Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2018-01-30T18:32:34Z No. of bitstreams: 1 DissMASC.pdf: 1647073 bytes, checksum: fb2402ada85ef6137035f37295790158 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (bco.producao.intelectual@gmail.com) on 2018-01-31T12:58:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMASC.pdf: 1647073 bytes, checksum: fb2402ada85ef6137035f37295790158 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (bco.producao.intelectual@gmail.com) on 2018-01-31T12:58:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMASC.pdf: 1647073 bytes, checksum: fb2402ada85ef6137035f37295790158 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-31T13:02:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMASC.pdf: 1647073 bytes, checksum: fb2402ada85ef6137035f37295790158 (MD5) Previous issue date: 2017-04-10 / Não recebi financiamento / The fermentation is one of the most critical steps of the fuel ethanol production. Some factors directly influence the fermentation efficiency, such as the fermentation system, the selected yeast and the bacterial contamination, especially from the genus Lactobacillus. For the control of the contamination, the industries apply antibiotics and biocides, however, these products can result in increased cost and environmental problems for the industry. The use of the acid treatment (sulphuric acid solution, pH 2.0) of the cells between the cycles of fermentation is not always effective to combat the bacterial contamination. In this context, the present study aimed to evaluate the effect of fermentation system – simple batch and fed batch – on the contamination of the sugarcane juice with Lactobacillus sp, in a cell-recycled fermentation with the selected yeast strain of S. cerevisiae PE-2. Following, the effect of ethanol addition to the acid treatment was evaluated to control the bacterial growth in fed-batch system with cell recycle. In the fed-batch system, a higher ethanol production and efficiency was verified, as well as a higher logarithmic variation of the yeast growth. The bacterium L. fermentum was more harmful to the fermentation than L. plantarum, resulting in more sugar left in the fermented must and lower fermentative efficiency, in both systems. The effect of contaminations in the single batch system was higher than in the fed-batch system especially since the substrate feeding allowed a better yeast development, which could be more competitive with the contaminant bacterium. Regarding the modification in the acid treatment performed between the fermentative cycles, only with the acid treatment, the population of L. fermentum reduced almost 3 log cycles at the end of the sixth fermentative cycle, however, when 5% of ethanol was added to the acid solution, the bacterium lost completely the cell viability right after the first fermentative cycle. There was no alteration in the ethanol production in the fermentation contaminated with L. fermentum, comparing the cell treatments with and without the addition of 5% ethanol. The acid treatment + 5% ethanol was able to reduce the population of L. fermentum without impact to the fermentative efficiency and with a low residual sugar concentration in the fermentative must (around 4 g/100 mL), at the end of six ninehour fermentative cycles, in fed-batch system. / A fermentação é uma das etapas mais críticas do processo de produção de etanol combustível. Alguns fatores influenciam diretamente na eficiência fermentativa, como por exemplo, o sistema de fermentação utilizado, a linhagem selecionada empregada e a contaminação por bactérias, especialmente as do gênero Lactobacillus. Para controle das bactérias, as indústrias aplicam antibióticos e biocidas, porém, esses produtos podem acarretar aumento de custo e problemas ambientais para a indústria. O tratamento ácido (solução de ácido sulfúrico, pH 2,0) do fermento empregado entre os ciclos fermentativos nem sempre é eficaz para combater a contaminação bacteriana. Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivos inicialmente avaliar o efeito do sistema de fermentação -batelada simples e batelada alimentada - sobre a contaminação do mosto de caldo de cana com as bactérias Lactobacillus, em fermentação com seis reciclos celulares conduzida pela levedura industrial Saccharomyces cerevisiae PE-2. Em seguida avaliou-se o efeito da adição de etanol ao tratamento ácido para o controle do crescimento de L. fermentum, em fermentação em batelada alimentada com reciclo celular. Em sistema de batelada alimentada, verificou-se maior produção de etanol, maior eficiência fermentativa e maior variação logarítmica de crescimento da levedura. A bactéria L. fermentum foi mais prejudicial à fermentação do que L. plantarum, resultando em maior sobra de açúcar no meio fermentado e menor eficiência fermentativa, nos dois sistemas. O efeito das contaminações no sistema de batelada simples foi maior do que no sistema de batelada com alimentação especialmente pelo fato de a alimentação permitir um maior desenvolvimento da levedura, que pode assim competir em melhor condição com a bactéria contaminante. Em relação à modificação do tratamento das células entre os ciclos fermentativos, só com o tratamento ácido, a população de L. fermentum reduziu quase 3 ciclos log ao final do sexto ciclo fermentativo, no entanto, quando se adicionou 5% de etanol à solução ácida, a bactéria perdeu completamente a viabilidade celular já ao final do primeiro ciclo fermentativo com o tratamento. Não houve alteração na produção de etanol na fermentação contaminada com L. fermentum, comparando-se os tratamentos celulares com e sem adição de 5% de etanol. O tratamento ácido + 5% de etanol foi capaz de reduzir a população de L. fermentum sem causar impacto à eficiência fermentativa, e com uma concentração de ART residual baixa (cerca de 4 g/100 mL), ao final de 6 ciclos fermentativos de 9 horas, em sistema de batelada alimentada.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMPAR.pdf: 5068377 bytes, checksum: 767cce78099d3010d32f9d63d3c82e23 (MD5) Previous issue date: 2007-03-05 / Universidade Federal de Minas Gerais / Nowadays, industrial production of semi-synthetic penicillins requires low temperatures, organochloride solvents and yields a great amount of non-recyclable wastes. During the last decades, concerns about environmental impacts have increased, as well as the environmental legislation restrictions. Thus, the pursuit of cleaner routes has been encouraged. Enzymatic synthesis of these antibiotics, using penicillin G acylase (PGA) as biocatalyst, may be carried out at mild temperatures and pH, and is an environmentalfriendly route, alternative to the chemical synthesis. However, the low yields of the enzymatic process are still a drawback for their industrial implementation. An enzymatic semi-batch reactor using aqueous-precipitated medium is a promising approach to improve process efficiency. Yet, finding the optimal operation condition of the reactor is still a challenge, in order to make the enzymatic route economically competitive. This thesis addresses this issue, focusing on several aspects of the enzymatic synthesis of ampicillin. The comprehension of the reaction mechanism, still not a consensus in the literature, was improved especially with respect to the role of the beta-lactam nucleus during the formation of the acyl-enzyme intermediate, which has important consequences on the reactor operation. Diffusion in the biocatalyst pores and its influence on the pH profile within this micro-environment were assessed through computer simulations. Results indicate considerable diffusion resistances within the biocatalyst, yielding important pH profiles. The process complexity leaded to the use of simplified mechanistic or empirical kinetic models. Applying dynamic optimization (optimal control) techniques, feed profiles for the reactants were obtained. A simplified model for the integrated semi-batch reactor for enzymatic synthesis of ampicillin with product crystallization was used for this purpose. Different techniques of dynamic optimization provided qualitatively the same optimum heuristics for the process operation. Since simplified models were used in optimal open-loop control algorithms, theoretical feed policies may diverge from those that would be needed to maintain the track of the concentration profiles of the optimized reactor. Moreover, disturbances in the input variables might lead the system to a different course. Thus, on-line monitoring is essential in pilot plants or industrial reactors. Multivariate calibration using UV spectra was the basis for the development of a system of analysis via flow injection (FIA), with good results. Ampicillin synthesis assays using an industrial biocatalyst (Recordatti, Italy) were run in order to improve some simplified kinetic models. The re-estimated models were inserted in optimization algorithms, providing trajectories in accordance with the same heuristics previously obtained. Experimental results obtained after two runs in the integrated semi-continuous reactor put into evidence a mismatch between model responses and the real process. This difference may be explained by the extrapolation of the kinetic model with respect to the enzymatic reactor load. On the other side, using a biocatalyst wrapped with a secondary inert matrix might alter the microenvironment of the enzyme, especially with respect to pH. Using a model that takes into account the effect of pH on the kinetics seems to be important to allow the fine-tuning of the industrial reactor selectivity and productivity. / A produção industrial de penicilinas semi-sintéticas é conduzida sob condições extremas de temperatura, demanda solventes organoclorados em seu processo e gera uma grande quantidade de resíduos não recicláveis. As crescentes preocupações governamentais em relação ao meio ambiente e a criação de leis de proteção ambiental nas últimas décadas vêm colocando esses processos sobre críticas e incentivando a busca de rotas alternativas mais limpas . A síntese enzimática desses antibióticos, usando penicilina G acilase (PGA) como biocatalisador, pode ser efetuada em condições amenas de temperatura e pH e vem sendo estudada como alternativa à rota atualmente empregada, mas o maior obstáculo para a substituição da rota química pela enzimática ainda é o baixo rendimento desta última. O uso de um reator enzimático semi-contínuo com um meio aquoso-precipitado é uma abordagem promissora em termos de eficiência. Contudo, ainda é necessário otimizar sua operação para que a rota enzimática seja economicamente competitiva. Esta tese enfoca vários aspectos da síntese enzimática de ampicilina. Avançouse na compreensão do mecanismo de reação, em pontos ainda não consensuais na literatura em especial com respeito ao papel do núcleo beta-lactâmico durante a etapa de formação do intermediário acil-enzima, com importantes conseqüências para a operação industrial do reator. A difusão nos poros do biocatalisador e sua influência sobre o perfil de pH nesse micro-ambiente foram avaliadas por meio de simulações computacionais. Os resultados indicam resistências difusivas apreciáveis no interior do biocatalisador, suficientes para gerar perfis significativos de pH. A complexidade desse processo como um todo levou a que se utilizassem modelos cinéticos mecanísticos simplificados ou empíricos. Por meio de técnicas de otimização dinâmica (controle ótimo), perfis de alimentação de reagentes foram obtidos. Para isso, um modelo simplificado do reator enzimático semi-contínuo integrado, com cristalização dos produtos (desejado e indesejado), foi utilizado. Respostas obtidas usando técnicas diferentes de otimização dinâmica resultaram, qualitativamente, em uma mesma heurística ótima para a operação do reator. Com a utilização de modelos simplificados, funções de alimentação obtidas teoricamente com algoritmos de controle ótimo em malha aberta poderão desviar-se das funções reais necessárias para manter os perfis de concentração no reator otimizado. Além disso, perturbações nas variáveis de entrada poderão levar o sistema a percorrer trajetórias diferentes. Assim, o monitoramento da reação em tempo real é imprescindível em um reator piloto ou industrial. Neste contexto, foi desenvolvido um procedimento de análise em fluxo incorporando técnicas de multicalibração. O procedimento proposto apresentou bons resultados na quantificação dos componentes de interesse, mostrando-se como método adequado para o monitoramento em tempo real do reator, principalmente, quando feita a reconciliação dos dados obtidos a partir dos balanços de massa. Ensaios de síntese de ampicilina, utilizando biocatalisador imobilizado (Recordatti, Itália) foram realizados com o objetivo de melhorar alguns modelos cinéticos simplificados. Os modelos re-estimados foram inseridos em algoritmos de otimização, resultando em trajetórias que seguem a mesma heurística obtida anteriormente. Entretanto, duas corridas de validação da estratégia ótima, realizadas em reator semi-contínuo integrado, evidenciaram um distanciamento entre o modelo utilizado e o processo real. Esses desvios podem ser explicados pela extrapolação do modelo em termos da carga enzimática utilizada no reator. Um modelo que leve em conta o efeito do pH sobre a cinética parece ser importante para permitir o ajuste fino da seletividade e produtividade do reator industrial.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1771.pdf: 1457129 bytes, checksum: 013319207cf51a783696430206a0ceed (MD5) Previous issue date: 2008-03-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / The clavulanic acid (CA) is a powerful inhibitor of β-lactamases, enzymes that clives the β- lactam ring of penicillins and cephalosporins, inactivating these compounds. CA is traditionally produced by Streptomyces clavuligerus in batch and fed-batch cultivations. Considering that the products of the catabolism of easily assimilable carbon source repress the biosynthesis of secondary metabolites, including CA, its production in fed-batch mode is preferable because the control of nutrient level can be performed. In the present work the influence of glycerol and ornithine feeding on the clavulanic acid (CA) production by S. clavuligerus in batch and fed-batch cultivations was studied. Batch and fed-batch cultivations were performed at 800 rpm, 0.5 vvm and pH at 6.8. In batch experiments under different concentrations of ornithine, the maximum concentration of CA was within of a closed range between 0.46 and 0.56 g.L-1. Nevertheless, the maximum value of volumetric productivity in CA (Ppmax=13.7 mg.L-1.h-1) was obtained in the experiment with ornithine at concentration of 0.66 g.L-1, a value that is 40% higher than the Ppmax obtained in run control without ornithine. In fed-batch experiments in 5 L bioreactor, with different ornithine feeding conditions, the maximum concentration of CA varied within the limited range of 1.254 and 1.405 g.L-1. Therefore, under these experimental conditions, it can be concluded that the presence of ornithine increases the Ppmax in CA but not its maximum concentration, contradicting literature. The kinetic model considering non-associated production with CA degradation was fitted to the experimental results of the batch and fed-batch cultivations. The experimental results showed that the rate of production of CA and glycerol consumption, were directly related, condition not predicted by model, besides, its negative effect on the AC production after the feeding indicate a possible inhibition/repression effect of glycerol. With the model, it was possible to simulate conditions that the cultivations should be performed with the intention of obtaining larger production of AC. With respect to the influence of glycerol in fed-batch experiments, in the presence of ornithine at the concentration of 3.7 g.L−1 in feeding medium, the maximum CA concentration of 1.506 g.L-1 was obtained in the run BA7 showing a positive effect of the combination ornithine/glycerol in the biosynthesis of CA. In fed-batch experiments in 10-L bioreactor, with different ornithine feeding conditions, the maximum concentrations of CA were near of 1.6 g.L-1, validating the results obtained in 5-L bioreactor. / O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de enzimas β-lactamases que clivam o anel β- lactâmico de antibióticos como penicilinas e cefalosporinas, tornando esses compostos inativos. O AC é tradicionalmente produzido por Streptomyces clavuligerus em cultivos operados em batelada (B) e em batelada alimentada (BA). Pelo fato dos produtos do catabolismo de fontes de carbono facilmente assimiláveis acabarem por reprimir as enzimas responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários, entre os quais se inclui o AC, a produção em BA é preferível, uma vez que torna possível controlar os níveis de nutrientes no caldo. No presente trabalho foi estudado a influência da alimentação de glicerol e ornitina na produção de ácido clavulânico (AC) por S. clavuligerus em cultivos em batelada e batelada alimentada operados a 800 rpm, 0,5 vvm e pH 6,8. Nos experimentos em batelada com diferentes concentrações de ornitina, as concentrações máximas de AC obtidas variaram na estreita faixa entre 0,46 e 0,56 g.L-1. Contudo, o valor máximo da produtividade volumétrica em AC (Ppmax=13,7 mg.L-1.h-1) obtida no experimento com concentração de ornitina de 0,66 g.L-1, foi 40% superior que o valor de Ppmax obtido no cultivo padrão sem adição de ornitina. Nos experimentos em batelada alimentada operados em biorreator de 5L, com diferentes concentrações de ornitina na alimentação, a concentração de AC variou entre 1,254 e 1,405 g.L-1. Portanto, sob as condições experimentais utilizadas, pode-se concluir que a presença de ornitina proporciona aumentos na Ppmax em CA, mas não sua produção máxima, contrariando trabalhos publicados recentemente na literatura. Um modelo cinético para produto não associado ao crescimento considerando degradação do AC foi ajustado aos resultados experimentais dos cultivos em batelada e batelada alimentada, a partir do qual foi possível simular condições que se deveria conduzir os cultivos em batelada alimentada com o intuito de se obter maior produção de AC. Com respeito à influência do glicerol na presença de ornitina no meio de alimentação numa concentração de 3,7 g.L−1, a concentração máxima de AC de 1,506 g.L-1 foi obtida no cultivo BA7 mostrando o efeito positivo da combinação ornitina/glicerol na biossíntese de AC. Nos experimentos em BA em biorreator de 10 L, com diferentes alimentações de ornitina, as produções máximas de AC foram próximas, em torno de 1,6 g.L-1, validando os resultados obtidos em escala de 5 L. Como principal conclusão, a presença de ornitina aumentou a produtividade volumétrica máxima em AC (Ppmax), mas não sua produção máxima, contrariando resultados anteriores publicados em literatura.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5647.pdf: 2822412 bytes, checksum: 769ca8edf54438ee75a0a4df886371c3 (MD5) Previous issue date: 2013-09-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Penicillin G acilase (PGA) is a key enzyme in the industrial production of β-lactamic antibiotics. In this work, it was studied the production of PGA from Escherichia coli by recombinant E. coli and from Bacillus megaterium by recombinant B. megaterium. In E. coli, the enzyme accumulates in the periplasmic cell space, B. megaterium secretes PGA, what may reduce downstream costs. With E.coli, the study has begun at the expression step. Using a donated recombinant microorganism, it was studied, in shake flasks cultures, the influence of temperature (ranging from 18 to 28°C) during induction phase in the PGA production. High level expression of PGA E. coli was detected at 20°C, which was 4-fold superior than the volumetric enzymatic activity reached at 28°C. Fed-batch cultures were conducted with glycerol as carbon source, using both defined and complex media as well as IPTG and lactose as inducers. Final biomass concentrations of 100 gDCW/L and 120 gDCW/L and enzymatic activity 210000 and 80000 IU/L were achieved, for complex and defined media, respectively. The study with B. megaterium was initiated isolating the pac gene, encoding for PGA from B. megaterium ATCC14945, which was after cloned into the pLipAhp expression plasmid, together with the promoter gene and a gene codifying antibiotic resistance. This construct (pga-pLipAhp) was used to transform three different B. megaterium strain protoplasts, aiming studies to determine the best expression host in terms of PGA production. The tested strains, B. megaterium PV361, QM B1551 and ATCC 14945, have respectively shown about 95%, 95% and 10% plasmidial stability, after eight consecutive growths. The best PGA production was detected in PV361. Study of thermal and pH stability with the purified enzyme showed that PGA has a half-life of 5 min at 60° C, 20 min at 50° C, keeping 100% of activity for 1h at pH 10.0 and up to 8 h at pH 5.0. The values of temperature and pH for maximum PGA activity are 37° C and 8.0, respectively. The enzyme was stable at least for 5 hours in these conditions, with Michaelis-Menten estimated as Km=8.8 μM. A systematic study was developed to search the best condition to obtain the highest level of B.megaterium PGA production by recombinant B.megaterium. Media compositions for biomass and PGA production were evaluated using a genetic algorithm. The screening was carried out in 96 microtiter deep well plates, starting as a minimal medium and studying the concentration of 12 defined components. In 7 generations, 240 different kinds of media were tested for production and secretion and a 10-fold increase in PGA production and 5-fold increase in biomass compared to the previously used minimal medium could be achieved. It was scaled-up to shaker flasks obtaining 3-fold in PGA production and 1.8-fold in biomass. Later, it was scaled-up to bioreactors obtaining 3-fold in biomass and 8-fold in PGA production. Using glycerol as carbon source, it was tested different complex amino acids sources, using flask cultures. The best medium was scale-up in a 5 L bioreactor, in a batch culture with pulses. The highest production of PGA of recombinant B. megaterium achieved was 105600 IU/L and 36 gDCW/L. / Penicilina G Acilase (PGA) é enzima chave na produção industrial de antibióticos β- lactâmicos. Neste trabalho, foram estudadas as produções de PGA de Escherichia coli produzida por E.coli recombinante e de Bacillus megaterium produzida por B. megaterium recombinante. No primeiro, esta é acumulada no espaço periplasmático, o segundo secreta a enzima, o que pode reduzir grandemente custos de recuperação da enzima, pois não requer rompimento celular. Para E.coli, o estudo foi iniciado na etapa de expressão. Utilizando E.coli recombinante doada, foi realizado um estudo em frascos agitados da influência da temperatura (entre 18 e 28°C), durante a fase de indução, na expressão de PGA, que mostrou haver altos níveis de expressão de enzima a 20°C, com atividade volumétrica 4 vezes superior à obtida a 28°C. Foram realizados então cultivos a 20°C, em biorreator, em batelada alimentada, com glicerol como fonte de carbono, usando meio definido ou complexo, com IPTG ou lactose como indutores. Foram atingidas concentrações de biomassa finais de 100 gms/L e 120 gms/L, e atividades enzimáticas de 210000 e 80000 UI/L para meios complexo e definido, respectivamente. Para B. megaterium, o gene pac, que codifica PGA de B. megaterium ATCC14945 foi isolado e clonado no plasmídeo pLipAhp, juntamente com um gene promotor e outro codificando resistência a antibiótico (para seleção da linhagem clonada). Essa construção (pga-pLipAhp) foi usada para transformar três linhagens de protoplastos de B. megaterium, com o objetivo de determinar o melhor hospedeiro para a expressão de PGA recombinante. Foram testadas as linhagens: B. megaterium PV 361, QM B1551 e ATCC 14945, obtendo-se 95%, 95% e 10%, respectivamente, de estabilidade plasmidial, após 8 cultivos consecutivos. A melhor produção de PGA foi detectada em PV 361. Estudo de estabilidade térmica e de pH com a enzima purificada mostrou que PGA possui um tempo de meia vida de 5 min a 60°C, 20 min a 50°C, mantém 100% de atividade por 1 h, a pH 10 e por 8 horas, a pH 5. A temperatura e pH de atividade máxima é 37°C e 8,0, respectivamente, com Km=8.8 μM, com manutenção de 100% de atividade, no mínimo por 5 horas, nessas condições. Um estudo sistemático foi desenvolvido para obter um alto rendimento na produção de PGA de B. megaterium por B.megaterium recombinante. Busca da melhor composição de meio para biomassa e produção de PGA foi feita usando o algoritmo genético. A busca foi desenvolvida em placas de 96 poços, iniciando com um meio mínimo, com 12 componentes definidos. Em 7 gerações, 240 tipos de meio foram testados para a produção e secreção, conseguindo-se um incremento de 10 vezes na produção de PGA e de 5 vezes na produção de biomassa, comparando-se com o meio mínimo controle. Escalonamento para frascos agitados permitiu aumento de 3 vezes na produção de PGA e de 1.8 vezes na produção de biomassa. Escolhendo-se glicerol como fonte de carbono, foram testadas diferentes fontes complexas de aminoácidos. O meio que conduziu ao melhor resultado foi usado em cultivos em biorreator em batelada, 5L, onde se obteve como máxima produção de PGA recombinante de B. megaterium 105600 UI/L, com 36 gms/L de massa celular.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2994.pdf: 558156 bytes, checksum: e1e70a4f064f373ef5d3879f5a261ad8 (MD5) Previous issue date: 2010-03-25 / Financiadora de Estudos e Projetos / The production of enzymes β-lactamases by pathogenic bacteria is the most common mechanism of resistance to β-lactam antibiotics. The β-lactamases catalyze the hydrolysis of β-lactam ring, splitting the amide bond, as a result, the antibiotics become ineffective. Clavulanic acid (CA) is a secondary metabolite β-lactam produced during the fermentation of Streptomyces clavuligerus and has a potent inhibitory activity of β-lactamases. Like other β-lactam compounds, CA is chemically unstable under high temperature conditions. The decomposition of the AC during the bacterial fermentation reduces its concentration in the broth which results in low yields of the process. In this study the production of CA was evaluated in batch processes and batch with glycerol pulses at different temperature conditions in shaker operated at 250 rpm and pH 6.8. Initially, three batch cultures containing glycerol as carbon source were performed at temperatures of 30, 25 and 20ºC. Batch cultivation at 30°C was considered as a control run. Then, other three batch tests were performed with reduction of temperature of 30°C for 25 or 20°C after the exhaustion of glycerol in the broth culture. Added, also were performed four cultures with reduction of temperature associated with feeding of glycerol (1, 2, 3 and 4 pulses of glycerol), resulting in twelve cultures. In general, the production of CA increased with decreasing temperature and feeding of glycerol was beneficial for CA production. For all experiments under low temperatures, the maximum production (CCA-max) and productivity in CC (PCA-max in mg.L-1.h-1) were higher than the control run. In addition, a significant increase product (CA) yield coefficient in relation to the glycerol consumption (YCA/G, mg.g-1) reaching 59.3 mg.g-1 for the batch culture at 20°C, while for the control run was obtained 10.2 mg.g-1. The CCA-max obtained was 1115.6 mg L-1 in cultivation with temperature reduction from 30 to 25°C and three pulses of glycerol, which represented about 7 times the yield on the run control culture at 30°C. The CA degradation in fermentation broth at temperatures of 30, 25 and 20ºC was also evaluated in this study. Values of constant degradation of CA (kdCA) were obtained in different cultivation times. The highest kdCA value in the broth was obtained at 30°C, 0.01306 h-1, and values for 25 and 20ºC were statistically similar, 0.00303 and 0.00173 h-1. The higher rate of production of CA (rCA) of 10.9 mg.L-1.h-1 was observed at 25°C. The results obtained demonstrate the potential application of temperature manipulation during S. clavuligerus fermentation for the optimization of CA production process. / A produção de enzimas β-lactamases por bactérias patogênicas é o mecanismo de resistência mais comum aos antibióticos β-lactâmicos. As β-lactamases catalisam a hidrólise do anel β-lactâmico, rompendo a ligação amida o que leva à perda da atividade antimicrobiana do antibiótico. O ácido clavulânico (AC) é um metabólito secundário β- lactâmico produzido durante a fermentação de Streptomyces clavuligerus e possui uma potente atividade inibitória de β-lactamases. Como outros compostos β-lactâmicos, AC é quimicamente instável sob condições elevadas temperaturas. A decomposição do AC durante a fermentação bacteriana reduz sua concentração no caldo o que se traduz em baixos rendimentos do processo. No presente trabalho foi avaliada a produção de AC em processos em batelada e batelada com pulsos de glicerol em diferentes condições de temperatura em mesa incubadora rotativa operados a 250 rpm e pH 6,8. Inicialmente, três cultivos em batelada, contendo glicerol como fonte de carbono, foram conduzidos em temperaturas de 30, 25 e 20ºC, onde a 30ºC foi considerado ensaio controle. Em seguida, outros três ensaios em batelada foram realizados com redução de temperatura de 30ºC para 25 ou 20ºC após a exaustão de glicerol no caldo de cultivo. Também foram realizados quatro cultivos com redução de temperatura associado com alimentação de glicerol (1, 2, 3 e 4 pulsos de glicerol), totalizando doze cultivos. Em geral, a produção de AC aumentou com o decréscimo de temperatura e a alimentação de glicerol foi benéfica para a produção. Para todos os cultivos em quaisquer condições de baixas temperaturas, a produção máxima de AC e produtividades em AC (PAC-máx em mg.L-1.h-1) observadas foram superiores àquelas obtidas no cultivo controle. Além disso, houve um aumento significativo do rendimento AC por glicerol (YAC/G, mg.g-1) chegando a 59,3 mg.g-1 no cultivo em batelada a 20ºC, enquanto que para o controle foi observado um rendimento de 10,2 mg.g-1. A concentração máxima de AC obtida foi de 1115,6 mg.L-1 para o cultivo com redução de temperatura de 30 para 25ºC e três pulsos de glicerol o que representou cerca de 7 vezes a produção obtida no cultivo controle em batelada a 30ºC. A degradação de AC em caldo de fermentação nas temperaturas de 30, 25 e 20ºC também foi avaliada neste estudo. Valores de constantes de degradação de AC relativas ao modelo de degradação de primeira ordem (kdAC) foram obtidos em diferentes tempos de cultivo. O maior valor de kdAC foi encontrado a 30ºC (0,01306 h-1) e os valores para 25 e 20ºC foram estatisticamente semelhantes (0,00303 e 0,00173 h-1). A maior velocidade de produção de AC (rAC) de 10,9 mg.L-1.h-1 foi observada a 25ºC.Estes resultados demonstram o potencial de aplicação da manipulação da temperatura durante a fermentação de S. clavuligerus para a otimização do processo de produção de AC.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:17:19Z : No. of bitstreams: 1 silva_laf_me_araiq.pdf: 881872 bytes, checksum: 1ed668293818af00e17546ddfe67a5f2 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os resultados descritos neste trabalho para a produção de etanol utilizando-se a levedura IQ-AR/45-1, forneceram informações sobre os melhores suplementos nutricionais e melhor tamanho de inóculo para a fermentação em batelada alimentada. Dadas as variações na composição do melaço e o uso de uma nova levedura, faz-se necessário o estudo de suas exigências nutricionais em processos fermentativos. Experimentos preliminares em batelada simples mostraram que a adição de DAP diminuiu o tempo de fermentação, estimulou o acúmulo da biomassa e produção de etanol enquanto o ZnSO4.7H2O diminuiu o tempo da fermentação, e aumentou o acúmulo de etanol elevando a produtividade. A adição de MgSO4.7H2O produziu mais etanol, melhorou o rendimento alcoólico e a produtividade. Estes resultados obtidos em batelada simples foram transferidos para o sistema em batelada alimentada. A melhor vazão do melaço 20 % em ART foi de 0,40 mL.min-1 para um volume final de trabalho de 100,0 mL. O aumento da temperatura de fermentação de 34 ºC para 37 ºC em meio suplementado com DAP e ZnSO4.7H2O ou DAP e MgSO4.7H2O diminuiu o tempo da fermentação e a biomassa produzida, porém, com menor rendimento e maior produtividade de etanol. O tamanho do inóculo foi estudado com meio suplementado a 34ºC. As melhores condições foram obtidas no processo em batelada alimentada a 34ºC no qual foi utilizado melaço clarificado com ácido sulfúrico e uma quantidade de inóculo de (23,7±0,1) g.L-1 que levou a um tempo de fermentação de 5 horas. Nestas condições, o rendimento alcoólico foi de (79,1±0,7) % e a produtividade de (16,17±0,56) g.L-1 .h-1 / The results of the fermentative processes for ethanol production using the yeast IQ-AR/45-1, provided information about the best nutritional supplementation and inoculum size for the batch fermentation. Due to the differences in the sugarcane molasses and the use of a new yeast strain, it was necessary to study the nutritional requirements of the new yeast. Previous experiments in batch fermentation showed that the DAP addition reduced the fermentation time, enhanced the biomass and ethanol production while the ZnSO4.7H2O reduced the fermentation time and increased both the ethanol production and productivity. The addiction of MgSO4.7H2O to the molasses increased the ethanol yield and enhanced the productivity. These results obtained in batch cultures were assayed in fed-batch fermentation. Using 20 % molasses (TRS), the best flow was 0.40 mL.min-1 for a final working volume of 100.0 mL. When molasses supplemented with DAP and ZnSO4.7H2O or DAP and MgSO4.7H2O was used in the fed-batch experiments, the raise in the temperature from 34 ºC to 37 ºC led to decreases in the fermentation time, production of biomass, and ethanol yield followed by increases in ethanol productivity. The best inoculum size to the ethanol fermentation was (23.7±0.1) g.L-1 which led to a yield of (79.1±0.7) % and productivity of (16.17±0.56) g.L-1 .h-1

Neste trabalho foi estudadaaproduÃÃo de etanol por processos de SacarificaÃÃo e FermentaÃÃo SimultÃneas (SSF) usando o bagaÃo de caju prÃ-tratado com Ãcido-Ãlcali (CAB-OH) como matÃria-prima. Nos processos de SSF foi utilizada a levedura KluyveromycesmarxianusATCC36907e o complexo enzimÃtico Celluclast 1.5L (30 FPU.gcelulose-1). Os experimentos foram conduzidos em Erlenmeyers de 250 mL com 100 mL de meio SSF (tampÃo citrato de sÃdio 50 mMapH 4,8; suplementado com 1 g/L de extrato de levedura e 1 g/L de sulfato de amÃnio, e a carga de CAB-OH desejada em %m/V), a concentraÃÃo inicial de cÃlulas de 5 g/L, temperatura de 40ÂC e rotaÃÃo de 150 rpm. Primeiramente, um processo em batelada foi realizado para avaliar a necessidade de suplementaÃÃo com a enzima celobiase (NS50010âNovozymes) com atividade de 60 CBU/gcelulose-1. O processo SSF conduzido com a suplementaÃÃo decelobiaseobteveuma maior produÃÃo mÃxima de etanol (30 g/L) e maior eficiÃncia (93%) em relaÃÃo ao nÃo-suplementado, sendo os estudos posteriores conduzidos com as enzimas celulases e celobiases. Em seguida, realizou-se o estudo da avaliaÃÃo da carga de CAB-OH (7,5, 10, 15 e 20 %m/V), em processos sem prÃ-sacarificaÃÃo (SSF) e comprÃ-sacarificaÃÃo(PSSF). A maiorconcentraÃÃo de etanol (58 g/L)ocorreu nos processos SSF com carga de 15%, sendo esse tambÃm o de maior produtividade, e PSSF com carga de 20%, nÃo apresentando diferenÃa significativa na produÃÃo mÃxima de etanol entre os dois processos. No entanto, osprocessos SSF e PSSFusando 10% CAB-OH apresentaram a maioreficiÃncia (98%)e rendimento global em etanol do estudo (40gEtanol/KgCAB).Posteriormente, foram realizadas estratÃgias de alimentaÃÃo, em conjunto com processos SSF, de forma a eliminar efeitos inibitÃrios presentes em processos em batelada com elevadas cargas de sÃlidos. Foram avaliadas estratÃgias de alimentaÃÃo de substrato: duas com carga inicial de 10% e atingindo 20% (uma com duas alimentaÃÃes e outra com quatro) e uma com carga inicial de 15% e final de 25% (quatro alimentaÃÃes). Todos os processos, exceto os de carga de 7,5%, apresentaram %Vetanol/VsoluÃÃo acima de 4% e os processos em batelada alimentada atingiram a maior produÃÃo de etanol do estudo(68g/L). Os processos com carga inicial de 10 % e final de 20 % apresentaram uma maior eficiÃncia (81 %), porÃm o processo que apresentou maior produtividade foi com carga inicial de 15% e final de 25% (2,4 g/L.h), e tambÃm rendimento global em etanol elevado (32 gEtanol/KgCAB), de forma que esse foi o processo com melhores resultados do presente estudo. Com isso, o CAB-OH se mostrou um substrato promissor para a produÃÃo de etanol por processos SSF e PSSF, conduzidosem batelada e batelada alimentada, utilizando elevadas cargas de sÃlidos. / In this work was studied ethanol production from cashew apple bagasse after acid followed by alkali pretreatment (CAB-OH) using theSimultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) processes. In SSF process was utilized the yeast Kluyveromycesmarxianus ATCC36907and the enzymatic complex Celluclast1.5L (30 FPU.gcellulose-1). The assays were conducted in 250mL Erlenmeyer flasks with 100mL of culture medium (sodium citrate buffer 50mM pH 4.8, supplemented with yeast extract 1 g/L and ammonium sulfate 1 g/L and the desired bagasse concentration in %w/v), the initial cells concentration was 5 g/L, the temperature was 40ÂC and 150rpm of rotation. First, a batch process was performed to evaluate the enzymatic supplementation of culture medium with cellobiase (NS50010-Novozymes) with an activity of 60 CBU.gcellulose-1. The supplemented process with cellobiase had the highest ethanol production (30 g/L) and ethanol efficiency (93%) than the non-supplemented and the subsequent studies were performed with supplementation. After, was realized the evaluation of CAB-OH load (7.5, 10, 15 e 20%w/V) in processes with (PSSF) and without pre-saccharification (SSF). The highest ethanol production corresponded to SSF processes with bagasse load of 15%, this being also the highest productivity, and PSSF with bagasse concentration of 20% and these processes were statistic similar within the standard deviation of the samples in relation to ethanol production. However, the SSF and PSSF processes with 10% of dry matter had the highest efficiency (98%) and yield feedstock in ethanol of study (32gEthanol/KgCAB). After, feeding strategies with SSF processes have been made to eliminate inhibitory effects in batch processes with high loadings of solids. There were evaluated feeding strategies: two with initial CAB-OH load of 10% and 20% in the end (a strategy with two feeds and one with four) and another with initial load of 15% and final of 25% (with four feeds). All processes, with the exception of 7.5% load, had %VethanolVsolution-1 above 4% and the fed batch processes reached a similar ethanol production (68 g/L), towering in 17% the ethanol concentration compared to batch process with load of 20%. All processes, with the exception of 7.5 % load, had %Vethanol/Vsolution above 4% and the fed batch processes reached the highest ethanol production of study (68 g/L). The processes with initial load of 10 % and final of 20 % reached a higher efficiency (81 %), but the process that reached the highest productivity was the process with the initial load of 15 % and final of 25 % (2,4 g/L.h), and high ethanol global yield too (32 gEthanol/KgCAB), so this process achieved the best results of present study. Based on the results presented, CAB-OH showed a promising substrate for ethanol production by SSF and PSSF processes, conducted by batch and fed batch method, using high loadings of solids.

Orientador: Rubens Maciel Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T20:06:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hendler_Bernardo_M.pdf: 3413673 bytes, checksum: adc25e09545e580c1ebf374d501f64b9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Este trabalho teve como objetivo desenvolver um programa computacional capaz de auxiliar o estudo da cinética de fermentação em reator de batelada alimentada ou simples. O resultado foi o programa nomeado FERMENTA, o qual simula fermentação considerando tanto um único substrato, os açúcares redutores totais (ART), como dois substratos, a glicose e a frutose. A descrição cinética resulta de um procedimento computacional de simulação que utiliza equações modelo para a estimativa da velocidade específica de crescimento da levedura ( ? ), resolvendo numericamente, por Runge-Kutta de quarta ordem, as equações diferenciais dos balanços de massa para os componentes no reator. Os dados inseridos são os parâmetros de operação do reator e os valores dos parâmetros cinéticos da equação escolhida. A resposta é apresentada como gráfico das curvas cinéticas da concentração dos componentes, informando qualquer valor em qualquer instante. Se há dados experimentais, também são calculados os desvios entre estes e os valores simulados. Uma estratégia de regressão a partir da simulação utiliza uma matriz do tipo empregado em desenho fatorial completo e permite o ajuste dos parâmetros da equação para ? ao conjunto de dados experimentais, sem o conhecimento prévio dos valores dos parâmetros cinéticos nesta equação. A resposta, ou "melhor ajuste", é o conjunto dos valores destes parâmetros que minimiza os desvios. O programa disponibiliza 28 diferentes equações para ? , todas coletadas na literatura. Quando simula ou ajusta considerando dois substratos, resolve para ? = ?G + ?F ,ou seja, estratifica a modelagem do metabolismo para cada substrato e, deste modo, tem-se 282 =784 modelos diferentes que podem ser testados. A linguagem de programação empregada foi o Object Pascal e a construção do programa utilizou o software compilador Borland® Delphi 7, o que permitiu obter-se um aplicativo de fácil utilização, orientado por eventos simples e em ambiente Windows / Abstract: This work aimed at developing a computer program able to the study of alcoholic fermentation kinetics in single or fed-batch reactor. The result was a program named FERMENTA, which simulates the fermentation, considering both a single substrate, the Total Reducing Sugars (TRS), and for two substrates, glucose and fructose. The kinetic description results from a computational procedure for simulation that uses equations to estimate the yeast specific growth rate ( ? ), and to solve numerically, by fourth order Runge-Kutta, mass balances differential equations for the components in the reactor. Data are inserted as the parameters of reactor operation and the equation kinetics coefficients values. The result is shown as a graph of the kinetic curves for components concentration, also informing any value at any time. With the experimental data, the deviations between it and simulated values are also calculated. A strategy of recurrence from the simulation using a matrix of the type used in full factorial design allows adjusting the equation to the experimental data set without prior knowledge of the kinetic coefficients values. The response, or "best fit", is the set of values of these coefficients that minimizes the deviations. The program has 28 different equations for calculate ?, all gathered in the literature. When simulating or adjusting considering two substrates, the program solves for ? = ?G + ?F equation, i.e., it stratifies the metabolism by substrate and, thus, there are 282 = 784 different models that can be tested. The computer language used was the Object Pascal and the program construction used Borland® Delphi 7 Studio Architec Edition software, which allowed to obtain an application for Windows environment, simple event-driven and easy to use / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

O câncer é um problema de saúde pública, especialmente entre os países em desenvolvimento. Está entre as doenças de maior taxa de mortalidade e é responsável por mais de 12% de todas as causas de óbito no mundo. Uma proteína denominda Amblyomin-X foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma Cajennense e expressa na bactéria Escherichia coli BL21DE3. Essa proteína é capaz de induzir a morte de células tumorais, além de ter pouca ou nenhuma atividade contra células normais, diminuindo assim os efeitos colaterais nos pacientes em tratamentos contra o câncer. Através deste trabalho foi possível elaborar um protocolo para obtenção de elevadas concentrações celulares e produção da proteína recombinante AmblyominX em biorreatores com capacidade total de 15 L. Uma vez que a proteína é intracelular, foram estudados alguns parâmetros e estratégias de cultivo do microrganismo para obtenção de alta concentração celular, tais como: composição do meio de cultura, identificação dos substratos limitantes e inibitórios e vazão de alimentação da fonte de carbono. Foi definido um meio de cultura adequado para atingir elevadas concentrações celulares na etapa de crescimento da E. coli, visando garantir elevadas concentrações de produto recombinante. Ensaios conduzidos em biorreatores com esse meio resultaram em concentrações celulares e densidade ótica (DO600nm) iguais a 40,0 g/L e 76,6, respectivamente, para a etapa de crescimento celular e 59,8 g/L e 161, respectivamente, no final da etapa de produção da proteína de interesse. Os ensaios conduzidos em reatores mostraram que concentrações de ácido acético acima de 0,4 g/L causam inibição do crescimento celular, portanto, foi elaborada uma estratégia eficaz de alimentação exponencial dos substratos limitantes (fontes de carbono e magnésio) na etapa de crescimento dessa bactéria para atingir elevadas concentrações celulares, mantendo-se a velocidade específica de crescimento (µx) menor que 0,2 h-1, abaixo do valor máximo, com a finalidade de evitar a formação de ácido acético. Este trabalho permitiu também conhecer os parâmetros cinéticos para a produção da proteína Amblyomin-X, tais como, a velocidade específica máxima de crescimento (max), a produtividade celular global (Pxglobal), a produtividade celular máxima (Pxmáx) e o fator de conversão de substrato em célula (Yx/s) na etapa de batelada alimentada, cujos valores foram, respectivamente, de 0,30 h-1, 13,8 g de célula/h, 14,1 g de célula/h e 0,37 g de célula/g de substrato. Para a avaliação da biossíntese da proteína recombinante foram realizadas análises de gel de poliacrilamida por eletroforese e a quantificação foi feita pela análise de Bradford. A concentração de proteína Amblyomin-X no final da etapa de síntese alcançou 8,57 g/L. / Cancer is a public health problem, especially among developing countries. It is among the diseases with the highest mortality rate and accounts for more than 12% of all causes of death in the world. A protein called Amblyomin-X was obtained from a cDNA library of Amblyomma Cajennense tick salivary glands and it was expressed in the bacterium Escherichia coli BL21DE3. This protein is able to induce death of tumor cells, as well as having little or no activity against normal cells, thus reducing the side effects in patients on cancer treatments. In this work it was possible to elaborate a protocol for obtaining high cellular concentrations and production of the recombinant Amblyomin-X protein in bioreactors with a total capacity of 15 L. Since the protein is intracellular, some parameters and strategies of culture of the microorganism for obtaining a high cell concentration, were: composition of the culture medium, identification of limiting and inhibitory substrates and feed rate of the carbon source. A culture medium suitable for achieving high cell concentrations in the growth stage of E. coli was defined in order to guarantee high concentrations of recombinant product. Experiments conducted in bioreactors with this medium resulted in cellular concentrations and optical density (DO600nm) of 40.0 g / L and 76.6, respectively, for the cell growth step and 59.8 g / L and 161, respectively, at the end of the production stage of the protein of interest. Experiments conducted in reactors showed that acetic acid concentrations higher than 0.4 g/L cause inhibition of cell growth, therefore, an effective strategy of exponential feeding of the limiting substrates (carbon and magnesium sources) was elaborated in the growth stage of this bacteria to reach high cellular concentrations, maintaining the specific growth rate (µx) less than 0.2 h-1, below the maximum value, in order to avoid the formation of acetic acid. This work also allowed to know the kinetic parameters for Amblyomin-X protein production, such as the maximum specific growth rate (max), the overall cellular productivity (Pxglobal), the maximum cellular productivity (Pxmax) and the conversion factor of substrate in cell (Yx/s) in the fed batch stage, whose values were respectively 0.30 h-1, 13.8 g cell/h, 14.1 g cell/h and 0.37 g of cell/g of substrate. For the evaluation of recombinant protein biosynthesis, polyacrylamide gel analyzes were performed by electrophoresis and quantification was done by the Bradford analysis. The Amblyomin-X protein concentration at the end of the synthesis step reached 8.57 g/L.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência da intensidade de agitação e tipo de impelidor, bem como a estratégia de alimentação, em reator anaeróbio operado em batelada seqüencial, escala piloto (\'da ordem de\' 1 \'M POT.3\'), com agitação mecânica e em duas configurações: uma com biomassa granulada (ASBR) e outra com biomassa imobilizada em suporte inerte de espuma de poliuretano (ASBBR), aplicadas ao tratamento de esgoto doméstico. No estudo da intensidade de agitação e tipo de impelidor, para cada reator foram avaliadas três tipos de impelidores (turbina de pás planas, turbina de pás inclinadas 45º e hélice) associados a duas intensidades de agitação (40 e 80 rpm), obtendo uma combinação de 6 (seis) condições experimentais. A combinação da intensidade de agitação e tipo de impelidor que apresentou melhor desempenho no processo foi utilizado no estudo da estratégia de alimentação, na qual foi avaliada as seguintes condições: batelada alimentada durante 25%, 50%, 75% e 100% do ciclo. Os resultados obtidos permitiram concluir que: no ASBBR o aumento da intensidade de agitação de 40 rpm para 80 rpm permitiu uma melhoria nos fluxos de transferência de massa e, portanto, aumentou a velocidade de consumo de substrato; no ASBR o aumento da intensidade de agitação de 40 rpm para 80 rpm proporcinou uma desestabilização do sistema, provavelmente por causa da ruptura dos grânulos provocada pela maior agitação; os sistemas operados com impelidor do tipo hélice apresentaram vantagens, tais como: melhor eficiência de remoção de sólidos, maior valor da constante cinética de primeira ordem (melhor fluxo de transferência de massa e conseqüentemente maior consumo de substrato) e maior produção de alcalinidade, ou seja, maior estabilidade para o sistema; tanto o sistema ASBR como o ASBBR quando operados nas condições de batelada típica, batelada alimentada durante 50% e 75% do ciclo apresentaram melhores desempenhos no processo de tratamento, mostrando a flexibilidade operacional dos reatores anaeróbios operados em bateladas seqüenciais; e comparando os sistemas ASBBR e ASBR verificou-se que estes apresentaram comportamentos similares em todas as condições de operação de batelada alimentada avaliadas, não sendo possível, estatisticamente apontar um sistema com melhor desempenho. / The objective of this work was to assess the effect of the stirring speed, the type of impeller and the feed strategy in a mechanically stirred pilot-scale (\'da ordem de\' 1 \'M POT.3\') anaerobic sequencing batch reactor to two configurations: a containing granulated biomass (ASBR) and the other containing immobilized biomass (AnSBBR). Domestic wastewater was treated in 8-h cycles. Three impeller types (turbine with six-flat blades, turbine with six 45º-inclined blades and helix with three blades) were assessed at two different stirring speeds (40 and 80 rpm), totaling six experimental conditions. The stirring speed and the impeller that resulted in the best combination was used in work of the feed strategy . The reactors were operated at room temperature at four different feed strategies (fed batch during 25%, 50% and 75% of the cycle, and conventional fed-batch). The results allowed conclude that: in the AnSBBR increasing the stirring speed from 40 rpm to 80 rpm showed to improve mass transfer, with consequent increase in substrate consumption; in the ASBR increasing the stirring speed from 40 rpm to 80 rpm showed desestabilization in system, because of the disruption caused in the granules witth greater agitation; operation with the helix impeller showed some advantages over the turbine impellers, such as: improved efficiency in solids removal, higher value of the first order kinetic constant and higher alkalinity production; both for the ASBR as for the ASBBR the best performance in wastewater treatment was obtained when the reactors were operated at conventional batch, fed-batch during 50% and 75% of the cycle; no significant difference in performance was observed among these three conditions. Despite poor performance of the conventional fed-batch and fed-batch during 25% of the cycle compared to the other conditions, both these conditions presented operational stability. Hence, the anaerobic sequencing batch reactors presented operational flexibility as far as feed strategy is concerned.