Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Resumo: A podridão negra, causada por Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), é considerada a doença bacteriana mais importante das brássicas no mundo. Apesar dos esforços para o manejo, sua ocorrência é comum em cultivos de brássicas. O conhecimento dos nichos de sobrevivência e mecanismos de disseminação de Xcc são de extrema importância para o manejo eficiente da podridão negra. Este trabalho avaliou a sobrevivência de Xcc em nichos ecológicos, assim como o potencial de disseminação da bactéria por insetos. Para identificar as plantas daninhas que podem favorecer a sobrevivência epifítica de Xcc, assim como novas hospedeiras sintomáticas da bactéria, coletas foram realizadas em seis campos de cultivo de brássicas do estado de São Paulo, em 2017 e 2018. A capacidade endofítica do isolado 3098C de Xcc, resistente a rifampicina, foi avaliada em quatro experimentos em casa de vegetação, entre 2017 e 2019, utilizando-se 23 espécies de plantas daninhas e dois métodos de inoculação. Em campo, quatro experimentos foram instalados entre 2017 e 2019 para avaliar a sobrevivência de Xcc na filosfera e rizosfera de 20 espécies de plantas cultivadas. A sobrevivência do isolado 3098C na rizosfera do repolho cultivado em seis tipos de solos também foi avaliada, em quatro experimentos. Além da sobrevivência, a disseminação de Xcc por Bemisia tabaci e Myzus persicae foi avaliada em experimentos em condições controladas. Como resultados, 30 espécies de plantas daninhas de 14 famílias botânicas ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Black rot, caused by Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), is considered the most important bacterial disease of brassica worldwide. Despite management efforts, its occurrence is common in brassica crops. Knowledge of survival niches and Xcc dissemination mechanisms are extremely important for the efficient management of black rot. This study evaluated Xcc survival in ecological niches, as well as the potential for the bacterium dissemination by insects. To identify the weeds that may favor Xcc epiphytic survival, as well as new symptomatic hosts of the bacterium, collections were carried out in six brassica crop fields in São Paulo State, in 2017 and 2018. The endophytic capacity of Xcc 3098C strain, resistant to rifampicin, was evaluated in four greenhouse experiments between 2017 and 2019, using 23 weed species and two inoculation methods. In the field, four experiments were conducted between 2017 and 2019 to assess Xcc survival in the phyllosphere and rhizosphere of 20 crop species. The survival of 3098C strain in cabbage rhizosphere, grown in six soils types, was also evaluated in four experiments. In addition to survival, Xcc dissemination by Bemisia tabaci and Myzus persicae was evaluated in experiments under controlled conditions. As a result, 30 weed species from 14 botanical families were collected from the six brassica crop fields, and Xcc was recovered from the phyllosphere of 25 species. In symptomatic plants, the bacterium was isolated from Bidens pilosa ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ronivaldo Rodrigues da Silva / Resumo: Atualmente, a avicultura é um dos setores de grande impacto na economia brasileira. Nos últimos anos, tem sido observado um aumento na produção de frangos de corte, fazendo com que este segmento da indústria gere toneladas de queratina com o descarte de penas. Isso aponta para a necessidade de degradar este material que emerge como um problema ambiental. Neste cenário, as enzimas queratinolíticas têm despertado interesse biotecnológico devido a peculiar capacidade para a degradação de queratina e a possibilidade de aplicar o hidrolisado protéico para suplementação de ração animal e uso como biofertilizantes. Desta forma, neste trabalho, nós propomos prospectar queratinases pela bactéria Citrobacter diversus e o fungo Coriolopsis byrsina e, em seguida, investigar as características bioquímicas destas enzimas, a fim de propor aplicação na degradação de penas de frango. Em nossos resultados, a bactéria C. diversus foi capaz de degradar quase completamente as penas de frango (0,5%) em meio submerso após 36 h de fermentação. O estudo com o extrato enzimático mostrou máxima atividade caseinolítica a pH 9-10,5 e 50-55 ºC, e queratinolítica a pH 8,5-9,5 e 50 ºC. Em destaque, conforme a estabilidade em incubação por 1 h a 50ºC, foi detectado aproximadamente 50% e 100% da atividade queratinolítica e caseinolítica, respectivamente. Sob estabilidade a pH por 48 h a 4ºC, o extrato enzimático manteve maior atividade na faixa de pH 6-8. A atividade caseinolítica foi inibida por EDTA e PMSF,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Currently, poultry is one of the sectors of great impact on the Brazilian economy. In recent years, there has been an increase in the production of broilers, causing this segment of the industry to generate tons of keratin with the disposal of feathers. This points to the need to degrade this material, which emerges as an environmental problem. In this scenario, keratinolytic enzymes have aroused biotechnological interest due to the peculiar capacity for the degradation of keratin and the possibility of applying protein hydrolyzate to supplement animal feed and use as biofertilizers. Thus, in this work we propose to prospect keratinases for the bacterium Citrobacter diversus and the fungus Coriolopsis byrsina and, next, to investigate the biochemical characteristics of these enzymes, in order to propose application in the degradation of chicken feathers. In our results, the bacterium C. diversus was able to degrade chicken feathers almost completely (0.5%) in submerged medium after 36 h. The study with the enzymatic extract showed maximum caseinolytic activity at pH 9-10.5 and 50-55 ºC, and keratinolytic activity at pH 8.5-9.5 and 50 ºC. Notably, after enzyme pre-incubation for 1 h at 50 ºC, approximately 50% and 100% of keratinolytic and caseinolytic activity were detected, respectively. Under pH stability for 48 h at 4ºC, the enzyme extract maintained greater activity in the pH 6-8 range. Caseinolytic activity was inhibited by EDTA and PMSF, and keratinolytic activity was i... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: Simone Baldini Lucheis / Banca: Paulo Francisco Domingues / Banca: Daniel Moura de Aguiar / Banca: Geraldo de Nardi Junior / Resumo: Nas últimas décadas é crescente o número de infecções por enterobactérias oportunistas multidroga resistentes em animais domésticos e humanos, em geral secundárias ao uso abusivo de antimicrobianos, incluindo pelo gênero Proteus. No entanto, as infecções por linhagens do gênero Proteus em animais domésticos são negligenciadas, relegadas ao segundo plano ou, por vezes, o micro-organismo é considerado "contaminante", ainda que em infecções como agente primário. Os registros de infecções por Proteus sp. em animais domésticos estão praticamente restritos aos relatos de casos, estudos retrospectivos ou compondo estudos com outros micro-organismos. São restritos no Brasil os estudos sistematizados envolvendo os principais aspectos clínico-epidemiológicos das afecções pelo gênero Proteus em grande número de animais domésticos, tampouco da presença de linhagens multirresistentes e/ou produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL). O presente estudo investigou o índice de resistência múltipla (IRMA) e a concentração inibitória mínima (CIM) de 73 isolados de Proteus mirabilis (n=69) e Proteus vulgaris (n=4) a diferentes antimicrobianos, bem com a produção fenotípica de ESBL, em isolados obtidos de várias manifestações clínicas em animais domésticos. Em cães, o micro-organismo foi identificado predominantemente em casos de cistite (48,21%), enterite (21,42%), otite (14,29%), conjuntivite (3,57%), dermatite (1,79%), artrite (1,79%) e em secreção de ferida cirúrgica (1,79%). Nos bovinos, o agente foi isolado de casos enterite (22,22%), abscesso (11,11%), otite (11,11%), onfalite (11,11%), peritonite (11,11%), metrite (11,11%) e em fragmento de órgão (11,11%). Nos equinos, enterite (50,0%), artrite (22,22%) e abscesso (16,67%) foram as principais afecções clínicas, enquanto nos felinos o agente foi isolado exclusivamente de casos de enterite (100,0%). A maior sensibilidade dos isolados no... / Abstract: In the last decades have been highlighted the increase number of infections in domestic animals and humans caused by opportunistic multidrug resistant enterobacteria, commonly associated to improper use of antimicrobials, including by Proteus species. However, Proteus infections in domestic animals have been misdiagnosed or the microorganism is considered a contaminant of microbiological cultures, besides to be a primary agent of diseases. Descriptions of Proteus infections in domestic animals usually are restricted to case reports, retrospective studies or part of studies involving other microorganisms. In Brazil, are restricted the comprehensive studies involving the main clinical and epidemiologic aspects of Proteus infections in a great number of domestic animals, as well as multiple drug resistant strains to conventional antimicrobials, and extended-spectrum beta-lactamase producers (ESBL). The present study investigated multiple antibiotic resistance index, minimum inhibitory concentration (MIC), and ESBL production in 73 strains of Proteus mirabilis (n=69) and Proteus vulgaris (n=4) isolated from different clinical manifestations in domestic animals. In dogs, the pathogen was identified most commonly causing cystitis (48.21), enteritis (21.42%), otitis (14.29%), conjuntivitis (3.57%), dermatitis (1.79%), arthritis (1.79%), and from surgical wound secretion (1.79%). In bovines, the microorganism occurred predominantly in enteritis (22.22%), abscesses (11.11%), otitis (11.11%), omphalitis (11.11%), peritonitis (11.11%), and in organ fragments (11.11%). Among equines, diarrhea (50.0%), arthritis (22.22%), and abscesses (16.67%) were the most common clinical manifestations, whereas in domestic cats the agent was identified exclusively in two cases of enteritis. In vitro standard disk diffusion method showed that the most effective antimicrobials against strains were imipenem (98.63), norfloxacin (95.89), amikacin (95.89), levofloxacin ... / Doutor

Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) é agente causal de uma das mais importantes doenças da cana-de-açúcar: o raquitismo-da-soqueira (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). O presente trabalho teve como objetivo principal usar métodos de análise cromossômica para corroborar o mapa genômico da estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli obtido através do seqüenciamento por "shotgun", realizado pelo grupo de seqüenciamento de Genomas Agronômicos e do Meio-ambiente (AEG) da rede ONSA-FAPESP. A identidade do isolado foi confirmada com a amplificação e seqüenciamento da região 23S do rRNA bem como por meio de testes sorológicos de microaglutinação com antissoro específico. Além destes, foram realizados testes de microscopia eletrônica de varredura da bactéria cultivada em meio líquido para confirmar a pureza do isolado. O tamanho do genoma de L. xyli subsp. xyli foi estimado com base na análise de fragmentos de restrição gerados por digestões com as enzimas de restrição XbaI e SpeI e eletroforese de campo pulsado (PFGE). As estimativas de 2.540 kb e 2.530 kb com XbaI e SpeI respectivamente ficaram próximas ao valor obtido pelo seqüenciamento genômico (2.596.959 pb). Em adição, o número de seqüências repetidas e de genes ribossomais identificados pelo projeto genoma foram confirmados por meio de hibridizações com sondas apropriadas. Comparações genômicas de L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis e duas espécies de Clavibacter também foram objetivos deste trabalho. As comparações foram baseadas em análise de RFLPs após a hibridização do DNA genômico utilizando como sondas elementos genéticos móveis presentes no genoma de L. xyli subsp. xyli. As estimativas dos números estimado de cópias destes elementos no genoma de L. xyli subsp. xyli obtidas por hibridizações concordam com aquelas obtidas pelo seqüenciamento, considerando fragmentos RFLPs menores que 9 kb. Informações referentes à fragmentos maiores não foram obtidas uma vez que estes não foram adequadamente resolvidos na corrida eletroforética. Finalmente, comparações através de análise de RFLP e rep-PCR mostraram diferenças entre L. xyli subsp. xyli e L. xyli subsp. cynodontis bem como entre estas e espécies de Clavibacter. Não foram verificadas diferenças entre a estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli e a estirpe australiana. / Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) is the causal agent of one of the most economically important disease of sugarcane worldwide, i.e, ratoon stunting disease (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). The main objective of this study was to confirm the assembly of the genome of L. xyli subsp. xyli obtained after shotgun sequencing by the Agronomic and Enviromental Genomes group of the ONSA/FAPESP network. The identity of the strain was confirmed by amplification and sequencing of the 23S rRNA region as well as by microaglutination serological tests with specific antiserum. Besides this, scanning electron microscopic analysis was used to assess the purity of the strain culture. The size of the genome of L. xyli subsp. xyli was estimated based on restriction analysis after digestion of genomic DNA with SpeI and XbaI followed by pulsed-field gel electrophoresis. The estimates of 2,530 kb and 2,540 kb, respectively for SpeI and XbaI, are in agreement with the one obtained by whole genome sequencing (2,596 kb). In addition, the number of repeated sequences and ribossomal genes predicted by thesequencing project was confirmed by hybridization experiments with the appropriate probes. Genomic comparisons of L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis and two Clavibacter species comprised a second objective of this study. Comparisons were based on RFLP analysis after hybridization of digested genomic DNA using mobile genetic elements present in the genome of L. xyli subsp. xyli as probes. The estimates of number of copies of these elements in the genome of L. xyli subsp. xyli obtained by this approach agreed with the ones obtained by sequencing if RFLP fragments smaller than 9 kb are considered. Data from larger fragments were not obtained since they were not adequately resolved by electrophoresis. Finally, RFLP and rep-PCR comparisons unveiled differences between L. xyli subsp. xyli and L. xyli subsp. cynodontis as well as between these and Clavibacter. No differences were found between strain CTC B07 of L. xyli subsp. xyli and an Australian strain.

Bactérias endofíticas e epifíticas podem conferir ao seu hospedeiro características como maior resistência a condições de estresse, alterações nas condições fisiológicas, fixação de nitrogênio atmosférico, suprimento de nutrientes, produção de reguladores de crescimento vegetal, entre outros. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivos estudar a composição da comunidade bacteriana associada à soja e avaliar diferentes mecanismos de interação bactéria-planta hospedeira. Para isso, bactérias endofíticas e epifíticas de folhas, caules e raízes de duas cultivares de soja, crescidas em solo com e sem aplicação pré-plantio do herbicida glifosato, foram amostradas em três estádios de desenvolvimento do hospedeiro, durante as safras de 2000/01 e 2001/02. Foram observadas diferenças significativas na diversidade e densidade bacterianas em relação às fases de crescimento da soja e tecidos da planta. Os principais grupos foram identificados como pertencentes aos gêneros Pseudomonas, Burkholderia, Ralstonia, Enterobacter, Pantoea, Acinetobacter, Agrobacterium e Methylobacterium. Além da avaliação de populações cultiváveis, análise por DGGE revelou que a comunidade bacteriana endofítica de raiz de soja pode ser influenciada pelo tratamento do solo com o herbicida glifosato. O potencial destas bactérias para a promoção de crescimento vegetal por bactérias associadas à soja foi avaliado, sendo possível observar que populações endofíticas e epifíticas de soja apresentam características relacionadas à promoção de crescimento vegetal e que fatores como cultivar e estádio fenológico do hospedeiro podem influenciar as freqüências destas populações. A análise da variabilidade genética destas populações bacterianas revelou que diferentes fatores ambientais também podem influenciar a diversidade de grupos bacterianos. Além disso, populações endofíticas com capacidade de crescer na presença do herbicida glifosato foram caracterizadas e identificadas como pertencentes às espécies Burkholderia gladioli e Pseudomonas oryzihabitans, enquanto que Methylobacterium spp. colonizam ativamente a superfície e os tecidos internos de soja após inoculação via semente. Os resultados obtidos podem oferecer uma contribuição para a melhor compreensão da interação microrganismossoja e, conseqüentemente, de sua aplicação na cultura deste vegetal. / Endophytic and epiphytic bacteria may increase the fitness of the plant host by increasing resistance to stress conditions, alterations in the physiologic conditions, fixation of atmospheric nitrogen, nutrient supplying and plant growth regulators production. The aims of the present work were to study the composition of soybean-associated bacterial community and to evaluate different mechanisms for bacteria-host plant interaction. For that, endophytic and epiphytic bacteria from leaves, stems and roots of two soybean cultivars, planted in soil with and without pre-planting application of the glyphosate herbicide, they were colleted in three development stages of the host, during two crops. Significant differences were observed in the bacterial diversity and population density in relation to the soybean growth stages and plant tissues. The principal groups were identified as belonging to the genera Pseudomonas, Burkholderia, Ralstonia, Enterobacter, Pantoea, Acinetobacter, Agrobacterium and Methylobacterium. Besides the evaluation of cultivable populations, analyses by DGGE revealed that the endophytic bacterial community from soybean roots may be influenced by the treatment of the soil with the glyphosate herbicide. Other analyzed aspect was the potential for plant growth promotion by soybean-associated bacteria; revealing that soybean's endophytic and epiphytic populations presented characteristics related to the plant growth promotion; factors such as cultivar and developmental stage of the host may influence the frequency of these populations. Environmental factors may affect the genetic variability of these bacterial populations. Besides, endophytic populations able to growth in medium containing glyphosate were characterized and identified as belonging to Burkholderia gladioli and Pseudomonas oryzihabitans species. Methylobacterium spp. were reintroduced in soybean seeds and superficial and endophytic colonization were evaluated by scanning electronic microscopy. The obtained results could offer a contribution for a better understanding of the interaction microorganism-soybean and, consequently, their possible use to improve soybean productivity.

Bactérias endofíticas e epifíticas podem conferir ao seu hospedeiro características como maior resistência a condições de estresse, alterações nas condições fisiológicas, fixação de nitrogênio atmosférico, suprimento de nutrientes, produção de reguladores de crescimento vegetal, entre outros. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivos estudar a composição da comunidade bacteriana associada à soja e avaliar diferentes mecanismos de interação bactéria-planta hospedeira. Para isso, bactérias endofíticas e epifíticas de folhas, caules e raízes de duas cultivares de soja, crescidas em solo com e sem aplicação pré-plantio do herbicida glifosato, foram amostradas em três estádios de desenvolvimento do hospedeiro, durante as safras de 2000/01 e 2001/02. Foram observadas diferenças significativas na diversidade e densidade bacterianas em relação às fases de crescimento da soja e tecidos da planta. Os principais grupos foram identificados como pertencentes aos gêneros Pseudomonas, Burkholderia, Ralstonia, Enterobacter, Pantoea, Acinetobacter, Agrobacterium e Methylobacterium. Além da avaliação de populações cultiváveis, análise por DGGE revelou que a comunidade bacteriana endofítica de raiz de soja pode ser influenciada pelo tratamento do solo com o herbicida glifosato. O potencial destas bactérias para a promoção de crescimento vegetal por bactérias associadas à soja foi avaliado, sendo possível observar que populações endofíticas e epifíticas de soja apresentam características relacionadas à promoção de crescimento vegetal e que fatores como cultivar e estádio fenológico do hospedeiro podem influenciar as freqüências destas populações. A análise da variabilidade genética destas populações bacterianas revelou que diferentes fatores ambientais também podem influenciar a diversidade de grupos bacterianos. Além disso, populações endofíticas com capacidade de crescer na presença do herbicida glifosato foram caracterizadas e identificadas como pertencentes às espécies Burkholderia gladioli e Pseudomonas oryzihabitans, enquanto que Methylobacterium spp. colonizam ativamente a superfície e os tecidos internos de soja após inoculação via semente. Os resultados obtidos podem oferecer uma contribuição para a melhor compreensão da interação microrganismossoja e, conseqüentemente, de sua aplicação na cultura deste vegetal. / Endophytic and epiphytic bacteria may increase the fitness of the plant host by increasing resistance to stress conditions, alterations in the physiologic conditions, fixation of atmospheric nitrogen, nutrient supplying and plant growth regulators production. The aims of the present work were to study the composition of soybean-associated bacterial community and to evaluate different mechanisms for bacteria-host plant interaction. For that, endophytic and epiphytic bacteria from leaves, stems and roots of two soybean cultivars, planted in soil with and without pre-planting application of the glyphosate herbicide, they were colleted in three development stages of the host, during two crops. Significant differences were observed in the bacterial diversity and population density in relation to the soybean growth stages and plant tissues. The principal groups were identified as belonging to the genera Pseudomonas, Burkholderia, Ralstonia, Enterobacter, Pantoea, Acinetobacter, Agrobacterium and Methylobacterium. Besides the evaluation of cultivable populations, analyses by DGGE revealed that the endophytic bacterial community from soybean roots may be influenced by the treatment of the soil with the glyphosate herbicide. Other analyzed aspect was the potential for plant growth promotion by soybean-associated bacteria; revealing that soybean's endophytic and epiphytic populations presented characteristics related to the plant growth promotion; factors such as cultivar and developmental stage of the host may influence the frequency of these populations. Environmental factors may affect the genetic variability of these bacterial populations. Besides, endophytic populations able to growth in medium containing glyphosate were characterized and identified as belonging to Burkholderia gladioli and Pseudomonas oryzihabitans species. Methylobacterium spp. were reintroduced in soybean seeds and superficial and endophytic colonization were evaluated by scanning electronic microscopy. The obtained results could offer a contribution for a better understanding of the interaction microorganism-soybean and, consequently, their possible use to improve soybean productivity.

Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) é agente causal de uma das mais importantes doenças da cana-de-açúcar: o raquitismo-da-soqueira (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). O presente trabalho teve como objetivo principal usar métodos de análise cromossômica para corroborar o mapa genômico da estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli obtido através do seqüenciamento por “shotgun”, realizado pelo grupo de seqüenciamento de Genomas Agronômicos e do Meio-ambiente (AEG) da rede ONSA-FAPESP. A identidade do isolado foi confirmada com a amplificação e seqüenciamento da região 23S do rRNA bem como por meio de testes sorológicos de microaglutinação com antissoro específico. Além destes, foram realizados testes de microscopia eletrônica de varredura da bactéria cultivada em meio líquido para confirmar a pureza do isolado. O tamanho do genoma de L. xyli subsp. xyli foi estimado com base na análise de fragmentos de restrição gerados por digestões com as enzimas de restrição XbaI e SpeI e eletroforese de campo pulsado (PFGE). As estimativas de 2.540 kb e 2.530 kb com XbaI e SpeI respectivamente ficaram próximas ao valor obtido pelo seqüenciamento genômico (2.596.959 pb). Em adição, o número de seqüências repetidas e de genes ribossomais identificados pelo projeto genoma foram confirmados por meio de hibridizações com sondas apropriadas. Comparações genômicas de L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis e duas espécies de Clavibacter também foram objetivos deste trabalho. As comparações foram baseadas em análise de RFLPs após a hibridização do DNA genômico utilizando como sondas elementos genéticos móveis presentes no genoma de L. xyli subsp. xyli. As estimativas dos números estimado de cópias destes elementos no genoma de L. xyli subsp. xyli obtidas por hibridizações concordam com aquelas obtidas pelo seqüenciamento, considerando fragmentos RFLPs menores que 9 kb. Informações referentes à fragmentos maiores não foram obtidas uma vez que estes não foram adequadamente resolvidos na corrida eletroforética. Finalmente, comparações através de análise de RFLP e rep-PCR mostraram diferenças entre L. xyli subsp. xyli e L. xyli subsp. cynodontis bem como entre estas e espécies de Clavibacter. Não foram verificadas diferenças entre a estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli e a estirpe australiana. / Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) is the causal agent of one of the most economically important disease of sugarcane worldwide, i.e, ratoon stunting disease (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). The main objective of this study was to confirm the assembly of the genome of L. xyli subsp. xyli obtained after shotgun sequencing by the Agronomic and Enviromental Genomes group of the ONSA/FAPESP network. The identity of the strain was confirmed by amplification and sequencing of the 23S rRNA region as well as by microaglutination serological tests with specific antiserum. Besides this, scanning electron microscopic analysis was used to assess the purity of the strain culture. The size of the genome of L. xyli subsp. xyli was estimated based on restriction analysis after digestion of genomic DNA with SpeI and XbaI followed by pulsed-field gel electrophoresis. The estimates of 2,530 kb and 2,540 kb, respectively for SpeI and XbaI, are in agreement with the one obtained by whole genome sequencing (2,596 kb). In addition, the number of repeated sequences and ribossomal genes predicted by thesequencing project was confirmed by hybridization experiments with the appropriate probes. Genomic comparisons of L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis and two Clavibacter species comprised a second objective of this study. Comparisons were based on RFLP analysis after hybridization of digested genomic DNA using mobile genetic elements present in the genome of L. xyli subsp. xyli as probes. The estimates of number of copies of these elements in the genome of L. xyli subsp. xyli obtained by this approach agreed with the ones obtained by sequencing if RFLP fragments smaller than 9 kb are considered. Data from larger fragments were not obtained since they were not adequately resolved by electrophoresis. Finally, RFLP and rep-PCR comparisons unveiled differences between L. xyli subsp. xyli and L. xyli subsp. cynodontis as well as between these and Clavibacter. No differences were found between strain CTC B07 of L. xyli subsp. xyli and an Australian strain.

A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. Kr6 mostrou-se com possibilidade de aplicação em processos envolvendo queratinólise, principalmente na hidrólise de penas de frango e depilação de couro bovino. No presente trabalho avaliou-se o efeito da composição do meio sobre o crescimento e atividade proteolítica deste isolado e uma protease queratinolítica (queratinase) foi purificada e caracterizada. O microrganismo mostrou-se adaptado à utilização de queratina como substrato durante o crescimento, produziu diferentes proteases dependendo do meio utilizado e a maior atividade proteolítica foi atingida quando utilizado meio de cultivo com penas como única fonte de carbono e nitrogênio. A adição de fonte extra de nutrientes resultou em uma parcial repressão catabólica. Uma protease extracelular (Q1) foi purificada cerca de 14 vezes utilizando cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL 4B e gel filtração em Superose H12R. Q1 mostrou ser uma proteína monomérica com peso molecular de 64 KDa determinado por SDS-PAGE e pH e temperatura ótimos de 8,5 e 50°C respectivamente. O perfil de inibição indica tratar-se uma metaloprotease e as seqüências internas dos peptídeos resultantes de digestão tríptica mostraram homologia ao sítio ativo e de ligação ao Zn da família M14 (Carboxipeptidase). A atividade proteolítica foi estimulada pela presença de íons Ca2+ e Mg2+ e inibida por Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ e agentes redutores. Q1 apresentou atividade queratinolítica sobre o substrato keratin azure, mas não foi capaz de hidrolisar penas de frango sugerindo a necessidade de outras enzimas durante o processo de degradação de penas. Utilizando os iniciadores degenerados desenhados com base na seqüência dos peptídeos, foi amplificado um fragmento de 470 pb correspondente a uma região do possível gene desta metaloproteína utilizando DNA e cDNA como molde. A seqüência do fragmento pode estar sendo expressa, mas não apresentou similaridade e homologia a proteínas conhecidas e portando, indicativa de uma nova metaloprotease. / The strain Chryseobacterium sp. kr6 shown to be useful for biotechnological purposes such as hydrolysis of poultry feathers and de-hairing of bovine pelts. The effect of media composition on the protease production and growth by this strain was studied and a keratinolytic protease (keratinase) was purified and characterized. The strain was adapted to use keratin as substrate to growth, produced different proteases in different media composition and the higher proteolytic activity was reached when used feather as only source of carbon and nitrogen. The addition of sources of nutrients has resulted in partially repressed catabolism. An extracellular protease Q1) was purified 14-fold by chromatography using the hydrophobic interaction Phenyl-Sepharose CL 4B column and gel filtração in Superose 12HR. SDS-PAGE indicated that the Q1 is a monomeric protein with molecular mass of 64 KDa. and optima pH and temperature were 8,5 e 50°C, respectively. The inhibition profile indicates to be a Zn-metalloprotease and analysis of tryptic peptides sequence revealed sequence homology to the conserved active site and Zn binding site, which may characterize keratinase Q1 as a member of M14 metalloprotease family (Carboxipeptidase). The activity was stimulated by of Ca2+ and Mg2+ and inhibited by Cu2+, Zn2+, Al2+, Hg 2+ and reducing agents. Q1 presented keratinolytic activity under substrate keratin azure, but was unable to hydrolyze poultry feather, suggesting the requirement by other enzymes in the feather hydrolysis mechanism. Degenerate primers amplified a 470 bp, corresponding to a probable gene region of this metalloprotein, with DNA and cDNA. The sequence is being expressed but do not showed similarity and homology to known proteins, thus indicating a new metalloprotease.

O objetivo do presente trabalho foi comparar fumantes e não fumantes com periodontite crônica com relação a presença e quantidade de patógenos periodontais, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real. Quarenta fumantes e quarenta não fumantes, pareados por idade, sexo e profundidade clínica de sondagem dos sítios de coleta microbiológica, foram incluídos no estudo. Foi realizado exame periodontal completo, e coletado um pool de biofilme subgengival dos sítios mais profundos de cada quadrante, em cada sujeito de pesquisa. Para confirmar os dados sobre tabagismo, os sujeitos foram submetidos à avaliação das concentrações de monóxido de carbono expirado, através de um monoxímetro. A presença e quantificação de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola foi determinada pela reação em cadeia da polimerase em tempo real. Fumantes apresentaram maior média de profundidade clínica de sondagem (p = 0,001) e nível clinico de inserção (p = 0,006), e menos sítios com sangramento à sondagem (p = 0,001) do que os não fumantes. Foi observada associação entre fumo e presença de A. actinomycetemcomitans (p < 0,001). Contagens médias de A. actinomycetemcomitans (p < 0,001), P. gingivalis (p = 0,042) e T. forsythia (p < 0,001) foram significantemente maiores nos fumantes. Os resultados permitiram concluir que o fumo altera a composição da microbiota subgengival em indivíduos com periodontite crônica, com diferenças na presença e quantidade dos patógenos periodontais investigados. / The aim of the present investigation is to compare smokers and nonsmokers with chronic periodontitis, regarding the presence and quantity of periodontal pathogens, using real-time polymerase chain reaction. Forty current smokers and forty never-smokers, matched for age, sex and sampling sites mean probing depth, were included in this investigation. A full-mouth periodontal examination was performed, and a pooled subgingival plaque sample was collected from the deepest site, in each quadrant, of each subject. To confirm smoking status, subjects had their expired air carbon monoxide concentrations measured with the help of a carbon monoxide monitor. The presence and quantification of Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia and Treponema denticola were determined by real-time polymerase chain reaction. Smokers presented greater overall mean probing depth (p = 0,001) and mean clinical attachment level (p = 0,006), and fewer bleeding on probing sites (p = 0,001). An association was observed between smoking status and presence of A. actinomycetemcomitans (p < 0.001). Counts of A. actinomycetemcomitans (p < 0,001), P. gingivalis (p = 0,042) and T. forsythia (p< 0,001) were significantly higher in smokers. We concluded that smoking changes the composition of the subgingival microbiota in chronic periodontitis patients, with differences in the presence and quantification of investigated periodontopathogens.

Soils have been contaminated with cadmium (Cd) by the use of fertilizers, calcareous, pesticides and industrial and/or domestic effluents. It can be leached to groundwater, as well as be taken up by plants potentially leading to reduce growth and yield. It causes different damages to the cell, generating oxidative stress which is responsible for its toxicity, affecting all living organism. A balance in the redox state of the cell to maintain cellular integrity and metabolism is essential for organism tolerance. Thus, the antioxidant response of bacteria exposed to Cd was studied to understand the tolerance mechanism, and be able to develop a methodology to bioremediate contaminated soils. MDA and hydrogen peroxide contents and different enzymes activity of antioxidant system (SOD, CAT, GR and GST) of two strains from Burkholderia genus, one from a soil contaminated with Cd in high concentrations (strain SCMS54) and the other from soil without Cd (strain SNMS32) in two exposure time (5 and 12 h), were analyzed. Stress measurement (MDA and hydrogen peroxide content) and antioxidant enzyme activities (SOD, CAT, GR and GST) increased in almost all treatments in the presence of Cd. These results also indicate that strain SCMS54 (isolated from Cd contaminated soil) presents a higher metabolic diversity and plasticity due the expression of more isoforms of the enzymes SOD, CAT and GR. The strain also accumulates 50% more Cd. We also analyzed the response to Ni of these two strain, observing a similar response to Cd, except for GST enzyme expression, which in strain SCMS54 this enzyme was induced in the presence of Ni, indicating that this enzyme can be essential on Ni tolerance. After that, the strain isolated from Cd contaminated soil (SCMS54) was selected to proceed the studies to evaluate the benefits of tolerant microorganism-tomato plant interaction. The use of plants to remove heavy metals from contaminated soilhas less impact and a lower cost. Soil microorganisms can be able to solubilize or mobilize soil metals acting also as bioremediator. Besides the high tolerance to Cd, the strain SCMS54 can produce indole-acetic acid (IAA), solubilize inorganic phosphate and produce siderophore, revealing its potential in plantmicroorganism mutual and beneficial interaction. When interacting with tomato plants exposed to Cd, this bacterium led to decrease in plant peroxide concentration and chlorosis levels, promoted relative plant growth and reduced the root absorption of Cd resulting in an increase in plant tolerance to this highly toxic heavy metal. Indicating that inoculation of tomato plants with Burkholderia sp. SCMS54 promotes better growth when cultivated in the presence of Cd by a mechanism that appears to decrease Cd concentration in roots as a result of a bacterial-plant root beneficial interaction. / O cádmio (Cd) tem contaminado solos pelo uso de fertilizantes, calcário, agrotóxicos e resíduos industriais e/ou domésticos. Podendo ser lixiviado ao lençol freático ou absorvido pelas plantas,resultando na redução do crescimento e da produtividade. Esse metal afeta todos os organismos vivos e causa diferentes danos às células. A tolerância a esse metal se deve principalmente ao balanço do estado redox da célula para manter a integridade celular e metabolismo.Assim, foram isoladas bactérias de solo contaminado e não contaminado com Cd, selecionando isolados tolerantes a altas concentrações de diferentes metais (Cd, Ni e Zn), em seguida, foi observado a resposta do sistema antioxidante da bactéria na presença do Cd, a fim de auxiliar no desenvolvimento de metodologias para biorremediar solos contaminados. Foi quantificado MDA e peróxido de hidrogênio e a atividade de diferentes enzimas do sistema antioxidante (SOD, CAT, GR e GST) de duas estirpes do gênero Burkholderia tolerantes a todos os metais testados, uma isolada do solo contaminado com altas concentrações de Cd (estirpe SCMS54) e a outra do solo sem Cd (estirpe SNMS32) em dois tempos de exposição (5 e 12 h). Na estirpe SCMS54, as medidas de estresse (peroxidação lipídica e peróxido de hidrogênio) e a atividade das enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GR e GST) da maioria dos tratamento com cádmio aumentaram, esta estirpe também expressa mais isoformas de SOD, CAT e GR, além de acumular 50% mais Cd. Esses resultados mostram que a estirpe SCMS54 (isolada do solo contaminado com Cd) apresenta uma maior diversidade metabólica e plasticidade. Foram analisadas também a resposta dessas duas estirpes ao Ni, observando uma resposta semelhante ao Cd, exceto na expressão da enzima GST, que no estirpe SCMS54 foi induzida na presença do Ni, indicando que essa enzima pode ser essencial na tolerância ao Ni. Portanto, a estirpe isoladado solo contaminado com Cd (SCMS54) foi selecionada para prosseguir os estudos e avaliar os benefícios da interação entre microrganismos tolerantes-plantas de tomate na fitorremediação. Essa técnica é usada remover para metais pesados do solo com um menor impacto e baixos custos. Os microrganismos do solo podem solubilizar e mobilizar metais do solo, atuando como biorremediador. Além da alta tolerância ao Cd, a estirpe SCMS54 produz ácido indol acético (AIA), solubiliza fosfato inorgânico e produz sideroforo, mostrando seu potencial na interação benéfica planta-microorganismo. Quando interagindo com as plantas de tomate expostas ao Cd, essa bactéria diminui a concentração de peróxido da planta e a clorose ocasionado pelo Cd,e reduz a absorção de Cd pela raiz resultando em um aumento da tolerância da planta ao metal pesado altamente tóxico. Assim, a inoculação de plantas de tomate com Burkholderia sp. SCMS54 promove crescimento da planta na presença de Cd, desencadeando um mecanismo que diminui a concentração de Cd nas raízes devido a essa interação benéfica bactéria-raiz da planta.