Orientador: Marcelo Andreotti / Banca: Salarier Buzetti / Banca: Vandeir Francisco Guimaraes / Resumo: Objetivou-se avaliar doses de nitrogênio em cobertura, com e sem a inoculação das sementes com a bactéria promotora de crescimento de plantas Azospirillum brasilense nas safras de primavera/verão de 2011/12 e 2012/13 em cultivo do milho solteiro, e no milho outonal nas safras 2012 e 2013, consorciado com Urochloa brizantha cv. Xaraés. O delineamento experimental utilizado para as quatro safras foi o de blocos casualizados, com quatro repetições, em esquema fatorial 5 X 2, ou seja, cinco doses de N em cobertura (0; 30; 60; 90 e 120 kg ha -1 ), com e sem a inoculação das sementes do milho com A. brasilense, na dose de 100 mL para 25 kg de sementes, sendo consorciado com Urochloa brizantha cv. Xaraés nas duas safras outonais. Foram avaliados no florescimento do milho, os teores de nutrientes foliares e o índice de clorofila foliar, e na colheita os componentes da produção e a produtividade de grãos do milho, bem como a produtividade de matéria seca e o teor de proteína bruta da forrageira após o consórcio. A adubação em cobertura, com a dose de N de até 120 kg ha -1 , incrementou linearmente os teores nutricionais foliares e a produtividade de grãos do milho irrigado cultivado na primavera/verão no Cerrado, e os teores de proteína bruta do capim-Xaraés em consórcio com o milho outonal. A inoculação das sementes de milho com A. brasilense, em cultivo consorciado com capim-Xaraés na época outonal incrementou a nutrição, a altura das plantas e os componentes da produção do milho, entretanto, sem efeito na produtividade de grãos. Plantas de milho advindas de sementes inoculadas com A. brasilense, pelo seu maior crescimento vegetativo, proporcionaram menor produção de matéria seca do capim-Xaraés semeado em consórcio com o milho outonal / Abstract: This study aimed to evaluate doses of nitrogen, with and without seed inoculation with bacteria Azospirillum brasilense cropped in spring/summer of 2011/12 and 2012/13 in single corn crop, and corn in autumn cropped in 2012 and 2013, intercropped with Urochloa brizantha cv. Xaraés. The experimental design for the four cropped was a randomized complete block design with four replications in a factorial 5 X 2, or five N topdressing (0, 30, 60, 90 and 120 kg ha -1 ) with and without the inoculation of corn seeds with A. brasilense at a dose of 100 mL per 25 kg of seed being intercropped by Urochloa brizantha cv. Xaraés the two autumnal cropped. Were evaluated at corn flowering, the levels of foliar nutrients and chlorophyll index, and crop yield components and grain yield of corn as well as the productivity of dry matter and crude protein content of the forage after the consortium. The topdressing, with N rates up to 120 kg ha -1 , increased linearly foliar nutrient levels and grain yield of irrigated corn grown in the spring/summer in the Cerrado soil, and crude protein of grass Xaraés in consortium with the autumnal corn. Inoculation of corn seeds with A. brasilense, in intercropping with Xaraés grass in autumnal time increased the nutrition, growth in plant height and yield components of corn, however, without effect on grain yield. Corn plants resulting from seeds inoculated with A. brasilense, by their greater vegetative growth, providing lower dry matter production of grass seed into Xaraés consortium with autumnal corn / Mestre

CAPES / O uso da água e seu posterior lançamento em corpos hídricos, pode ser um possível fator de disseminação de microrganismos potencialmente patogênicos e/ou resistentes. A presença destes microrganismos em águas tratadas ou não, pode representar considerável risco a saúde da população em geral e ao meio ambiente. No Brasil, segundo a legislação atual, os estabelecimentos assistenciais de saúde podem direcionar seus efluentes para a rede coletora e de tratamento de esgoto, juntamente com o esgoto doméstico. Considerando a sobrevivência dos microrganismos patogênicos lançados no esgoto hospitalar e sua permanência após os processos de tratamento, buscou-se realizar a quantificação, isolamento, identificação de bactérias ambientais oportunistas e/ou feco-orais (Acinetobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus), presentes em esgoto hospitalar, entrada e saída de uma estação tratamento de esgoto - ETE, além de estudar a sensibilidade destes isolados a antimicrobianos (antibióticos e desinfetantes) e exposição à radiação Ultravioleta (UV). Amostras de esgoto foram coletadas durante um período de oito meses (Maio a Dezembro de 2013), sendo realizadas analises quanto a seus parâmetros físico-químicos (DQO, Série de Sólidos, pH, Nitrogênio Amoniacal, Turbidez) e análises microbiológicas (Isolamento, quantificação e identificação), e testes de sensibilidade a antibióticos e desinfetantes mais utilizados nos hospitais brasileiros e de contatado com radiação ultravioleta. Foi constatado a existência de todos os gêneros/espécies foco deste estudo, em todos os pontos de coleta, além de resistência das bactérias aos antibióticos testados e tratamentos propostos. Um dos fatores de baixa eficiência para os tratamentos pode ser atribuída a quantidade elevada de sólidos suspensos dispersos no efluente e a crescente emergência de multirresistência para os testes de antibiograma. Estes fatores suscitam a necessidade de um maior controle pela comunidade científica e pela população em geral no que diz respeito ao impacto da presença dessas bactérias nos esgotos e posteriormente nos corpos hídricos, em seu ecossistema e a saúde pública. / The use of water and its posterior release into hydric bodies can be a possible factor of dissemination of microorganisms potentially pathogenic and/or resistant. The presence of these organisms in treated or untreated water may represent considerable threat to the general population’s health and the environment. In Brazil, according to current legislation, health assistance establishments can direct its effluents to the sewage treatment and collection network together with domestic sewage. Taking into consideration the survival of pathogenic microorganisms released in hospital sewage as well as its permanence after treatment processes, this study realized the quantification, isolation and identification of opportunistic environmental and/or fecal-oral bacteria (Acinetobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus), present in hospital sewage and in sewage treatment station entry and exit –ETE, and studied the sensibility of these isolated towards antimicrobials (antibiotics and disinfectants) and exposure to UV (Ultraviolet Radiation). Sewage samples were collected during a period of 8 months (from May to December 2013) to analyze their chemical-physical parameters (COD, Series of Solids, pH, Nitrogen Ammonia, Turbidity) and to carry out microbiological analyses (Isolation, quantification and identification) and sensibility tests to the most used antibiotics and disinfectants by Brazilian hospitals and in contact with UV radiation. The presence of all the species/ genus, which were the focus of this study, was detected in all collection points plus their resistance to tested antibiotics and proposed treatments. One of the low efficiency factors for the treatments were the high amount of suspended solids dispersed in the effluent and the increasing multi-resistance emergency to antibiogram tests. These factors have created the need for greater control by the scientific community and the general population in regards to the impact of the presence of these bacteria in sewages and later in hydric bodies, its ecosystem and public health.

O lançamento de compostos nitrogenados em corpos d’água pode resultar em problemas ambientais, sendo assim tratar águas residuárias, como o esgoto sanitário com o objetivo de remover não apenas matéria orgânica, mas tambémnitrogênio tem sido objeto de estudo há algumas décadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho de um reator de leito estruturado e fluxo contínuo, com recirculação, na remoção de matéria orgânica e nitrogênio presente em esgoto sanitário, sob diferentes ciclos de Aeração intermitente (AI) e avaliar a influência destes ciclos no desenvolvimento de bactérias nitrificantes (Bactérias Oxidadoras de Amônia – BOA e Bactérias Oxidadoras de Nitrito – BON) e desnitrificantes (DESN) aderidas (Material Suporte - MS) e em suspensão (Efluente – EF e Lodo – LD). O reator utilizado possuía volume útil de 9,4 L. Como material suporte (MS) foi utilizado espuma de poliuretano, cortada e fixada em hastes de PVC. Foram trabalhadas 3 fases de aeração (AE) e não aeração (AN) com diferentes tempos: Fase 1 (4 h AE/ 2 h AN); Fase 2 (2 h AE/ 1 h AN) e Fase 3 (2 h AE/ 2 h AN). Durante todas as fases o tempo de detenção hidráulico foi mantido em 16 h e o efluente recirculado a uma vazão de 3 vezes a vazão afluente. Foram analisados: pH, alcalinidade total, temperatura, Demanda Química de Oxigênio (DQO), Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO), Nitrogênio Kjeldhl Total (NKT), N-amoniacal – N-NH4+, nitrito- N-NO2 e nitrato- N-NO3. A concentração das BOA, BON e DESN foi determinada utilizando o Número Mais Provável.gSSV-1 (NMP.gSSVmL-1). Na Fase 1 o percentual de remoção de NKT, N-NH4+ e NT foi de 76±10%, 70±21% e 67±10% respectivamente. Na Fase 2 de 80±15% de remoção de NKT, 86±15% de N-NH4+ e 68±9% de remoção de NT e na Fase 3 de 58±20%, 72±28% e 41±6% de NKT, N-NH4+ e NT, respectivamente. A eficiência de desnitrificação nas 3 fases foi acima de 70%, indicando que no reator ocorreu o processo de Nitrificação e desnitrificação Simultânea (NDS). Os percentuais de remoção de DQOT foram de 88%±4 na Fase 1, 94%±7 na Fase 2 e 90%±11 na Fase 3. A ANOVA multivariada aplicada ao NMP.gSSV-1, indicou que houve diferença significativa (F: 20,2; p-valor <0,01) entre a concentração dos organismos analisados nos diferentes ciclos de AI. Porém as diferenças entre os NMP.gSSV-1 não depende apenas de fatores isolados e sim de quais meios, fases e grupos estão sendo analisados. Dos resultados conclui-se que o sistema foi eficiente em termos de remoção de nitrogênio e matéria orgânica, e que a fase que apresentou a maior disponibilidade de Oxigênio Dissolvido (OD) e relação C/N (Fase 2), foi a que obteve as menores concentrações efluentes de matéria orgânica e N-NH4+. Apontasse que houve diferença significativa entre a concentração (NMP.gSSV-1) dos organismos analisados (BOA, BON e DESN), porém esta diferença não depende de fatores isolados e sim de quais meios (MS, EF ou LD, fases (1, 2 ou 3) e grupos (BOA, BON e DESN) está sendo considerado. / The release of nitrogen compounds in water bodies can result in many environmental problems, so treat wastewater, such as sewage in order to remove not only organic matter but also nitrogen has been studied a few decades. From the above, the objective of this study was to evaluate the performance of a structured bed reactor, continuous flow, with recirculation, in removing organic matter and nitrogen present in wastewater under different cycles of intermittent aeration (AI) and to evaluate the influence of these cycles in the development of nitrifying bacteria (Oxidizing Bacteria Ammonia - BOA and Bacteria Oxidizing Nitrite - BON) and denitrifying (DESN) adhered (Support Material - MS) and suspension (Effluent - EF and sludge - LD). The reactor used has usable volume of 9.4 L. As support materials (MS) polyurethane foam was used, cut and fixed in PVC rods. 3 were worked aeration phases (AE) and non-aeration (AN) at different stage: Stage 1 (4 h EA / AN 2H); Stage 2 (2H EA / AN 1 h) and Phase 3 (2H EA / AN 2 h). During all hydraulic detention time phases was kept at 16 h and the effluent recirculated at a rate of 3 times the inflow. Were analyzed: pH, total alkalinity, temperature, chemical oxygen demand (COD), Biochemical Oxygen Demand (BOD), nitrogen Kjeldhl Total (NKT), ammonia-N-N-NH4+, nitrito-N-NO2+andnitrato-NO3-. The concentration of BOA, BON and DESN was determined using the number More Provável.gSSV-1 (NMP.gSSV-1). In phase 1 the percentage removal NTK N-NH4+ and NT was 76±10%, 70±21% and 67±10% respectively. In Phase 2 80±15% of removel NKT, 86±15% of N-NH4+ e 68±9% of removel NT e na Fase 3 de 58±20%, 72±28% and 41±6% of NKT, N-NH4+ of NT, respectively. The denitrification efficiency in stage 3 was over 70%, indicating that occurred in the reactor the process of simultaneous nitrification and denitrification (NDS). DQOT the removal percentages were 88 ± 4% in Phase 1, 94 ± 7 in Phase 2 and 90± 11% in Phase 3. The multivariate ANOVA applied to NMP.gSSV-1, it indicated that there was significant (F: 20,2, p <0,01) between the analyzed concentration of organisms AI in different cycles, but the differences between NMP.gSSV-1 depends not only isolated factors but of which means, and phase groups being analysis. From the results it is concluded that the working system is efficient in terms of nitrogen removal and organic matter, and that the stage with the highest availability of Dissolved Oxygen (DO) and C/N ratio (Step 2), was the one obtained the lower concentrations of organic matter effluents and N-NH4+. Hinted that there was a significant difference between the concentration (NMP.100mL-1) of the analyzed organizations (BOA, BON and DESN), but this difference does not depend on factors alone but of which means (MS, EF or LD), stages (1, 2 or 3) and groups (BOA, BON and DESN) is being considered.

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000431351-0.pdf: 2942190 bytes, checksum: c6eabd5cdfe51ae9bd263fa784c3b71b (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / This study evaluated the use of optic fiber and different pre-irradiation times (PIT) in phototherapy with LED for the root canal disinfection of bovine teeth infected in vitro with Enterococcus faecalis. One hundred twenty bovine teeth were inoculated with E. faecalis and incubated for 60 days. The teeth were divided into six groups (n=20): Group 1 – distilled water; Group 2 – 1 minute PIT and no optic fiber; Group 3 – 1 minute PIT and optic fiber; Group 4 – 5 minute PIT and no optic fiber; Group 5 – 5 minutes PIT and optic fiber; Group 6 – 2% sodium hypochlorite. Specimens were evaluated using microbiological tests and SEM analysis. Microbiological analysis revealed that group 6 had the best results and there were statistically significant differences between this group and groups 1, 2, 3, 4 and 5, there were no statistically significant differences between groups 1, 2, 3, 4 and 5. SEM analysis of canal wall, in the three thirds, revealed group 6 had the best results (there were statistically significant differences between this group and groups 1, 3, 4 and 5) and group 2 had the best results between groups of photodynamic therapy. In exposed tubules, group 1 had the best results in the apical, and group 3 had the best results between groups of photodynamic therapy. Group 6 had the best results in the middle and coronal third, and between groups of photodynamic group 2 had the best results in the middle third and group 3 in the coronal third. No differences in disinfection of root canals were found when optic fiber were used for photodynamic therapy. Photodynamic therapy should not be used alone in the disinfection of root canals, but it may be valuable as a complement for disinfection performed using different cleaning methods. / O objetivo deste estudo foi testar a influência da utilização da fibra óptica e de diferentes tempos de pré-irradiação (PIT) na terapia fotodinâmica com LED, na desinfecção de canais radiculares de dentes bovinos infectados, in vitro, com Enterococcus faecalis. Cento e vinte dentes bovinos foram inoculados com E. faecalis, permanecendo em cultivo por 60 dias. Os dentes foram divididos em seis grupos (n=20): Grupo 1- água destilada; Grupo 2- 1 minuto PIT/sem fibra óptica; Grupo 3- 1 minuto PIT/fibra óptica; Grupo 4- 5 minutos PIT/sem fibra óptica; Grupo 5 - 5 minutos/com fibra óptica; Grupo 6 –hipoclorito de sódio 2%. Foram realizados testes microbiológicos e análise em SEM. A análise microbiológica mostrou que o grupo 6 obteve os melhores resultados, com diferença estatística entre este e os grupos 1, 2, 3, 4 e 5. A análise da microscopia eletrônica de varredura, nos três terços da parede do canal mostrou os melhores resultados para o grupo 6 (com diferença estatisticamente significativa com os grupos 1, 3, 4 e 5) e o grupo 2, entre os grupos da terapia fotodinâmica. Na área de túbulos expostos, no terço apical os grupos com melhores resultados foram os grupos 1 e 3; no terço médio grupos 6 e 2; e no terço cervical grupos 6 e 3. Não foi encontrada diferença na desinfecção dos canais radiculares quando a fibra óptica foi usada na aplicação da terapia fotodinâmica. Esta não pode ser usada de forma isolada na desinfecção dos canais radiculares, o seu valor pode estar na complementação da desinfecção obtida por outros protocolos de limpeza.

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000429331-0.pdf: 3416061 bytes, checksum: b9dd27c021e450278555744beaf366b5 (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / ARTIGO 1 : Introduction: Photodynamic therapy has been proposed to improve to root canal desinfection, but its role on certain bacterial species needs to be further ellucidated. Objective: to compare, in vitro, the action of photodynamic therapy and sodium hypochlorite in root canals infected with Enterococcus faecalis. Methods: The root canals of 45 single-rooted human extracted teeth were enlarged up to a file 60, autoclaved, inoculated with a suspension of Enterococcus faecalis and incubated for 60 days, with renewal of the culture medium every 48 hours. After that, samples were divided into five groups according to the protocol of decontamination: G1 (n = 5) positive control - no procedure; G2 (n = 10) negative control - distilled water; G3 (n = 10) - PAD, G4 (n = 10) – NaOCl 2. 5%; G5 (n = 10) - NaOCl 2. 5% + PAD. Subsequently, samples were fixed on 25% glutaraldehyde, dehydrated, dried, metalized and subjected to scanning electron microscopy (SEM). The assessment was made of images taken at every root third at 5. 000x magnification for the canal wall and 10. 000x for the exposed tubule area, both in backscattering (BS), noting the effect of proposed treatments to the different thirds of the root canal. The presence of bacteria in the images was scored by position ranks from 1 to 45, where the higher the value, the cleanliness of the sample. Data were subjected to One-way ANOVA followed by post-hoc Tukey test (α = 0. 05). Results: Group 5 had the highest mean position ranks for all thirds of the root canal, both in canal wall and in the exposed tubule area. Thus, it was the most effective in eliminating Enterococcus faecalis. Conclusion: the association NaOCl 2,5% + PAD is an efficient protocol for the elimination of Enterococcus faecalis present in the dentinal surface and deep into the dentinal tubules. ARTIGO 2 : Purpose: Evaluate the bovine pulp tissue dissolution ability of photodynamic therapy. Methods: Twenty pieces of bovine pulp tissue were weighed and divided randomly into four groups (n = 5), according to the cleaning protocol: G1 - distilled water (negative control), G2 - sodium hypochlorite 1% (positive control), G3 - photodynamic therapy, G4 - sodium hypochlorite 1% + photodynamic therapy. The observation of the events of dissolution was performed by two observers blinded in relation to the test using 2x loupe magnification, recording time in minutes until complete tissue dissolution. The total observation time was 2 hours. The dissolution rate was calculated dividing the weight of the fragment pulp (mg) by the time of dissolution (mg / min). Results: only group 2 (NaOCl) was able to promote complete dissolution of pulp tissue. In the other groups there was no occurrence of complete dissolution of the samples. The mean dissolution time for samples from group 2 (NaOCl) was 1. 26 mg / min. Conclusion: photodynamic therapy was not able to dissolve the fragments of bovine pulp tissue and was not able to accelerate the rate of dissolution. / ARTIGO 1 : O objetivo deste estudo foi comparar, in vitro, a ação da terapia fotodinâmica com a ação do hipoclorito de sódio em canais radiculares infectados com Enterococcus faecalis. Os canais radiculares de 45 dentes humanos unirradiculares foram ampliados até a lima 60, autoclavados, inoculados com uma suspensão de Enterococcus faecalis e incubados por 60 dias, com renovação do meio de cultura de 48 em 48 horas. Após o período de contaminação, as amostras foram divididas aleatoriamente em cinco grupos, de acordo com o protocolo de descontaminação: G1 (n=5) controle positivo – nenhum procedimento; G2 (n=10) controle negativo – água destilada; G3 (n=10) – PAD; G4 (n=10) – NaOCl 2,5%; G5 (n=10) – NaOCl 2,5% + PAD. Posteriormente, as amostras foram fixadas em glutaraldeído 25%, desidratadas, secas, metalizadas e submetidas à microscopia eletrônica de varredura (MEV). A avaliação foi feita em imagens do MEV com o aumento de 5. 000x para a luz do canal e de 10. 000x para a interface dentinária, ambos em backscattering (BS), observando o efeito dos tratamentos propostos nos diferentes terços do canal radicular. A presença de bactérias foi classificada por intermédio de um rankeamento de posições de 1 a 45, onde quanto maior o valor, maior o grau de limpeza da amostra. Os dados de níveis de contaminação foram submetidos ao teste de ANOVA de uma via, seguido pelo post-hoc de Tukey (α=0,05). Os resultados mostraram que o grupo 5 apresentou os maiores valores na média de rankeamento de posições nos três terços do canal radicular, tanto na luz do canal quanto na interface dentinária. Com isso, foi o mais efetivo na eliminação de Enterococcus faecalis. Diante do exposto, é possível concluir que a associação NaOCl 2,5% + PAD foi eficiente na eliminação de Enterococcus faecalis presentes na parede dentinária e na profundidade de penetração dos túbulos dentinários. ARTIGO 2 : O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de dissolução do tecido pulpar bovino através da ação da terapia fotodinâmica. Vinte fragmentos de tecido pulpar bovino foram pesados e divididos aleatoriamente dentro de quatro grupos (n=5), de acordo com o mecanismo de dissolução testado: G1 – água destilada (controle negativo); G2 – hipoclorito de sódio 1% (controle positivo); G3 – terapia fotodinâmica; G4 – hipoclorito de sódio + terapia fotodinâmica. A observação dos eventos de dissolução foi realizada por dois observadores cegados em relação ao teste, com lupa de 2x de aumento, sendo anotado, em minutos, o tempo até que ocorresse a completa dissolução do tecido. O período total de observação foi de 2 horas. O tempo necessário para dissolução foi registrado em minutos (min) e a velocidade de dissolução foi calculada dividindo o peso do fragmento pulpar (mg) pelo tempo de dissolução (mg/min). Os resultados mostraram que somente o grupo 2 (NaOCl) foi capaz de promover a dissolução completa do tecido pulpar. Nos demais grupos não houve a ocorrência da dissolução completa das amostras. A média do tempo de dissolução para as amostras do grupo 2 (NaOCl) foi de 1. 26 mg/min. Em conclusão, somente o hipoclorito de sódio foi capaz de dissolver os fragmentos de tecido pulpar bovino e a terapia fotodinâmica não apresentou capacidade de dissolução tecidual.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437675-Texto+Completo-0.pdf: 3014292 bytes, checksum: 10c5c967edfd4e61677f7867c8186a73 (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, which currently infects one-third of the world’s population. Despite the availability of the Bacille Calmette-Guérin vaccine and effective short-course chemotherapy, the increasing global burden of TB has been linked to the co-infection with HIV, the emergence of multi, extensively and now totally drug-resistant strains. Furthermore, the capacity of M. tuberculosis to remain viable within infected hosts in a long-term asymptomatic infection is an additional problem for the control of TB. Nucleotides biosynthesis pathways provide promising molecular targets for the development of new vaccines and therapeutic strategies to control the global incidence of TB. Uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) catalyzes the conversion of uracil and 5'-phosphoribosyl-a- 1'-pyrophosphate (PRPP) to uridine 5'-monophosphate (UMP) and pyrophosphate (PPi). UPRT plays an important role in the pyrimidine salvage pathway since its product (UMP) is a common precursor of all pyrimidine nucleotides. This work presents cloning, recombinant expression in Escherichia coli, and purification of the upp-encoded M. tuberculosis UPRT (MtUPRT). Mass spectrometry analysis and N-terminal amino acid sequencing confirmed the identity of homogeneous MtUPRT. The molecular mass of the native MtUPRT was shown to follow a monomer-tetramer association model by analytical ultracentrifugation. This enzyme did not show a pronounced regulation by GTP as this nucleotide did not affect enzyme kinetic parameters, and its binding was not detected by isothermal titration calorimetry (ITC).Initial velocity and ITC studies suggested that catalysis proceeds through a sequential ordered mechanism, in which PRPP binds first, followed by uracil binding, and PPi is the first product to be released, followed by UMP. ITC also showed that PRPP and UMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles indicated that groups with pK values of 5. 7 and 8. 1 are important for catalytic activity and a group with a pK value of 9. 45 is involved in PRPP binding. Pre-steady-state kinetic data suggested that product release is not the rate-limiting step of the reaction catalyzed by MtUPRT. Kinetic fluorescence studies demonstrated two forms of enzyme in solution of which only one can bind to PRPP. Knockout of the upp gene showed that this gene is not essential for M. tuberculosis H37Rv in the employed experimental conditions and the absence of upp gene did not affect the mycobacterium growth. UPRT is expressed in both high and low oxygen conditions of M. tuberculosis H37Ra growth. MtUPRT is inhibited by an active metabolite of isoxyl, which does not seem to inhibit RNA polymerase, adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Minimum inhibitory concentration of isoxyl for M. tuberculosis mutant for upp gene, complemented and wild type strains was 12. 8 μg/mL, meaning that the absence of the upp gene did not affect M. tuberculosis sensitivity to isoxyl. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the nucleotide biosynthesis pathway in M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to decrease the global incidence of this pathogen. / A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, o qual atualmente infecta um terço da população mundial. Apesar da disponibilidade da vacina Bacille Calmette-Guérin e da eficaz quimioterapia de curta duração, o aumento na incidência global da TB está relacionado à co-infecção com o HIV e ao surgimento de cepas multi, extensivamente e agora totalmente resistente a drogas. Além disto, a capacidade do M. tuberculosis de permanecer viável dentro do hospedeiro infectado por longo período em uma infecção assintomática é um problema adicional para o controle da TB. As rotas de biossíntese de nucleotídeos fornecem alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de novas vacinas e estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB no mundo. A uracil fosforribosil transferase (UPRT) catalisa a conversão de uracil e 5’- fosforribosil-a-1’-pirofosfato (PRPP) a uridina 5’-monofosfato (UMP) e pirofosfato (PPi). A UPRT tem um papel importante na rota de salvamento das pirimidinas já que seu produto (UMP) é o precursor comum de todos os nucleotídeos pirimídicos. Este trabalho apresenta a clonagem, expressão recombinante em E. coli, e a purificação da UPRT de M. tuberculosis codificada pelo gene upp (MtUPRT). Adicionalmente, foram realizadas análises de espectrometria de massas e sequenciamento N-terminal que confirmaram a identidade da MtUPRT homogênea. A massa molecular da MtUPRT nativa seguiu um modelo de associação monômero-tetrâmero por ultracentrifugação analítica. Esta enzima não mostrou uma regulação pronunciada por GTP já que este nucleotídeo não afetou os parâmetros cinéticos da enzima, e a sua ligação não foi detectada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC).A velocidade inicial e os estudos de ITC sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo ordenado sequencial, no qual o PRPP liga primeiramente, seguido pela ligação de uracil, e PPi é o primeiro produto a ser liberado, seguido pelo UMP. ITC também mostrou que a ligação de PRPP e UMP são processos termodinamicamente favoráveis. O perfil de pH indicou que grupamentos com os valores de pK próximos de 5,7 e 8,1 são importantes para a atividade catalítica e um grupamento com valor de pK próximo a 9,45 está envolvido na ligação do PRPP. Dados de cinética no estado pré-estacionário sugeriram que a liberação de produto não é a etapa limitante da reação catalisada pela MtUPRT. Estudos de fluorescência demonstraram a existência de duas formas da enzima em solução, das quais apenas uma pode ligar ao PRPP. O nocaute do gene upp demonstrou que este gene não é essencial para o M. tuberculosis H37Rv nas condições empregadas no experimento e a ausência do gene upp não afetou o crescimento micobacteriano. A UPRT mostrou ser expressa tanto em altas como em baixas concentrações de oxigênio. A MtUPRT foi inibida por um metabólito ativo do isoxyl, que não parece inibir as enzimas RNA polimerase, adenina fosforribosil transferase e hipoxantinaguanina fosforribosil transferase. A concentração inibitória mínima de isoxyl para as cepas de M. tuberculosis mutante para o gene upp, complementada e tipo selvagem foi de 12,8 μg/mL, o que significa que a ausência do gene upp não afetou a sensibilidade do M. tuberculosis ao isoxyl. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre a via de biossíntese de nucleotídeos em M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas eficientes para diminuir a incidência global deste patógeno.

O Atlântico Sul está entre os menos estudados dos oceanos, em relação às suas comunidades microbianas, apesar da importância ecológica e do interesse biotecnológico nos micro-organismos marinhos. Este potencial biotecnológico inclui a produção de enzimas como as lípases de endoglicanases, que podem ser utilizadas na produção de biocombustíveis, no processamento têxtil e na suplementação de detergentes. Neste contexto, o presente trabalho objetivou o isolamento, identificação filogenética e avaliação das atividades lipolíticas e endoglucanolíticas de bactérias cultivadas de sedimentos do leste do Oceano Atlântico Sul, e de águas da região da Elevação do Rio Grande. Para isto, oito amostras de sedimento e dezesseis de água foram coletadas em novembro de 2009 e novembro de 2011, para as referidas regiões do Oceano Atlântico Sul. Os micro-organismos foram cultivados e identificados pela análise de sequências de genes de RNA ribossômico 16S. Posteriormente, as atividades lipolíticas e endoglucanolíticas foram determinadas em ensaios em placas com diferentes substratos tais como Tween20, Tween40, Twen60, Tween80 para a atividade lipolítica, e carboximetilcelulose para a atividade endoglucanolítica. No total 212 linhagens foram isoladas e 138 foram identificadas filogeneticamente das duas áreas de estudo, em cinco classes diferentes e trinta gêneros, sendo as classes Gammaproteobacteria e Bacilli as mais freqüentes, assim como os gêneros Halomonas e Bacillus. Os sedimentos apresentaram maior diversidade em nível de espécie, enquanto que nas amostras pelágicas a diversidade foi maior em nível de gênero e classe. Dezoito linhagens isoladas parecem pertencer a espécies ainda não descritas de bactérias. As 212 linhagens foram testadas quanto às atividades enzimáticas. Mais que metade destes organismos apresentou algum tipo de atividade lipolítica, enquanto que a atividade endoglucanolítica foi restrita a dez linhagens. O método de isolamento direto em meio sólido contendo lipídeos foi o mais apropriado para a prospecção de bactérias lipolíticas. Os resultados deste trabalho atestam a necessidade de estudos sobre a microbiota marinha cultivável, bem como seu potencial para a obtenção de enzimas com uso industrial. / The South Atlantic is among the less studied oceans concerning its microbial communities, despite the ecological importance and the biotechnological interest related to marine microorganisms. In this context, the present work aimed the isolation, phylogenetic identification and evaluation of the lipolytic and endoglucanolytic activities of bacteria from sediments of the Eastern South Atlantic and waters from the Rio Grande Rise Region. For this, eight sediment samples and sixteen water samples were collected in two cruises conducted on November/2009 and November/2011 to the specified areas. Microorganisms were cultivated and identified by 16S rRNA sequences analysis. Lipolytic and endoglucanolytic activities were evaluated on plate assays with different substrates (Tween20, Tween40, Twen60, Tween80 for lypotytic activity, and carboximethilcellulose for endoglucanolytic activity). 138 bacteria were phylogenetically identified from the two studied areas in five different classes and thirty genera. The classe Gammaproteobacteria and Bacilli and the genera Halomonas and Bacillus were the most frequent identified. Higher species-level diversity was detected in sediments, but a higher genus- and class-level diversity was present on waters samples. Eighteen strains seem to belong to no yet described bacterial species. Two hundred and twelve strains were tested for the enzymatic activities. More than a half of the bacteria showed some kind of lipolysis, while the endoglucanolytic activity was restricted to ten strains. The direct isolation in solid media containg a lipidic substrate was the best method to prospect lipolytic bacteria. The results of this work attest the necessity of studies on the cultivable marine microbiota, as well as their potential for the prospection of industrially relevant enzymes.

Este estudo teve como objetivos avaliar a qualidade microbiológica de duas marcas de queijo tofu comercializadas em supermercado da cidade de Porto Alegre/RS. O queijo de soja foi primeiramente coletado e estocado refrigerado até chegar ao local de análise. Foram realizadas contagens de bactérias mesófilas, contagens e determinação de Staphylococcus coagulase positivo e negativo, contagens de coliformes a 35ºC e a 45ºC e confirmação de Escherichia coli, pesquisa de Bacillus cereus, de Salmonella sp. e de Listeria sp. Foi realizada a coleta de duas diferentes marcas, sendo um lote por mês, durante seis meses e foram analisadas cinco amostras de cada lote. Todas as amostras, de ambas as marcas, apresentaram unidades formadoras de colônia de mesófilos aeróbios acima de 4,3x105. Metade das amostras da marca A e 100% das amostras da marca B apresentaram a presença de coliformes a 45ºC e acima dos limites preconizados pela legislação e a presença de E. coli foi confirmada nestas amostras. Também foi verificado que 83% dos queijos tofu de ambas as marcas possuíam contagens de unidades formadoras de colônia para Staphylococcus coagulase positivo acima do que a legislação preconiza (RDC 12 de 2001 da Anvisa). Em nenhuma das análises realizadas foi detectada a presença de Salmonella sp., B. cereus e Listeria sp. Estes resultados mostram que os queijos analisados estão sendo comercializados com composição inapropriada de microrganismos que são potencialmente debilitantes e causadores de infecções e ou intoxicações alimentares. / The objective of this study was to evaluate the microbiological quality of two different trade-mark of tofu cheese sold in Porto Alegre/RS supermarket. The soy cheese was first collected and stored refrigerated until the performing of of the analyses. It was performed mesophilic bacteria counts, Staphylococcus coagulase positive and negative counts, coliforms counts and confirmation of the presence of Escherichia coli, also, search of Bacillus cereus, Salmonella sp. and Listeria sp. It was collected two different trade-mark during six months, one trade-mark each month, and it was analyzed five samples of each trade-mark. It was found the presence of > 4x105 units forming colonies of mesophilic bacteria in all samples of both trade-marks. Half the samples of the trade-mark A and 100% of the trade-mark B had fecal coliforms above the legal limits, and the presence of E. coli was confirmed in all those samples. It was also noticed that 83% of tofu samples, of both trade-mark, had coagulase positive Staphyloccocus counts above the legal limit (RDC 12 de 2001 Anvisa). In conclusion this study showed that the tofu of both trade-marks analyzed had higher numbers of microorganisms dangerous for human health because they could cause infections and/or food poisoning.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-23T16:08:50Z No. of bitstreams: 1 2014_EdivânioRodriguesdeAraújo (2).pdf: 3003726 bytes, checksum: 23430b119aff14a628af0d6d8cbfc70c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-12T12:15:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_EdivânioRodriguesdeAraújo (2).pdf: 3003726 bytes, checksum: 23430b119aff14a628af0d6d8cbfc70c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-12T12:15:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_EdivânioRodriguesdeAraújo (2).pdf: 3003726 bytes, checksum: 23430b119aff14a628af0d6d8cbfc70c (MD5) / A mancha-bacteriana está entre os fatores que prejudicam a produção de tomate no Brasil. A doença é causada por um complexo de espécies do gênero Xanthomonas: X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans e X. gardneri. Os objetivos dessa tese são: i) realizar um levantamento da frequência de ocorrência de espécies e raças causadoras da doença em lavouras brasileiras de tomate, tanto destinadas ao consumo in natura quanto ao processamento industrial; ii) estabelecer protocolos de detecção e identificação simultânea das espécies causadoras da doença; iii) compreender o efeito da temperatura e molhamento foliar no monociclo da doença; iv) identificar possíveis agentes causadores da mancha-bacteriana e a comunidade bacteriana presente em mudas assintomáticas cultivadas em viveiro comercial e sementes comerciais de tomateiro. Para alcance desses objetivos, testes de patogenicidade, técnicas moleculares baseadas na PCR (BOX-PCR, iniciadores específicos), além de sequenciamento do gene de avirulência avrXv3 foram utilizados. O efeito da temperatura (15; 20; 25; 30 e 35°C) e molhamento foliar (0; 6; 12; 24 e 48 horas) na severidade da doença foi avaliado para as duas espécies de maior ocorrência: X. perforans e X. gardneri. Da mesma forma, foi verificado o efeito in vitro da temperatura na taxa de multiplicação em meio de cultura dessas espécies. Por fim, por meio de coletas de água superficial no filoplano de mudas assintomáticas e maceração de sementes, buscou-se identificar possíveis agentes patogênicos, tentando identificá-los por isolamento direto, uso de iniciadores específicos e sequenciamento do rRNA de 16S. Com base nos resultados obtidos, verificou-se que X. perforans é a espécie predominante (≈ 92% dos isolados) nos campos brasileiros de produção de tomate, em ambos os segmentos produtivos: consumo in natura e processamento industrial. Entre os isolados de X. perforans, a raça T3 predomina, representando 97,3% desses isolados. Cinco isolado foram identificados como raça T4. Esses isolados apresentaram uma inserção de 858 pb no gene avrXv3, relacionada à família de proteínas YscJ/HrcJ. Por meio dos protocolos estabelecidos foi possível identificar as quatro espécies causadoras da doença com iniciadores específicos tanto utilizando PCR convencional como PCR multiplex. As espécies X. perforans e X. gardneri apresentaram comportamento distinto com relação ao ótimo de temperatura para seu desenvolvimento. Enquanto X. perforans incitou maior porcentagem de área foliar lesionada quando exposta a temperaturas acima de v 25°C, com agressividade crescente até o limite superior testado (35°C), observou-se para X. gardneri uma redução da agressividade nos limites inferior (15°C) e superior de temperatura. Essas espécies só incitaram doença quando o período de molhamento foliar foi igual ou maior que 12 horas. Do mesmo modo, a temperatura teve efeito direto na taxa de crescimento in vitro de X. perforans. Por fim, foi possível identificar um isolado de X. euvesicatoria associado a mudas assintomáticas de tomateiro, além dos gêneros Agrobacterium, Enterobacter, Microbacterium, Sphingobium e Sphingomonas. Com isso, estratégias de manejo da doença devem focalizar X. perforans, já que é a espécie predominante. No mesmo sentido, estratégias de controle denominadas evasivas devem ser adotadas, uma vez que a doença apresenta faixas limítrofes para as variáveis temperatura e molhamento foliar. Este é o primeiro registro da ocorrência da raça T4 no país. Os isolados bacterianos dos demais gêneros encontrados em sementes e mudas devem ser avaliados quanto ao seu potencial como agentes de controle biológico. Levantamentos sistemáticos das espécies/raças causadoras da doença devem ser continuados para o auxílio nas tomadas de decisão. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacterial spot is among the limiting factors in tomato production in Brazil. The disease is caused by a species complex of the genus Xanthomonas: X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans and X. gardneri. The aims of this thesis were: i) to perform a survey the frequency of occurrence of species and races causing bacterial spot on Brazilian tomato crops; ii) to establish protocols for simultaneous detection and identification of the species causing disease; iii) to understand the effect of temperature and leaf wetness on the monocycle of tomato bacterial spot; iv) to identify possible causal agents of tomato bacterial spot and bacterial community present in asymptomatic seedlings and seeds. For achieving these objectives, pathogenicity tests, molecular techniques based on PCR (BOX-PCR, specific primers) and sequencing of avirulence gene avrXv3 were used. The effect of temperature (15, 20, 25, 30, and 35°C) and leaf wetness (0, 6, 12, 24, and 48 hours) on disease severity was assessed. Likewise, the in vitro effect of temperature on the population growth rate of X. perforans and X. gardneri was checked. Finally, by collecting surface water on the phylloplane of asymptomatic seedlings and soaking commercial seeds, the presence of potential pathogens were surveyed. Direct isolation, using PCR with specific primers and sequencing of 16S rRNA were the tempted methods applied. Based on the results, we found that X. perforans is the predominant species (≈ 92% of isolates) in Brazilian tomato fields, in both production segments: fresh market and processing. Among strains of X. perforans, the T3 race was predominant, representing 97.3% of these isolates. Five isolates were identified as T4 race. These isolates had an insertion of 858 bp in avrXv3 gene related to a protein YscJ/HrcJ family. The protocols enabled the identification of the four species causing the disease with specific primers using both conventional PCR and multiplex PCR. The species X. perforans and X. gardneri showed different behaviors with respect to the optimum temperature for development. Xanthomonas perforans caused more disease at temperatures above 25°C, with increasing aggressiveness up to the upper limit tested (35°C). On the other hand, X. gardneri decreased the disease severity from the optimal temperature for both lower and upper limit of temperature. Both species only incited disease vii when leaf wetness periods were longer than six hours. In the same way, the temperature had a direct effect on the in vitro growth rate of X. perforans. Finally, it was possible to identify an isolate of X. euvesicatoria associated with asymptomatic tomato seedlings in a commercial nursery production, besides the genus Agrobacterium, Enterobacter, Microbacterium, Sphingomonas and Sphingobium. Thus, disease management strategies should focus on the species X. perforans, since it is the predominant species. Similarly, control strategies based on evasion should be applied, since the disease has a borderline range for the temperature and leaf wetness. This is the first report of occurrence of race T4 in Brazil. Bacterial isolates from other genus found in seeds and seedlings should be evaluated to assess their biological control potential. Systematic surveys of species/races causing the disease should be continued to aid in the control decision taking.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-06-23T01:18:07Z No. of bitstreams: 1 2012_AnaClaudiaFariaBorgesdeCampos.pdf: 1878171 bytes, checksum: bea1e564ad3d0ca46c9d93489614ae27 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T12:43:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AnaClaudiaFariaBorgesdeCampos.pdf: 1878171 bytes, checksum: bea1e564ad3d0ca46c9d93489614ae27 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-27T12:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AnaClaudiaFariaBorgesdeCampos.pdf: 1878171 bytes, checksum: bea1e564ad3d0ca46c9d93489614ae27 (MD5) / O objetivo deste trabalho foi realizar o isolamento de cepas de Enterococcus de carcaças de frango resfriadas e congeladas, comercializadas no Distrito Federal, analisar o perfil de resistência antimicrobiana através da realização de antibiograma, promover uma pesquisa de genes de resistência antimicrobiana e diferenciação das espécies Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium através da reação em cadeia da polimerase. Foram analisadas 100 carcaças de frango congeladas e resfriadas, das quais foram isoladas 50 cepas de Enterococcus spp, sendo 42% de E. faecalis e 2% de E. faecium. O teste de susceptibilidade antimicrobiana demonstrou que todas as cepas isoladas apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano, dos quais 90,47% das cepas de E. faecalis, 100% das cepas de E. faecium e 82,14% dos Enterococcus spp apresentaram resistência à Tetraciclina; 80,95% das cepas de E. faecalis e 35,71% das cepas de Enterococcus spp foram resistentes à Eritromicina; 39,28% dos Enterococcus spp e 23,80% dos E. faecalis à Ciprofloxacina e 28,57% dos E. faecalis apresentaram resistência ao Cloranfenicol. Foram detectados os genes de resistência antimicrobiana tet(M), sendo o mais encontrado, seguido pelo erm(B), vanC-1, aph(3’)-llla, ant(6)-la, vanB, vanA, aac(6’)- le-aph(2’’)-la e erm(A). O isolamento de cepas de Enterococcus com resistência antimicrobiana em carcaças de frango, observados neste estudo, pode acarretar sérios problemas para a saúde pública, devido à resistência propriamente dita, e devido a esses microrganismos terem a capacidade de transmitir genes de resistência antimicrobiana para outros microrganismos presentes na microbiota intestinal de humanos e animais, podendo inviabilizar o uso destas drogas para uso clínico. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this work was to detect Enterococcus from cooled and frozen poultry carcasses commercialized at the Federal District area, analyze the profile of antimicrobial resistance by antibiotic susceptibility test, detect the antimicrobial resistance genes and differentiate Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium by polymerase chain reaction. Were analyzed 100 poultry carcasses cooled and frozen that were isolated 50 strains of Enterococcus spp, being 42% of E. faecalis and 2% of E.faecium. The antimicrobial susceptibility testing showed that all isolates were resistant to at least one antimicrobial. In 90,47% of E. faecalis, 100% of E. faecium and 82,14% of Enterococcus spp were resistant to Tetracycline; 80,95% of E. faecalis and 35,71% of Enterococcus spp strains were resistant to Erythromycin; 39,28% of Enterococcus spp and 23,80% of E. faecalis to Ciprofloxacin and 28,57% of E. faecalis were resistant to Chloramphenicol. Were detected genes of antimicrobial resistance as tet(M), being this gene most verified. Were detected the genes erm(B), vanC-1, aph(3’)-llla, ant(6)-la, vanB, vanA, aac(6’)-le-aph(2’’)-la and erm(A). The antimicrobial resistance observed in Enterococcus from poultry carcasses, observed in this study, might suggest serious problems for public health due the high resistance, due these microorganisms have ability to transmit genes for antimicrobial resistance to other microorganisms presents in the intestinal tract of humans and animals, can hinder the use of these drugs for clinical use.