Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas / Made available in DSpace on 2012-10-19T11:28:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T21:07:58Z : No. of bitstreams: 1 179179.pdf: 2177316 bytes, checksum: 8e86fd3248dda48b5105e4faf0c91e65 (MD5) / Alterações no estado redox intracelular participam da modulação de diversos sistemas de sinalização entre os quais o da apoptose. No presente trabalho investigamos a influência do estresse oxidativo e nitrosativo na morte de timócitos de camundongo induzida por dexametasona, além de avaliar a participação da proteína quinase C (PKC) e do fator de transcrição NF-kB na indução da apoptose nestas células.

As heme oxigenases catalisam a degradação do grupo heme produzindo bileverdina, monóxido de carbono (CO) e ferro. A heme oxigenase I (HO-1) é a isoforma indutível e está dentro do grupo das proteínas de choque térmico. A expressão dessa enzima é desencadeada como resultado de diversos estímulos de estresse. Evidências presentes na literatura sugerem um papel fundamental da HO-1 no crescimento e morte celular. Apesar da maioria das evidências confirmarem o efeito citoprotetivo (anti-apoptótico) da HO-1, ainda existem muitas controvérsias a esse respeito. Já foi demonstrado que a HO-1 pode exercer diferentes efeitos na sobrevivência celular incluindo a indução de apoptose, dependente dos níveis de expressão da enzima bem como do tipo celular. A linhagem célular pré-monocítica, U937, e a linhagem celular linfoblástica, Jurkat, foram submetidas a restrição de soro mais hemina 20μM (grupo heme oxidado, indutor de HO-1), durante diferentes tempos, e a quantidades crescentes de hemina durante 24h sem restrição de soro. Após 12h, ambas as linhagens celulares demonstraram, no tratamento envolvendo restrição de soro mais hemina, um aumento significativo (p<0,001) na atividade de caspase 3/7 (U937, 135 pmol/min/mg proteina, e Jurkat, 384 pmol/min/mg proteina) quando comparado aos controles. A adição do inibidor específico de HO-1, zinco II protoporfirina IX (ZnPP), resultou em um diminuição significativa (p<0,001) na atividade de caspase 3/7 (U937, 70 pmol/min/mg proteina, and Jurkat, 150 pmol/min/mg proteína), demonstrando um papel ativo da HO-1 na apoptose induzida pelo tratamento que empregou restrição de soro mais hemina. As linhagens celulares mostraram comportamentos distintos quando tratadas com quantidades crescentes de hemina, de forma que não se atingiu a super-expressão da enzima HO-1. A linhagem celular Jurkat apresentou uma regulação negativa na expressão de HO-1 em quantidades crescentes de hemina, resultado esse sem precedentes na literatura, indicando uma regulação diferenciada dessa enzima nessa linhagem celular. Esses resultados indicam que a atividade de HO-1 é importante para manter os altos níveis de caspase 3/7. Portanto, no sistema de estresse gerado pela restrição de soro mais hemina, a HO-1 estaria agindo como um regulador positivo da apoptose.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-31Bitstream added on 2014-06-13T19:52:06Z : No. of bitstreams: 1 cornelio_alg_me_arafo.pdf: 397515 bytes, checksum: b29bef30bd070aadb818ff553343600a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A proposta deste estudo foi investigar a citotoxicidade, ação antimicrobiana e pH do cimento Portland puro (CP) e associações com agentes radiopacificadores: óxido de bismuto (CPBi), óxido de zircônio (CPZir), tungstato de cálcio (CPCa). Para avaliar o potencial citotóxico, foram empregadas linhagens celulares de fibroblastos do ligamento periodontal de camundongos (mPDL) e osteosarcoma de ratos (ROS 17/2.8). Ambas foram expostas por 24 horas a diferentes concentrações do CP fresco, CP associado com radiopacificadores e cimento de óxido de zinco eugenol. Peróxido de hidrogênio foi aplicado como controle positivo para apoptose. A viabilidade após incubação com os cimentos foi avaliada pela atividade da enzima desidrogenase mitocondrial. A morfologia celular foi analisada microscopicamente pelo corante violeta de cresilo, e o mecanismo de morte celular foi determinado pela metodologia de laranja de acridina/brometo de etídio. Os dados foram analisados estatisticamente por ANOVA e Tukey post-test (p<0.01). A correlação entre os dois tipos de morte celular e valores de pH foi estabelecido pela correlação linear de Pearson. O ensaio da enzima desidrogenase mitocondrial revelou um padrão significante de morte celular apenas nas altas concentrações dos eluídos de cimento. CP puro não foi citotóxico, mesmo na alta concentração de 100mg/ml. As imagens microscópicas mostraram que nenhuma das formulações de CP causaram danos as linhagens celulares. Análises estatísticas dos dados de apoptose/necrose demonstram que CP e CP mais agentes radiopacificadores promoveram morte por necrose estatisticamente significativa apenas em 100mg/ml. Os resultados mostraram que CP associado com óxido de bismuto, óxido de zircônio ou tungstato de cálcio não foram citotóxicos para mPDL ou ROS 17/2.8, e podem ser boas... / The purpose of this study was to investigate the cytotoxicity, antimicrobial and pH of pure Portland cement (PC), and associations with radiopacifier agents: bismuth oxide (CPBi), zirconium oxide (CPZir), calcium tungstate (CPCA). To assess the potential cytotoxicity, fibroblast cell lines from the periodontal ligament of mice (mPDL) and rat osteosarcoma (ROS 17/2.8) were used. Both were exposed for 24 hours with different concentrations of fresh PC, PC associated with radiopacifiers and eugenol zinc oxide cement. Hydrogen peroxide was used as a positive control for apoptosis. The viability after incubation with the cements was evaluated by mitochondrial dehydrogenase enzyme activity. Cell morphology was examined microscopically by cresyl violet stain, and the mechanism of cell death was determined by the method of acridine orange / ethidium bromide. The data were statistically analyzed by ANOVA and Tukey post-test (p <0.01). The correlation between the two types of cell death and pH values was established by Pearson linear correlation. The mitochondrial dehydrogenase enzyme assay revealed a significant pattern of cell death only at high concentrations of the eluted cement. Pure PC was not cytotoxic, even at high concentration of 100mg/ml. Microscopic images showed that none of the formulations of PC caused damage cell lines. Statistical analysis of apoptosis/necrosis data showed that PC and PC plus radiopacifiers agents promoted death by necrosis statistically significant only at 100mg/ml. The results showed that PC associated with bismuth oxide, zirconium oxide or calcium tungstate were not toxic to ROS 17/2.8 or mPDL, and may be good alternatives as radiopacifier agents. The antimicrobial and pH of Portland cement and radiopacifier agents were evaluated. For antimicrobial activity agar diffusion was... (Complete abstract click electronic access below)

A piplartina ou piperlongumina (PPLGM) é uma amida isolada de plantas do gênero Piper, da qual se obtêm as pimentas. As plantas desse gênero encontram-se distribuídas pelo mundo inteiro e têm sido utilizadas medicinalmente em diferentes culturas há muitos anos. A piplartina é o composto isolado desta espécie que mais se destaca, mostrando diferentes atividades biológicas e promissoras propriedades anticancerígenas. A resistência adquirida ao tratamento convencional é muito comum no câncer colorretal, na maioria dos casos devido à perda de função nas vias de apoptose e proteínas relacionadas ao ciclo celular. Sendo assim, buscou-se avaliar a capacidade da piplartina de induzir a morte celular na linhagem celular de carcinoma colorretal HCT 116. As células de HCT 116 selvagem e deficientes para as proteínas Bax, p21 e p53 foram tratadas com diferentes concentrações de piplartina, bem como a linhagem celular não tumoral Hek-293. Observou-se uma redução importante na viabilidade celular das células HCT 116, independentemente do estado de Bax, p21 e p53. As alterações morfológicas características de apoptose foram evidenciadas por coloração de Giemsa, microscopia eletrônica de varredura e coloração de laranja de acridina e brometo de etídeo. Para confirmar a indução de apoptose, foi realizado o ensaio de Anexina-V/PI, que evidenciou um aumento no percentual de células apoptóticas após o tratamento com piplartina, com o aumento da concentração relacionado ao aumento de células em apoptose tardia e pequeno aumento no número de células necróticas. A análise do ciclo celular mostrou alteração na distribuição tanto na linhagem selvagem quanto nas deficientes após o tratamento com a piplartina. Neste ensaio, o resultado mais expressivo foi o aumento de células na fase Sub-G0/G1, o que está relacionado à diminuição do conteúdo de DNA devido à fragmentação e indução de apoptose. Para avaliar a interação da piplartina com o DNA foram realizados ensaios com DNA plasmidial. Nesses ensaios, não foi observada interação direta da piplartina com o DNA, evidenciando sua ação indireta sobre o mesmo, que pode estar associado ao aumento de espécies reativas de oxigênio. Os dados aqui apresentados sugerem que PPLGM trata-se de uma molécula promissora na terapia de câncer colorretal. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2017-07-03T18:02:41Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Fernanda da Silva Machado.pdf: 1515890 bytes, checksum: 2dd7bbe5e4151c12e6dfc6c8d9278896 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T18:02:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Fernanda da Silva Machado.pdf: 1515890 bytes, checksum: 2dd7bbe5e4151c12e6dfc6c8d9278896 (MD5) Previous issue date: 2017-07-03 / Universidade de Caxias do Sul, UCS / Piplartine or piperlongumine is an amide isolated from plants of the genus Piper, from which the peppers is obtained. Plants of this genus are distributed all over the world, and have been used medicinally in different cultures for many years. From the isolated compounds found in these species, piperlongumine is the most outstanding, showing different biological activities and promising anticancer properties. Acquired resistance to conventional treatment is very common in colorectal cancer, in most cases due to loss of function in apoptotic methabolism and cell cycle protein regulation. Therefore, we sought to evaluate the ability of piperlongumine to induce cell death in HCT 116 colorectal carcinoma cell line. HCT 116 wild-type and lines deficient in Bax, p21 and p53 were treated with different concentrations of piperlongumine, as well as the non-tumor cell line Hek-293. A significant reduction in the cell viability of HCT 116 cells was observed, independent from Bax, p21 and p53 status. The morphological alterations from apoptosis were evidenced by Giemsa staining, scanning electron microscopy and acridine orange and ethidium bromide staining. To confirm apoptosis induction, Annexin-PI assay was performed, which evidentiate an increasing percentage of apoptotic cells after PPLGM treatment, with increasing concentrations related with higher percentage of late apoptosis stage and small increase of necrotic cells number. Cell cycle analysis showed altered distribution in both proficient and deficient cells after PPLGM treatment. In this assay, the most expressive result was the increase of Sub-G0/G1 cells phase, which is related to decrease DNA content due to fragmentation and apoptosis induction. To evaluate direct interaction of PPLGM with DNA, plasmidial DNA assays were performed. In this trials, there were no direct interaction of PPLGM with DNA observed, evidencing the indirect action of PPLGM through the increase of reactive oxygen species. The data presented here suggest that PPLGM should be a promising molecule in colorectal cancer therapy

Gliomas malignos compreendem o subtipo mais comum e devastador de tumores primários do sistema nervoso central (SNC), sendo o Glioblastoma Multiforme (GBM) a forma mais agressiva e mortífera. Pacientes com este tipo de tumor apresentam um prognóstico de sobrevida que não ultrapassa os 18 meses, após o diagnóstico. Isso é decorrente do fato de que os GBMs possuem elevada resistência aos tratamentos de quimio e radioterapia, além de serem altamente infiltrativos e neurologicamente destrutivos. Um importante fator que contribui para essa resistência é a superexpressão da proteína XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis), o mais potente inibidor de apoptose da família das IAPs. Este atua inibindo diretamente a ativação das Caspases 3, 7 e 9. P53 é considerada uma das mais potentes proteínas supressoras tumorais, uma vez que esta atua como reguladora central em diversas vias de sinalização de mecanismos celulares distintos, como a via de controle do ciclo celular, reparo ao DNA, apoptose, senescência, autofagia, entre outras. Isto justifica o fato de p53 estar frequentemente mutada, nos mais variados tipos de cânceres. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos resultantes da interação entre a superexpressão da proteína supressora tumoral p53 e o silenciamento da proteína anti-apoptótica XIAP na proliferação, na sobrevivência de GBMs. Quando p53 foi superexpressa (P+) na linhagem de glioma U87 silenciada para XIAP (Xi), através de RNAi, a taxa de proliferação celular reduziu significativamente em relação às células com as intervenções isoladas (U87Xi e U87wtP+) ou em relação ao controle selvagem U87wt, ao longo de dez dias. O ensaio de citotoxicidade LDH revelou um aumento na desestabilização da membrana citoplasmática nas células com a manipulação gênica combinada (U87XiP+) em relação os controles U87Xi e U87wtP+. O ensaio com AnexinaV/PI demonstrou uma elevação na marcação de células U87XiP+ com os dois marcadores, indicando uma maior indução de morte celular em relação aos controles. Além disso, como consequência da modulação combinada de p53 e XIAP, os níveis das proteínas pró-apoptóticas Bax e PUMA aumentaram tanto na linhagem U87wt, quanto na linhagem U87Xi, ao superexpressar p53. Além disso, os níveis de p21 e da proteína anti-apoptótica Bcl-xL foram reduzidos na linhagem U87Xi em relação ao controle U87wt. Outra constatação importante foi o aumento dos níveis de caspase-3 na linhagem U87Xi em relação ao controle U87wt e um aumento ainda maior nas células com a intervenção combinada (U87XiP+). Todos estes dados convergem para o fato de que a combinação do silenciamento de XIAP e superexpressão de p53 é mais efetiva na redução da proliferação e indução de morte na linhagem de glioma U87, do que as manipulações gênicas realizadas de forma isoladas, além de sugerir uma possível via de integração entre XIAP e p53, tendo como ponto de conexão o controle dos níveis citoplasmáticos da proteína p21 tanto por p53, quanto por XIAP, mostrando que a modulação combinada de proteínas da via apoptótica é capaz de potencializar os efeitos produzidos pelas intervenções de forma isoladas, representando uma nova e promissora estratégia no desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de Gliomas.

O Abortamento de repetição (AR) é uma condição patológica definida pela ocorrência de duas ou mais perdas gestacionais consecutivas. Estima-se que esta desordem acometa 5% dos casais em idade reprodutiva. Esta condição clínica é classificada em dois subtipos clínicos: AR primário e AR secundário. Apesar dos esforços em investigar as causas desta desordem obstétrica, estima-se que em 50% dos casos a etiologia do AR permanece desconhecida. A reprodução humana implica em um paradoxo imunológico fundamental: no qual o feto representa uma entidade estranha ao sistema imune materno, sendo constituído por metade de material genético paterno, no entanto, de forma fascinante este não é rejeitado. Sendo assim, a aceitação materna do feto é um evento único e demonstra como o sistema imune materno remodela-se e tolera a presença de células invasivas semi-alogênicas no útero. Casos de AR, pré-eclâmpsia (PE), entre outras desordens gestacionais, levam a uma questão retórica; ‘Porque a mãe rejeitou o feto?’. No entanto, considerando as gestações saudáveis e as complexas interações que ocorrem na interface materno-placentária, talvez, a intrigante e fascinante questão correta que ainda permanece é ‘Porque a mãe não rejeitou o feto?’. Existem muitos mecanismos que protegem o feto de um possível ‘ataque’ do sistema imune materno das quais podemos citar: (i) a baixa expressão de moléculas clássicas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) na interface materno-placentária, (ii) a expressão diferencial de moléculas não clássicas de classe I do MHC nas células do trofoblasto, como HLA (antígeno leucocitário humano)-E, HLA-F e HLA-G, (iii) a apoptose de células do sistema imunológico ativadas, entre outras. A morte celular programada ou apoptose é essencial ao desenvolvimento e funcionalidade dos organismos multicelulares. Os mecanismos apoptóticos mais reconhecidos pela efetividade em desencadear a morte celular são: o sistema FAS-FAS-L (via extrínseca) e BAX-BCL-2 (via intrínseca). A molécula do HLA-G, descrita por sua versatilidade imunológica, é essencial na gestação e neste cenário é descrito que, além de contribuir essencialmente na imunotolerância materna, também atua nos processos de angiogênese, apoptose e consequente remodelação tecidual da decídua materna. Considerando que os eventos apoptóticos estão presentes nas diversas etapas da gestação, desde a concepção até o nascimento, e que constituem diferentes interações de proteínas apoptóticas e anti-apoptóticas específicas para manter a adequada homeostasia celular e tecidual, o presente estudo visa: (i) a compreensão dos principais genes envolvidos neste processo e (ii) o entendimento da contribuição destes na predisposição à recorrência de abortamentos, em um estudo de carácter caso-controle. No total, 138 mulheres diagnosticadas com AR e 156 mulheres saudáveis com mais de dois filhos, sem histórico de complicações gestacionais foram incluídas neste estudo. Os genes e variantes polimórficas analisados no estudo a menos diferentemente especificado correspondem a variações presente na região promotora, são: FAS (rs1800682, rs763110), FASL-L (rs5030772, rs763110), BAX (rs4645878), BCL-2 (rs2279115) e HLA-G [região 3̍ UTR (região não traduzida) (rs66554220, rs1707, rs1710, rs17179101, rs17179108, rs1063320, rs9380142 e rs1610696)]. Como conclusão, no presente estudo nós não observamos a associação destas variantes ao AR na população estudada. No entanto, algumas ressalvas a respeito deste estudo devem ser mencionadas, são estas: (i) a heterogeneidade genética da população estudada, (ii) o tamanho amostral e (iii) o critério clínico para o diagnóstico do abortamento de repetição como 2 (duas) ou mais perdas gestacionais consecutivas. Portanto, o papel destas variantes genéticas na predisposição ao AR não deve ser descartada e necessitam ser confirmadas em estudos posteriores. Como perspectivas, no intuito de gerar evidências mais satisfatórias sobre o ofício destas variantes genéticas na fisiopatologia do AR, estudos com adequado tamanho amostral capaz de detectar tais efeitos funcionais destas variantes, bem como em diferentes populações são fortemente recomendados. / Recurrent miscarriage (RM) or recurrent pregnancy loss (RPL) is a pathological condition defined by occurrence of two or more consecutive pregnancy losses. It is estimated that about 5% of couples in reproductive age are affected by RM. This clinical condition is classified in two subtypes: primary and secondary RM. In despite of the efforts to investigate the causes of RM, approximately 50% of cases the etiology of RM remains unknown. Human reproduction involves a fundamental immunological paradox: in which the fetus is seem as foreign entity to the maternal immune system, consisting of half maternal and half paternal genetic material origin; however, in a fascinating way the fetus is not rejected. Thus, maternal-fetal acceptance is a unique example and demonstrates how the maternal immune system shapes and tolerates up the presence of invasive semi-allogeneic cells in utero. Obstetric disorders such as RM, preeclampsia (PE) and other pregnancy complications, lead to a rhetorical question: 'Why the mother rejected the fetus?'. However, considering all healthy pregnancies and complex interactions that occur in the maternalplacental interface, perhaps the intriguing question that remains is 'why the mother did not reject the fetus?’ there are many mechanisms that protect the fetus of a possible 'attack' from maternal immune system. Among them we can cite: (i) the low expression of classical class I molecules of the major histocompatibility complex (MHC) in maternalplacental interface, (ii) the differential expression of non-classical class I molecules MHC on the trophoblast cells such as HLA (human leukocyte antigen)-E, HLA-F and HLA-G, (iii) tryptophan catabolism by the enzyme indoleamine (2,3)-dioxigenase, (iv) regulation of the complement system in maternal-placental interface and (v) apoptosis of maternal activated immune system cells. Programmed cell death or apoptosis is essential to development and function of multicellular organisms. Apoptotic mechanisms recognized for the effectiveness in triggering cell death are: FAS-FAS-L system (extrinsic pathway) and BAX-BCL-2 (intrinsic pathway). HLA-G molecule is described by its immunological versatility being essential to establishment of a healthy gestation. The HLA-G contributes primarily to maternal immunotolerance and is related to many process, such as angiogenesis, apoptosis and consequently to tissue remodeling of maternal decidua. Since the apoptotic events are present at different stages of pregnancy, from conception to birth, and considering different interactions of apoptotic and specific anti-apoptotic proteins to maintain a suitable cellular and tissue homeostasis, this study aims to: (i) the understanding of key genes involved in the apoptotic process and (ii) the understanding of these genes in the predisposition to recurrent miscarriages, in a case-control study. A total of 138 women diagnosed with RM and 156 healthy women with more than two children with no history of pregnancy complications were included in this study. All polymorphic variants of candidate genes analyzed in the study unless otherwise specified correspond to variations in the promoter region. The variants assessed in study are: FAS (rs1800682, rs763110), FASL-G (rs5030772, rs763110), BAX (rs4645878), BCL-2 (rs2279115) and HLA-G [region 3̍ UTR (untranslated region) (rs66554220, rs1707, rs1710, rs17179101, rs17179108, rs1063320, rs9380142 and rs1610696)]. In conclusion, we did not observe the association of these variants to the RM risk in the present population. However, some caveats about this study should be mentioned, such as (i) the genetic heterogeneity of the study population, (ii) the sample size and (iii) the clinical criteria for the diagnosis of recurrent miscarriage as two (2) or more consecutive pregnancy losses. Therefore, a definitive conclusion on the role of these genetic variants in the predisposition to RM should not be dismissed and should be further confirmed in future studies. As prospects to generate more satisfactory evidence about the role of these genetic variants in the pathophysiology of RM, further studies with adequate sample size capable of detecting such functional effects of these variants as well as in different populations are strongly recommended.

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