De nos jours, les biocapteurs électrochimiques constituent des outils rapides, fiables, rentables et sans marquage pour la détection sur site des polluants environnementaux et l’évaluation des critères de sécurité alimentaire et pour la détection des résidus militaires sur le terrain. Nous avons développé des biocapteurs d’affinité basés sur des récepteurs biologiques pour la détection électrochimique de l'estradiol dans des échantillons environnementaux et de molécules odorantes dans l'adultération de viande de porc. Des biocapteurs sensibles, sélectifs, rapides, simples reproductible, stables et efficaces ont été élaborés. En outre, une autre stratégie basée sur des nanomatériaux intégrés a été employée pour élaborer un capteur biomimétique pour la détection d’explosifs, qui a montré de bonnes qualités dans la protection de l'environnement. A la fin du manuscrit, certaines perspectives sont discutées / Nowadays, electrochemical biosensors are rapid, reliable, cost-effective and label-free tools for in field monitoring of environmental pollutants, for assessing the food safety criterion and for detection of the territory military residues. We developed biological receptors based affinity biosensors for electrochemical detection of estradiol in environment samples and odorant molecules in pork meat adulteration. The sensitive, selective, rapid, simple, repetitive, stable and effective biosensors were produced. In addition, another strategy entrapment based on integrated nano-material was used to produce a biomimetic sensor for explosives detection, which has shown good valuable in environmental protection and homeland security. In the end, certain significant prospective are discussed

Notre projet vise la conception d’un biocapteur ultra-sensible à base de bactéries pour la détection de métaux lourds (contrôle environnemental). Ces travaux concernent le développement de systèmes impédimétriques et à ondes acoustiques de Love, associés à une puce microfluidique et fonctionnalisés par des bactéries Escherichia coli immobilisées sur une multicouche de polyélectrolytes déposés par la méthode « Layer by Layer » . L’ étude fondamentale des interactions physiques-chimiques-biologiques mises en jeu lors des étapes de fonctionnalisation du capteur, et de son application à la détection de cadmium et de mercure, est également abordée, à travers le suivi en temps réel par le capteur acoustique, ainsi que par microscopie à force atomique en milieu sec ou liquide.Des seuils de détection inférieurs à 10-12M en quelques minutes ont été observés. / Our works aim the study of an ultra-sensitive bacteria-based biosensor for the detection of heavy metals (environmental control). They include the development of impedimetric and of Love acoustic wave devices, both associated with a microfluidic chip and functionalized with Escherichia coli immobilized on a polyelectrolyte multilayer deposited by the method "Layer by Layer." The theoretical study of physico-chemical interactions and biological phenomena involved during the steps of functionalization of the sensor surface, and during its application to the detection of cadmium and mercury, is also addressed through the real-time monitoring by the acoustic sensor and by atomic force microscopy in air or liquid medium. Detection threshold better than10-12M within only a few minutes have been observed.

Cette thèse porte sur l’étude des propriétés plasmoniques de réseaux nanostructurés dans le but de développer des applications de bioanalyse. L'intérêt de travailler avec ces structures est dû à leur grande sensibilité de surface, leur facilité de fabrication et leur simplicité d'analyse par spectrophotométrie en transmission. L'objectif était de fabriquer un dispositif capable d'effectuer du criblage à haut débit pour des fins biomédicales. Le premier objectif de la thèse porte sur l’étude des propriétés plasmoniques des réseaux de nanotrous. Une compréhension approfondie de ces structures a permis d’exploiter efficacement leur performance pour des applications de bioanalyse plasmonique. Une solution analytique fut établie pour étudier les modes de diffractions des polaritons de plasmons de surface d’onde de Bloch (BW-SPP). Cette équation a permis de corroborer les observations expérimentales avec des calculs théoriques par rapport au couplage plasmonique des réseaux de nanotrous. De plus, la variation de l'angle d'incidence a permis de déplacer la fréquence à laquelle les modes plasmoniques sont excités. Il était donc possible d'ajuster la position des BWSPP de façon à maximiser un couplage à une longueur d'onde désirée. Cet effet a été exploité avec la technique d'amplification de surface de diffusion Raman exaltée (SERS). Finalement, la sensibilité en surface de réseaux de nanotrous a été amplifiée selon l’angle d’excitation en transmission. Ce gain en sensibilité permet la détection de protéines d’IgG humain pour des basses concentrations de l’ordre du nanomolaire (nM). Le second objectif de la thèse traite du développement d’un lecteur multipuits couplé avec la technologie des réseaux de nanotrous afin de créer une plateforme de détection plasmonique pour du criblage à haut débit. Cet instrument offre une analyse en transmission d’échantillons nanostructurés à l’aide d’une plaque 96-puits pour des angles d’incidence allant jusqu’à 50°. Une nouvelle méthode de microfabrication de réseaux de nanotrous par photolithographie fut établie. Cette technique a permis de fabriquer des réseaux de nanotrous sur de grandes surfaces avec uniformité. L’efficacité du système fut démontrée pour la détection de protéines d’IgG humain, du méthotrexate (MTX) et le criblage d’anticorps de l’antigène prostatique spécifique (PSA). Le dernier volet de la thèse discute de l’étude des propriétés plasmoniques de réseaux de nanodisques recouverts d’un film d’or pour amplifier plus fortement la sensibilité des capteurs plasmoniques. Cette section de la thèse a démontré la performance des réseaux de nanodisques en tant que capteur plasmonique. En effet, les réseaux de nanodisques ont l’avantage d’exciter un mode de Bragg (BM, Bragg modes) en transmission directe générant une bande plasmonique fine ayant un facteur de mérite (FOM, figure of merit) élevé (sensiblité/réponse plasmonique). L’excitation de ces structures en transmission directe a simplifié énormément l’utilisation du robot multipuits par l’excitation à incidence normale tout en offrant une FOM supérieure aux réseaux de nanotrous. Pour continuer, des simulations 3D et une image Raman du signal SERS des structures ont démontré que le champ plasmonique des BM est grandement confiné autour des nanodisques. Ce confinement du champ plasmonique des réseaux de nanodisques à générer un facteur d’amplification SERS de l’ordre de 107. En somme, cette thèse démontre une étude des propriétés plasmoniques de réseaux nanostructurés pour des applications de bioanalyse par criblage à haut débit. Les études rapportées dans cette thèse ont prouvés que le champ plasmonique des réseaux de nanotrous peut être contrôlé afin d’amplifier leur sensibilité. De plus, la thèse rapporte la première plateforme de bioanalyse plasmonique utilisant un lecteur multipuits. Finalement, la fabrication de structures plasmoniques composés de nanodisques d’or a permis de mettre en évidence des propriétés optiques qui peuvent être mises à profit pour des mesures optiques ultras sensibles. / This thesis describes the plasmonic properties of nanostructured arrays towards development of biosensing applications. These structures exhibited several advantages such as high surface sensitivity, ease of microfabrication and simple excitation setup in transmission spectroscopy. The goal was to design a plasmonic device able to achieve high throughput analysis for biomedical purposes. The first section of the thesis covers a study of the plasmonic properties of nanohole arrays. An analytical solution was derived to assess plasmonic properties of the diffraction modes of Bloch-Wave surface plasmon polaritons (BW-SPP). Tuning of the excitation angle allowed for a precise control of the plasmonic signal’s position and an optimal coupling at a specific wavelength. This feature of nanohole arrays was demonstrated for applications in surface-enhanced Raman scattering (SERS). Finally, this section described the enhancement of the surface sensitivity of nanohole arrays through variation of the excitation angle in transmission. Such enhancement of the sensitivity allowed for detection of the concentration of human IgG proteins in the low nanomolar range. The second section of the thesis discusses the development of a multi-well plate reader coupled with the nanohole arrays technology. A custom-built plasmonic reader, designed at University of Montreal, allowed analysis of plasmonic structures in transmission with a 96-well plate for excitation where the incident angle is up to 50° relative to normal. A novel microfabrication technique of nanohole arrays, based on photolithography, is described. This technique allowed fabrication of nanohole arrays on a large scale with great surface uniformity. The performance of the plasmonic reader is demonstrated for sensing of human IgG proteins, methotrexate (MTX) and screening of prostate specific antigen (PSA) antibodies. The final section of the thesis describes studies on the plasmonic properties of nanodisk arrays coated with a gold film. This section described the performance of nanodisk arrays for plasmonic sensing. This structure benefited from the excitation of Bragg modes (BM) in direct transmission, which generated a sharp plasmonic band with a high figure of merit (FOM). The excitation of nanodisk arrays in direct transmission simplified the design of the plasmonic reader while providing a greater FOM than nanohole arrays. Furthermore, 3D simulations and a Raman image of the nanodisk arrays’ SERS intensity showed the confinement of the plasmonic field of the BM at the edges of the nanodisk. Such confinement of the plasmonic field of nanodisk arrays led to high SERS enhancements to a factor of 10^7. In summary, this thesis studied the plasmonic properties of nanostructured arrays towards development of applications for high throughput biosensing. These studies proved that the plasmonic field of nanohole arrays can be tuned to enhance their surface sensitivity. Furthermore, the thesis revealed the first plasmonic sensing platform using a multiwell plate reader. Finally, the thesis describes a novel plasmonic structure with outstanding optical properties; the gold coated nanodisk arrays.

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au développement d’un nouveau biocapteur enzymatique ultrasensible pour la détection conductimétrique d’une mycotoxine, l’ochratoxine A (OTA). Une peptidase, la thermolysine (TLN), a été choisie comme élément de reconnaissance. Le biocapteur proposé est basé sur l’immobilisation de la TLN dans une matrice d’alcool polyvinylique (PVA)/polyéthylènimine (PEI) contenant des nanoparticules d’or et réticulée à la surface de microélectrodes interdigitées à l’aide de vapeurs de glutaraldéhyde. Dans les conditions optimales (35 min de réticulation, mesure à pH 7 et 25°C), la réponse du biocapteur est linéaire jusqu’à 60 nM et la limite de détection est de 1 nM. Cette valeur est 700 fois plus basse que celle obtenue en utilisant une méthode d’immobilisation basée sur la co-réticulation de la TLN en présence d’albumine de sérum bovin (BSA). La matrice PVA/PEI crée un environnement aqueux favorable à l’enzyme. Par ailleurs, les interactions entre les groupements amines protonés du PEI et les charges négatives des nanoparticules citratées et de la TLN améliore leur dispersion dans la matrice et favorise la stabilisation de l’enzyme et son accessibilité au substrat (OTA). Le biocapteur conductimétrique développé est très reproductible et stable pendant 30 jours lorsqu’il est stocké à 4°C dans du tampon phosphate 20 mM pH7 entre 2 mesures. Le biocapteur a ensuite été évalué sur des échantillons d’huile d’olive commerciale dopée. Aucun prétraitement de l’échantillon n’a été nécessaire et des taux de recouvrement proches de 100% ont été obtenus, démontrant l’absence d’effet de matrice / A new ultrasensitive enzymatic biosensor for the direct conductometric detection of ochratoxin A (OTA) has been developed in this work. Thermolysin (TLN), a peptidase, was chosen as recognition element. The proposed biosensor is based on TLN immobilization into a polyvinyl alcohol (PVA)/polyethylenimine (PEI) matrix containing gold nanoparticles (AuNPs) and cross-linked at the surface of gold interdigitated microelectrodes using glutaraldehyde vapor. Under optimal conditions (35 min cross-linking time, working pH of 7 and temperature of 25◦C), the biosensor response was linear up to 60 nM OTA and the limit of detection was 1 nM. This value was 700 times lower than the detection limit obtained using the more classical method based on enzyme cross-linking in the presence of bovine serum albumin (BSA). PVA/PEI hydrogel creates a very favorable aqueous environment for the enzyme. In addition, interactions between protonated amino groups of PEI and negative charges of both citrated AuNPs and thermolysin improve their dispersion in the polymer blend, favoring enzyme stabilization and accessibility to the substrate (OTA). The developed OTA biosensor was very reproducible and stable over a 30 days period when stored at 4◦C in 20 mM phosphate buffer between two measurements. The method was further evaluated using commercial doped olive oil samples. No pretreatment of the sample was needed for testing and no matrix effect was observed. Recovery values were close to 100%, demonstrating the suitability of the proposed method for OTA screening in olive oil

Cette thèse vise à développer un capteur d’ions cuivre dans des échantillons humains tels que le plasma ou les urines où l’accumulation des ions induit la maladie de Wilson. Le manque d’outil de diagnostic efficace et non invasif rend cette maladie traitable, potentiellement fatale. Notre capteur, basé sur la technologie des transistors à effet de champ de type metal-oxide-semiconducteur, a l’originalité d’utiliser une monocouche de lipide de type DC8,9PC de 2.4 nm d’épaisseur comme diélectrique de grille. Nous démontrons dans cette thèse que ces lipides peuvent être chimiquement modifiés en de monocouches, à stabilité mécanique et électrique élevée, transformées en sondes spécifiques par greffage sur le groupement de tête des lipides d’une fonction chélatante spécifique aux ions cuivre. La monocouche lipidique est formée à la surface du canal semiconducteur du transistor par fusion vésiculaire et est stabilisée par réticulation des lipides suivant un protocole que nous avons développé. Dans une première partie, nous décrivons la fabrication du transistor ainsi que l’ingénierie chimique des lipides avec le chélateur. Des mesures, en solutions aqueuses contenant des ions cuivre et d’autres ions potentiellement compétiteurs, ont validé la sensibilité et la spécificité du capteur. La deuxième partie est dédiée à l’optimisation des monocouches en tant qu’isolants électriques stables. Nous introduisons dans cette thèse la notion de double polymérisation des lipides dans la monocouche avec réticulation des chaînes aliphatiques et des groupements de tête. Nous démontrons que celle-ci conduit à l’amélioration drastique des propriétés mécaniques et électriques des monocouches. / This thesis aims at developing a sensor for the detection of Cu2+ in human samples such as urine. Copper is an ion of pathological interest in the body and its accumulation in tissues is responsible for the Wilson disease. While the disease can be effectively treated, the lack of efficient and non-invasive diagnosis techniques makes it potentially deadly. Our project aims for developing an efficient, sensitive, specific, and low cost sensor device based on metal-oxide-semiconductor field effect transistor technology and has the originality of using a 2.4 nm thick monolayer of DC8,9PC lipids as gate dielectric. We demonstrate that such lipids can be chemically engineered to allow the fabrication of monolayers with high mechanical and electrical stability and to confer them specific probe function. Specificity of the sensor is given by the grafting of a copper specific chelator to the lipids head-groups. The lipid monolayer is formed on the transistor semiconducting channel by the vesicle fusion. In the first part of the thesis, we describe the fabrication of the transistor including the chemical engineering of the lipids with the chelator. Sensitivity and specificity measurements were realized in aqueous solutions containing copper ions and potentially competitive ions. The second part is dedicated to improving the performances of the lipid monolayer as a stable insulator. We introduce in this thesis the concept of double polymerization of the lipids in the monolayer with a reticulation at both the levels of their aliphatic chains and their head-groups. We demonstrate that that leads to drastic improvements of both the mechanical and electrical properties of the monolayer.

Malgré le nombre croissant de capteurs dans les domaines de la chimie et la biologie, de nombreuses réactions n’ont pas encore été correctement identifiées et étudiées. C’est entre autres le cas des interactions intermoléculaires à l’interface liquide/solide trouvées dans les chimies de surface utilisées pour les méthodes de diagnostics médicaux et l’identification de divers processus biologiques. Afin de correctement comprendre les mécanismes en jeux, il est important de pouvoir croiser différentes méthodes de détection pour obtenir des informations complémentaires.MuLe principal objectif de cette étude est de dimensionner, fabriquer et caractériser un détecteur optique intégré sur verre basé sur la résonance plasmonique de surface, destiné à terme à être combiné avec d’autres techniques de détection. La résonance plasmonique de surface est une technique reconnue pour sa sensibilité adaptée à la détection de surface, qui a l’avantage d’être sans marquage et permet de fournir un suivi en temps réel de la cinétique d’une réaction. L’avantage principal de ce capteur est qu’il a été dimensionné pour une large gamme d’indice de réfraction de l’analyte, allant de 1,33 à 1,48. Ces valeurs correspondent à la plupart des entités biologiques associées à leurs couches d’accroche, particulièrement les matrices de polymères. Ces matrices sont de plus en plus utilisées non seulement pour leur capacité à augmenter la densité d’analytes présents à la surface du capteur, mais aussi pour leurs propriétés favorisant l’adsorption spécifique et leur utilisation comme élément actif de reconnaissance biologique.Étant donné que beaucoup d’études biologiques nécessitent la comparaison de la mesure à une référence ou à une autre mesure, le second objectif du projet est d’étudier le potentiel du système SPR intégré sur verre pour la détection multianalyte.MuLes trois premiers chapitres se concentrent sur l’objectif principal du projet. Le dimensionnement du dispositif suivant un cahier des charges préétabli est présenté, ainsi que les outils de simulation. Le procédé de fabrication de la puce optique sur verre est ensuite décrit, ainsi que les instruments et protocoles de caractérisation. Une comparaison est faite entre les simulations et les résultats expérimentaux, et les performances des outils numériques ainsi que celles du dispositif sont évaluées.Le dernier chapitre de la thèse présente l’étude de plusieurs techniques de multiplexage spectral adaptées à un système SPR intégré, exploitant en particulier la technologie sur verre. L’objectif est de fournir au moins deux détections simultanées. Dans ce cadre, plusieurs solutions sont proposées et les dispositifs associés sont dimensionnés, fabriqués et testés. / In spite of the growing number of available biosensors, many biochemical reactions and biological components have not yet been studied in detail. Among them, some require the combination of several detection techniques in order to retrieve enough information to characterize them fully. An unknown reaction based, for example, on DNA hybridization could be characterized with an electrochemical sensor, a mechanical sensor and an optical sensor, each giving a different type of information.MuThe main objective of the work presented here is to design, fabricate and characterize a flexible integrated optical biosensor based on surface plasmon resonance, intended to be then combined with other detection techniques. Surface Plasmon Resonance (SPR) is well known to be a sensitive technique for surface-based biochemical detection. It has the advantage to be an unlabeled method and provides real time information on the kinetics of a reaction. The use of an integrated technology enables us to integrate several sensors on the same chip for the same sample, making them compact and low-cost. The flexibility of the proposed SPR biosensor comes from the fact that it is designed for a large range of analyte refractive indices, from 1.33 to 1.48 in the 600 nm-1000 nm wavelength range. These values are suitable for most biological entities and their ligand layers, and especially for hydrophilic polymer matrices used to trap DNA or protein entities. These biochemical matrices are used more and more for their ability to trap high densities of analyte, provide a strong binding and serve as an active detection medium with good anti-fouling properties.MuAs several biochemical studies require the simultaneous comparison of measurements to a reference or to another measurement, the second objective of this project is to study the potential of multianalyte detection in an integrated SPR device on glass.The first three chapters of the thesis are focused on the main objective. The design according to predefined specifications is presented, at the same time as the simulation tools. The fabrication process of the glass chip is introduced, as well as the characterization instruments and protocols. Simulation and experimental results are then compared, and the device performance is assessed.The last chapter describes the study of several spectral multiplexing techniques adapted to an integrated SPR system using the glass technology. The goal is to provide at least two simultaneous measurements. Several detection techniques are examined and the related devices are designed, fabricated and characterized.

L'encapsulation de protéines pose de nombreuses difficultés liées à leurs propriétés physicochimiques, leur sensibilité aux conditions environnementales et opératoires. La structure 3D spécifique de chaque protéine étant directement liée à son activité biologique, un contrôle de l'intégrité protéique est indispensable pour assurer l'efficacité et la sécurité des systèmes formulés. Dans cet optique, l'encapsulation par émulsion multiple a été appliquée à une protéine modèle : la myoglobine (Mb). Le but de cette thèse a été l'étude du procédé d'encapsulation à travers 3 objectifs. Le premier fut d'étudier l'influence de paramètres de formulation sur les propriétés des particules obtenues et sur la conformation de la Mb. Les mesures en spectrométrie UV/Vis. et le calcul des principaux rapports d'absorbance ont constitué une méthode de contrôle fiable et rapide. Le second fut de valider la pertinence et de montrer les limites de cette méthode en la comparant à une seconde méthode utilisant des mesures conductimétriques. Enfin, l'étape de solidification des particules par élimination du solvant ainsi que le changement de solvant ont été étudiés.. Des microsphères creuses de 15μm avec un rendement d'encapsulation de 36% ont pu être obtenues tout en maintenant la conformation native de la Mb. L'emploi de polymère de masse moléculaire élevée et un taux d'élimination de solvant trop rapide sont 2 paramètres altérants significativement la protéine. Ces travaux ouvrent la voie au développement de transporteurs d'O2 utilisables par exemple dans le cas de pathologies musculaires / Protein encapsulation results in several problems related to their physicochemical properties, their sensitivity to environmental conditions and operating procedures. The specific 3D structure being directly linked to their biological activity, monitoring of protein integrity is crucial to ensure the efficacy and security of formulations. In this context, the multiple emulsion method was applied to a model protein: myoglobin (Mb). The aim of this thesis was to study the encapsulation process through 3 objectives. The first was to study the influence of formulation parameters on the particle properties and the conformation of Mb. Measurements by UV/Vis. spectrometry and calculation of key absorbance ratios established a reliable and rapid method for protein monitoring. The second was to validate the pertinence and show the limits of this method by comparing it to a second one using conductimetry measurements. Finally, the particle solidification by solvent removal and the solvent exchange were studied. The process maintains the Mb native conformation in Hollow microspheres of 15μm in diameter and an encapsulation efficiency of 36% were obtained, while keeping intact the Mb native conformation. The use of high molecular weight polymer and a fast solvent removal rate are 2 parameters inducing significant protein alteration. This work paves the way for the development of O2 carriers for muscular diseases for example

L’objectif de cette thèse, dans le cadre de l'ANR TRICETOX (CESA, 2013-2017), était de développer des méthodes alternatives aux méthodes d’analyse chimiques classiques pour la détection spécifique des herbicides de la famille des β-tricétones. Ces nouveaux outils analytiques doiventt être faciles à utiliser, rapides, peu coûteux et devant répondre aux exigences imposées pour la détection de ces herbicides (valeur critique de 0,1 µg.L-1). Les β-tricétones ont pour cible spécifique l'enzyme p-HydroxyPhénylPyruvate Dioxygénase (HPPD), impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes, son inhibition entraîne un blanchiment des feuilles des plantes traitées. Deux stratégies ont été envisagées, basées sur l’inhibition de l’HPPD : un bio-essai colorimétrique à cellules entières utilisant un clone recombinant d'Escherichia coli exprimant l’HPPD d’Arabidopsis thaliana, et un biocapteur enzymatique à transduction électrochimique. Le principe du bio-essai repose sur la capacité du clone recombinant à produire un pigment brun à partir de la voie de catabolisme de la tyrosine. L’addition de β-tricétones entraîne une diminution de la pigmentation dans le milieu. Après optimisation des conditions opératoires, les LODs obtenues pour la mésotrione, la tembotrione, la sulcotrione et la leptospermone sont de 0,069, 0,051, 0,038 et 20 μM, respectivement. En format biocapteur, l'enzyme HPPD purifiée a été immobilisé sur la surface d’une électrode de graphite sérigraphiée. Le biocapteur à enzyme libre a permis l’obtention de limites de détection de 1,36-10 M, 1,25.10-11 M et 1,08.10-11 M pour la sulcotrione, la tembotrione et la mésotrione, respectivement. A ce jour, des échantillons réels ont été analysés sur le bio-essai et les résultats ont été validés par HPLC. / The goal of this thesis, in the frame of the ANR TRICETOX (CESA, 2013-2017), was to develop some alternative methods to conventional chromatographic methods for the monitoring of the β-triketone herbicides. These new analytical tools have to be easy to handle, fast, low-cost, and to respond to the requirements for the detection of these herbicides (critical value of 0.1 μg.L-1). The β-triketones specifically target the 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) enzyme, involved in the carotenoids biosynthesis in plants ; its inhibition results in foliage bleaching of the treated plant. Two strategies have been considered, both based on the HPPD inhibition : a whole-cell colorimetric bioassay involving a recombinant E. coli expressing the HPPD from A. thaliana, and an electrochemical enzymatic biosensor. The principle of the bioassay is based on the ability of the recombinant E. coli clone to produce a soluble brown pigment from tyrosine catabolism. The addition of β-triketone induces the decrease of the pigment production in the medium. After optimization of the operational conditions, the LODs obtained for mesotrione, tembotrione, sulcotrione, and leptospermone were 0.069, 0.051, 0.038, and 20 μM, respectively. In the biosensor format, the purified HPPD enzyme was immobilized on the surface of a screen-printed graphite electrode. Using the free enzyme biosensor, LODs as low as 1.36-10 M, 1.25.10-11 M and 1.08.10-11 M were obtained for sulcotrione, mesotrione and tembotrione, respectively. Up to date, real samples have been analyzed using the bioassay and the results were validated by HPLC.

La phophomannose isomérase de type I (PMI), une métalloenzyme à zinc, et la phosphoglucose isomérase (PGI), catalysent l’isomérisation réversible du β-D-fructose-6-phosphate (F6P), respectivement en β-D-mannose-6-phosphate (M6P) et en α-D-glucose-6-phosphate (G6P). Ces deux enzymes sont des cibles thérapeutiques potentielles. La phosphoglucose isomérase humaine (hPGI), connu également sous le nom de facteur de motilité autocrine (AMF), stimule, en plus de son activité glycolytique intracellulaire, la migration des cellules in vitro et le développement de métastases in vivo. D'autre part, Candida albicans est la principale levure impliquée en pathologie humaine. Ces dernières années, un problème de résistance du germe aux antifongiques classiques est apparu. En conséquence, la recherche se dirige vers de nouvelles cibles thérapeutiques, dont la PMI de C. albicans (CaPMI) qui joue un rôle important dans la biosynthèse de structures mannosylées nécessaires à la survie du pathogène. Les réactions catalysées par ces deux enzymes mettent en jeu le même intermédiaire de haute énergie (IHE) de type 1,2-cis-ènediolate, sauf qu’il est coordiné au zinc dans le cas de la PMI. La surexpression ainsi que la purification de CaPMI et de hPGI ont été réalisées au laboratoire. Une petite chimiothèque a été créée à partir du 5-phospho-D-arabinono-1,4-lactone (5-PAL) en modulant la partie tête de l’IHE. Un groupe chélatant du zinc (zinc binding group, ZBG) a été introduit dans plusieurs composés dans le but d’inhiber sélectivement CaPMI. De plus, deux composés possédant en partie tête une fonction amine terminale ont été synthétisés pour inhiber spécifiquement la PGI humaine en ciblant un résidu glutamate du site actif de l'enzyme (Glu357). Toutes ces molécules ont d’abord été testées sur la PGI du muscle de lapin et la PMI de E. coli commerciales, et par la suite sur la CaPMI et la hPGI surexprimées. Une série de bons voire très bons inhibiteurs de hPGI, et donc potentiellement anti-métastatiques, a été découverte. Ces composés ne sont cependant pas inhibiteurs de la CaPMI. Deux structures tridimensionnelles à haute résolution de complexes enzyme-inhibiteur ont été obtenues. Au delà des aspects thérapeutiques, mécanistiques et structuraux, un biocapteur électrochimique à base d'un des inhibiteurs synthétisés a été réalisé pour la détection de hPGI qui est un biomarqueur validé de cancers métastatiques. Ce biocapteur a démontré une limite de détection de 43 fM dans du tampon phosphate (PBS). / Phosphoglucose isomerase (PGI) and type I phosphomannose isomerase (PMI), a zinc metalloenzyme, catalyze the reversible isomerization of β-D-fructose 6-phosphate (F6P) to α-D-glucose 6-phosphate (G6P) and β-D-mannose 6-phosphate (M6P), respectively. These two enzymes are potential therapeutic targets. Human PGI (hPGI) often called as AMF-PGI (autocrine motility factor-PGI), in addition to its intracellular glycolytic activity, stimulates cell migration in vitro and metastasis in vivo. Inhibition of its extracellular activity is obviously interesting in oncology. On the other hand, Candida albicans is the main yeast involved in human pathology. During recent years, resistance of this pathogenic fungus to conventional antifungal drugs appeared. Consequently, research is moving towards new therapeutic targets, including C. albicans PMI (CaPMI) that plays an important role in the biosynthesis of mannosylated structures required for pathogen survival. The reactions catalyzed by these two enzymes involve the same high energy intermediate (HEI) type 1,2-cis-enediolate, except that it is coordinated to the zinc active site in the case of PMI. Overexpression and purification of both CaPMI and hPGI were performed in our laboratory. A small chemical library was created from the synthon 5-phospho-D-arabinono-1,4-lactone (5-PAL) by modulating the head part of the HEI. A zinc binding group (ZBG) was introduced in several compounds in order to selectively inhibit the CaPMI enzyme. Moreover, two compounds with a terminal amine function were designed to selectively inhibit hPGI by targeting a glutamate residue of the enzyme (Glu357). All these molecules were first tested on rabbit muscle PGI and PMI from E. coli, and later on CaPMI and hPGI. None of these compounds are good inhibitors of CaPMI. However, a series of strong inhibitors of hPGI, and therefore potentially anti-metastatic drugs, was discovered. High-resolved 3D structures of the two enzymes complexed with inhibitors have been successfully obtained. Beyond the therapeutic, mechanistic and structural aspects, an electrochemical biosensor based on one of the synthesized inhibitors was carried out for the detection of hPGI, which is a validated biomarker of metastatic cancers. This biosensor demonstrated a detection limit of 43 fM in phosphate buffer (PBS).

L'électroporation est un procédé physique qui consiste à appliquer des impulsions de champ électrique pour perméabiliser de manière transitoire ou permanente la membrane plasmique. Ce phénomène est d'un grand intérêt dans le domaine clinique ainsi que dans l'industrie en raison de ses diverses applications, notamment l'électrochimiothérapie qui combine les impulsions électriques à l'administration d'une molécule cytotoxique, dans le cadre du traitement des tumeurs. L'analyse de ce phénomène est traditionnellement réalisée à l'aide des méthodes optique et biochimique (microscopie, cytométrie en flux, test biochimique). Elles sont très efficaces mais nécessitent l'utilisation d'une large gamme de fluorochromes et de marqueurs dont la mise en œuvre peut être laborieuse et coûteuse tout en ayant un caractère invasif aux cellules. Durant ces dernières années, le développement de nouveaux outils biophysiques pour l'étude de l'électroporation a pris place, tels que la diélectrophorèse et la spectroscopie d'impédance (basse fréquence). Outre une facilité de mise en œuvre, ces méthodes représentent un intérêt dans l'étude des modifications membranaires de la cellule. De là vient l'intérêt d'opérer au-delà du GHz, dans la gamme des micro-ondes, pour laquelle la membrane cytoplasmique devient transparente et le contenu intracellulaire est exposé. L'extraction de la permittivité relative suite à l'interaction champ électromagnétique/cellules biologiques reflète alors l'état cellulaire. Cette technique, la spectroscopie diélectrique hyperfréquence, se présente comme une méthode pertinente pour analyser les effets de l'électroporation sur la viabilité cellulaire. De plus, elle ne nécessite aucune utilisation des molécules exogènes (non-invasivité) et les mesures sont directement réalisées dans le milieu de culture des cellules. Deux objectifs ont été définis lors de cette thèse dont les travaux se situent à l'interface entre trois domaines scientifiques : la biologie cellulaire, l'électronique hyperfréquence et les micro-technologies. Le premier objectif concerne la transposition de l'électroporation conventionnelle à l'échelle micrométrique, qui a montré une efficacité aussi performante que la première. La deuxième partie du travail concerne l'étude par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules soumises à différents traitements électriques (combinés ou non à une molécule cytotoxique). Ces travaux présentent une puissance statistique et montrent une très bonne corrélation (R2 >0 .94) avec des techniques standards utilisées en biologie, ce qui valide 'biologiquement' la méthode d'analyse HF dans le contexte d'électroporation. Ces travaux montrent en outre que la spectroscopie diélectrique hyperfréquence s'avère être une technique puissante, capable de révéler la viabilité cellulaire suite à un traitement chimique et/ou électrique. Ils ouvrent la voie à l'analyse 'non-invasive' par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules électroporées in-situ. / Electroporation is a physical process that consists in applying electric field pulses to transiently or permanently permeabilize the plasma membrane. This phenomenon is of great interest in the clinical field as well as in the industry because of its various applications, in particular electrochemotherapy which combines electrical pulses with the administration of a cytotoxic molecule in the treatment of tumors. The evaluation of this phenomenon is raditionally carried out using optical and biochemical methods (microscopy, flow cytometry, biochemical test). They are very effective but require the use of a wide range of fluorochromes and markers, which can be laborious and costly to implement, while being invasive to the cells. In recent years, the development of new biophysical tools for the study of electroporation has taken place, such as dielectrophoresis and impedance spectroscopy (low frequency). In addition to the ease of implementation, these methods are of interest in the study of membrane modifications of the cell. Hence the advantage of operating beyond the GHz, in the range of microwaves, for which the cytoplasmic membrane becomes transparent and the intracellular content is exposed. The extraction of the relative permittivity as a result of the electromagnetic field / biological cell interaction then reflects the cell state. This technique, microwave dielectric spectroscopy, is a relevant method for analyzing the effects of electroporation on cell viability. Moreover, it does not require any use of the exogenous molecules (non-invasive) and the measurements are directly carried out in the culture medium of the cells. Two objectives were defined during this thesis whose work is located at the interface between three scientific fields: cellular biology, microwave electronics and micro-technologies. The first objective concerns the transposition of conventional electroporation to the micrometric scale, which has shown an efficiency as efficient as the first. The second part of the work concerns the study by HighFrequency dielectric spectroscopy of cells subjected to different electrical treatments (combined or not with a cytotoxic molecule). This work presents a statistical power and shows a very good correlation (R2> 0.94) with standard techniques used in biology, which biologically validates the HF analysis method in the context of electroporation. This work also shows that microwave dielectric spectroscopy proves to be a powerful technique capable of revealing cell viability following chemical and / or electrical treatment. They open the way to 'non-invasive' analysis by hyper-frequency dielectric spectroscopy of electroporated cells in situ.