ASSEF, A. N. B. Meio condicionado de macrófagos ativados por polissacarídeos sulfatados da alga parda Dictyota caribaea inibe a proliferação de melanoma metastático In vitro. 2017. 87 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceara, Fortaleza, 2017. / Submitted by Farmacologia Pós-Graduação (posgfarmacologia@gmail.com) on 2017-08-07T22:02:56Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_anbassef.pdf: 2693690 bytes, checksum: 383c9eb9c2aeb8aaa7466ce9c480c742 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-08-08T12:55:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_anbassef.pdf: 2693690 bytes, checksum: 383c9eb9c2aeb8aaa7466ce9c480c742 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-08T12:55:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_anbassef.pdf: 2693690 bytes, checksum: 383c9eb9c2aeb8aaa7466ce9c480c742 (MD5) Previous issue date: 2017-07-24 / Cancer refers to a set of diseases related to uncontrolled proliferation and invasion of neoplastic cells into distant tissues. The tumoral tissue is complex and consists of several non-tumor cells that contribute, together with the tumor cells, to the formation of the tumor microenvironment (MIT). MIT favors the growth and development of the tumor and increase the aggressiveness of the disease. Among the non-tumor cells present in MIT, macrophages (MΦ) have prominent role. MΦ have high phenotypic plasticity, and may show anti-tumor action when activated classically (M1 phenotype) or pro-tumor, when tumor-associated MΦ undergo alternative activation (M2-like phenotype). TAMs are often related to a worse prognosis for the patient. Modulation from M0 MΦ (unstimulated) to M1 or re-education from TAM to M1 are strategies aimed at assisting in the treatment of malignant tumors. Sulfated polysaccharides (SP) from algae can act as modifiers of the biological response by regulating the activation of MΦ and potentiate the immune response against tumor cells. The objective of this work was to evaluate the immunostimulatory and antitumor potential of sulfated polysaccharides extracted from brown algae Dictyota caribaea (DCA) in vitro. Samples of DCA and conditioned medium of macrophage stimulated with DCA (CM) were initially evaluated for cytotoxicity in murine metastatic melanoma (B16-F10 cell line) by the SRB assay and activation of murine macrophages (RAW264.7 cell line) by the Griess assay. Although samples, including crude extract and fractions, were not cytotoxic, all of them activated the MΦ. Additionally, the supernatants of macrophages treated with DCA (CM DCA) were able to inhibit B16-F10 cells growth approximately 25%. The DCA F9 fraction was chosen for additional studies using CM DCA F9 due to their high yield (~40%) and better antiproliferative effect among the other fractions. In addition to increasing nitric oxide production, treatment of macrophages with DCA F9 also increased the release of TNF-α and IL-10 cytokines as measured by ELISA. Treatment of melanoma with CM DCA F9 caused a reduction on cell counting and induced morphological changes without compromising membrane integrity. In relation to the morphology, it was observed an increasing of the population percentage of shrink cells (~10%) and granularity cells (~15%). CM DCA F9 treatment also changed B16-F10 cell cycle profile. It decreased the G2/M phase. Since nitrite did not inhibit the growth of B16 F10, the antiproliferative effects observed are due to other cytotoxic substances produced by RAW264.7, e.g. TNF-α. When associated with the chemotherapeutic doxorubicin (DOX), DCA F9 but not CM DCA F9, potentiated tumor cell inhibition in vitro. In conclusion PS of D. caribaea activated MΦ for anti-tumor phenotype. Further studies are needed to improve phenotypic characterization of MΦ, as well as the antitumor effect and respective pathways related to these effects. / O câncer se refere a um conjunto de doenças relacionadas à proliferação descontrolada e invasão células neoplásicas para tecidos distantes. O câncer faz parte de um sistema complexo, constituído por diversas células não tumorais que contribuem, junto com as células tumorais, para a formação do microambiente tumoral (MIT). Por sua vez, o MIT favorece o crescimento e desenvolvimento do tumor e aumento da agressividade da doença. Dentre as células não-tumorais presentes no MIT, os macrófagos (MΦ) possuem papel destacado. Os MΦ possuem alta plasticidade fenotípica, podendo exibir ação anti-tumoral quando ativados classicamente (fenótipo M1) ou pró-tumoral, quando sofrem ativação alternativa (fenópito M2). Os MΦ associados ao tumor (TAM) apresentam fenótipo M2 peculiar e a sua presença está frequentemente relacionada a um pior prognóstico para o paciente. A modulação de MΦ M0 (não estimulados) para M1 ou reeducação de TAM para M1 são estratégias que visam auxiliar no tratamento de tumores malignos. Polissacarídeos sulfatados (PS) de algas podem atuar como modificadores da resposta biológica regulando a ativação de MΦ e potencializar a resposta destes últimos contra células tumorais. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antitumoral in vitro de macrófagos ativados por PS extraídos da alga parda Dictyota caribaea (DCA). DCA e o meio condicionado de macrófagos estimulados (MC) pela DCA foram avaliadas inicialmente quanto sua citotoxicidade em melanoma metastático (linhagem murina B16-F10) in vitro pelo ensaio do SRB. Para avaliação do efeito imunoestimulante de macrófagos (linhagem murina RAW264.7) ativados pela DCA foi realizadoo ensaio de Griess. Embora nenhum PS, incluindo extrato bruto e frações, tenha sido citotóxico, todos ativaram MΦ. Os MC com DCA (MC DCA) 100 e 250 µg/mL foram capazes de inibir aproximadamente 25% do crescimento tumoral in vitro. A fração DCA F9 foi escolhida para estudos adicionais com MC DCA F9 devido ao seu alto rendimento (~40%) e destacado efeito antiproliferativo em relação as demais. Além de aumentar a produção de óxido nítrico, o tratamento de macrófagos com DCA F9 também provocou aumento da liberação das citocinas TNF-α e IL-10 medidas por ELISA. O tratamento de melanoma com MC DCA F9 nas concentrações de 100 e 250 µg/mL causou redução da contagem de células e alterações na morfologia, mas a membrana plasmática permaneceu íntegra. Em relação à morfologia, observou-se aumento das populações de células com tamanho reduzido (~10%) e com granulosidade aumentada (~15%). Além disso, MC DCA F9 alterou o perfil do ciclo celular da B16-F10. Observou-se diminuição de células em G2/M. Uma vez que o nitrito não inibiu o crescimento da B16-F10, os efeitos antiproliferativos observados se devem a outras substâncias citotóxicas produzidas pela RAW264.7, como p.ex. TNF-α. Quando associados com o quimioterápico doxorrubicina (DOX), DCA F9, mas não MC DCA F9, foi capaz de potencializar a inibição tumoral da DOX in vitro. Desta forma, concluímos que os PS de D. caribaea ativaram MΦ para perfil antitumoral. Mais estudos são necessários para complementar a caracterização fenotípica de MΦ, bem como do efeito antitumoral e respectivas vias relacionadas a estes efeitos.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2013-03-21T18:15:02Z No. of bitstreams: 1 André_C_Ferreira.pdf: 895655 bytes, checksum: fffce754856c9d5194a6fac09f960736 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-21T18:15:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 André_C_Ferreira.pdf: 895655 bytes, checksum: fffce754856c9d5194a6fac09f960736 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A malária é uma doença parasitária causada por protozoários do gênero Plasmodium e representa um grande problema de saúde pública. Sabe-se que metade da população mundial vive em áreas endêmicas, onde esta doença gera cerca de 500 milhões de casos clínicos e em torno de 1 milhão de mortes anualmente. O processo infeccioso da malária é desencadeado por uma resposta imunoinflamatória exacerbada do hospedeiro caracterizada por migração e acúmulo de leucócitos, produção de citocinas pró-inflamatórias e mediadores químicos. Neste processo, as leucointegrinas exercem um papel extremamente importante mediando a adesão, migração e sinalização celular. Neste grupo de integrinas, a CD11d/CD18, que foi descrita mais recentemente está envolvida em diversos eventos patológicos como aterosclerose, dano neuronal e outros. Resultados preliminares de nosso grupo mostraram que animais deficientes (CD11d-/-) para esta integrina apresentam uma maior sobrevida à infecção com Plasmodium berghei Anka (PbA). Entretanto, ainda não se conhece o papel desta integrina na fisiopatologia da malária. O presente trabalho mostrou que a integrina CD11d/CD18 é dinamicamente expressa em macrófagos diferenciados da medula óssea de animais infectados com PbA. Ensaios in vitro com essas células, demonstraram que esta integrina não afeta a capacidade proliferativa dessas células. Além disso, avaliamos parâmetros importantes para a ativação celular, como produção de espécies reativas de oxigênio e citocinas pró- e anti-inflamatórias. Observamos que macrófagos de animais CD11d-/- produzem quantidades significantemente mais baixas de malondialdeído e de TNF- , e níveis altos de IL-10 em relação aos macrófagos de animais CD11d+/+. Além disso, a produção de prostaglandina E2 foi significantemente diminuída em macrófagos provenientes de animais CD11d-/-. Esses dados indicam que a integrina possui um papel importante na modulação da resposta imune. Verificamos ainda que macrófagos de animais CD11d-/- apresentaram uma diminuição na sua capacidade fagocítica de hemácias parasitadas em relação aos macrófagos de animais CD11d+/+. Entretanto, a ausência desta integrina não afetou a capacidade destes macrófagos de fagocitar hemozoína sintética (sHz). Estes resultados juntos sugerem que a integrina CD11d está envolvida no processo de ativação celular dos macrófagos, modulando a resposta imune do hospedeiro na fisiopatologia da malária, o que torna esta molécula um potencial alvo para ações terapêuticas. / Malaria is a parasitic disease caused by protozoa of the genus Plasmodium and is a major public health problem. It is known that half the world population lives in endemic areas where this disease causes about 500 million clinical cases and around 1 million deaths annually. The process of malaria infection is initiated by a host immunoinflammatory response exacerbated characterized by the migration and accumulation of leukocytes, the production of proinflammatory cytokines and chemical mediators. In this process, leukointegrins play a very important role in mediating adhesion, migration and cell signaling. In this group of integrins, CD11d/CD18, which has been described more recently, is involved in gravel pathological events such as atherosclerosis, neuronal damage and others pathologies. Preliminary results from our group have shown that animals deficient (CD11d-/-) for this integrin have a higher survival to infection with Plasmodium berghei Anka (PbA). However, we still do not know the role of CD11d/CD18 integrin in the pathophysiology of malaria. The present study demonstrated that the integrin is dynamically expressed in differentiated bone marrow macrophages from animals infected with PbA. Experiments with these cells in vitro have demonstrated that the integrin does not affect the proliferative capacity of these cells. Furthermore, we evaluated parameters important to cellular activation, such as production of reactive oxygen species, proinflammatory and anti-inflammator cytokines. Observed that macrophages, from deficient mice for the integrin CD11d-/-, produce significantly lower amounts of malondialdehyde and TNF- , and high levels of IL-10 in relation to the macrophages from animals CD11d+/+. Furthermore, the production of prostaglandin E2 was significantly reduced by macrophages from animals CD11d-/-. These data indicate that integrin plays an important role in modulating the immune response. Also verified that macrophages from animals CD11d-/- showed a decrease in their phagocytic ability of infected erythrocytes to macrophages compared to animals CD11d+/+. However, absense of this integrin did not affect the ability of macrophages to phagocytize synthetic hemozoin – sHz. These results together suggest that CD11d integrin is involved in cellular activation of macrophages by modulating the host immune response in the pathophysiology of malaria, which makes this molecule a potential target for therapeutic actions.

A flagelina é reconhecida pelo receptor TLR5, e pelos receptores NLRs, NLRC4/Naip5. Estes últimos induzem ativação de caspase-1 e liberação de IL-1b e IL-18, além da morte do macrófago por piroptose. Para investigar os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos, MOs peritoneais foram estimulados com flagelina de B. subtilis e S. typhimurium em sua forma livre (capaz de ativar TLR5), ou inserida em vesículas lipídicas (capaz de ativar os NLRs). Demonstramos que ambas as flagelinas citosólicas induzem produção de IL-1b e morte celular, embora a flagelina de S. typhimurium tenha mostrado maior potencial em induzir produção de IL-1b e IL-6 pelos MOs. Verificamos que a produção de IL-1b e lise celular de MOs se mostraram eventos subseqüentes à formação de poros na membrana celular. Embora a liberação de IL-1b após reconhecimento de ambas as flagelinas ser um fenômeno dependente do eixo NLRC4/caspase-1, a morte celular induzida pelas flagelinas citosólicas ocorre na ausência destas moléculas, ao contrário do que prevê a literatura atual. / Flagellin is recognized by TLR5, and NLRs NLRC4/Naip5. The latter induce activation of caspase-1 and release of IL-1b and IL-18, besides the death of macrophages by pyroptosis. To investigate the molecular mechanisms involved in these processes, peritoneal MOs were stimulated with flagellin from B. subtilis and S. typhimurium in its free form (activating TLR5), or inserted into lipid vesicles (able to activate NLRs). We demonstrated that both cytosolic flagellins induce the production of IL-1b and cell death, while the flagellin of S. typhimurium has shown greater potential to induce production of IL-1b and IL-6 by MOs. We found that the production of IL-1b and cell lysis by MOs are subsequent events proven by the formation of pores in cell membranes. Although the release of IL-1b after recognition of both flagellins is a phenomenon dependent on the axis NLRC4/caspase-1, cell death induced by cytosolic flagellin occurs in the absence of these molecules, unlike that provided by the current literature.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores, tais como processos inflamatórios, estresse oxidativo, endotoxinas bacterianas, infecções e febre. Este efeito citoprotetor é principalmente atribuído à habilidade de as proteínas de choque térmico estabilizarem estruturas protéicas através de interações reversíveis. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Previamente, nós descrevemos a relação entre os níveis de HSP70 sérica, o estatus oxidante e o desfecho clínico de pacientes sépticos; o grupo de pacientes com maiores níveis pró-oxidantes e maiores níveis de HSP70 sérica também foi aquele que houve maior mortalidade. Afim de investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada, e a produção de nitrito, proliferação celular, viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de TNF-α e atividade fagocítica foram avaliadas. Também foram avaliadas as modificações estruturais causadas pela oxidação na HSP70 purificada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os efeitos modulatórios da HSP70 oxidada sobre a linhagem de macrófagos RAW 264.7 foram diferentes dos efeitos modulatórios da HSP70 nativa. Os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli, such as inflammation, oxidative stress, hypoxia, endotoxins, infections and fever. This cytoprotective effect is mainly attributed to their ability to stabilize protein structures through chaperon-like reversible interactions. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. Previously, we have described the relationship between serum HSP70 levels, oxidant status and clinical outcome of septic patients; the group of patients with higher pro-oxidant status and higher serum HSP70 had also higher mortality. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70 and evaluated nitrite production, cell proliferation, cell viability, reactive oxygen species production, TNF-α release and phagocytic activity. We also evaluated structural modifications caused by oxidation in purified HSP70. Oxidation of HSP70 altered its protein structure; besides, the modulatory effect of oxidized HSP70 on RAW265.7 cells was different from native HSP70. Macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability.

Introdução: Macrófagos de fenótipo M1 (ativação clássica) e M2 (ativação alternativa) estão relacionados com diversos processos patológicos como o câncer, a aterosclerose e doenças neurodegenerativas. No microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (TAM) têm atuação controversa na progressão da doença. Um modelo in vitro pode servir para avaliar a influência dessa alteração fenotípica em diversas patologias. A linhagem celular monocítica humana U937, sob estímulo de PMA (do inglês, Phorbol 12-myristate 13-acetate), se diferencia em macrófagos típicos. Estes adquirem fenótipos M1 e M2 quando estimulados, respectivamente, por LPS/IFN- e IL-4. Objetivo: Estabelecer um modelo in vitro para o estudo do papel dos macrófagos e seu envolvimento na progressão de doenças, bem como, sua caracterização fenotípica nesses eventos. Para tal, utilizamos: a) meta-análise de dois conjuntos de dados de micro-arranjos para avaliar os genes relacionados e b) análise de marcadores de diferenciação celular, taxa de adesão, alterações morfológicas e níveis de espécies reativas. Métodos: Cultura Celular: Linhagem celular humana U937, cultivada com meio de cultura RPMI 1640 e tratada com 10nM de PMA, por 12, 24, 48 e 72 horas. Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas incubadas com a sonda DCF para avaliar a formação de espécies reativas, medida fluorescência por 1h. Ensaio de MTT e Adesão Celular: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas foram incubadas com solução de MTT por 1h, para análise da viabilidade celular, foi medida absorbância em 560nm e índice de adesão por método de SRB. Produção de óxido Nítrico: Quantificado pelo método de Griess, a 540nm. Análise Morfológica por meio de Imagens das Células: Imagens obtidas após tempos de tratamento com PMA em 0, 12, 24, 48 e 72 horas. Bioinformática: a) obtidos dois conjuntos de dados de micro-arranjos do Gene Expression Omnibus (GEO) - GSE5099 e GSE15038; b) criamos redes de genes para o fenótipo M1 e M2, com ferramenta on-line STRING e software MEDUSA; c) rede de genes e informações dos micro-arranjos foram combinados e plotados em gráficos de acordo com a sua topologia, com software ViaComplex. Resultados: As imagens mostraram alteração morfológica característica da célula monocítica U937 (célula proliferativa) para macrófago (célula aderida na placa), quando tratadas com PMA. Quanto aos níveis de espécies reativas formadas e a taxa de aderência medida, foi maior nas células tratadas, no decorrer do tempo de tratamento. A taxa de proliferação da célula controle U937 aumentou com o tempo, enquanto que, observamos uma diminuição na proliferação das células tratadas com PMA. A análise bioinformática mostrou um aumento na expressão, tratadas x controle, de genes do fenótipo M1 e M2, nas células U937 diferenciadas por PMA e polarizadas com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. O fenótipo M1 mostrou aumento na formação de ER e de NO quando tratado com LPS + IFN-gamacombinados. Houve uma diminuição de NO no fenótipo M2 quando ativadas por IL-4. Conclusão: Nosso trabalho descreve um método válido de diferenciação macrofágica da linhagem humana U937 e a possibilidade de sua polarização ao fenótipo M1 e M2 quando estimulada com PMA e posteriormente com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. A compreensão das relações entre as alterações fenotípicas dos macrófagos e do microambiente gerado é importante para o desenvolvimento de pesquisas para combater/atenuar a agressividade das patologias. / Introduction: In vitro model of macrophages (MF) can be used to evaluate the influence of these cells in human pathologies. Objective: To establish an in vitro model to study macrophages and it’s evaluating M1/M2 polarization. Methods: The human U937 cell line was grown in medium RPMI 1640 and differentiated into functional macrophages by 10 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-treatment, with M1 or M2 phenotypes with LPS/IFNg and IL-4, respectively. Reactive Oxigen Species (ROS) (time course of DCF oxidation), nitric oxide (NO) (Griess method), cell proliferation (MTT assay) and adherence (SRB method), and change in cellular morphology were determined. Moreover, two microarray data sets from Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE5099 and GSE15038) were used to analyze differential M1/M2 gene expression with the online bioinformatics tools STRING, MEDUSA and Via Complex. Results: Time course experiments (0, 24, 48 and 72h) showed decreased cell proliferation with increase in morphological changes, cell adherence and ROS generation in PMA-treated U937 cells compatible with the acquisition of a macrophage-like phenotype. Bioinformatics approach showed increased expression in M1/M2 genes by PMA-treatment. 24h of LPS/IFNg- treatment induced increased NO, ROS, and the expression of M1 genes (classical activation MF), while 24h IL-4-treatment induced the expression of M2genes (alternative activation MF). Conclusion: This simple human macrophage-like differentiation and M1/M2 activation protocol could be used in vitro to establish the role of these cells in human pathologies.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores, tais como processos inflamatórios, estresse oxidativo, endotoxinas bacterianas, infecções e febre. Este efeito citoprotetor é principalmente atribuído à habilidade de as proteínas de choque térmico estabilizarem estruturas protéicas através de interações reversíveis. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Previamente, nós descrevemos a relação entre os níveis de HSP70 sérica, o estatus oxidante e o desfecho clínico de pacientes sépticos; o grupo de pacientes com maiores níveis pró-oxidantes e maiores níveis de HSP70 sérica também foi aquele que houve maior mortalidade. Afim de investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada, e a produção de nitrito, proliferação celular, viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de TNF-α e atividade fagocítica foram avaliadas. Também foram avaliadas as modificações estruturais causadas pela oxidação na HSP70 purificada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os efeitos modulatórios da HSP70 oxidada sobre a linhagem de macrófagos RAW 264.7 foram diferentes dos efeitos modulatórios da HSP70 nativa. Os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli, such as inflammation, oxidative stress, hypoxia, endotoxins, infections and fever. This cytoprotective effect is mainly attributed to their ability to stabilize protein structures through chaperon-like reversible interactions. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. Previously, we have described the relationship between serum HSP70 levels, oxidant status and clinical outcome of septic patients; the group of patients with higher pro-oxidant status and higher serum HSP70 had also higher mortality. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70 and evaluated nitrite production, cell proliferation, cell viability, reactive oxygen species production, TNF-α release and phagocytic activity. We also evaluated structural modifications caused by oxidation in purified HSP70. Oxidation of HSP70 altered its protein structure; besides, the modulatory effect of oxidized HSP70 on RAW265.7 cells was different from native HSP70. Macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability.

Introdução: Macrófagos de fenótipo M1 (ativação clássica) e M2 (ativação alternativa) estão relacionados com diversos processos patológicos como o câncer, a aterosclerose e doenças neurodegenerativas. No microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (TAM) têm atuação controversa na progressão da doença. Um modelo in vitro pode servir para avaliar a influência dessa alteração fenotípica em diversas patologias. A linhagem celular monocítica humana U937, sob estímulo de PMA (do inglês, Phorbol 12-myristate 13-acetate), se diferencia em macrófagos típicos. Estes adquirem fenótipos M1 e M2 quando estimulados, respectivamente, por LPS/IFN- e IL-4. Objetivo: Estabelecer um modelo in vitro para o estudo do papel dos macrófagos e seu envolvimento na progressão de doenças, bem como, sua caracterização fenotípica nesses eventos. Para tal, utilizamos: a) meta-análise de dois conjuntos de dados de micro-arranjos para avaliar os genes relacionados e b) análise de marcadores de diferenciação celular, taxa de adesão, alterações morfológicas e níveis de espécies reativas. Métodos: Cultura Celular: Linhagem celular humana U937, cultivada com meio de cultura RPMI 1640 e tratada com 10nM de PMA, por 12, 24, 48 e 72 horas. Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas incubadas com a sonda DCF para avaliar a formação de espécies reativas, medida fluorescência por 1h. Ensaio de MTT e Adesão Celular: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas foram incubadas com solução de MTT por 1h, para análise da viabilidade celular, foi medida absorbância em 560nm e índice de adesão por método de SRB. Produção de óxido Nítrico: Quantificado pelo método de Griess, a 540nm. Análise Morfológica por meio de Imagens das Células: Imagens obtidas após tempos de tratamento com PMA em 0, 12, 24, 48 e 72 horas. Bioinformática: a) obtidos dois conjuntos de dados de micro-arranjos do Gene Expression Omnibus (GEO) - GSE5099 e GSE15038; b) criamos redes de genes para o fenótipo M1 e M2, com ferramenta on-line STRING e software MEDUSA; c) rede de genes e informações dos micro-arranjos foram combinados e plotados em gráficos de acordo com a sua topologia, com software ViaComplex. Resultados: As imagens mostraram alteração morfológica característica da célula monocítica U937 (célula proliferativa) para macrófago (célula aderida na placa), quando tratadas com PMA. Quanto aos níveis de espécies reativas formadas e a taxa de aderência medida, foi maior nas células tratadas, no decorrer do tempo de tratamento. A taxa de proliferação da célula controle U937 aumentou com o tempo, enquanto que, observamos uma diminuição na proliferação das células tratadas com PMA. A análise bioinformática mostrou um aumento na expressão, tratadas x controle, de genes do fenótipo M1 e M2, nas células U937 diferenciadas por PMA e polarizadas com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. O fenótipo M1 mostrou aumento na formação de ER e de NO quando tratado com LPS + IFN-gamacombinados. Houve uma diminuição de NO no fenótipo M2 quando ativadas por IL-4. Conclusão: Nosso trabalho descreve um método válido de diferenciação macrofágica da linhagem humana U937 e a possibilidade de sua polarização ao fenótipo M1 e M2 quando estimulada com PMA e posteriormente com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. A compreensão das relações entre as alterações fenotípicas dos macrófagos e do microambiente gerado é importante para o desenvolvimento de pesquisas para combater/atenuar a agressividade das patologias. / Introduction: In vitro model of macrophages (MF) can be used to evaluate the influence of these cells in human pathologies. Objective: To establish an in vitro model to study macrophages and it’s evaluating M1/M2 polarization. Methods: The human U937 cell line was grown in medium RPMI 1640 and differentiated into functional macrophages by 10 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-treatment, with M1 or M2 phenotypes with LPS/IFNg and IL-4, respectively. Reactive Oxigen Species (ROS) (time course of DCF oxidation), nitric oxide (NO) (Griess method), cell proliferation (MTT assay) and adherence (SRB method), and change in cellular morphology were determined. Moreover, two microarray data sets from Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE5099 and GSE15038) were used to analyze differential M1/M2 gene expression with the online bioinformatics tools STRING, MEDUSA and Via Complex. Results: Time course experiments (0, 24, 48 and 72h) showed decreased cell proliferation with increase in morphological changes, cell adherence and ROS generation in PMA-treated U937 cells compatible with the acquisition of a macrophage-like phenotype. Bioinformatics approach showed increased expression in M1/M2 genes by PMA-treatment. 24h of LPS/IFNg- treatment induced increased NO, ROS, and the expression of M1 genes (classical activation MF), while 24h IL-4-treatment induced the expression of M2genes (alternative activation MF). Conclusion: This simple human macrophage-like differentiation and M1/M2 activation protocol could be used in vitro to establish the role of these cells in human pathologies.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores, tais como processos inflamatórios, estresse oxidativo, endotoxinas bacterianas, infecções e febre. Este efeito citoprotetor é principalmente atribuído à habilidade de as proteínas de choque térmico estabilizarem estruturas protéicas através de interações reversíveis. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Previamente, nós descrevemos a relação entre os níveis de HSP70 sérica, o estatus oxidante e o desfecho clínico de pacientes sépticos; o grupo de pacientes com maiores níveis pró-oxidantes e maiores níveis de HSP70 sérica também foi aquele que houve maior mortalidade. Afim de investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada, e a produção de nitrito, proliferação celular, viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de TNF-α e atividade fagocítica foram avaliadas. Também foram avaliadas as modificações estruturais causadas pela oxidação na HSP70 purificada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os efeitos modulatórios da HSP70 oxidada sobre a linhagem de macrófagos RAW 264.7 foram diferentes dos efeitos modulatórios da HSP70 nativa. Os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli, such as inflammation, oxidative stress, hypoxia, endotoxins, infections and fever. This cytoprotective effect is mainly attributed to their ability to stabilize protein structures through chaperon-like reversible interactions. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. Previously, we have described the relationship between serum HSP70 levels, oxidant status and clinical outcome of septic patients; the group of patients with higher pro-oxidant status and higher serum HSP70 had also higher mortality. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70 and evaluated nitrite production, cell proliferation, cell viability, reactive oxygen species production, TNF-α release and phagocytic activity. We also evaluated structural modifications caused by oxidation in purified HSP70. Oxidation of HSP70 altered its protein structure; besides, the modulatory effect of oxidized HSP70 on RAW265.7 cells was different from native HSP70. Macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability.

Introdução: Macrófagos de fenótipo M1 (ativação clássica) e M2 (ativação alternativa) estão relacionados com diversos processos patológicos como o câncer, a aterosclerose e doenças neurodegenerativas. No microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (TAM) têm atuação controversa na progressão da doença. Um modelo in vitro pode servir para avaliar a influência dessa alteração fenotípica em diversas patologias. A linhagem celular monocítica humana U937, sob estímulo de PMA (do inglês, Phorbol 12-myristate 13-acetate), se diferencia em macrófagos típicos. Estes adquirem fenótipos M1 e M2 quando estimulados, respectivamente, por LPS/IFN- e IL-4. Objetivo: Estabelecer um modelo in vitro para o estudo do papel dos macrófagos e seu envolvimento na progressão de doenças, bem como, sua caracterização fenotípica nesses eventos. Para tal, utilizamos: a) meta-análise de dois conjuntos de dados de micro-arranjos para avaliar os genes relacionados e b) análise de marcadores de diferenciação celular, taxa de adesão, alterações morfológicas e níveis de espécies reativas. Métodos: Cultura Celular: Linhagem celular humana U937, cultivada com meio de cultura RPMI 1640 e tratada com 10nM de PMA, por 12, 24, 48 e 72 horas. Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas incubadas com a sonda DCF para avaliar a formação de espécies reativas, medida fluorescência por 1h. Ensaio de MTT e Adesão Celular: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas foram incubadas com solução de MTT por 1h, para análise da viabilidade celular, foi medida absorbância em 560nm e índice de adesão por método de SRB. Produção de óxido Nítrico: Quantificado pelo método de Griess, a 540nm. Análise Morfológica por meio de Imagens das Células: Imagens obtidas após tempos de tratamento com PMA em 0, 12, 24, 48 e 72 horas. Bioinformática: a) obtidos dois conjuntos de dados de micro-arranjos do Gene Expression Omnibus (GEO) - GSE5099 e GSE15038; b) criamos redes de genes para o fenótipo M1 e M2, com ferramenta on-line STRING e software MEDUSA; c) rede de genes e informações dos micro-arranjos foram combinados e plotados em gráficos de acordo com a sua topologia, com software ViaComplex. Resultados: As imagens mostraram alteração morfológica característica da célula monocítica U937 (célula proliferativa) para macrófago (célula aderida na placa), quando tratadas com PMA. Quanto aos níveis de espécies reativas formadas e a taxa de aderência medida, foi maior nas células tratadas, no decorrer do tempo de tratamento. A taxa de proliferação da célula controle U937 aumentou com o tempo, enquanto que, observamos uma diminuição na proliferação das células tratadas com PMA. A análise bioinformática mostrou um aumento na expressão, tratadas x controle, de genes do fenótipo M1 e M2, nas células U937 diferenciadas por PMA e polarizadas com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. O fenótipo M1 mostrou aumento na formação de ER e de NO quando tratado com LPS + IFN-gamacombinados. Houve uma diminuição de NO no fenótipo M2 quando ativadas por IL-4. Conclusão: Nosso trabalho descreve um método válido de diferenciação macrofágica da linhagem humana U937 e a possibilidade de sua polarização ao fenótipo M1 e M2 quando estimulada com PMA e posteriormente com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. A compreensão das relações entre as alterações fenotípicas dos macrófagos e do microambiente gerado é importante para o desenvolvimento de pesquisas para combater/atenuar a agressividade das patologias. / Introduction: In vitro model of macrophages (MF) can be used to evaluate the influence of these cells in human pathologies. Objective: To establish an in vitro model to study macrophages and it’s evaluating M1/M2 polarization. Methods: The human U937 cell line was grown in medium RPMI 1640 and differentiated into functional macrophages by 10 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-treatment, with M1 or M2 phenotypes with LPS/IFNg and IL-4, respectively. Reactive Oxigen Species (ROS) (time course of DCF oxidation), nitric oxide (NO) (Griess method), cell proliferation (MTT assay) and adherence (SRB method), and change in cellular morphology were determined. Moreover, two microarray data sets from Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE5099 and GSE15038) were used to analyze differential M1/M2 gene expression with the online bioinformatics tools STRING, MEDUSA and Via Complex. Results: Time course experiments (0, 24, 48 and 72h) showed decreased cell proliferation with increase in morphological changes, cell adherence and ROS generation in PMA-treated U937 cells compatible with the acquisition of a macrophage-like phenotype. Bioinformatics approach showed increased expression in M1/M2 genes by PMA-treatment. 24h of LPS/IFNg- treatment induced increased NO, ROS, and the expression of M1 genes (classical activation MF), while 24h IL-4-treatment induced the expression of M2genes (alternative activation MF). Conclusion: This simple human macrophage-like differentiation and M1/M2 activation protocol could be used in vitro to establish the role of these cells in human pathologies.

A flagelina é reconhecida pelo receptor TLR5, e pelos receptores NLRs, NLRC4/Naip5. Estes últimos induzem ativação de caspase-1 e liberação de IL-1b e IL-18, além da morte do macrófago por piroptose. Para investigar os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos, MOs peritoneais foram estimulados com flagelina de B. subtilis e S. typhimurium em sua forma livre (capaz de ativar TLR5), ou inserida em vesículas lipídicas (capaz de ativar os NLRs). Demonstramos que ambas as flagelinas citosólicas induzem produção de IL-1b e morte celular, embora a flagelina de S. typhimurium tenha mostrado maior potencial em induzir produção de IL-1b e IL-6 pelos MOs. Verificamos que a produção de IL-1b e lise celular de MOs se mostraram eventos subseqüentes à formação de poros na membrana celular. Embora a liberação de IL-1b após reconhecimento de ambas as flagelinas ser um fenômeno dependente do eixo NLRC4/caspase-1, a morte celular induzida pelas flagelinas citosólicas ocorre na ausência destas moléculas, ao contrário do que prevê a literatura atual. / Flagellin is recognized by TLR5, and NLRs NLRC4/Naip5. The latter induce activation of caspase-1 and release of IL-1b and IL-18, besides the death of macrophages by pyroptosis. To investigate the molecular mechanisms involved in these processes, peritoneal MOs were stimulated with flagellin from B. subtilis and S. typhimurium in its free form (activating TLR5), or inserted into lipid vesicles (able to activate NLRs). We demonstrated that both cytosolic flagellins induce the production of IL-1b and cell death, while the flagellin of S. typhimurium has shown greater potential to induce production of IL-1b and IL-6 by MOs. We found that the production of IL-1b and cell lysis by MOs are subsequent events proven by the formation of pores in cell membranes. Although the release of IL-1b after recognition of both flagellins is a phenomenon dependent on the axis NLRC4/caspase-1, cell death induced by cytosolic flagellin occurs in the absence of these molecules, unlike that provided by the current literature.