidade de transcritos de outros genes. O papel dos genes profenoloxidase e dorsal na imunidade, descritos como codificadores de importantes proteínas em outros insetos, foi avaliado através da metodologia de silenciamento gênico por RNA de interferência. Observamos a diminuição da transcrição do gene alvo, mostrando a eficiência da metodologia. No entanto, a simples injeção de um RNA de fita dupla foi capaz de ativar o sistema imune de abelhas. Este efeito contribuiu para a dificuldade de atribuição do papel da Profenoloxidase na imunidade de abelhas. Contudo, os resultados de silenciamento de dorsal e suas isoformas, nos levaram a considerar que dorsal 1-A ou dorsal 2 participam da via de sinalização intracelular para produção de peptídeos antimicrobianos, principalmente de defensina. Em relação às proteínas de estocagem, tanto a quantidade de transcritos quanto de proteínas diminui após infecção com bactérias, indicando que estas proteínas estão envolvidas de alguma forma no processo de imunidade em abelhas. Além disso, consumo de alimentos ricos em proteína aumentou os níveis de transcritos das proteínas de estocagem, o que muito provavelmente favorece a manutenção da capacidade de resposta imune de abelhas. O efeito do envelhecimento no declínio da imunidade foi analisado em abelhas nutridoras (novas) e forrageiras (velhas) de uma colônia típica. Além disso, foram utilizadas abelhas de uma colônia single-cohort, que eram de uma mesma idade, mas algumas eram nutridoras, enquanto outras eram forrageiras. Todas as abelhas, independentemente da idade ou comportamento, foram capazes de ativar o sistema imune após infecção pela bactéria S. marcescens. No entanto, as abelhas com o comportamento de forrageira, independentemente da idade, sempre foram mais susceptíveis a infecções que as nutridoras. Este fato se deve, muito provavelmente, às diferenças fisiológicas entre essas abelhas, que proporciona às nutridoras maior competência à sobrevivência. / Insects have developed an efficient immune system against parasites and pathogens, which is comprised of both cellular and humoral responses. The cellular mechanisms involve phagocytosis and encapsulation by hemocytes, whereas the humoral responses include activation of prophenoloxidase and synthesis of antimicrobial peptides by the fat body, which are released into the hemolymph. Two signaling pathways, Toll and Imd, control the expression of genes encoding antimicrobial peptides. Genome-wide analyses of the honey bee, Apis mellifera, have identified predicted genes for these signaling pathways. However, immune response mechanisms in honey bees were not yet in depth studied. We analyzed the transcription of effector genes (abaecin, hymenoptaecin, defensin, transferin, prophenoloxidase), as well as other immune genes, such as pathogen recognition genes (PGRP, GNBP) and signaling genes (cactus, relish, dorsal 1- B). We also investigated the role of the storage proteins Vitellogenin, Hexamerin 70a, Lipophorin I/II and Lipophorin III in the honey bee immunity. Finally, we analyzed the effect of nutrition and aging on honey bee immunity. Gene expression of signaling pathway components was assessed in honey bees that had been infected with the bacteria Serratia marcescens or Micrococcus luteus through injection or oral challenge. Honey bees infected with these microorganisms had strong up-regulation of antimicrobial peptide genes and of transferin, and also other changes in transcript abundance after 3 and 12 hours of challenge. The roles of prophenoloxidase and dorsal in the immune response, described as genes encoding important proteins in other insects, were also investigated. In this case we used RNA interference (RNAi) to silence the expression of these genes. RNAi efficiently silenced the target genes. However, injection of doublestranded RNA in honey bees induced a reaction by the immune system. This made it difficult to determine the role of prophenoloxidase in honey bee immunity. Yet, silencing of dorsal and its isoforms led us to consider dorsal 1-A or dorsal 2 as members of the signaling pathways that produce antimicrobial peptides, especially defensin. The abundance of storage proteins transcripts and proteins was lower in infected bees than in controls, giving evidence that these proteins participate in the immune process in honey bees. Moreover, protein consumption caused up-regulation of genes encoding storage proteins, which may favor the maintenace of the immune response capacity. The effect of aging on decline in immunity was analyzed in (young) nurse bees and (old) foragers from normal free-flying colony. We also examined bees from a single-cohort colony, in which all individuals were at the same age; but some were nursing, while others were foraging. All the bees, independent of age or behavior, were able to activate the immune system after infection with S. marcescens. However, foragers, independent of age, were always more susceptible to infections than were nurse bees. This is probably due to physiological differences between bees, which confers to the nurses more competence to survivorship.

Le parasite microsporidien Nosema ceranae est un pathogène émergent de l’abeille européenne (Apis mellifera). Il provoque une maladie appelée nosémose qui peut induire de fortes mortalités dans les colonies. La présence de N. ceranae dans les ruches n’est pas toutefois pas systématiquement associée à des symptômes ou à une dépopulation, ce qui suggère une variabilité de sa virulence. Une hypothèse proposée pour expliquer cette variation repose sur l'existence potentielle de variants parasitaires de niveaux de virulence différents. Ce travail a eu pour objectif d’évaluer le polymorphisme de N. ceranae par une approche multilocus, dans le but de savoir s’il est possible de différencier des isolats parasitaires. La diversité nucléotidique de dix marqueurs génétiques a été évaluée dans des abeilles géographiquement éloignées. L’analyse du polymorphisme de ces gènes a révélé un fort contenu allélique au sein même d'un individu hôte mais une absence de divergence entre les populations parasitaires issues d'hôtes distincts. Ces données montrent que cette approche multilocus ne permet de pas de différencier des isolats de N. ceranae, mais que des populations parasitaires similaires infectent des abeilles géographiquement distantes. Ces données sont en accord avec l'hypothèse d'une colonisation récente d'A. mellifera par N. ceranae mais posent de nombreuses questions quand à l'origine de la diversité parasitaire au sein d'un seul individu. Le second volet de cette thèse a eu pour objectif de rechercher dans le génome de N. ceranae des gènes codant de potentiels facteurs de virulence puis de produire des protéines recombinantes et des anticorps dirigés contre ces facteurs. Ces anticorps devaient permettre de localiser ces protéines d'intérêt au niveau subcellulaire dans des tissus infectés. / The microsporidian parasite Nosema ceranae is an emergent pathogen of the Western honeybee (Apis mellifera). It is associated to a disease called nosemosis that can lead to high mortality of honybees in colonies. Its presence in hives has not been systematically linked to symptoms or depopulation, suggesting a variation in its virulence. Thus, the existence of several N. ceranae variants with different virulence levels has been proposed. In this work aimed to assess N. ceranae polymorphism through a multilocus approach to test whether is it possible to discriminate between parasite taxa. Thus the nucleotide diversity of ten marker genes has been measured in parasite populations isolated from single A. mellifera individuals in distant locations. While high nucleotide diversity and allele content have been observed for all genes in single individuals, the absence of isolate differentiation precluded any taxa discrimination. These data support the hypothesis of a recent host-jump to A. mellifera and suggest that similar populations of parasites infect honeybees in distant locations. However they question the origin of such polymorphism within one host. In the second part of this work genes encoding putative virulence factors have been searched within N. ceranae genome, in order to produce recombinant proteins and then specific antibodies. Such antibodies would allow the subcellular localization of those proteins in infected tissues.

<p>Dokazivanje virusnih infekcija pĉela od velikog je interesa za pravilnu procjenu odnosa izmeĊu domaćina i potencijalnog patogena. Do izrade ove doktorske teze, na teritoriji Bosne i Hercegovine nije bilo prouĉavanja koja bi dokaz virusnih infekcija pĉela dovela do mogućnosti kliniĉke procjene patolo&scaron;kog odnosa za eko-genotip prilagoĊene pĉelinje zajednice. Evolucijski adaptirani virusi medonosne pĉele Apis mellifera carnica, sa stanovi&scaron;ta veterinarske entomologije, veterinarske virusologije i infektivnih bolesti, te saznanja veterinarskog servisa uop&scaron;te, nisu bili dovoljno prepoznati. Pojava i dostupnost molekularnih dijagnostiĉkih metoda omogućile su senzitivno i specifiĉno dokazivanje dijela genoma virusa koji inficiraju pĉelinje zajednice. Iz ekstrahovanih uzoraka templata razliĉitih uzoraka homogenizata sluĉajno uzorkovanih pĉela, RNK, sa jednim parom prajmera za svaki virus, pojedinaĉno, redoslijedom: BQCV, DWV, SBV, ABPV, KBV, CBPV uraĊeni su amplifikacijski protokoli i dobijeni rezultati za klasiĉan, end point, RT-PCR. Ovom doktorskom disertacijom dobijeni su prvi rezultati koji se odnose na utvrĊivanje prisustva i ra&scaron;irenosti virusnih infekcija kod vrste Apis mellifera u pĉelinjacima Bosne i Hercegovine. Od oko dvadeset virusa koji inficiraju pĉele i pĉelinje zajednice, metodama primjenjive molekularne dijagnostike u ovoj doktorskoj tezi dokazivali smo prisustvo virusnih infekcija za &scaron;est najvi&scaron;e prouĉavanih virusa pĉela. Dobijeni rezultati dokazali su prisustvo pet od &scaron;est traţenih virusa sa razliĉitim kombinacijama koinfekcija te raznolikom prostornom distribucijom virusa. Poznavanje sloţenih mehanizama virusnih infekcija pĉelinjih zajednica neophodnost je koja sa novim saznanjima progla&scaron;ava neke od virusa emergentnim patogenima, koji bitno naru&scaron;avaju opstanak pĉelinje zajednice. U patolo&scaron;ko-sinergistiĉkom odnosu sa nametnikom pĉelinje zajednice Varroa destructor neki pĉelinji virusi uzroci su globalno registrovanih gubitaka. Dio istraţivanja u radu odnosio se na terensko prouĉavanje dinamike prisustva grinje Varroa destructor u pĉelinjim zajednicama. Za pravilno dono&scaron;enje suda o uzroku ugibanja pĉelinjih zajednica, pored postojećih zahtjeva kontrole patogena pĉela definisanih procedurama dijagnostiĉkog manuala i Koda OIE-a, bilo bi potrebno imati i rezultate kojim bi se dokazalo kvalitativno i kvantitativno prisustvo virusa kod vrste Apis mellifera. UvoĊenje i standardizacija molekularno-biolo&scaron;kih metoda u rutinskoj dijagnostici virusnih bolesti pĉela je opravdano. Samo je pitanje vremena kada će virusne infekcije pĉela biti predmet rutinske dijagnostike kojim se kontroli&scaron;ezdravstveni status pĉelinje zajednice.</p> / <p>Evidence of viral infection of bees is of great interest for the proper assessment of the relationship between host and pathogen potential. By making this doctoral thesis on the territory of Bosnia and Herzegovina, where before was no present study of evidence of viral infections, lead to ability on clinical evaluation of pathological relations for eco-genotype adapted colonies. Evolutionarily adapted viruses honeybee Apis mellifera, from the veterinary entomology, veterinary virology and infectious diseases, and knowledge of the veterinary services in general, have not been recognized enough. The appearance and availability of molecular diagnostic methods have allowed sensitive and specific detection part of the genome of the virus that infects the colonies. Templates were extracted from samples of different patterns, homogenisate, randomly sampled bees, RNA, with a pair of primers for each virus, respectively, in the order: BQCV, DWV, SBV, ABPV, KBV, CBPV amplification protocols were done and the results obtained by conventional, end point, RT -PCR. This doctoral dissertation obtained the first results concerning the determination of the presence and spread of viral infections in the species Apis mellifera in Bosnia and Herzegovina. From about twenty viruses that can infect bees and hives using diagnostic methods applicable in this doctoral thesis we demonstrate the presence of viral infections of six most studied viruses of bees. The obtained results showed the presence five of the six essential viruses in forms of co-infection with different combinations and varied virus spatial distribution. Awareness of the complex mechanisms of viral infections in colonies is that the new knowledge proclaimed a virus as &quot;emergent pathogen&quot; that significantly impairs the survival of honeybee colonies. The pathogenic synergistic relationship with the parasite Varroa destructor causes that bee viruses are globally listed as reasons for losses. Part of the research work was related to the field study of the dynamics of the presence of Varroa destructor mites in honey bee colonies. For a accurate judgment of the deaths of bee colonies, in addition to existing requirements bee pathogen control procedures defined by diagnostic Manuals and Code of the OIE, it would be necessary to have the results to prove the qualitative and quantitative presence of the virus in the species Apis mellifera. The introduction and standardization of molecular biological methods in routine diagnosis of viral diseases of bees is justified. It is only a matter of time before the virus infections of bees will be subject to routine diagnostics which controls the health of bee colonies</p>

Em insetos, as enzimas glutationa S-transferases (GSTs) são conhecidas pela capacidade de degradar inseticidas, pesticidas e outros compostos químicos, naturais ou não naturais, estranhos ao organismo, podendo também promover o transporte intracelular de hormônios, metabólitos, e atuar na proteção celular contra o estresse oxidativo. Além disto, a função de uma GST tem sido associada ao processo de sequestro, pelo corpo gorduroso, de um tipo de proteína (hexamerinas) estocada na hemolinfa larval para ser utilizada como fonte de aminoácidos durante a metamorfose. Os objetivos deste trabalho consistiram em caracterizar a estrutura, a expressão e aspectos da função dos genes codificadores de GSTs em abelhas operárias Apis mellifera, além de investigar a possível função de um destes genes, hp191(GSTS1), na dinâmica de sequestro de hexamerinas durante a metamorfose. A metodologia utilizada abrangeu técnicas de biologia molecular, como RT-PCR semiquantitativa e em tempo real, sequenciamento de nucleotídeos, western blot, silenciamento gênico. Resumidamente os resultados mostraram (1) diferenças estruturais (número e organização de íntrons e éxons) entre os dez genes GSTs de A. mellifera, (2) aumento da atividade destes genes relacionado ao envelhecimento e intensa atividade de forrageamento, (3) níveis de expressão dependente do tipo de dieta alimentar, (4) perfil de expressão de hp191(GSTS1), assim como sua resposta aos hormônios morfogenéticos (hormônio juvenil e 20-hidroxiecdisona), consistentes com função na metamorfose, (4) diminuição dos níveis de hexamerina HEX 70a na hemolinfa em consequência do silenciamento de hp191(GSTS1) mediado por RNAi. Em conjunto, estes dados informam sobre estrutura, expressão e função dos genes GSTs de A. mellifera com particular foco na potencial participação de hp191(GSTS1) na metamorfose. / In insects, the enzymes glutathione S-transferases (GSTs) are known for their ability to degrade insecticides, pesticides and other chemical compounds, natural or not, which are not normally produced or expected to be present in the organism. GSTs can also promote the intracellular transportation of hormones and metabolites as well as act in the cellular protection against oxidative stress. In addition, the GST function has been associated with the process of sequestration, by the fat body, of one type of protein (hexamerin) which is stored in the larval hemolymph to be used as a source of amino acids during metamorphosis. The aims of this study were (1) to characterize structure and expression, and explore the roles of the GST encoding genes in Apis mellifera worker bees and, (2) to investigate the potential role of one of these genes, hp191(GSTS1), in the dynamics of hexamerin sequestration during metamorphosis. The methodology included molecular biology techniques, such as semiquantitative and real time RT-PCR, gene sequencing and silencing, and western blot. Briefly, the results revealed structural differences (number and organization of introns and exons) among the ten GSTs genes of A. mellifera, increased activity of these genes associated to bee aging and the intense foraging activity, and modulation of the expression levels of GST genes by the type of diet. The results also revealed that the expression profile of hp191(GSTS1), as well as its response to the morphogenetic hormones (juvenile hormone and 20-hydroxyecdysone), are consistent with a function in metamorphosis. Furthermore, hp191(GSTS1) silencing mediated by RNAi resulted in decreased hemolymph levels of a hexamerin (HEX 70a) with an essential function in metamorphosis. Altogether, these data provide novel findings concerning the structure, expression and function of the GSTs genes of A. mellifera with a special focus on the potential participation of hp191(GSTS1) in metamorphosis.

Western honey bees (Apis mellifera; hereafter honey bees) provide vital pollination services to global agriculture and biodiversity. However in recent years they have experienced severe population declines in many regions of the northern hemisphere. Although causes of these honey bee declines are not well understood, multiple pressures such as changes in land-use and climate, management issues, and introduced parasites are believed to be responsible. First described in honey bees in 2006 during a period of high colony mortalities, the microsporidian gut parasite Nosema ceranae became of great concern. In this dissertation I investigated the distribution, management, virulence, and inter-specific interactions of this introduced species. First, I described and clarified the multiple pressures believed to influence honey bee health, including N. ceranae, especially in relation to the mysterious phenomenon Colony Collapse Disorder. I then surveyed colonies in Maritime Canada for N. ceranae and the historic honey bee microsporidian Nosema apis. Although both species were present at a regional scale, intensive sampling in Nova Scotia revealed that N. ceranae was highly prevalent compared to the historic congener. Next, I investigated two potential management options for the parasite. Chemotherapy using the fungicide fumagillin reduced N. ceranae spore intensity but had no effect on colony survival, and indoor over-wintering did not reduce spore intensity but was associated with increased colony survivorship in spring. Using a comparative approach, I observed that N. ceranae infection significantly reduced honey bee longevity in the laboratory but did not influence overall colony health or strength in the field. Last, a laboratory study demonstrated reduced spore production during N. ceranae and N. apis co-infection, possibly due to inter-specific competition that has resulted in the displacement of the historic Nosema species by N. ceranae in many global regions. This dissertation provides crucial information on biology and management of N. ceranae that can be used towards the development of an integrated pest management strategy, and for future studies investigating factors that may influence the parasite’s distribution, virulence, and inter-specific interactions.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 479899 bytes, checksum: e40cd980381607b878c1d582d0ded3c1 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Pollination is an activity threatened by the indiscriminate use of pesticides, which can lead to lethal effects on bees, especially in forager adults due to their contact with pesticides, but also on larvae if the pesticides are carried back to the nest. Botanical pesticides supposedly have advantage over synthetics, and can be used as a viable alternative to control pests causing minor damage to beneficial insects. The neem tree, Azadirachta indica, stands out among these botanical pesticides, because of its efficiency in pest control. On this basis, we evaluated the effect of neem on the survival of forager adults and of larvae of Apis mellifera. We tested three neem based insecticides, Organic Neem (1,7 g a.i./L), Azamax® (12 g a.i./L) and Neemseto (2,4 g a.i./L) mixed to the adult diets. Organic Neem-treated bees showed no significant differences in their survival as well as those treated with lower concentrations of Azamax®. Bees that received the highest concentration of Azamax® (480 mg a.i./L) and of Neemseto (96 mg a.i./L) had their survival reduced. In the case of Neemseto this lower survival can be explained by the presence of other compounds besides azadirachtin. For Azamax® can be due to the high content of azadirachtin contained in the formulation. Two concentrations of Azamax®, 60 mg a.i./L e 120 mg a.i./L were tested in larvae, mixed to their diets. The mortality of treated larvae was 100% and none achieved the pupa stage. We observed low intake of food showing antifeedant action of neem. Azadirachtin at low concentrations was not harmful to adults of A. mellifera, but proved to be highly toxic to the larvae. High concentrations of azadirachtin and the presence of other components, such as nimbin and salanin, in the formulation of the insecticides may have seen the cause of the high toxicity to adult bees. / A polinização é uma atividade ameaçada pelo uso indiscriminado de pesticidas, os quais podem ter efeitos letais sobre as abelhas, principalmente as operárias forrageiras, devido ao seu maior contato com os pesticidas, mas também sobre as larvas, caso o pesticida seja transportado para dentro da colmeia. Pesticidas botânicos supostamente apresentam vantagem sobre os sintéticos e podem ser usados como alternativa viável no controle de pragas acarretando menos prejuízos à entomofauna benéfica. O nim, Azadirachta indica, se destaca dentre estes pesticidas botânicos por sua eficiência no controle de pragas. Neste trabalho foi avaliado o efeito do nim na sobrevivência de operárias forrageiras e de larvas de Apis mellifera. Foram testados três inseticidas à base de nim, Organic Neem (1,7 g i.a./L), Azamax® (12 g i.a./L) e Neemseto (2,4 g i.a./L), misturados à dieta de operárias forrageiras. Abelhas tratadas com Organic Neem não apresentaram diferenças significativas na sua sobrevivência assim como aquelas tratadas com as menores concentrações de Azamax®. Abelhas que receberam a maior concentração de Azamax® (480 mg i.a./L) e Neemseto (96 mg i.a./L) tiveram sua sobrevivência reduzida. No caso de Neemseto essa menor sobrevivência pode ser explicada pela presença de outros compostos além da azadiractina, como salanina e nimbina. Já para Azamax® pode ser devido ao alto teor de azadiractina contido na formulação. Em larvas foi testado apenas o Azamax® nas concentrações de 60 mg i.a./L e 120 mg i.a./L misturadas à dieta artificial oferecida,. A mortalidade das larvas tratadas foi de 100% e nenhuma larva conseguiu atingir o estágio de pupa. Foi observado baixo consumo de alimento evidenciando ação fagoinibidora do nim. Azadiractina em baixas concentrações não se mostrou prejudicial a adultos de A. mellifera, porém mostrou ser altamente tóxica às larvas. Altas concentrações de azadiractina e a presença de outros componentes, como salanina e nimbina, na formulação dos inseticidas podem ter sido a causa da alta toxicidade a abelhas adultas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:32:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 540797 bytes, checksum: 8f31a791537c94182ffb7cf0199e9e42 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bees are essential for the maintenance of biodiversity. They are also responsible for a large percentage of world food production. The species Apis mellifera is considered of great economic value due to its products for human consumption. The creation of insect-resistant transgenic products has increased the chances for the contact between bees and the Cry proteins derived from the bacterium Bacillus thuringiensis, which can be toxic to bees. Therefore, it is very important to study the hazards of toxicity. The study of these proteins in bees can be conducted by using survival analysis techniques, in which the response variable is the time until the occurrence of the event of interest, called failure time. If failure does not occur, time is called censoring, which is some partial information. The main interest is to estimate parameters to describe the survival or hazards, at a given time. In general, when there are covariates that may affect the survival time, adjustment can be performed by the Cox Regression Model, also known as proportional hazards model, through the assumption of proportional hazards among individuals over time. Chapter I, which deals with an adaptation of the Cox Regression model known as Fragility Model, not only explains the hazard of failure from individuals due to the effect of covariates, but also describes the existence of an unobserved random variable that groups individuals in natural or artificial conglomerates. The survival times were modeled to explain the hazard of failure by immature workers of A. mellifera under the effect of covariates; the colony was used as a random variable; and the ingestion of Cry1Ac protein, as fixed explanatory variable. Three different diets were tested to evaluate the toxicity of Cry1Ac on A. Mellifera: pure artificial (D0), artificial diluted in water with Cry1Ac (D2) and artificial diluted in water (D2). The individuals were collected from five different colonies maintained in Viçosa, Minas Gerais, Brazil. The random variable colony (frailty) was significant, which indicates statistical differences in the lifespans of bees from different colonies. Considering this diversity of frailty, the artificial diet diluted in water showed a higher hazard of failure, significantly different from the effect of the control diet (artificial pure). Therefore, the survival of the bee larvae was decreased due to the addition of water to the diet, which diluted the feed. However, the Cry1Ac-protein-based diet showed no significant hazard of failure when compared with the control. An alternative technique to the Cox model is presented in Chapter II of this work. When no proportional hazards of the individuals over time are observed within the sample, it is necessary to stratify or perform some other weakening of the proportional hazard condition. It can be used the Quantile Regression, which studies the relationship between the dependent variable and the explanatory variables in the conditional quantiles by minimizing the weighted mean absolute errors. This technique has properties of equivariance, invariance for monotomic transformations and robustness in the presence of outliers. Thus, by means of equivariance, they can be applied to data with censoring. It was found that, in the same set of biosafety data from the Cry1Ac protein, in honeybees called A. Mellifera, the hazards of failure by individuals are not proportionalities for the different diets studied. The survival times of bees were adjusted by quantile regression, by using the Portnoy estimator for 14 quantiles. In quantiles {0.10; 0.15; 0.30; 0.40}, the coefficients are negative values significantly different from zero. For such, in these quantiles, the individuals fed with pure diet (D0) had longer survival time compared to those fed with a diet containing Cry1Ac protein (D1). This was observed among younger individuals, since the lifespan of the larvae lifespans in these quantiles are below the average time of life. The coefficients for the quantiles {0.35; 0.50; 0.60} presented statistically significant negative effect. Therefore, water addition to the diet affected the survival of larvae approximately at the average lifespans. / As abelhas são seres indispensáveis para a manutenção da biodiversidade e além disso, são responsáveis por grande porcentagem da produção mundial de alimentos. A Apis mellifera é considerada espécie de grande valor econômico, devido a seus produtos para o consumo humano. Atualmente, com a criação de transgênicos resistentes a insetos, aumentou a possibilidade das abelhas entrarem em contato com as proteínas Cry derivada da bactéria Bacillus thuringiensis, que pode ser toxica às abelhas, tornando o estudo dos riscos de toxicidade importante. Portanto, o estudo dessas proteínas nas abelhas pode ser realizada por meio das técnicas da análise de sobrevivência. Nestas técnicas a variável resposta é o tempo até a ocorrência do evento de interesse, denominado tempo de falha, e se a falha não ocorrer, o tempo é denominado censura, que é uma informação parcial. O principal interesse é estimar parâmetros para descrever a sobrevivência ou riscos, num certo tempo determinado. Usualmente quando existem covariáveis que possam influir no tempo de sobrevivência o ajuste pode ser realizado pelo Modelo Regressão de Cox, também conhecido como de modelo de riscos proporcionais, pela suposição dos riscos proporcionais entre os indivíduos ao longo do tempo. No Capítulo I deste trabalho é realizada uma adaptação da Regressão de Cox conhecida como Modelo de Fragilidade, que além de explicar o risco do indivíduo falhar por influência de covariáveis, também descreve a existência de alguma variável aleatória não observada que agrupa indivíduos em conglomerados naturais ou artificiais. Os tempos de sobrevivência foram modelados para explicar o risco de falhar das operárias imaturas de A. mellifera sob o efeito de covariáveis, sendo a colônia utilizada como variável aleatória e a ingestão da proteína Cry1Ac como variável explicativa fixa. Para avaliar a toxicidade de Cry1Ac sobre A. mellifera, foram testadas três diferentes dietas: artificial pura (D0), artificial diluída em água com Cry1Ac (D2) e artificial diluída em água (D2). Os indivíduos foram coletados de cinco colônias diferentes mantidas em Viçosa, Minas Gerais, Brasil. A variável aleatória colônia (fragilidade) foi significativa, indicando diferenças estatísticas nos tempos de vida das abelhas provenientes de diferentes colônias. Dentro dessa diversidade de fragilidade, a dieta artificial diluída em água apresentou risco maior de falhar, significativamente diferente do efeito da dieta controle (artificial pura). Portanto, a sobrevivência das larvas de abelhas foi diminuída em virtude da adição de água na dieta, pela diluição do alimento. No entanto, a dieta baseada na proteína Cry1Ac não mostrou risco de falha significativo quando comparado com o controle. Uma técnica alternativa ao Modelo de Cox é apresentada no Capítulo II deste trabalho. Quando se verifica que os riscos dos indivíduos, ao longo do tempo dentro da amostra, não são proporcionais, é necessário estratificar ou realizar um outro procedimento na análise. Uma alternativa que pode ser utilizada é a Regressão Quantílica, que estuda a relação entre a variável dependente e as variáveis explicativas nos quantis condicionais, por meio da minimização de erros absolutos ponderados. Esta técnica possui propriedades de equivariância, invariância para transformações monotômicas e robustez na presença de outlier. Assim, pela equivariância podem ser aplicados aos dados com censura. Foi verificado que no mesmo conjunto de dados de biossegurança da proteína Cry1Ac em abelhas denominadas A. mellifera que os riscos de falhar dos indivíduos não são proporcionalidades para as diferentes dietas estudadas. Os tempos de sobrevivência das abelhas foram ajustados pela regressão quantílica, utilizando o estimador de Portnoy para 14 quantis. Nos quantis {0,10; 0,15; 0,30; 0,40} os coeficientes são valores negativos significativamente diferentes de zero. Por tanto, nestes quantis os indivíduos alimentados com a dieta pura (D0) tiveram maior tempo de sobrevivência, que aqueles que têm incorporado à proteína Cry1Ac na dieta (D1), isto aconteceu entre os indivíduos mais novos, já que nesses quantis os tempos de vida das larvas são inferiores ao tempo de vida mediano. Os coeficientes para os quantis {0,35; 0,50;0,60} apresentaram efeito negativo estatisticamente significativos, por tanto a incorporação da água na dieta influiu na sobrevivência das larvas aproximadamente nos tempos medianos de vida.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaianaSS_DISSERT.pdf: 992609 bytes, checksum: 09ead14cb109f1d0241dab4527cc9c70 (MD5) Previous issue date: 2013-08-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed to assess the the effect of direct sunlight and shade in two groups of AHB colonies. Sheets of carnauba trees were used to provide shading for a group of hives and as control another group of hives were installed direct under the sun. The experiment was conducted at the Technology Center of Beekeeping and Meliponiculture of Rio Grande do Norte, at the Experimental Station of UFERSA, Mossoró-RN. 16 Langstroth beehives were used, 8 in the shade and 8 under the sun. During the period from April, 05, 2012 to March 18, 2013 were performed monthly monitoring and about the development of the colonies. Approximatelly every 10 days the survey was conducted with data collected in % in the areas of oviposition (eggs laying by queens) ,open brood, capped brood, honey and pollen. The data were tested for normality, analysis of variance based on the least squares method and the comparison of means was done by Tukey test with 5% level of significance The environment showed an influence upon duration or longevity of colonies with difference statistically significant (P <0.01), with an average duration of 132 days in the sun and 155 days in the shade. During the experiment, the colonies had 65% reduction in bee populations in the shade and 90% under the sun. There were no statistical differences between the groups as oviposition, open brood and capped brood. The area of honey was higher in the colonies under the sun and pollen area was higher in shadow environment, both differences statistically significant (P<0,01). The drought of 2012, the most serious in the last 50 years in the Brazilian Northeast, had an important impact on both groups of colonies but the AHB colonies had a better adaptation in the shadow than under the sun in the semiarid Northeast region. Honey production accumulated in the colonies supers installed in the shade was approximately 45% higher than under the sun. It was found that bees (AHB) have a better adaptation to the environment under the shadow of the sun in the semiarid Northeast / Este estudo objetivou avaliar o efeito da ação direta do sol e da sombra em colônias de abelhas africanizadas (AHB). Foram utilizadas coberturas naturais com folhas de carnaúba para o sombreamento das colmeias, tendo como controle colmeias instaladas ao sol. O experimento foi realizado na Fazenda Experimental da UFERSA, (CETAPIS) em Mossoró-RN. Foram utilizadas 16 colmeias modelo Langstroth com abelhas AHB, 8 na sombra e 8 sob o sol. Durante o período de 05/04/2012 a 18/03/2013, foram realizados monitoramento mensais para avaliar o desenvolvimento das colônias e a cada 10 dias o levantamento das áreas de oviposição, cria aberta, cria operculada, mel e pólen. Foi testada a normalidade dos dados, aplicada análise de variância (método quadrados mínimos) e comparação das médias pelo Teste de Tukey com nível de 5% de significância. O ambiente exerceu influência sobre a duração das colônias (P<0.01) com média de 132 dias no sol e 155 dias à sombra. Durante o experimento as colônias tiveram 65% de redução nas populações de abelhas à sombra e 90% sob o sol. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os ambientes quanto a oviposição das rainhas, cria aberta e cria operculada. A área de mel foi superior no sol e a área de pólen foi superior na sombra. A seca de 2012, uma das mais sérias nos últimos 50 anos no nordeste brasileiro, teve impacto em ambos os grupos. A produção de mel acumulado ao longo do experimento nas melgueiras das colônias à sombra foi aproximadamente 45% superior às colônias submetidas ao sol. Constatou-se que as abelhas africanizadas apresentam melhor adaptação ao ambiente sombra do que sob o sol no semiárido Nordestino