As tonsilas palatinas e adenoides são órgãos linfoides epiteliais do trato respiratório superior, onde ocorre o primeiro contato entre antígenos inalados e células de defesa do hospedeiro. O tecido adenoamigdaliano está em contato constante com uma grande diversidade de bactérias e vírus, que se reflete na elevada taxa de detecção de patógenos bacterianos e virais nesses tecidos, mesmo que saudáveis. Infecções crônicas ou repetidas nas mucosas dos tecidos linfoides podem desencadear o desenvolvimento de um estado inflamatório crônico e a presença de hiperplasia tecidual. Esse estado está associado com inúmeras complicações como rinussinusites de repetição, ronco, obstrução nasal, disfunção da tuba auditiva, apnéia obstrutiva do sono, otite média, alterações do desenvolvimento facial, desenvolvimento comportamental. Por isso, este trabalho tem como objetivo principal analisar co-detecções das principais bactérias da microbiota respiratória humana (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophylus influenzae, Moraxella catahrralis e Pseudomonas aeruginosa) de pacientes com e sem adenoamigdalite crônica através da técnica de PCR em tempo real. Tivemos como principal bactéria detectada em nosso estudo H. influenzae, que foi encontrada em altos níveis na amígdala e adenoide. Já nas secreções, a bactéria de maior frequência encontrada foi S. pneumoniae. Os resultados de comparação entre os 2 grupos (pacientes com a doença e sem a mesma) não foram estatisticamente significantes, porém não menos importante, mostrando que os principais agentes comensais que colonizam o trato aéreo superior (Streptococcus pneumoniae, Haemophylus influenzae e Moraxella catahrralis) sao elevados em ambos os grupos, e que provavelmente não são fundamentais na fisiopatogenia da hipertrofia adenoamigdaliana/tonsilites de repetição. Como conclusão podemos observar que as bactérias H. influenzae, M. catarrhalis e S. pneumoniae tiveram altas frequências de detecção em amígadalas, adenoides e lavados nasofaríngeo de crianças sem hipertrofia tonsilar e sintomatologia de infecção respiratória. Além disso, não houve maiores frequências de detecção de bactérias presentes na microbiota em pacientes com hipertrofia tonsilar do que em controles e diferentemente das demais bactérias, houve concordância moderada ou boa nas detecções de M. catarrhalis e H. influenzae entre adenoide e amígdada de indivíduos sem sintomas respiratórios. / The tonsils and adenoids are lymphoid epithelial organs of the upper respiratory tract, where the first contact between inhaled antigens and host defense cells occurs. In fact, the adenoid and tonsillar tissue is in constant contact with a wide variety of bacteria and viruses, which is reflected in the high rate of detection of bacterial and viral pathogens in these tissues, even if healthy. Chronic or recurrent infections of mucosal lymphoid tissues may trigger the development of a chronic inflammatory condition and the presence of tissue hyperplasia. This condition is associated with numerous complications such as rinussinusites repeat, snoring, nasal congestion, Eustachian tube dysfunction, obstructive sleep apnea, otitis media, abnormal facial development, behavioral development. Therefore, this study aims to analyze co-detections of the major human respiratory microbiota bacteria (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Moraxella catahrralis and Pseudomonas aeruginosa) in patients with and without chronic adenoamigdalite using the technique of real time PCR. We had the main bacteria detected in our study H. influenzae, which was found in high levels in the amygdala and adenoids. Already in the secretions, the bacterium most frequently found was S. pneumoniae. In conclusion we can see that the bacteria H. influenzae, M. catarrhalis, and S. pneumoniae had high frequency of detection in amígadalas, adenoids and nasopharyngeal washed children without tonsillar hypertrophy and symptoms of respiratory infection. In addition, there were no major frequency detection of bacteria present in the microbiota in patients with tonsillar hypertrophy than in controls, and unlike the other bacteria, there was moderate to good agreement in the detection of M. catarrhalis and H. influenzae between adenoid and amígdada of individuals without respiratory symptoms.

O objetivo deste estudo foi avaliar a técnica de espectrometria de massas por ionização/dessorção a laser assistida por matriz tempo-de-vôo (MALDI-TOF) para a identificação direta em amostras de leite (sem cultivo microbiológico) de bactérias causadoras de mastite. Para tanto foram realizados dois experimentos (1 e 2). No experimento 1, o objetivo foi determinar a sensibilidade diagnóstica da técnica MALDI-TOF MS para a identificação direta em amostras de leite de Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae e Escherichia coli. Foram realizadas contaminações experimentais de S. aureus, S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e E. coli em amostras de leite, para a obtenção de contagens de 103 a 109 ufc/mL. As amostras de leite contaminadas foram processadas com o uso do kit Maldi Sepsityper® (Bruker Daltonics) e submetidas ao protocolo de lise bacteriana para posterior análise por MALDI-TOF MS. Espectros de massas foram coletados na faixa de massas de 2.000-20.000 m/z e foram analisados pelo programa MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics) com as configurações padrão para obtenção da identificação bacteriana. A identificação direta de patógenos causadores de mastite a partir de amostras de leite foi possível em contagem ≥106 ufc/mL para S. aureus, ≥107 ufc/mL para E. coli, e ≥108 ufc/mL para S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. uberis. No experimento 2, o objetivo foi avaliar o efeito da pré-incubação de amostras de leite de quartos mamários com mastite subclínica sobre a eficácia da identificação sem cultivo de patógenos causadores de mastite por MALDI-TOF MS. Foram selecionados 2 rebanhos leiteiros para coletas de leite de quartos mamários de todas as vacas em lactação. As amostras de leite foram submetidas às análises de: a) cultura microbiológica; b) pré-incubação seguida de identificação por espectrometria de massas diretamente do leite; c) contagem bacteriana total (CBT). Para a realização da CBT, as amostras de leite foram submetidas à citometria de fluxo; e para a identificação direta de patógenos causadores de mastite a partir do leite, as amostras foram submetidas ao desnate por centrifugação (10.000 Xg por 10 minutos), e pré-incubação a 37ºC por 12 horas. Posteriormente, as amostras foram processadas com o uso do kit Maldi Sepsityper® (Bruker Daltonics) e submetidas ao protocolo de lise bacteriana para posterior análise por MALDI-TOF MS. Do total de 810 amostras de leite analisadas por cultura microbiológica (método referência), 347 apresentaram crescimento bacteriano, sendo 305 identificadas como agentes de interesse na identificação direta pelo método MALDI-TOF MS: Staphylococcus coagulase negativa (n=191), S. aureus (n=31), S. agalactiae (n=42), S. uberis (n=37), S. dysgalactiae (n= 4). Sendo assim, 305 amostras foram analisadas pelo método de idenfificação direta MALDI-TOF MS, a qual apresentou baixa sensibilidade quando comparado com a cultura microbiológica (método referência): Staphylococcus coagulase negativa (14,08%), S. agalactiae (15,25%), S. uberis (1,69%) S. aureus (6,12%) e S. dysgalactiae (0%). A pré-incubação de amostras de leite não aumentou a sensibilidade de identificação direta de microrganismos causadores de mastite pelo método MALDI-TOF MS. / The purpose of the present study was to evaluate the technique of mass spectrometry by desorption / ionization assisted laser array time-of-flight (MALDI-TOF MS) for the direct identification in milk samples (no microbiological culture) of mastitis causing bacteria. Therefore, we carried out two experiments (1 and 2). In experiment 1, we determined the diagnostic sensitivity of MALDI-TOF MS technique for the direct identification in milk samples of Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae and Escherichia coli. Experimental contamination of S. aureus, S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae and E. coli in samples of milk to a concentration of 103-109 cfu/mL were performed. The contaminated milk samples were processed using kit Maldi Sepsityper® (Bruker Daltonics) and subjected to bacterial lysis protocol for analysis by MALDI-TOF MS. Mass spectra were collected in the mass range of 2000-20000 m/z and were analyzed by MALDI Biotyper 3.0 software (Bruker Daltonics) with default settings to obtain bacterial identification. Direct identification of mastitis causing pathogens from milk samples was possible at ≥106 cfu/mL for S. aureus, ≥107 cfu/mL for E. coli and ≥108 cfu/mL for S. agalactiae, S. dysgalactiae and S. uberis. In experiment 2, the objective was to evaluate the effect of pre-incubation of milk samples from mammary quarters with subclinical mastitis on the effectiveness of identification without cultivation, of mastitis-causing pathogens by MALDI-TOF MS. We selected mammary quarter milk samples from all lactating cows on two dairy herds. The milk samples were subjected to analyzes of: a) microbiological culture; b) pre-incubation followed by identification by mass spectrometry directly from milk; c) total bacterial count (TBC). Flow cytometry was used to determine TBC and; to directly identify the mastitis-causing pathogens from milk, fat was separated by centrifugation (10,000 Xg for 10 minutes) and; samples were pre-incubated at 37°C for 12 hours. Subsequently, the skim milk samples were submitted to kit Maldi Sepsityper® (Bruker Daltonics) and to the bacterial lysis protocol for analysis by MALDI-TOF MS. A total of 810 milk samples were analyzed by microbiological culture (reference method), of which 347 showed bacterial growth. Considering all culture positive samples 305 were identified as agents of interest in the direct identification by MALDI-TOF MS method: coagulase negative staphylococci (n = 191), S. aureus (n = 31), S. agalactiae (n = 42), S. uberis (n = 37) and S. dysgalactiae (n = 4). Therefore, 305 samples were directly identified by MALDI-TOF MS, which presented low sensitivity when compared to microbiological culture (Reference method): coagulase-negative staphylococci (14.08%), S. agalactiae (15.25 %), S. uberis (1.69%), S. aureus (6.12%) and S. dysgalactiae (0%). Pre-incubation of milk samples did not increase the sensitivity of the MALDI-TOF MS method directly identify mastitis-causing microorganisms.

Atualmente existe uma grande preocupação com relação aos efeitos a curto e longo prazo que muitos herbicidas podem ter sobre a saúde pública e o meio ambiente. Estes podem causar sérios danos ao metabolismo celular, levando geralmente a inibição do crescimento em microrganismos. Em exposição a herbicidas, esses microrganismos aumentam significativamente a geração de EAOs (Espécies Ativas de Oxigênio), causando estado de estresse oxidativo. O objetivo desse trabalho foi estudar a relação entre o efeito do herbicida acetochlor e a resposta do sistema antioxidante. Três linhagens de Klebsiella oxytoca foram submetidas ao crescimento em meio nutritivo com este herbicida nas concentrações de 0, 62 e 620 mM. O perfil protéico foi avaliado em SDS-PAGE, o qual revelou diferenças de intensidade das bandas, bem como a presença e ausência das mesmas em meio com herbicida. O herbicida causou estresse oxidativo nas três linhagens, o qual foi avaliado através da peroxidação de lipídeos, observado principalmente na concentração de 620 mM. As atividades da Catalase (CAT) e Superóxido Dismutase (SOD) foram altas para as três linhagens na concentração de 62 mM seguida de queda em 620 mM. Para a atividade da Glutationa Redutase (GR) foi observado decréscimo gradativo da atividade com o respectivo aumento da concentração de herbicida para as três linhagens. Porém para a atividade da Glutationa-S-transferase (GST), as três linhagens apresentaram comportamento diferencial para os mesmos tratamentos. O estudo da resposta antioxidativa de microrganismos na presença de xenobióticos são importantes para a compreensão de mecanismos de tolerância, biodegradação bem como para aplicação na biorremediação de ambientes contaminados. / Currently there is a great concern with respect to short and long term effects that many herbicides may cause on public health and the environment. They may seriously damage the cellular metabolism, generally leading to inhibition of the microbial growth. With the exposure to herbicides, these microorganisms significantly increase the generation of EAOs (Active Oxygen Species), generating a state of oxidative stress. The aim of this work was to study the effect of acetochlor herbicide in the response of antioxidant system. Three strains of the bacteria Klebsiella oxytoca were grown in a nutritional media containing the herbicide in concentrations of 0, 62 and 620 mM. The protein profile was evaluated in SDS-PAGE, which showed differences in the intensity of the bands, as well as the presence and absence in the media with herbicide. The oxidative stress was evaluated through the lipid peroxidation, and herbicide caused stress in all the three strains, mainly at the concentration of 620 mM. The activities of Catalase (CAT) and Superoxide Dismutase (SOD) were higher for the three strains in the concentration of 62 mM followed by a decrease at the concentration of 620 mM. For Glutathione Reductase (GR) it was observed a gradual reduction in its activity with the increase of herbicide concentration for all the three strains. However, in the case of Glutathione-S-transferase (GST) activity, the three strains showed differential behavior for the same treatments. The study of the antioxidative response of microorganisms in the presence of xenobiotics is important for the understanding of tolerance mechanisms, biodegradation as well as for application in the bioremediation of contaminated environments.

As plantas quando colonizadas produzem diversas enzimas de defesa que podem impedir o estabelecimento de microrganismos. Esta condição adversa na planta hospedeira gera uma resposta do microrganismo, a qual está associada à síntese de proteínas e outras moléculas que atuam na sua interação com a planta e alteram a comunidade microbiana associada. Todos os organismos respondem a essa condição, estabelecendo biofilmes, ou sintetizando um grupo de moléculas e proteínas que os protegem de danos e facilita a recuperação. Estas são chamadas proteínas de choque térmico (HSPs), as quais não foram ainda estudadas na interação Methylobacterium - planta. As bactérias do gênero Methylobacterium são metilotróficas facultativas da classe Alfa-proteobactéria, encontradas em relações epifíticas e endofíticas com diferentes espécies vegetais. Assim, o presente trabalho teve como objetivos avaliar o efeito da deficiência da produção de biofilme e de Acil-Homoserina-Lactonas (AHLs), e do estresse térmico de M. extorquens na colonização da planta hospedeira (Saccharum sp.). Para isso, foram usadas linhagens defectivas para produção de biofilme e AHLs, juntamente com a linhagem selvagem submetida ou não ao estresse térmico. Os resultados obtidos mostram a complexidade dos mecanismos envolvidos na produção de biofilme e moléculas AHLs. O estresse térmico não afetou a colonização das raízes nem de colmos após 5 dias de inóculo, porém causou uma diminuição da colonizacão do colmo após 15 dias. A mutação para produção de AHL não causou nenhuma diferença significativa na colonização da planta hospedeira, no entanto o mutante para biofilme apresentou uma diminuição significativa da colonização tanto de raízes quanto de colmos, mostrando a grande importância da formação de biofilme na colonização da planta hospedeira. Entretanto, quando esta linhagem foi coinoculada com uma linhagem transformada (ARGFP) este resultado não foi observado. Os demais tratamentos após co-inoculação com a linhagem ARGFP apresentaram o mesmo padrão de colonização. O estudo proteômico de M. extorquens detectou um grande número de proteínas induzidas ou suprimidas nos tratamentos avaliados que podem estar associadas às alterações no padrão de interação desta bactéria com a planta hospedeira. A identificação dessas proteínas auxiliará a compreensão e o maior entendimento dos fatores envolvidos na interação bactéria-planta. / Plants produce a variety of defense enzymes when colonized that can impair the microorganisms\' establishment. This adverse condition in the host plant lead to a response from the microorganism, which is associated with the synthesis of a set of proteins and other molecules that affect the interaction with the host and shift the bacterial community associated. All organisms respond to this condition by establishing biofilms, or synthesizing a group of proteins and molecules that protect them from injuries and help them recover from damages. They are called heat shock proteins (HSPs), which is still not studied in Methylobacterium-plant interaction. The methylotrophic bacteria of the genus Methylobacterium are found in epiphytic and endophytic association with different plant species. So, in this present work the effect of a deficiency in biofilm and acyl-homoserine-lactones (AHLs) production and the effect of heat shock of M. extorquens on the host colonization (Saccharum sp.) was assessed. Defective strains for biofilm and AHLs production were used. Also the wild type AR 1.6/2 and this strain submitted to heat shock was evaluated. The results demonstrated that the mechanisms associated to biofilm and AHLs production are very complex. The heat stress has no effect on roots or stems colonization after 5 days of the inoculum, but was associated to reduction of bacterial density in stems after 15 days. The strain defective for AHL production showed similar colonization profile with wild type strain, while the biofilm mutant colonized the host plant in low density, suggesting the role of this process in plant colonization. Likewise, coinoculation of this strain with ARGFP target strain, which is AHL producer, the low density of this biofilm mutant was observed. The other treatments after coinoculation with ARGFP strain showed similar result when inoculated alone. A proteomic study of the strains showed that synthesis of many proteins were induced or suppressed in evaluated treatments, which proteins could be associated to shift in the bacteria-plant interaction. The identification of these proteins will contribute to a better understanding of the factors related to bacteria-plant interaction.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-04T10:40:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 943889 bytes, checksum: 2c73252c1e6bb98d5e7d98fa75eb15c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T10:40:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 943889 bytes, checksum: 2c73252c1e6bb98d5e7d98fa75eb15c3 (MD5) Previous issue date: 2014-07-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As principais culturas starter utilizadas para produção de derivados cárneos fermentados são micro-organismos do grupo das bactérias láticas (BAL) e Staphylococcus coagulase negativa. Os gêneros Pediococcus e Lactobacillus possuem como principal característica a acidificação dos produtos e produção de compostos responsáveis pela determinação de aroma e sabor. Staphylococcus coagulase negativa contribuem para o desenvolvimento e a estabilidade da cor vermelha e para o desenvolvimento de outras propriedades sensoriais, como textura e aroma. O monitoramento adequado dessas populações é indispensável para manutenção da qualidade e inocuidade desses produtos. Porém, as metodologias convencionais de enumeração de culturas starter em alimentos possuem limitações quanto a praticidade e seletividade. Com isso, placas PetrifimTM AC tem sido empregadas para enumeração de culturas starter em produtos lácteos fermentados, desde que associadas a meios de cultura com agentes seletivos para grupos microbianos específicos. Considerando a escassez de dados científicos que demonstrem a pertinência de utilização de placas PetrifimTM AC associadas a meios de cultura seletivos para enumeração de BAL em produtos cárneos fermentados, o presente estudo tem como objetivo avaliar o uso de placas PetrfilmTMAC associado ao caldo MRS e vermelho de clorofenol para enumeração de culturas starter adicionadas em salames. Quatorze culturas puras e dois mix de culturas starter foram enumerados em seis protocolos diferentes: 1) PetrifilmTM AC associados ao caldo MRS adicionado de vermelho de clorofenol incubado em aerobiose e 2) em anaerobiose, 3) ágar MRS associado a vermelho de clorofenol, 4) MRS associado a púrpura de bromocresol, 5) MRS pH 5,7, e 6) ágar All Purpose Tween. Em seguida, amostras de salame foram obtidas e suas culturas starter enumeradas pelos protocolos 1, 2, 3 e 5. A análise de variância indicou ausência de diferenças significativas entre os protocolos de enumeração, independente dos tempos de incubação considerados (24, 48 e 72 horas). De maneira geral as contagens de culturas puras e culturas starter não apresentaram diferenças significativas considerando os diferentes tempos de incubação (exceto para AS 308 e S. xylosus em MRS com pH 5.7). Houve correlação significativa entre os protocolos, indicando a equivalência entre as contagens de culturas puras e culturas starter obtidas em aerobiose e em anaerobiose (p < 0,05). Os parâmetros de regressão linear também indicam correlações adequadas entre as contagens obtidas após 24, 48 e 72 h de incubação, indicando a confiabilidade dos resultados obtidos em um menor tempo de análise (24 h). Considerando os resultados obtidos na enumeração de culturas starter em salames, não foram observadas diferenças significativas entre os protocolos, independente dos tempos e condições de incubação e todas as correlações foram significativas (p < 0,05), indicando equivalências entre os protocolos independente das condições (aerobiose ou anaerobiose) e tempos (24, 48, 72h) de incubação. Após análise morfológica e identificação molecular de isolados obtidos das amostras de salame pelos protocolos avaliados, verificou-se uma seletividade adequada dos mesmos, que permitiram a formação de colônias apenas por micro-organismos dos gêneros Lactobacillus e Pediococcus, bem como Staphylococcus coagulase negativa, tipicamente utilizados como culturas starter para a produção de salame. Esses resultados confirmam a viabilidade da utilização de PetrifilmTM AC associado ao caldo MRS e vermelho de clorofenol para enumeração de culturas starter isoladas e em amostras de salame, em diferentes condições de aerobiose e em um reduzido período de incubação, representando vantagens a serem consideradas no monitoramento desses micro- organismos. / The main starter cultures used for the production of fermented meat products are microorganisms from the group of lactic acid bacteria (LAB) and Staphylococcus coagulase negative. Pediococcus and Lactobacillus present as main technological characteristic the acidification of products and production of compounds responsible for determining aroma and flavor. Staphylococcus coagulase negative contributes to the development and stability of the red color and the development of others sensory properties such as flavor and texture. Monitoring the populations is essential for maintaining the quality and safety of these products. However, conventional methods for enumeration of starter cultures in foods have limitations, due to poor selectivity and handling. Thus, PetrifilmTM AC plates have been used for enumeration of starter cultures in fermented dairy products, since associated with culture media with selective agents for specific microbial groups. Considering the lack of scientific data demonstrating the relevance of using PetrifilmTM AC plates associated with selective culture media for LAB enumeration in fermented meat products, the present study aimed to assess alternative protocols for the enumeration of starter culture in salami. Fourteen reference strains and two mix of starter cultures were plated on six different protocols: 1) PetrifilmTM AC added to MRS broth and chlorophenol red incubated in aerobiosis and 2) in anaerobiosis 3) agar MRS added to chlorophenol red 4) MRS added to bromocresol purple 5) MRS pH 5.7 and 6) agar All Purpose Tween. Then, samples of salami were obtained and their starter cultures enumerated by plating using protocols 1, 2, 3 and 5. The analysis of variance showed no significant differences between the enumeration protocols, independent of the incubation time: 24, 48 and 72 h. Generally, the counts of pure cultures of microorganisms and reference starter cultures showed no significant differences considering the different incubation times (except for AS 308 and S. xylosus in MRS at pH 5.7). The results indicated a significant correlation between the protocols, indicating equivalence between the counts of reference cultures and starter cultures in aerobiosis and anaerobiosis (p < 0.5). The linear regression parameters also indicate appropriate correlations between the counts obtained after 24, 48 and 72 h of incubation, indicating a reliability of the results obtained in a shorter analysis time (24 h). Considering the results obtained in the enumeration of starter cultures in salami, no significant differences were observed among the protocols considered, independent of time and incubation conditions, and all correlations were significant (p < 0.05), indicating equivalence between the protocols independent the conditions (aerobiosis and anaerobiosis) and time (24, 48 and 72 h) of incubation. After morphological and molecular identification of isolates obtained from samples of salami by the tested protocols, it was observed an adequate selectivity, which allowed the formation of colonies only by microorganisms of the genera Lactobacillus, Pediococcus and Staphylococcus coagulase negative, typically considered as starter cultures for the salami production. These results confirm the feasibility of using PetrifilmTM AC associated to MRS broth and chlorophenol red for enumeration of isolated starter cultures and starter cultures from salami samples, in different aerobic conditions and in a reduced incubation period, representing advantages to be considered during the monitoring of these microorganisms.

Orientadores: Valéria Maia Merzel, Itamar Soares de Melo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T12:19:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingos_DanielaFerreira_D.pdf: 4459680 bytes, checksum: c21b44008997f453425f3732e5729029 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O manguezal é um ambiente rico em diversidade microbiana, entretanto existem poucos estudos sobre esse tema no Brasil, tornando imperativo o conhecimento e a exploração de novos micro-organismos e seus metabólitos neste ecossistema. A prospecção da diversidade microbiana em ambientes pouco explorados, como os manguezais, potencializa as chances de sucesso na busca por novas moléculas bioativas, contribuindo para o desenvolvimento econômico e ambiental mais sustentável. Entretanto, sabemos que embora as técnicas de cultivo tenham sido aprimoradas e tenham permitido a recuperação in vitro de um número crescente de micro-organismos ainda não cultivados, nosso conhecimento sobre sua ecologia permanece insuficiente para cultivar a maioria deles. Neste contexto, as bibliotecas metagenômicas surgem como uma ferramenta poderosa para acessar de maneira mais abrangente a diversidade microbiana total em um dado ambiente, permitindo a análise e exploração de genes funcionais de membros da microbiota, principalmente de micro-organismos não-cultivados, e a descoberta de novos compostos bioativos. O objetivo geral desse trabalho foi a prospecção de biossurfactantes a partir de microbiota de manguezal utilizando uma abordagem polifásica. Para a abordagem independente-de-cultivo, foi construída uma biblioteca metagenômica de alto peso molecular a partir de sedimento de manguezal contaminado com petróleo. Os clones obtidos foram submetidos à triagem funcional e molecular para compostos com atividade biossurfactante. Três clones potencialmente produtores foram selecionados e submetidos ao sequenciamento fosmidial para a caracterização gênica dos insertos. Embora os clones apresentassem uma redução na tensão superficial, não foram identificados genes que pudessem estar envolvidos na síntese de algum biossurfactante. Os resultados obtidos revelaram que o uso da metagenômica funcional para a exploração metabólica de uma comunidade microbiana pode oferecer grandes limitações quando se trata de prospecção de biossurfactantes, cujos operons são muitas vezes maiores que 30-40 kb e podem conter elementos de regulação esparsos no genoma da bactéria selvagem. Na abordagem dependente-de-cultivo, foram selecionadas duas linhagens produtoras de biossurfactantes, Bacillus safensis CCMA-560 e Gordonia sp. CCMA-559, isoladas e testadas em estudo prévio. Através de planejamento experimental do tipo Plackett-Burman e Delineamento Composto Central Rotacional foi otimizada a produção do biossurfactante por essas linhagens. A pumolicidina produzida pelo B. safensis CCMA-560 foi caracterizada quimicamente, bem como a via metabólica responsável por sua produção. Este foi o primeiro trabalho a reportar a análise fisiológica, genética e química da produção de biossurfactante por representantes da espécie B. safensis / Abstract: Mangrove is an environment rich in microbial diversity, but little has been reported about it in Brazil, making the knowledge and exploitation of new microorganisms in mangroves an imperative issue. The prospection of microbial diversity in underexplored environments, such as mangroves, increses possibility of success in looking for new bioactive molecules, contributing to a more sustentable economy and environment. Although the cultivation techniques have been improved, allowing an increased number of yet uncultivated microorganisms to be able recuperated in vitro, our knowledge about their ecology is still insufficient to cultivate the majority of them. Therefore, the metagenomic library have emerged as a powerful tool to more widely access the overall microbial diversity in an environment, enabling the functional analyses of genes and the discovery of new bioactive compounds, mainly uncultured-microorganisms. The aim of the current work was the prospection of biosurfactant from mangrove microbiota through a polifasica approach. For the independent-cultivation approach, a metagenomic library of high molecular weight was constructed from mangrove sediment contaminated with oil. The clones were subjected to functional and molecular screening to identify biosurfactant activity. Three clones with the potential to procuce biosurfactant were selected, and the fosmid sequencing for genetic chatacterization of the insert was carried out. Although the clones showed the ability to reduce the surface tension, genes that may involved in biosurfactant synthesis were not identified. The results showed that using the functional metagenomic to explore metabolic pathways of microbial communities can have great limitation when in the prospection of biosurctants when the operon are larger then 30-40 kb and the genome of wild bacteria contains sparse regulation elements. For the dependent-cultivation approach, two strains that produce biosurfactant were selected: Bacillus safensis CCMA-560 and Gordonia sp. CCMA-559. They were isolated and tested in previous study. The biosurfactant production was opmized through the Placktt-Burman design and the Central Composite Design. The pumilacidin produced by B. safensis CCMA-560 was chemically characterized, and the metabolic pathway that is responsible for its production was genetically characterized. This work was the first report the physiologic, genetic, and chemical analysis on the biosurfactant production by the B. safensis strain / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are polyesters produced and degradable by prokaryotes, while biosurfactants/bioemulsifiers (BS/BE) are metabolites that reduces surface tension and synthesized by this group of organisms. Interest in the potential industrial applications for PHA and BS/BE has increased due to its eco-friendly appeal. In this study, 24 bacterial colonies were isolated from Atlantic forest soil and agro-industrial sludge (Coruripe-AL, Brazil) in minimum mineral medium, as indicative of the possible ability to synthesize PHA. All strains were submitted to biochemical characterization, while the phaC gene amplification showed that isolates BMA-05, BMA-10, BMA-13 and BDL-07 can express the key enzyme for the synthesis of PHA (PHA synthase). Sequencing of the partial 16S r-DNA region was able to identify these bacteria respectively as Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytocaand Bacillus pumilus. The PHAs produced by each isolate were extracted with hot chloroform and the polymeric films were obtained. Experiments in shaken flasks (0 – 96 h) were conducted to compare the biomass, total reducing glycides, pH, and total protein in minimal medium containing different contents of glucose and peptone. Supplementation with peptone was able to induce the growth of these strains, and cell-free supernatant from the cultivation of Pseudomonas fluorescens BMA-05 showed no acidification in any of the conditions tested. To polyhydroxybutyrate production (evaluated after 24 h incubation), minimal medium was used with different nitrogen sources: ammonium acetate, ammonium chloride, ammonium nitrate, sodium nitrate, ammonium sulfate, beef extract, yeast extract, glycine and peptone. The maximum accumulation of P (3HB), detected by UV-visible spectrophotometry, was obtained for P. fluorescens, E. aerogenes, K. oxytoca and B. pumilus grown in ammonium sulfate, ammonium chloride, meat extract and nitrate sodium, respectively. Observations in transmission electron microscope showed Pseudomonas fluorescens BMA-05 with eletronlucent granules when the strain was cultivated in the presence of ammonium sulfate or sodium nitrate. Although no granule was observed for the other strains in the presence of ammonium sulfate, the gas chromatography analysis confirmed the production of P (3HB). When exoenzymes expression tests were conducted, the results indicated that the strains were able to hydrolyse gelatine, starch and Tween 80, and B. pumilus caused hemolysis of sheep blood. Experiments for biosurfactant/bioemulsifier production indicate that E. aerogenes BMA-10 excreted a compound surfactant which collapses the hydrophobic surface and emulsifies the hydrocarbons kerosene, toluene, diesel oil and soybean oil. The emulsification index (E24) using the cell-free supernatant of this microorganism was thermally stable in toluene, but not in kerosene. Similar results were obtained when the pH of this microorganism cell-free supernatant was adjusted to 2, 7 and 10, as well as different concentrations of NaCl (2, 6, and 10 %) were added to the samples. These results reveal the potential of Enterobacter aerogenes BMA-10 as a P(3HB)-producing, and its growth medium free of cells an emulsifier for biotechnological purposes and also in bioremediation. / Polihidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres produzidos e degradados por procariotos, enquanto biosurfactantes/bioemulsificantes (BS/BE) são metabólitos que diminuem a tensão superficial e sintetizados por esse grupo de organismos. O interesse nas potenciais aplicações industriais para PHA e BS/BE tem aumentado devido ao apelo ecologicamente correto desses produtos. No presente estudo, isolaram-se 24 colônias bacterianas de solo de Mata Atlântica e lodo agroindustrial (Coruripe-AL, Brasil) em meio mineral mínimo, como indicativo da possível capacidade de sintetizar PHA. Todas as linhagens foram caracterizadas bioquimicamente, enquanto a amplificação do gene phaC evidenciou que os isolados BMA-05, BMA-10, BMA-13 e BDL-07 podem expressar a enzima-chave para a síntese de PHA (PHA sintase). O sequenciamento da região parcial 16S r-DNA dessas bactérias permitiu suas identificações respectivamente como Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca e Bacillus pumilus. Os PHAs produzidos por cada isolado foram extraídos com clorofórmio quente e os filmes poliméricos foram obtidos. Experimentos em frascos agitados (0 – 96 h) foram conduzidos para comparar a biomassa, glicídios redutores totais, pH e proteínas totais em meio mínimo contendo diferentes conteúdos de glicose e peptona. O suplemento com peptona demonstrou induzir o crescimento das linhagens, e o sobrenadante livre de células proveniente do cultivo de Pseudomonas fluorescens BMA-05 não apresentou acidificação em nenhuma das condições testadas. Na produção de polihidroxibutirato (avaliada após 24 h de incubação), utilizou-se o meio mínimo com diferentes fontes de nitrogênio: acetato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio, nitrato de sódio, sulfato de amônio, extrato de carne, extrato de levedura, glicina e peptona. O acúmulo máximo de P(3HB), detectado por espectrofotometria UV-visível, foi obtido quando P. fluorescens, E. aerogenes, K. oxytoca e B. pumilus foram cultivados no sulfato de amônio, cloreto de amônio, extrato de carne e nitrato de sódio, respectivamente. As observações em microscópio eletrônico de transmissão mostraram Pseudomonas fluorescens BMA-05 com grânulos eletronlucentes quando a linhagem foi cultivada na presença de sulfato de amônio ou nitrato de sódio. Embora nenhum grânulo tenha sido observado para as outras linhagens na presença do sulfato de amônio, as análises de cromatografia gasosa confirmaram a produção de P(3HB). Quando os testes de expressão de exoenzimas foram realizados, os resultados indicaram que as linhagens foram capazes de hidrolisar gelatina, amido e Tween 80, e B. pumilus causou hemólise em sangue de carneiro. Experimentos para a produção de biosurfactante/bioemulsificante indicam que E. aerogenes BMA-10 excretou um composto surfactante que colapsa na superfície hidrofóbica bem como emulsiona os hidrocarbonetos querosene, tolueno, óleo diesel e óleo de soja. O índice de emulsificação (E24) usando o sobrenadante livre de células desse microrganismo foi termalmente estável no tolueno, mas não em querosene. Resultados similares foram obtidos quando o pH do sobrenadante livre de células desse microrganismo foi ajustado para 2, 7 e 10, bem como quando concentrações diferentes de NaCl (2, 6 e 10 %) foram adicionadas às amostras. Tais resultados revelam o potencial de Enterobacter aerogenes BMA-10 como produtora de P(3HB), e o meio de cultura livre de suas células para finalidades emulsificantes em biotecnologia ambiental, bem como em biorremediação.

Métodos de desinfecção da água destinam-se à inativação de patógenos a fim de minimizar o risco de doenças transmitidas pela água. Estes métodos incluem tratamento com luz ultravioleta e processos químicos, para o qual cloro, dióxido de cloro, hipoclorito e ozônio são comumente utilizados. No entanto, métodos analíticos modernos revelam que estes métodos padrão de desinfecção da água podem levar à formação de produtos tóxicos e potencialmente cancerígenos. Desse modo, desenvolver métodos mais adequados para a desinfecção de água é uma necessidade. Inativação Fotodinâmica é uma nova abordagem para a eliminação de microrganismos patogênicos. Basicamente, esse processo utiliza fotossensibilizadores e luz para promover uma resposta fototóxica, normalmente oxidativa, capaz de danificar biomoléculas e estruturas celulares, provocando a morte dos microrganismos. No entanto, o fotossensibilizador não pode permanecer livre como um contaminante neste tipo de aplicação. Assim, o objetivo desse estudo foi o desenvolvimento de membranas de quitosana com fotossensibilizadores incorporados visando à desinfecção microbiológica da água. As membranas foram preparadas incorporando-se o azul de metileno, a rosa de bengala, meso-tetrakis (4-N-metilpiridil)-porfirina ou a 5,10,15,20-tetrakis(p-aminofenil)-porfirina. A eficiência do processo de Inativação Fotodinâmica com os fotossensibilizadores incorporados as membrana foi investigada empregando-se a bactéria Escherichia coli como modelo, já que esta bactéria está comumente presente em águas de abastecimento. Os resultados mostraram que, dentre os quatro fotossensibilizadores incorporados em membranas de quitosana, o processo fotodinâmico empregando a TMPyP se mostrou mais efetivo: 5 log de redução após 120 minutos de irradiação com LED branco e 4 log de redução após 120 e 140 minutos de irradiação com LED azul e amarelo, respectivamente. Além disso, com o intuito de simular uma situação real de desinfecção, um sistema circulatório de água, contendo membranas de quitosana/TMPyP reforçadas com nylon, foi empregado. Os resultados mostraram que o processo de fotoinativação dinâmico foi efetivo, apresentando 3 log de redução em 80 minutos de irradiação com LED branco. Estes resultados sugerem que o processo é efetivo para inativar bactérias contaminantes na água, empregando-se fotossensibilizadores incorporados em quitosana como suporte polimérico. / Methods of water disinfection aim to inactivate pathogens in order to minimize the risk of waterborne diseases. These methods include treatment with ultraviolet light and chemical processes, for which chlorine, chlorine dioxide, hypochlorite and ozone are commonly used. However, modern analytical methods reveal that these standard methods of water disinfection may lead to the formation of toxic and potentially carcinogenic products. Thus, developing suitable methods for water disinfection is a necessity. Photodynamic inactivation is a new approach to eliminate pathogenic microorganisms. Basically, this process uses photosensitizers and light to promote a phototoxic response, normally oxidative, capable of damaging biomolecules and cellular structures, causing the death of microorganisms. However, the photosensitizer cannot remain free as a contaminant in this type of application. The objective of this study was to develop chitosan membranes with incorporated photosensitizers aiming the microbiological water disinfection. The membranes were prepared by incorporating methylene blue, rose bengal, meso-tetrakis (4-N-methylpyridyl)-porphine or the 5,10,15,20-tetrakis(p-aminophenyl)- porphyrin. The efficiency of the Photodynamic Inactivation with photosensitizers incorporated into the membrane was investigated using the bacteria Escherichia coli as a model, since this bacteria is commonly present in drinking water. The results showed that, among the four photosensitizers incorporated into chitosan membranes, the process employing the TMPyP was more effective: 5 log reduction after 120 minutes of irradiation with white LED and 4 log reduction after 120 and 140 minutes of irradiation with blue and yellow LED, respectively. Moreover, in order to simulate a real situation of disinfection, a water circulation system, containing TMPyP/chitosan membranes reinforced with nylon, was employed. The results showed that the process of photoinactivation using a dynamic system was effective, with about 3 log reduction in 80 minutes of irradiation with white LED. These results suggest that the process is effective to inactivate bacterial contaminants in water using photosensitizers incorporated into chitosan as a polymeric support.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:53:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariana Caroline SpineliDissertacao.pdf: 444301 bytes, checksum: ea838eb9f0e8066235f850f27442c463 (MD5) Previous issue date: 2015-05-08 / Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The objective of this research was to evaluate the association between inoculation and application of nitrogen fertilizers in planting and cover the bean (Phaseolus vulgaris L.). The experiment was conducted in the field in Vegetable Crops experimental sector of the Faculty of Agronomy of the University José do Rosário Vellano - Unifenas, Alfenas - MG. The experimental design was randomized blocks, with eight treatments and three repetitions, being a control treatment without addition of inoculant and fertilizer, the other treatments were made up of N at planting, nitrogen in N at planting and coverage, inoculation and N in planting, inoculation and nitrogen in inoculation and N at planting and coverage, and only one treatment using only inoculation. We used the species Rhizobium inoculant tropici strain CIAT 899T, which was cultured in 79, containing bromothymol blue and pH 6.8, until the appearance of isolated colonies. These were transferred to liquid medium 79 for three days under stirring at 28 ° C until log phase growth containing approximately 108 cells ml-1. Sixty milliliters of this bacterial suspension was inoculated in 1400 using seeds cv. Pearl. All treatments received fertilization of 110 kg ha-1 of P2O5 and 50 kg ha-1 K2O at planting, after planting to 38 daysall treatments also received fertilization applied via leaf molybdenum. Nitrogen fertilization corresponded to 40 kg ha-1applied at planting and 60 kg ha-1applied in coverage at 28 days foliar. We evaluated the dry weight parameters of shoot (PSPA), shoot nitrogen content (TNPA), number of nodes (NN) and dry weight of nodules (PSN), nitrate reductase activity (NRA) in the flowering period, and number of pods per plant (NVP), number of seeds per plant (NSP), grain productivity (kg ha-1) and grain yield in bag of 60 kg ha-1. The results were that the inoculation is a practical feasible, and should be used in areas where there is used nitrogen fertilizer. The use of inoculant in association with nitrogen fertilization promoted higher plant growth and production of dry beans. / O objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito da associação entre inoculação e aplicação de fertilizantes nitrogenados em plantio e cobertura no feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). O experimento foi conduzido em campo no setor experimental de Olericultura da Faculdade de Agronomia da Universidade José do Rosário Vellano - Unifenas, Alfenas - MG. O delineamento experimental foi realizado em blocos casualizados, com oito tratamentos e três repetições, sendo um tratamento controle sem adição do inoculante e adubação, os demais tratamentos constituídos de N no plantio, N em cobertura, N no plantio e em cobertura, inoculação e N no plantio, inoculação e N em cobertura, inoculação e N no plantio e cobertura, e apenas um tratamento utilizando somente inoculação. Utilizou-se o inoculante da espécie Rhizobium tropici, estirpe CIAT 899T, que foi cultivada em meio 79, contendo azul de bromotimol e pH 6,8, até o aparecimento de colônias isoladas. Estas foram transferidas para o meio 79 líquido por três dias, sob agitação, a 28ºC até a fase log de crescimento, contendo aproximadamente 108 células mL-1. Sessenta mililitros desta suspensão bacteriana foram inoculados em 1400 sementes utilizando cv. Pérola. Todos os tratamentos receberam adubação de 110 kg ha-1de P2O5 e 50 kg ha-1 de K2O no sulco de plantio.Aos 38 dias após o plantio,todos os tratamentos também receberam adubação com molibdênio aplicado via foliar. A adubação nitrogenada correspondeu de 40 kg ha-1aplicadosno sulco de plantio e 60 kg ha-1aplicados em cobertura aos 28 dias via foliar. Foram avaliados os parâmetros: peso seco da parte aérea (PSPA), teor de nitrogênio da parte aérea (TNPA), número de nódulos (NN) e peso seco dos nódulos (PSN), atividade nitrato redutase (ANR) no período do florescimento, e número de vagem por planta (NVP), número de sementes por planta (NSP), produtividade de grãos em (kg ha-1) e produtividade de grãos em saca de 60 kg ha-1. Os resultados obtidos foram que a inoculação é uma prática viável, sendo recomendado seu uso em áreas em que não se empregam adubações nitrogenadas. O emprego do inoculante em associação com adubação nitrogenada promoveu o aumento do crescimento das plantas, bem como da produção do feijoeiro.

No presente trabalho procurou-se avaliar os tipos de metabolismo existentes em espécies e linhagens de Latobacillus isoladas de ambiente de fermentação alcoólica industrial. Para tal, 17, linhagens foram crescidas por 24 horas a 32 ºC, em meio de glicose e frutose (1% de cada açúcar) suplementado com extrato de levedura, minerais e tampão. O crescimento bacteriano foi estimado por plaqueamento e abosrbância a 600 nm, enquanto que no meio de crescimento foram estimados, mediante cromatografia de alta eficiência, os teores de ácido lático, ácido acético e etanol. Os isômeros óticos D(-)- e L(+)-lactato foram dosados enzimaticamente mediante espectrofotometria a 340nm, empregando-se desidrogenases estereoespcíficas. Os resultados mostraram que entre as 17 linhagens de Latobacillus avaliadas foram observados os três tipos de metabolismo : homofermentativo obrigatório (8 linhagens), heterofermentativo facultativo (1 linhagem) e heterofermentativo obrigatório (8 linhagens). Observou-se também uma relação estequiométrica dos produtos formados (lactato, acetato e etanol), condizente com os passos metabólicos característicos de cada grupo. Os resultados também permitem deduzir que quanto à formação dos isômeros óticos, houve predominância das linhagens tipo DL (produção simultânea dos dois isômeros), sobre as linhagens D e L. No entanto foram encontradas linhagens produzindo 100% de um dado isômero (D e L), descortinando a possibilidade de que linhagens isoladas de processo industrial de produção de etanol, possam atender demandas biotecnológicas que requeiram proporções definidas dos isômeros. Foi possível deduzir que a utilização dos teores de ácido lático na avaliação da contaminação bacteriana deve ser considerada com ressalvas, especialmente no caso do emprego do ácido L(+)-lático, e notadamente no caso de comunidades bacterianas complexas. / The aim of the present work was to evaluate the metabolism type of 17 Lactobacilli strains isolated from industrial ethanol fermentation plants. The strains were grown, at 32°C for 24 hours, on a mixture of equal amounts of glucose and fructose as the carbon source, and supplemented with yeast extract, mineral nutrients and buffer. Bacterial growth was estimated either by absorbance at 600nm and by plating. The main end products of bacterial metabolism (lactate, acetate and ethanol) were measured by high performance liquid chromatography, while the stereoisomers, D(-)- and L(+)-lactate were assayed by an enzymatic methodology using stereospecific lactatedehydrogenases. According to the results, all the three types of metabolism were found among the bacteria investigated: obligately homofermentative (8 strains), facultative heterofermentative (1 strain) and obligately heterofermentative (8 strains). Additionally, it was observed a stoichiometric relationship between the major end products (lactate, acetate and ethanol) in agreement with the metabolic pathway proposed for the different bacterial types (homo- and heterofermentative strains). The results have showed a predominance of strains of DL type, regarding the stereoisomers production. However, it was found strains producing a single type of the isomeric form. These findings suggest the possibility to explore the Lactobacilli biodiversity in fuel ethanol fermentation plants for lactate production of chemically pure optical isomers. It was also observed that the use of lactate content for a chemical evaluation of bacterial contamination may be considered with some restrictions, mainly in the case of L(+)-lactate, and particularly in the case of complex bacterial communities.