Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-04-26T10:41:11Z No. of bitstreams: 2 Tese - Lara Cristina Pereira da Silva Pacheco - 2017.pdf: 3161074 bytes, checksum: 69afc236d4b1540e17072504bc7db6b9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-04-26T11:21:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Lara Cristina Pereira da Silva Pacheco - 2017.pdf: 3161074 bytes, checksum: 69afc236d4b1540e17072504bc7db6b9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-26T11:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Lara Cristina Pereira da Silva Pacheco - 2017.pdf: 3161074 bytes, checksum: 69afc236d4b1540e17072504bc7db6b9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-06-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The behavior of the herbicides in the environment is not determined solely by the physicochemical characteristics of the products (pKa, Kow, vapor pressure, water solubility and etc.). Soil attributes (CTC, organic matter, texture, mineralogy, pH, etc.), environmental factors (temperature, rainfall, winds) and the practices adopted in the production systems (cropping system, vegetation cover, chemical fertilization Or organic) also affect the behavior of herbicides in the environment. The objective of this work was to evaluate: 1 - The effect of the soil type on the activity of the herbicides clomazone, diclosulam, oxyfluorfen and sulfentrazone and to determine the ideal dose of this herbicide in each type of soil, through dose- answer; 2 - The activity of the herbicide Oxyfluorfen in soil with addition of biochar of sewage sludge; 3 - The activity of pre-emergent herbicides, in the absence and presence of Pennisetum glaucum straw. The soil type affected the the herbicides activities and, therefore, should be considered when deciding the herbicide applied doses. In Cerrado soils CEC is the most suitable soil attribute to predict the ideal herbicides doses of oxyfluorfen. The addition of biochar from sewage sludge obtained by pyrolysis at 500 ° C increased the sorption of the herbicide Oxyfluorfen to the soil, reducing its availability to the plants. The herbicide efficacy of the herbicides atrazine, clomazone and diclosulam is negatively affected by the presence of straw of Pennisetum glaucum. The presence of straw of Pennisetum glaucum does not affect the effectiveness of the herbicides Oxyfluorfen and Sulfentrazone. / O comportamento dos herbicidas no ambiente não é determinado, somente, pelas características físico-químicas dos produtos (pKa, Kow, pressão de vapor, solubilidade em água e etc). Os atributos do solo (CTC, teor de matéria orgânica, textura, mineralogia, pH, etc), os fatores ambientais (temperatura, precipitação pluviométrica, ventos) e as práticas adotadas nos sistemas de produção (sistema de cultivo, cobertura vegetal, adubação química ou orgânica) também afetam o comportamento dos herbicidas no ambiente. Diante disso, objetivou-se com este trabalho avaliar: 1 – O efeito do tipo de solo na atividade dos herbicidas clomazone, diclosulam, oxyfluorfen e sulfentrazone e determinar a dose ideal desse herbicida em cada tipo de solo, por meio de curvas de dose-resposta; 2 – A atividade do herbicida Oxyfluorfen em solo com adição de biochar de lodo de esgoto; 3 – A atividade de herbicidas pré-emergentes, na ausência e presença de palhada de Pennisetum glaucum. O tipo de solo afeta a atividade dos herbicidas estudados e, portanto, deve ser considerado quando da tomada de decisão das doses aplicadas dos herbicidas. Nos solos de Cerrado, a CTC é o atributo do solo mais indicado para predição das doses a serem aplicadas do herbicida oxyfluorfen. Quanto ao impacto de resíduos orgânicos na atividade de herbicidas, a adição de biochar de lodo de esgosto, obtido pela pirólise a 500°C, aumentou a sorção do herbicida Oxyfluorfen ao solo, reduzindo sua disponibilidade às plantas. A eficácia no controle de plantas daninhas dos herbicidas atrazina, clomazone e diclosulam, éafetada negativamente pela presença de palhada de Pennisetum glaucum. A presença de palhada de Pennisetum glaucum não afeta a eficácia dos herbicidas Oxyfluorfen e Sulfentrazone.

Para avaliar o efeito de diferentes linhagens de leveduras, Saccharomyces cerevisiae, vivas, na redução de aflatoxicoses e, contribuir para o entendimento do modo de ação destas leveduras sobre aflatoxina B1 marcada com trítio (AFB13H), foram conduzidos três experimentos. No primeiro experimento, foram utilizados ratos Wistar para investigar o efeito de duas linhagens de S. cerevisiae (Y1026 e Y904), e da suplementação com aminoácidos na redução de aflatoxicoses. O bioensaio, em delineamento inteiramente casualizado, foi conduzido por 28 dias para avaliar sete tratamentos (dietas), sendo um livre de aflatoxinas e seis contendo 400g kg-1 de aflatoxinas; destes, cinco com leveduras, a saber: Y1026 (níveis de 0,5; 1,0 e 5,0%) e Y904 (níveis de 1% e 1%+1000ppm de metionina + 1000 ppm de cisteína). Não foram observadas diferenças estatistiticamente significativas no consumo de alimentos, ganho de peso, conversão alimentar e função hepática entre os animais submetidos aos diferentes tratamentos. No entanto, o exame histopatológico revelou que os animais que receberam aflatoxinas sem leveduras sofreram danos mais severos em relação aos que receberam aflatoxinas juntamente com leveduras, os quais apresentaram poucos danos celulares. Conclui-se que, as duas linhagens de leveduras em todas as situações estudadas apresentaram capacidade de reduzir as aflatoxicoses. O segundo ensaio foi conduzido com o objetivo de investigar o efeito de diferentes doses da levedura Y1026 no controle de aflatoxicoses em ratos. Neste bioensaio, os animais foram distribuídos em gaiolas individuais ao acaso, e foram submetidos a 7 tratamentos (dietas) por 60 dias, sendo uma sem aflatoxinas e seis contaminadas com 550 g kg-1 de aflatoxinas, das quais cinco contendo a levedura Y1026 (doses: 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0%). Foram realizadas análises sobre o aproveitamento do alimento, funções hepáticas e tecido hepático. O consumo de alimentos pelos animais alimentados com dieta livre de aflatoxinas foi maior do que pelos animais que receberam dietas contaminadas com a toxina, os demais parâmetros para julgamento do aproveitamento dos alimentos não diferiram estatisticamente entre os animais que foram submetidos a ambos os tratamentos. A atividade de enzimas hepáticas foi maior nos animais que não receberam a toxina do que nos demais. O exame histopatológico revelou que os animais que receberam aflatoxinas e aflatoxinas mais 0,2 ou 0,5% da levedura apresentaram sinais claros de hepatotoxidez e que os demais animais que ingeriram os níveis mais altos da levedura sofreram poucos danos celulares. Conclui-se que, a dose de levedura Y1026 aplicada foi determinante na redução das aflatoxicoses em ratos Wistar. No último bioensaio, trinta ratos foram alimentados por 28 dias seguindo-se quatro tratamentos (dietas): uma dieta livre de aflatoxinas e as outras três contaminadas com 500 g kg 1 de aflatoxina, sendo uma o controle com aflatoxinas e as outras duas na presença de 1% de levedura Y1026 ou Y904. No 18º dia, seis animais de cada um dos tratamentos que recebiam aflatoxinas foram transferidos para gaiolas metabólicas, onde permaneceram por cinco dias em adaptação e, no 23º dia, estes receberam, por via oral, uma dose simples de 2Ci/animal de AFB13H. Os animais restantes (três ratos em cada um dos tratamentos) foram utilizados nos exames histopatológicos. A radioatividade foi determinada 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a introdução do material radioativo nos animais. Os animais que receberam dietas contendo as leveduras apresentaram a absorção, a distribuição e a excreção da radioatividade mais lenta do que aqueles que não receberam os probióticos. O exame histopatológico revelou que os animais que ingeriram leveduras sofreram poucos danos celulares e que aqueles que não receberam levedura foram muito afetados. As leveduras apresentaram habilidade de reduzir aflatoxicoses e modificaram a absorção, a distribuição e a excreção da radioatividade de AFB13H em ratos Wistar. / The capacity of Saccharomyces cerevisiae, from two Strain, to reduce aflatoxicosis and the effect of yeast cells on tritium-labeled B1 aflatoxin (AFB13H) were investigated in three distinct studies. The effects of S. cerevisiae Y1026 and Y904 strains and diets amended with amino acids on the reduction of aflatoxicosis in Wistar rats were evaluated in the first study. A completely randomized block-designed bioassay with Wistar rats was conducted to evaluate seven formulations (Treatments), which consisted of an aflatoxin-free formulation and six formulations with 400 g kg-1 of aflatoxins. Of these, three formulations had the yeast strain Y1026 (at 0.5, 1.0 and 5.0%) and two had the strain Y904 (at 1% and 1%+1000ppm of methionine + 1000 ppm of cysteine). No statistical differences were observed for the food consumption, weights of the body organs, feed conversion and liver function between the animals fed the different treatments. Histopathological analysis revealed that animals fed aflatoxins diet without yeast cells had liver damage caused by the toxins and those that were fed aflatoxin-diet amended with yeast cells had less liver tissue damage. Therefore, the results obtained suggested that the presence of either yeast strain in the formulations caused a reduction in aflatoxicosis. The second study was conducted to investigate the effect of different dosages of the yeast strain Y1026 on the control of aflatoxicosis in rats. The bioassay was conducted with rats randomly placed in individual cages and fed seven different diets (7 treatments) for 60 days. These were an aflatoxin-free formulation and six others containing aflatoxins at 550 g kg-1, of which five had the yeast strain Y1026 (concentrations at 0.2; 0.5; 1.0; 2.0 and 5%). Feed conversion, liver functions indexes and liver tissue parameters were evaluated. The activity of the liver enzymes was greater in animals that fed the toxin-free diet when compared to other animals. Histopathological analysis showed that animals fed aflatoxin containing diets with and without 0.2 or 0.5% yeast cells showed clear signs of hepatotoxicity, while animals that were fed diets with higher concentrations of yeast cells had less liver tissue damage. The concentration of the yeast cells (Y1026) used in the formulations was correlated with the reduction of aflatoxicosis in Wistar rats. The third study fed Wistar rats an aflatoxin-free diet and diets with aflatoxins (at 500 g kg 1) and aflatoxin amended with a 1% concentration of the yeast strains Y1026 or Y904. In this study, six animals from each group fed the aflatoxin-diets were transferred to metabolic cages and received a single oral dose of AFB13H at 2Ci/animal. Three animals of each treatment were kept at the initial conditions and their liver tissues were used for histopathological analysis. Radiation levels in the animals were monitored at 12, 24, 48, 72, 96 and 120 h after receiving the labeled aflatoxin. Animals fed diets with active yeast cells had absorption, distribution and excretion levels of the labeled toxin different than those that did not receive the probiotic. Histopathological analysis showed that animals fed diets with yeast cells had less liver tissue damage while those fed the aflatoxin-diet had significantly higher liver damage. Therefore, these results indicate that active yeast cells have the ability to reduce aflatoxicosis and modify the absorption, distribution and excretion of radioactivity from AFB13H in Wistar rats.

Toxoplasma gondii é um protozoário formador de cistos capaz de infectar diversas espécies de aves e mamíferos domésticos e selvagens, incluindo o homem. Apesar de evidências sorológicas da infecção por T. gondii em animais selvagens, pouco se sabe sobre o papel da vida selvagem na cadeia epidemiológica e tampouco a susceptibilidade das variadas espécies a este parasito. O presente trabalho consistiu no isolamento e caracterização genotípica de T. gondii de tecidos de animais selvagens, de vida livre e de cativeiro, provenientes de diversas localidades do Brasil e na detecção sorológica de anticorpos contra o parasito nas amostras em que foi possível obter o soro. A sorologia foi realizada em 54 amostras de soros de aves e mamíferos de várias espécies por meio do Teste de Aglutinação Modificado (MAT). Deste total, 18 amostras (cinco de aves e 13 de mamíferos) foram positivas para anticorpos anti-T. gondii. Para o isolamento do parasito foi realizado o bioensaio em camundongos. Homogenados de coração e cérebro de cada um dos animais foram submetidos à digestão péptica e inoculados em grupos de cinco camundongos. Tecidos dos camundongos que vinham à óbito eram examinados para constatar a presença de formas de T. gondii. Seis semanas após inoculação, foi colhido sangue dos camundongos para a realização de testes sorológicos (MAT) para detecção de anticorpos anti-T. gondii e dois meses após a inoculação estes animais foram submetidos à eutanásia para a procura por cistos teciduais do parasito. Por meio desta prova biológica foi possível isolar T. gondii em 18 animais selvagens (16 de diversas espécies de mamíferos e duas de aves) provenientes de diferentes localidades. T. gondii foi isolado em uma coruja-buraqueira (Athene cunicularia), um pica-pau-de-banda-branca (Dryocopus lineatus), um gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus), um lobo-guará (Chrysocyon brachyurus), uma mucura (Didelphis marsupialis), uma paca (Cuniculus paca), três queixadas (Tayassu pecari), uma raposa-do-campo (Pseudalopex etulus), três tamanduás-mirim (Tamandua tetradactyla), três tatus-galinha (Dasypus novemcinctus) e dois tatuspeba (Eufractus sexcinctus). Dezesseis dos 18 isolados obtidos foram letais para 100% dos camundongos infectados. O isolado de um tatu-peba não causou mortalidade em camundongos e o isolado da coruja-buraqueira causou 50% de mortalidade. A caracterização genotípica dos isolados foi realizada pela técnica de PCR/RFLP utilizando 12 marcadores genotípicos. As amostras primárias dos tecidos provenientes dos animais selvagens que foram positivas na PCR de triagem também foram submetidas à caracterização genotípica. Por meio da PCR/RFLP foi possível obter o genótipo completo de 22 amostras, 15 delas provenientes de isolados e sete de amostras primárias de tecidos. Dos 18 isolados obtidos através do bioensaio, em três (tatu-peba, coruja-buraqueira e mucura) não foi possível obter a caracterização completa de todos os 12 marcadores utilizados. Pela análise das 22 amostras caracterizadas foram observados 17 genótipos diferentes, sendo que 13 deles são inéditos. A mortalidade de camundongos infectados foi comparada com a ocorrência dos diferentes alelos no marcador CS3 nos 15 genótipos provenientes de isolados, dos quais, sete apresentaram o alelo tipo I, seis o alelo tipo II e os alelos u-1 e u-3 foram encontrados em um isolado cada. Todos os isolados apresentaram 100% de mortalidade para os camundongos infectados. / Toxoplasma gondii is an intracellular protozoan parasite that infects almost all warmblooded animals, including humans. Although studies indicate that wild animals are frequently positive for antibodies anti-T. gondii, the role of wild life in the epidemiology of this parasite is not well understood nor the susceptibility of different wild species. The present study aimed to isolate T. gondii from free-living and captive wild birds and mammals from different locations from Brazil, to perform the genotipic characterization of T. gondii found in the analyzed tissue samples and to detect aintibodies anti-T. gondii in samples which were possible to obtain the serum. Serology was performed in 54 serum samples from different species of wild birds and mammals by the Modified Agglutination Test (MAT). From this total, 18 samples (five from birds and 13 from mammals) were seropositive for antibodies anti-T. gondii. For the isolation of the parasite, mice bioassay was performed. Brain and heart homogenates were submitted to peptic digestion and were inoculated in groups of five mice per animal sampled. Tissues of mice that died were examined for the presence of T. gondii. Mice were bled six weeks post-inoculation, and their sera were tested for anti-T. gondii antibodies by MAT. Surviving mice were euthanized two months after the inoculation and their brains were examined for the presence of T.gondii tissue cysts. T. gondii was isolated in 18 wild animals (16 from different species of mammals and two from birds) from different locations. T. gondii was isolated from one burrowing owl (Athene cunicularia), one lineated woodpecker (Dryocopus lienatus), three collared anteater (Tamandua tetradactyla), one hoary fox (Pseudalopex vetulus), one maned wolf (Chrysocyon brachyurus), one oncilla (Leopardus tigrinus), one opossum (Didelphis marsupialis), one paca (Cuniculus paca), three nine-banded armadillo (Dasypus novemcinctus), two six-banded armadillo (Euphractus sexcincticus) and three white-lipped peccary (Tayassu pecari). Sixteen of the 18 isolates were lethal to 100% of inoculated mice. The genotypic characterization was performed using 12 PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) Primary tissue samples which were positive in a trial PCR were also submitted to genotypic characterization. It was possible, by PCR/RFLP, to obtain the complete genotype of 22 samples, 15 from isolates and seven from primary tissue samples. It was not possible to accomplish the complete genotypic characterization in three isolates; one burrowing owl, one opossum and one sixbanded armadillo. In this 22 samples characterized, a total of 17 different genotypes were found with 13 of them described for the first time. Mortality of infected mice was compared between the different alleles of the marker CS3 in the 15 genotypes originated from isolates, which seven were type I, six were type II and alleles u-1 and u-3 were found in one isolate each. All the isolates presented 100% of mortality in infected mice.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 11099.pdf: 11463827 bytes, checksum: bb578b448e10132701e772d72317252f (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:36:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 03641.pdf: 1524540 bytes, checksum: 9eac945221973ca315eb33b118d750af (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:34:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:04:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente trabalho, a técnica de Espectroscopia de Correlação Angular Perturbada (CAP) foi usada para medir a interação de quadrupolo elétrico em amostras de DNA de diferentes linhagens de camundongos (A/J, C57BL/6, B6AF1, BXA1 e BXA2), amostras de antiimunoglobulinas pertencentes as subclasses (IgG1, IgG2a e IgG2b) e de porções ativas de imunoglobulinas fracionadas ou inteiras, correspondentes a parte diversificada da imunoglobulina, responsável pelo padrão de resposta imunológica apresentado pelos organismos. Também foram realizadas medidas da interação de quadrupolo elétrico em amostras de bases nitrogenadas do DNA (adenina, citosina, guanina e timina). As medidas CAP foram realizadas utilizando os núcleos de prova 111In111Cd; 111mCd111Cd; 111Ag111Cd; e 181Hf181Ta, nas temperaturas ambiente e do nitrogênio líquido para investigar as interações dinâmicas e estáticas, respectivamente. As biomoléculas foram marcadas por meio direto, onde os átomos dos núcleos de prova devem se ligar a um determinado sítio da biomolécula. Os materiais biológicos e os núcleos de prova foram escolhidos com o objetivo de verificar, em todos os seus aspectos, a possibilidade de aplicação da espectroscopia de CAP na investigação dos parâmetros hiperfinos em um núcleo de prova de um átomo metálico ligado às biomoléculas (incluindo o uso de diferentes núcleos de prova, resultantes do decaimento do núcleo pai de quatro diferentes metais) e estudar, por meio dos parâmetros hiperfinos medidos, o comportamento dessas diferentes moléculas. Os resultados obtidos mostram as diferenças entre a interação das biomoléculas estudadas com os núcleos de prova Estas diferenças foram observadas por meio de variações nos parâmetros hiperfinos medidos, que depende do tipo de molécula, mostrando que o núcleo de prova em alguns casos ligou-se as moléculas e em outros não houve esta ligação. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:08/00844-6

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 07430.pdf: 1129491 bytes, checksum: 0b39089585cf6b2242e38c4bb6ccf19e (MD5) / Dissertacao (Mestrado Profissionalizante em Lasers em Odontologia) / IPEN/D-MPLO / Intituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares, IPEN/CNEN-SP; Faculdade de Odontologia, Universidade de Sao Paulo

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:26:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Uma linhagem celular de CHO, previamente modificada geneticamente pela introdução de cDNA da 2,6 sialiltransferase de rato, gerou, pela primeira vez, um hTSH recombinante com sialilação humanizada (hlsr-hTSH), mais similar ao hormônio nativo, com 61% de ligação de ácido siálico na conformação 2,3 e 39%, na conformação 2,6. O clone mais produtivo, quando submetido à amplificação gênica com 8 M de metotrexato, apresentou um nível de secreção de aproximadamente 2 g de hTSH/106 células/dia, nível este útil para a purificação e caracterização do produto. A massa molecular relativa do heterodímero e das subunidades e do hlsr-hTSH purificado, determinada por espectrometria de massa MALDI-TOF, e a hidrofobicidade relativa, determinada por RP-HPLC, não apresentaram diferenças significativas com relação às preparações de hTSH recombinante derivadas de células CHO sem a modificação devida ao gene da 2,6 sialiltransferase. Entretanto, algumas diferenças foram observadas na composição dos N-glicanos, com mais estruturas tri- e tetra-sialiladas no hlsr-hTSH. O hlsr-hTSH mostrou-se eqüipotente (p>0,05) à preparação comercial de r-hTSH (Thyrogen) e 1,5 vezes mais potente do que a preparação nativa de hTSH (p<0,001), quando analisado por um bioensaio in vivo baseado na capacidade do TSH de estimular a liberação de T4. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:07:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Apesar dos constantes avanços no tratamento de câncer, essa doença continua sendo umas das principais causas de mortalidade no mundo todo, portanto, é imperativo que novas modalidades de tratamento sejam desenvolvidas. Venenos de serpentes causam uma variedade de efeitos biológicos, pois constituem uma mistura complexa de substâncias como disintegrinas, proteases (serino e metalo), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases entre outras. No presente trabalho pesquisou-se em alguns venenos de serpentes frações com atividade antitumoral, pois há relatos de compostos ofídicos que apresentam esta atividade. Após fracionamento de venenos de serpentes das famílias Viperidae e Elapidae foram feitas incubações das frações obtidas com células normais de fibroblasto L929 e de melanoma B16-F10. Os resultados mostraram que as frações do veneno da serpente Notechis ater niger apresentaram a maior especificidade e potencial antitumoral em células de melanoma murino B16-F10 que os demais venenos utilizados. Este achado, aliado ao fato de ser um veneno pouco explorado foram determinantes para que este veneno fosse selecionado para dar continuidade aos estudos. As frações citotóxicas deste veneno foram submetidas a análises para identificar e caracterizar os componentes que apresentaram esta atividade atitumoral. Ensaios de western-blot e zimografia sugerem que estas proteínas não pertencem à classe das metalo e serinoproteinases. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Neste trabalho foi desenvolvida pela primeira vez uma estratégia de purificação com duas etapas, uma cromatografia de troca iônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência em fase-reversa (RP-HPLC), para obter um hTSH derivado de CHO (r-hTSH-IPEN), que mostrou-se rápida e prática, permitindo um rendimento de 70% e uma pureza > 99%. Um aumento de ~60% na produtividade de r-hTSH-IPEN foi observado quando condições de cultura celular foram alteradas de 5% de CO2 para ar (0,03% CO2). A qualidade dos produtos obtidos em ambas as condições foi avaliada com relação à estrutura dos N-glicanos, aos isômeros de carga e à atividade biológica em comparação com a única preparação comercial conhecida (Thyrogen®) e com uma preparação de referência de origem hipofisária (p-hTSH) do National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, EUA). Os N-glicanos identificados nas preparações recombinantes foram do tipo complexo, apresentando estruturas bi-, tri- e tetra- antenárias, algumas fucosiladas, sendo 86-88% sialiladas com níveis variáveis. As três estruturas mais abundantes foram monosialiladas, representando ~69% de todas as formas identificadas nas três preparações. A principal diferença foi encontrada em termos de antenaridade, com 8-10% mais estruturas bi-antenárias na ausência de CO2 e 7-9% mais estruturas tri-antenárias na presença de CO2. No caso do p-hTSH foram identificadas estruturas do tipo complexo, com alta-manose e híbridas, a maioria delas contendo resíduos terminais de ácido siálico e/ou sulfato. As duas estruturas mais abundantes contem um ou dois resíduos de sulfato, sendo que no primeiro caso ele inesperadamente se liga a uma galactose. A porcentagem de ligação do ácido siálico à galactose nas conformações 2-3 e 2-6 foi de 68 ± 10% e 32 ± 10% respectivamente. Não foram observadas diferenças fundamentais nos isômeros de carga, nas três preparações recombinantes, os perfis da focalização isoelétrica mostrando seis bandas distintas no intervalo de pI de 5,39 a 7,35. Uma distribuição consideravelmente diferente, com várias formas na região ácida, foi observada, no entanto, para duas preparações hipofisárias. Uma bioatividade ligeiramente superior (p <0,02) foi encontrada para o r-hTSH-IPEN obtido na presença de CO2 quando as preparações foram analisadas com boa precisão por um simples bioensaio em dose única; esta atividade, no entanto, não é significativamente diferente da atividade do Thyrogen, as duas preparações sendo 1,6 e 1,8 vezes mais potentes do que a preparação de referência (p-hTSH). Podemos concluir que, pelo menos para o caso dos r-hTSH derivados de CHO, diferentes condições de cultivo não afetam significativamente as estruturas dos N-glicanos, distribuição de isómeros de carga ou atividade biológica. Thyrogen e r-hTSH-IPEN, quando comparados com p-hTSH-NIDDK, apresentaram cerca de 7% de aumento da massa molecular determinada por MALDI-TOF-MS. Esta técnica, que permite uma avaliação exata da massa do heterodímero, apresentou valores de MR de 29611, 29839 e 27829, respectivamente. Diferenças significativas foram encontradas entre o r-hTSH e o p-hTSH pelo que se refere às propriedades hidrofóbicas, avaliadas por RP-HPLC. Também foram observadas diferenças relacionadas à composição de carboidratos, principalmente de ácido siálico e galactose, tendo sido encontrado um menor teor destes resíduos no p-hTSH. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP