La leucémie aiguë mégacaryocytaire (LAM7) est un sous-type rare de leucémie myéloïde aiguë (LMA). Son incidence est plus élevée chez les nouveau-nés et les jeunes enfants de moins de trois ans et elle est associée à un taux de survie globale faible et à un risque accru de rechute. Des gènes de fusion oncogéniques, récurrents et mutuellement exclusifs, sont considérés comme étant des évènements transformants dans les LAM7 pédiatriques et ils sont détectés dans plus de 70% des cas, tels que CBFA2T3::GLIS2 (CG2), NUP98::KDM5A et les réarrangements de KMT2A. De nouvelles thérapies ciblées sont urgemment requises pour améliorer les résultats des traitements. Cependant, la recherche dans le domaine est retardée par la rareté des échantillons primaires de patient causée par la faible incidence de la maladie et la myélofibrose fréquente de la moelle osseuse qui rend les prélèvements difficiles chez les patients. Nous avons surmonté la limitante du nombre d’échantillons restreints pour la recherche en développant avec succès des modèles synthétiques de LAM7 pédiatriques exprimant les gènes de fusion oncogéniques pertinents. Nous avons utilisé des cellules souches et progénitrices hématopoiétiques humaines CD34+ isolées de sang de cordon, transduites avec des particules lentivirales codant pour la fusion CG2 et générant six modèles synthétiques distincts de xénogreffes en souris immunodéficientes. Ces modèles reproduisent fidèlement la maladie humaine en termes d’expression génique, d’immunophénotype, d’ontogénie et de vulnérabilités thérapeutiques. Ces derniers peuvent être maintenus en culture optimisée in vitro et transplantés de façon sériée dans les souris, procurant un substrat essentiel pour effectuer des cribles pharmacologiques à haut débit de grande envergure pour identifier de nouveaux composés thérapeutiques. Au cours de ce projet, j’ai piloté un crible pharmacologique de grande envergure avec près de 12,000 composés, incluant 2,000 molécules approuvées par la FDA, contribuant à démontrer que les échantillons LAM7 sont vulnérables à la perte de fonction génétique (knock-down) et à l’inhibition pharmacologique du facteur pro-survie BCL-XL par le BH3 mimétique navitoclax ou le dégradeur protéosomal DT2216. Par ailleurs, les échantillons LAM7 exprimant la fusion CG2 sont hautement sensibles aux inducteurs de l’apoptose classifiés comme les mimétiques de SMAC, tel que le LCL-161, une nouvelle piste inexplorée dans les LAM7. J’ai aussi étudié les rôles de facteurs pro-survie sélectionnés de la famille BCL2 dans les échantillons de LAM7 et LMA, révélant que la dépendance aux différentes protéines pro-survie est spécifique au génotype et au sous-type de LMA. Finalement, j’ai investigué le potentiel synergique de combinaisons de composés comme différents BH3 mimétiques ou des inhibiteurs de BCL-XL jumelés à de faibles doses de cytarabine. J’ai démontré que ces combinaisons étaient hautement efficaces et elles pourraient offrir de nouvelles alternatives pour le traitement des LMA pédiatriques de haute fatalité. En résumé, la génération de nouveau modèles humains de LAM7 de haute fatalité a fait progresser la recherche translationnelle et nous a permis de bénéficier d’une source inestimable d’échantillons pour réaliser des cribles pharmacologiques à grande échelle qui ont révélé de nouvelles vulnérabilités thérapeutiques pour développer des thérapies ciblées. / Acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) is a rare subtype of acute myeloid leukemia (AML). It has the highest incidence in neonates and infants below three years of age and is associated with poor overall survival and high chance of relapse. Recurrent and mutually exclusive oncogenic fusions are considered to be the transforming event in pediatric AMKL and are detected in over 70% of cases, such as CBFA2T3::GLIS2 (CG2), NUP98::KDM5A and rearrangements of KMT2A. Novel and targeted therapies are urgently needed to improve treatment outcomes, however research in this field is hampered by the rarity of primary patient samples which is a result of the low disease incidence and common myelofibrosis in the bone marrow of patients that makes sample collection difficult. We overcame the limitation of restricted sample material for research by successfully engineering synthetic models of pediatric AMKL with the relevant oncogenic driver fusions. We used human CD34+ haematopoietic stem and progenitor cells collected from cord blood and transformed them with lentiviral particles carrying the CG2 fusion, thus generating six distinct synthetic models xenografted in immunodeficient mice that phenocopy the human disease in terms of gene expression, immunophenotype, ontogeny and therapeutic vulnerabilities. These models can be maintained in optimised in vitro cultures and serially transplant in mice, which provided us with essential material for conducting large scale high-throughput chemical screens to identify novel compounds for therapy. Moreover in this project, I conducted a large chemical screen with around 12,000 compounds, including 2,000 FDA-approved molecules, which highlighted that AMKL samples are vulnerable towards genetic knock-down and pharmacological inhibition of pro-survival factor BCL-XL by BH3 mimetic navitoclax or proteasomal degrader DT2216. In addition, AMKL samples with the CG2 fusion were highly susceptible to inducers of apoptosis classified as SMAC mimetics, namely LCL-161, a novel and yet unexplored finding in AMKL. I further investigated the role of selected pro-survival factors of the BCL2 family in samples of AMKL and AML and uncovered that the reliance on different pro-survival proteins is geno- and subtype-specific in AML. Furthermore, I investigated the potential of synergistic drug combinations with different BH3 mimetics or BCL-XL inhibition with low-dose cytarabine, and demonstrated that those combinations are highly effective and could provide novel options for the treatment of high-fatality pediatric AML. In summary, the generation of novel human models of high-fatality AMKL advanced translational research and provided us with invaluable sample material for large chemical screens that highlighted novel therapeutic vulnerabilities for targeted therapies.

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Die Wirkung von zwei endogen neuroprotektiven Substanzen, Melatonin und 17 beta-Estradiol wurde an drei Caspase-abhängigen, apoptotischen, aber Exzitotoxin-unabhängigen Schadensmodellen an neuronalen Primärkulturen untersucht und mit der bei vorwiegend nekrotischen Schadensmodellen verglichen. Es zeigten sich eine Abhängigkeit des neuroprotektiven Potentials von der Art des Zelluntergangs sowie unterschiedliche Mechanismen der Neuroprotektion. Melatonin wirkte in allen drei apoptischen Modellen nicht neuroprotektiv, sondern verstärkte die Schädigung der Neurone noch, während partiell gegen die OGD-induzierte Nekrose (OGD, engl. Oxygen glucose deprivation, kombinierter Sauerstoff- und Glukoseentzug) kortikaler Neurone Schutz erzielt wurde. Der Einsatz des endogenen neuroprotektiven Faktors Melatonin als Therapeutikum ist möglicherweise nur bei neurodegenerativen Erkrankungen mit exzitotoxischer Schädigung durch Glutamat oder oxidativem Stress wie bei Epilepsie oder dem Schlaganfall durch Ischämie sinnvoll. Die fehlende bzw. potenzierenden Wirkung von Melatonin bei neuronaler Apoptose in vitro, stellt jedoch einen therapeutischen Erfolg bei der Behandlung der mit apoptotischer Schädigung einhergehenden Alzheimer'schen Erkrankung in Frage. Bei klinischer Anwendung ist auch der von uns erhobene Befund zu beachten, dass in vitro native neuronale Zellen durch Melatonin geschädigt werden. 17 beta-Estradiol wirkte sowohl bei nekrotischer als auch bei apoptotischer Zellschädigung. Dabei zeigten sich wesentliche Unterschiede in den Mechanismen der Neuroprotektion und in der Ansprechbarkeit verschiedener Regionen des Gehirns. Schutz vor Apoptose konnte nur durch eine Langzeitvorbehandlung (20 h) in septalen und hippokampalen Kulturen, nicht jedoch in kortikalen Kulturen beobachtet werden. Dieser Effekt liess sich durch Rezeptorantagonisten, Proteinsynthesehemmung sowie durch Hemmung der Phosphoinositol-3-Kinase blockieren. Eine Kurzzeitbehandlung war gegen Apoptose nicht wirksam, zeigte gegen OGD und Glutamattoxizität jedoch neuroprotektives Potential. Dieser Effekt liess sich nicht antagonisieren, so dass hier ein direkter antioxidativer Mechanismus wahrscheinlich erscheint. Die antiapoptotische Wirkung in septalen und hippokampalen Kulturen korrelierte mit einer höheren Dichte des Estrogenrezeptors-alpha und einer erhöhten Expression antiapoptotischer Proteine in diesen Regionen. Da bei der Alzheimer'schen Erkrankung der Kortex betroffen ist, könnte der fehlende Effekt von 17 beta-Estradiol in kortikalen Neuronen sowohl auf die neuronale Apoptose als auch auf die Proteinexpression von Bcl-2 und Bcl-xL möglicherweise auf experimenteller Basis erklären, warum eine langfristige Estrogentherapie bei Frauen mit milder bis moderater Alzeimer'scher Erkrankung den Progress der Erkrankung nicht aufhalten konnte (Mulnard et al. 2000). / The neuroprotective effect of melatonin and 17 beta-estradiol has been evaluated in several in vitro models of neuronal apoptosis and necrosis. Melatonin was not neuroprotective in three models of apoptosis but showed a pro-apoptotic effect in primary cortical neurons. Melatonin revealed to damage naïve neurons, too. Partial protection was observed against necrotic neurodegeneration after oxygen-glucose deprivation (OGD). The use of melatonin as a therapeutic agent might be of interest in neurodegenerative diseases with excitotoxic damage like epilepsia or ischemia, but is questioned in case of apoptotic neurodegeneration. 17 beta-estradiol was neuroprotectiv in both necrotic and apoptotic neurodegeneration. Differences in the mechanism of neuroprotetion and in the efficacy in different regions of the brain were observed. A neuroprotective effect was visible only in hippocampal and septal cultures if 17 beta-estradiol was applied 20 h prior (long term pre-treatment) but not in cortical neurons. This effect correlates with an increased density of estrogen receptor-alpha and an increased expression of anti-apoptotic proteins like Bcl-2 and Bcl-xL in these regions. These effect could be blocked with receptor antagonists, protein synthesis inhibitors and an inhibitor of the phosphatidylinositol 3-kinase. A short term pre-treatment revealed a receptor independent neuroprotective potential against OGD and glutamate toxicity. The failure of 17 beta-estradiol to protect cortical neurons against apoptosis could be an experimental basis to understand, why a long lasting treatment with estrogens of women with mild to moderate Alzheimer´s disease failed to inhibit the progress of the illness (Mulnard et al., 2000)

The aim of this thesis is the characterization of a protein involved in apoptosis. Our group has identified an early step common to different forms of intrinsic apoptosis stimuli. This step requires de novo synthesis of a novel Cyclin, Cyclin O, that upon apoptosis induction in lymphoid cells forms active complexes, primarily with Cdk2. Cyclin O expression precedes glucocorticoid and gamma radiation-induced apoptosis in vivo in mouse thymus and its overexpression induces apoptosis in cultured cells. Knocking down the endogenous expression of Cyclin O by shRNA leads to the inhibition of glucocorticoid and DNA damage-induced apoptosis while leaving CD95 death receptor mediated apoptosis intact. This data demonstrates that apoptosis induction in lymphoid cells is one of the physiological roles of Cyclin O and it does not act by perturbing a normal cellular process such as the cell cycle. In addition we have identified c-Myb a substrate of Cdk2-Cyclin O complexes and we show that c-Myb is downregulated during apoptosis of lymphoid cells. / L'objectiu d'aquesta tesi és la caracterització d'una proteïna involucrada en l'apoptosi. El nostre grup ha identificat un pas primerenc comú en diversos estímuls apoptòtics de la ruta intrínseca. Aquest pas requereix la síntesi de novo d'una nova Ciclina, Ciclina O, que quan s'indueix apoptosi en cèl·lules limfoides forma complexes actius majoritàriament amb Cdk2. L'expressió de la Ciclina O és prèvia a l'apoptosi induïda per glucocorticoids i radiació gamma i la seva sobreexpressió indueix apoptosi en cultius cel·lulars. La baixada dels nivells d'expressió de la Ciclina O endògena amb shRNA provoca una inhibició de l'apoptosi induïda per glucocorticoids o agents que danyen el DNA, mentre que l'apoptosi mediada pel receptor CD95 es manté intacta. Aquests resultats demostren que la inducció d'apoptosi en cèl·lules limfoides és una de les funcions fisiològiques de la Ciclina O i que no es deu a una pertorbació de processos cel·lulars normals com ara el cicle cel·lular. A més a més, hem identificat c-Myb com a substrat dels complexes Cdk2-Ciclina O i demostrem que els nivells de c-Myb baixen durant l'apoptosis de cèl·lules limfoides.

No / Vitiligo is characterized by a patchy loss of inherited skin color affecting approximately 0.5% of individuals of all races. Despite the absence of the protecting pigment and the overwhelming evidence for hydrogen peroxide (H(2)O(2))-induced oxidative stress in the entire epidermis of these patients, there is neither increased photodamage/skin aging nor a higher incidence for sun-induced nonmelanoma skin cancer. Here we demonstrate for the first time increased DNA damage via 8-oxoguanine in the skin and plasma in association with epidermal up-regulated phosphorylated/acetylated p53 and high levels of the p53 antagonist p76(MDM2). Short-patch base-excision repair via hOgg1, APE1, and polymerasebeta DNA repair is up-regulated. Overexpression of Bcl-2 and low caspase 3 and cytochrome c levels argue against increased apoptosis in this disease. Moreover, we show the presence of high epidermal peroxynitrite (ONOO(-)) levels via nitrotyrosine together with high nitrated p53 levels. We demonstrate by EMSA that nitration of p53 by ONOO(-) (300 x 10(-6) M) abrogates DNA binding, while H(2)O(2)-oxidized p53 (10(-3) M) enhances DNA binding capacity and prevents ONOO(-)-induced abrogation of DNA binding. Taken together, we add a novel reactive oxygen species to the list of oxidative stress inducers in vitiligo. Moreover, we propose up-regulated wild-type p53 together with p76(MDM2) as major players in the control of DNA damage/repair and prevention of photodamage and nonmelanoma skin cancer in vitiligo.