The objective of this study was to evaluate the antimicrobial and anti-caries effects of two plant extracts. The first chapter dealt with a review of the literature whose objective was to discuss the antimicrobial potential of Brazilian natural agents on the biofilm related to dental caries and gingivitis/periodontal disease. The research of the articles was carried out using PubMed. We found a total of 23 papers. Most of the studies were performed using planktonic microorganisms or under clinical trials. Nineteen articles were focused on cariogenic bacteria. From these nineteen articles, eleven were also about periodontopathogenic bacteria. Four studies addressed only periodontopathogenic bacteria. The most tested Brazilian natural agents were green propolis, essential oils of Lippia sidoides and Copaifera sp. Most of the tested agents showed similar results when compared to positive control (essential oils and extracts) or better effect than negative control (green propolis). More studies involving protocols closer to the clinical condition and the use of response variables that allows understanding the mechanism of action of natural agents are necessary before the incorporation of these natural agents into dental products. The second chapter aimed to test the effect of the hydroalcoholic extracts of Myracrodruon urundeuva All. and Qualea grandiflora Mart. leaves on the viability of the microcosm biofilm and on the prevention of enamel demineralization. The microcosm biofilm was produced on bovine enamel, using human saliva pool mixed with McBain saliva (0.2% sucrose) for 14 days. The biofilm was treated daily with the extracts for 1 min. M. urundeuva at 100, 10 and 0.1 g/ml and Q. grandiflora at 100 and 0.1 g/ml reduced cell viability similarly to the positive control and significantly more than negative control. M. urundeuva at 1000, 100 and 0.1 g/ml were able to reduce the counting formation unit-CFU counting of lactobacilli sp. and Streptococcus mutans, while Q. grandiflora at 1000 and 1.0 g/ml significantly reduced the S. mutans CFU counting. On the other hand, the natural extracts did not reduce the production of extracellular polyssacharides, lactic acid and the development of enamel caries lesions. The third chapter aimed to evaluate the effect of hydroalcoholic extracts of M. urundeuva and Q. grandiflora (alone or combined) on the viability of S. mutans biofilm and the prevention of enamel demineralization. S. mutans strain (ATCC 21175) was reactivated in BHI broth. Minimum inhibitory concentration, minimum bactericidal concentration, minimum biofilm inhibitory concentration and minimum biofilm eradication concentration were determined to choose the concentrations to be tested under the biofilm model. S. mutans biofilm (5x105 CFU/ml) was produced on bovine enamel using McBain saliva with 0.2% sucrose for 3 days. The biofilm was treated daily with the extracts for 1 min. M. urundeuva (isolated or combined) at concentrations equal or higher than 0.625 mg/ml was able to reduce the bacteria viability, whereas Q. grandiflora extract alone showed antimicrobial effect at 5 mg/ml only (p<0.05). On the other hand, none of the extracts was able to reduce the development of enamel caries lesions. Despite the tested natural extracts have antimicrobial effect; they are unable to prevent caries in enamel. / O objetivo foi avaliar os efeitos antimicrobiano e anti-cárie de dois extratos de plantas. O primeiro capítulo se referiu a uma revisão da literatura cujo objetivo foi discutir o potencial antimicrobiano dos agentes naturais brasileiros sobre o biofilme relacionado à cárie dentária e à gengivite/doença periodontal. A pesquisa dos artigos foi realizada usando o PubMed. Foram encontrados 23 trabalhos. A maioria dos estudos foi realizada utilizando microorganismos na fase planctônica ou ensaios clínicos. Dezenove artigos foram focados em bactérias cariogênicas. Dos dezenove artigos, onze também eram sobre bactérias periodontopatogênicas. Quatro estudos abordaram apenas bactérias periodontopatogênicas. Os agentes naturais brasileiros mais testados foram própolis verde, óleos essenciais de Lippia sidoides e Copaifera sp. Os agentes testados apresentaram resultados similares quando comparados ao controle positivo (óleos essenciais e extratos) ou melhor efeito que o controle negativo (própolis verde). Mais estudos próximos da condição clínica e o uso de variáveis de resposta que permitam entender o mecanismo de ação são necessários, para permitir a incorporação desses agentes naturais em produtos odontológicos. O segundo capítulo teve como objetivo testar o efeito dos extratos hidroalcoólicos de Myracrodruon urundeuva All. e Qualea grandiflora Mart. sobre a viabilidade do biofilme microcosmo e na prevenção da desmineralização do esmalte. O biofilme microcosmo foi produzido em esmalte bovino, utilizando pool de saliva humana misturada à saliva de McBain (0,2% de sacarose) durante 14 dias. O biofilme foi tratado diariamente com os extratos durante 1 min. M. urundeuva a 100, 10 e 0,1 g/ml e Q. grandiflora a 100 e 0,1 g/ml reduziram a viabilidade dos microrganismos de forma semelhante ao controle positivo e significativamente maior do que o controle negativo. M. urundeuva a 1000, 100 e 0,1 g/ml foi capaz de reduzir a contagem de Unidade formadora de colônia-UFC para Lactobacilos totais e Streptococcus mutans, enquanto a Q. grandiflora a 1000 e 1,0 g/ml reduziu significativamente a contagem de UFC para S. mutans. Os extratos naturais não conseguiram reduzir a produção de polissacarídeos extracelulares-PEC, ácido lático e o desenvolvimento da lesão cariosa em esmalte. O terceiro capítulo teve como objetivo avaliar o efeito dos extratos hidroalcoólicos de M. urundeuva. e Q. grandiflora (sozinhos ou combinados) sobre a viabilidade do biofilme de S. mutans e na prevenção da desmineralização do esmalte. Cepa de S. mutans (ATCC 21175) foi reativada em caldo BHI. Concentração inibitória mínima, concentração bactericida mínima, concentração inibitória mínima de biofilme e concentração de erradicação mínima de biofilme foram determinadas para escolher as concentrações a serem testadas sob o modelo de biofilme. O biofilme de S. mutans (5x105 CFU/ml) foi produzido em esmalte bovino, utilizando saliva de McBain com 0,2% de sacarose durante 3 dias. O biofilme foi tratado diariamente com os extratos durante 1 min. M. urundeuva (isolada ou combinada) nas concentrações iguais ou superiores a 0,625 mg/ml foi capaz de reduzir a viabilidade das bactérias, enquanto que o extrato da Q. grandflora apresentou efeito antimicrobiano somente a 5 mg/ml (p<0,05). Nenhum dos extratos reduziu o desenvolvimento da lesão da cárie. Apesar dos extratos naturais terem efeito antimicrobiano, são incapazes de prevenir o desenvolvimento da lesão cariosa em esmalte.

La formation de biofilms bactériens pathogènes est un problème important, particulièrement dans les secteurs médicaux et agro-alimentaires. La formation contrôlée de biofilms de la bactérie probiotique Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) est sélectionnée ici comme méthode potentielle pour prévenir la contamination de surfaces par des bactéries pathogènes. Nous avons étudié le développement de biofilms de LGG ainsi que leur possible contrôle en combinant des approches physico-chimiques et de fonctionnalisation de surface. L’impact des conditions environnementales sur la cinétique de croissance des biofilms et sur leur composition biochimique a été analysé par des mesures in situ et en temps réel par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier en réflexion totale atténuée (ATR-FTIR) sous conditions de flux. Ces données ont été complétées par des images de microscopie en épifluorescence permettant d’obtenir des informations sur la distribution et la forme des cellules bactériennes sur la surface à des étapes clé du développement du biofilm. Compatible avec les mesures ATR-FTIR, un cristal de séléniure de zinc a été choisi comme substrat, nu ou fonctionnalisé avec des monocouches auto-assemblées d’alcane-thiols (SAMs). Différents groupes fonctionnels ont été étudiés : méthyl (-CH3), hydroxyle (-OH) ou amine (-NH2) pour obtenir respectivement des substrats hydrophobe, hydrophile ou chargé positivement. La cinétique d’auto-assemblage des SAMs, leur organisation et l’énergie de surface ont été étudiées en combinant ATR-FTIR, spectroscopie de rétrodiffusion de Rutherford à hautes énergies et mesures d’angles de contact. L’analyse des spectres ATR-FTIR des biofilms de LGG enregistrés in situ et en temps réel pendant 24 heures a montré un rôle important du milieu nutritif sur la composition biochimique et le métabolisme bactériens. Les propriétés du substrat ont un impact faible sur la composition biochimique des biofilms, mais ont un rôle crucial sur leur force d’attachement à la surface. Ce travail pluridisciplinaire a fourni des informations sur l’influence de l’environnement, et particulièrement des caractéristiques du support, sur les propriétés des biofilms aux échelles moléculaire et cellulaire. La méthodologie développée dans ce travail peut notamment être utilisée dans la recherche des conditions les plus favorables à la croissance des biofilms de bactéries probiotiques. / Biofilm formation by pathogenic bacteria brings concerns, particularly in food and medical sectors, and is associated with high sanitary risks and economic losses. Biofilms of probiotic bacteria can potentially be used to prevent the surface contamination by pathogenic species. This work was focused on the investigation of the development of biofilms of probiotic Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and the possible control of their formation by combining surface functionalisation and physico-chemical approaches. The effect of different environmental conditions on the kinetics of the biofilm growth and on its biochemical composition was analysed by in situ and real time measurements with infrared spectroscopy in attenuated total reflection mode (ATR-FTIR) under flow conditions. These data were complemented by epifluorescence images providing information on the surface distribution and the shape of the bacterial cells at specific stages of the biofilm development. Compatible with ATR-FTIR measurements, a zinc selenide (ZnSe) crystal was chosen as a substrate, bare or functionalised with self-assembled monolayers (SAMs). SAMs were formed from alkanethiols terminated by methyl (-CH3), hydroxyl (-OH) or amine (-NH2) groups to obtain hydrophobic, hydrophilic and positively charged substrates, respectively. The kinetics of self-assembly of the alkanethiols onto ZnSe, the organisation of the molecules, their areal density and the surface energy of thus obtained surfaces were studied preliminarily to the biofilm cultivation by means of ATR-FTIR spectroscopy, high energy Rutherford backscattering spectrometry, and contact angle measurements. The analysis of the ATR-FTIR spectra of LGG biofilms recorded in situ and in real time during 24 hours revealed an important role of the nutritive medium in the biosynthesis of nucleic acids, phospholipids, polysaccharides and lactic acid. Substrate properties had low impact on the biochemical composition of LGG biofilms, but had a critical role in the strength of attachment of cultivated biofilms. The findings of this multidisciplinary work provide a fundamental understanding of how the direct environment, including a support surface, influences the properties of bacterial biofilms at the molecular and cellular scales, based on which favourable conditions for the enhancement of probiotic biofilm growth and its mechanical stability can be chosen.

Les infections nosocomiales liées aux dispositifs médicaux, et plus particulièrement ceux de la perfusion, sont un problème majeur dans le milieu hospitalier. Ces infections sont liées à la présence de biofilm. Pour lutter contre le biofilm, les mesures préventives en hygiène ne sont pas suffisantes. Les recherches se dirigent vers la modification des surfaces des matériaux des dispositifs médicaux: ajout de substances biocides, développement de surfaces antiadhésives par voie chimique ou topographique. L’objectif de cette thèse est de créer des polymères nanostructurés pouvant entrer dans la composition de dispositifs médicaux de la perfusion et de tester leur impact sur l’adhésion bactérienne et le développement du biofilm. Dans un premier temps, la technique de nanostructuration choisie repose sur la réplication d’un moule nanostructuré en alumine nanoporeuse qui se caractérise par des nanopores auto-organisés en nid d’abeille. Après avoir mis en place une station d’anodisation permettant la nanostructuration de ce moule, la reproductibilité du procédé de fabrication a été validée (diamètre des pores : 51 ± 6 nm, profondeur: 97 ± 9 nm, espace interpores: 102 ± 6 nm). Ensuite, les travaux de réplication ont été effectués avec le polymère ABS (acrylonitrile-butadiène-styrène). Plusieurs méthodes de réplication ont été testées à partir de dépôt de solutions de polymères ou de fonte du matériau sur le moule d’alumine. La méthode sélectionnée sur des critères de reproductibilité et de facilité de transposition industrielle donne des nanostructures de type nanopicots (diamètres des picots : 56 ± 7 nm, distances interpicots : 101 ± 16 nm, longueurs : 73 ± 33 nm). Les surfaces développées sont ensuite caractérisées (MEB, DSC analyse calorimétrique différentielle, spectrométrie Infra Rouge, angle de contact). La fabrication des nanostructures ne semble pas dégrader le matériau ABS et la modification topographique rend la surface plus hydrophile. Une étude de stabilité montre que les nanostructures résistent à plusieurs modes de stérilisation (oxyde d’éthylène, plasma H2O2 et rayon Beta) et sont conservés dans le temps, ce qui les rend applicables à la surface d’un dispositif médical. La seconde étape du travail consiste à évaluer l’adhésion bactérienne sur les surfaces témoins et nanostructurées. Différents tests de culture de biofilm ont été réalisés avec S. epidermidis en conditions statique ou dynamique. Après un temps de 3 à 48h, les bactéries sont décrochées de la surface puis dénombrées sur gélose. Il n’y a pas de différence significative d’adhésion bactérienne entre les deux types de surface. L’observation en microscopie électronique à balayage et confocale à 24h semble confirmer ce résultat. Des tests réalisés avec d’autres souches bactériennes (S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa) en condition statique montrent également que l’adhésion est également identique sur les deux surfaces. Par conséquent, nous pouvons conclure que nos surfaces ABS développées avec ces nanopicots spécifiques n’ont pas un effet anti-adhésion sur les bactéries testées. Des recherches récentes mettent en évidence que l’espacement entre les nanopciots est un facteur critique sur l’adhésion bactérienne. L’étape suivante de notre travail consiste à tester de nouvelles nanostructures réalisées avec un moule AAO ayant une distance interpore plus grande. / Medical device-related infections are a public health concern and an economic burden. The role of biofilms in medical device-related infections is clearly established. Preventive hygiene measures are not often sufficient to prevent biofilms formation. One promising way of preventing device-related infections is the development of medical devices with surfaces or materials that reduce either microbial viability using biocidal substances or microbial adhesion with topographical modifications.Developing nanostructured polymeric surfaces, which could have applications in medical devices, and testing their impact on bacterial adhesion and biofilm development were the main goals of this thesis. First of all, the polymer was replicated on an aluminum anodized oxide nanostructured mold (AAO), characterized by highly ordered nanopores. An anodization station was made in order to create molds. Then, the reproducibility of the process fabrication was validated (pore diameter: 51 ± 6 nm, deepness 97 ± 9 nm, interpore espace: 102 ± 6 nm). Several replication techniques with ABS were tested including polymers solutions and melted polymers. The selected method was the one with the most reproducible results pillar diameter: 56 ± 7 nm, interpillar distance: 101 ± 16 nm, length: 73 ± 33 nm) and the most representative of industrial injection processes. The created surfaces were then characterized (MEB, DSC, ATR-FTIR, wettability). The fabrication process does not seem to degrade the ABS material and the topographical change increases the hydrophilicity of the surface. A stability study showed that the nanopillars were resistant to several sterilization processes (ethylene oxide, H2O2 plasma, Beta irradiation) and were maintained through time, which is an important element for applications in medical-devices.The second step of our work consisted of assessing bacterial adhesion on control and nanostructured ABS samples. Several biofilm tests were made with S. epidermis in static and dynamic conditions. Between 3 and 48 hours of culture, bacteria were removed from the surfaces and then viable plate counting was performed. No significant differences were observed between the samples. Microscopic observations (MEB, CSLM) seemed to confirm this result. Other bacteria with different morphologies were tested (S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa): bacterial adhesion was similar for the two surfaces. Therefore, we can conclude that our developed ABS surfaces with these specific nanopillars do not have an anti-adhesion effect on the tested bacteria. Recent researches showed that spacing between nanopillars is a critical factor on bacterial adhesion. The following step of our work would be to test new nanostructures using AAO molds with bigger interpore distance.

Bacillus subtilis est une bactérie à Gram positif ubiquitaire vivant dans différents environnements terrestres et aquatiques. Différents polymères extracellulaires entrant dans la composition de la matrice des biofilms à B. subtilis ont été décrits. Des polysaccharides sont à la base de ces propriétés mécaniques, la viscoélasticité étant modulée par la teneur du biofilm en différents polymères extracellulaires comme les protéines amyloïdes et l’ADN extracellulaire.L’objectif de ce travail était d’étudier le rôle des exopolymères dans les biofilms à B. subtilis en utilisant la souche type de l’espèce CIP52.65T et différentes autres souches sauvages, cliniques et mutantes. La composition de la matrice varie en fonction de la présence de saccharose dans le milieu de culture, ainsi les effets d’une supplémentation du milieu Trypticase Soja (TS) en saccharose (20% p/v) ont été étudiés sur la croissance planctonique, la production de polymères de matrice et la formation de biofilm pour toutes ces souches de B. subtilis. Enfin, parmi les protéines de la matrice, B. subtilis produit une protéine formant des fibres amyloïdes appelée TasA. Son rôle exact dans le biofilm reste encore mal connu. Le but de cette seconde étude était de mieux comprendre le mécanisme d'auto-assemblage de TasA et de comprendre son rôle dans la matrice. En regroupant toutes les caractérisations effectuées sur les biofilms et sur les peptides amyloïdes, la conception de matrice biomimétique a permis d’effectuer de première approche sur les propriétés mécaniques de celle-ci, en reproduisant des matrices artificielles à base d’exopolysaccharides (lévane), de peptides amyloïdes et d’ADN. / Bacillus subtilis is a ubiquitous gram-positive bacterium that lives in different terrestrial and aquatic environments. Various extracellular polymers involved in the composition of the B. subtilis biofilm matrix have been described. Polysaccharides are the basis of these mechanical properties, the viscoelasticity being modulated by the content of the biofilm in different extracellular polymers such as amyloid proteins and extracellular DNA.The aim of this work was to study the role of exopolymers in B. subtilis biofilms using the type CIP52.65T strain and various other wild, clinical and mutant strains. The composition of the matrix varies according to the presence of sucrose in the culture medium, so the effects of supplementation of the medium Trypticase Soy (TS) sucrose (20% w/v) were studied on the planktonic growth, matrix polymer production and biofilm formation for all these B. subtilis strains. Finally, among the proteins in the matrix, B. subtilis produces an amyloid-forming protein called TasA. Its exact role in the biofilm remains poorly understood. The purpose of this second study was to better understand the self-assembly mechanism of TasA and to understand its role in the matrix. By grouping all the characterizations carried out on the biofilms and the amyloid peptides, the biomimetic matrix design made it possible to carry out a first approach on the mechanical properties of this one, by reproducing artificial matrices based on exopolysaccharides (levan), amyloid peptides and DNA.

Les infections ostéo-articulaires (IOA) regroupent plusieurs entités cliniques hétérogènes ayant en commun l'invasion et la destruction progressive des tissus osseux et cartilagineux par un ou plusieurs micro-organismes. Le genre Staphylococcus, impliqué dans plus de 65% des IOA, représente la première étiologie dans ces infections particulièrement sévères et difficiles à traiter. Les Staphylococcus non-aureus (SNA) incluant des espèces tels que Staphylococcus epidermidis sont responsables de près de 40% de certaines formes cliniques notamment les IOA sur matériels. Contrairement à S. aureus, pour lequel les mécanismes physiopathologiques incluent : (i) la capacité d'internalisation dans les cellules de l'hôte et (ii) la formation de biofilm, peu de données sont disponibles concernant ceux impliqués dans les IOA dues aux SNA. Dans ce contexte, mon travail de doctorat s'est attaché à caractériser les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la genèse des IOA causées par différentes espèces de SNA. A l'aide d'une approche in silico puis in vitro conduite dans un modèle d'invasion d'ostéoblastes humains, nos travaux ont mis en évidence une capacité d'internalisation et de persistance dans les cellules osseuses pour seulement deux espèces (S. pseudintermedius et S. delphini) sur les 17 testées. De façon similaire à S. aureus, le processus d'invasion cellulaire pour ces espèces fait intervenir une liaison tripartite entre les adhésines bactériennes liant la fibronectine (FnBPs), la fibronectine de la matrice extracellulaire et l'intégrine cellulaire α5β1. Un autre point essentiel de ce travail est la mise en évidence du phénotype hautement cytotoxique de l'espèce S. pseudintermedius après internalisation dans les cellules hôtes. Nous démontrons ici que cette cytotoxicité est, au moins en partie, médiée par une action combinée de (i) la leucocidine Luk-I (toxine homologue de la leucocidine Panton-Valentine de S. aureus) qui cible spécifiquement les cellules immunitaires exprimant le récepteur CXCR2 (récepteur 2 à l'interleukine 8) et (ii) les phénol-soluble modulins (PSMs) qui perturbent les membranes des cellules immunes et non immunes. Sachant que les SNA sont les agents infectieux les plus incriminés dans les IOA sur matériel, une technique d'étude du biofilm sur biomatériaux orthopédiques (acier inoxydable, titane et polyéthylène) a été mise au point pour étudier le biofilm mature formé par les six espèces SNA les plus prévalentes dans les IOA (S. epidermidis, S. lugdunensis, S. heamolyticus, S. warneri, S. caprae, S. capitis). A l'exception de S. epidermidis qui forme plus de biofilm sur le polyéthylène, constituant placé à l'interface des pièces métalliques et/ou des os dans les prothèses orthopédiques, aucune différence significative n'a été observée entre les trois biomatériaux orthopédiques pour l'ensemble des espèces de SNA testées. Néanmoins, nos observations indiquent une forte hétérogénéité au sein des SNA en matière de capacité à former un biofilm mature. Les espèces telles que S. capitis et S. lugdunensis se distinguent significativement de S. haemolyticus et S. warneri par leurs aptitude à former plus de biofilm. La grande diversité des phénotypes observés vis-à-vis des mécanismes physiopathologiques impliqués lors des IOA par les différentes espèces de SNA testées démontre qu'il ne faut pas considérer les SNA comme une entité clinique unique. L'amélioration des connaissances apportées au cours de ce travail devraient contribuer à l'optimisation de la prise en charge chirurgicale, médicale, et thérapeutique des patients / Bone and joint infections (BJI) include several heterogeneous clinical entities that share the invasion and the progressive destruction of bone and cartilage tissue by one or more microorganisms. The genus Staphylococcus, involved in over 65% of the BJI, represents the first etiology in these particularly severe and difficult-to-treat infections. Staphylococcus non-aureus (SNA), including species such as Staphylococcus epidermidis, are responsible for nearly 40% of some clinical forms, including device-associated BJI. In contrast to S. aureus, for which pathophysiological mechanisms include (i) internalization capacity in host cells and (ii) biofilm formation, few data are available regarding those involved in BJIs due to SNA. In this context, my PhD work focused on characterizing the pathophysiological mechanisms involved in the genesis of BJI caused by different SNA species. Using an in silico together with an in vitro approach conducted in a human osteoblast invasion model, our work revealed an ability to internalize and persist in bone cells for only two species of SNA out of the 17 tested. Indeed, we have been able to demonstrate that only S. pseudintermedius and S. delphini have the ability to invade the cytoplasmic compartment of the host cells. Similar to S. aureus, the cellular invasion process for these species involves a tripartite association between bacterial adhesins fibronectin-binding proteins (FnBPs), fibronectin of the extracellular matrix, and α5β1 cell integrin. Another key point of this work is the demonstration of the highly cytotoxic phenotype of the S. pseudintermedius species after internalization in the host cells. We demonstrate here that this cytotoxicity is, at least in part, mediated by a combined action of (i) the Leukocidin Luk-I (homologous to S. aureus Panton-Valentine Leukocidin) that specifically targets immune cells expressing the CXC chemokine receptor 2 (CXCR2) with (ii) phenol-soluble modulins (PSMs) that disrupt the membranes of immune and non-immune cells. Knowing that SNA are the most incriminated infectious agents in device-associated BJI, a technique for studying biofilm on orthopedic biomaterials (stainless steel, titanium and polyethylene) has been developed to study the mature biofilm formed by the six SNA species with the highest prevalence in BJI (S. epidermidis, S. lugdunensis, S. heamolyticus, S. warneri, S. caprae, S. capitis). With the exception of S. epidermidis, which forms more biofilm on polyethylene (constituting at the interface of metal parts and / or bone in orthopedic prostheses), no significant difference was observed between the three orthopedic biomaterials for all the SNA species tested. The great diversity of phenotypes observed with respect to the pathophysiological mechanisms involved in BJI by the different SNA species tested demonstrates that SNA should not be considered as a single clinical entity. Improved knowledge provided during this work should contribute to the optimization of the surgical management, medical and therapeutic patient

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mes travaux de recherche ont eu pour but d'analyser la diversité des microorganismes des trois domaines du vivant présents dans des biofilms phototrophes exposés à l'air, se développant sur des substrats minéraux divers, afin d'essayer, d'une part, de répondre à des questions de diversité et de biogéographie et, d'autre part, d'étudier le processus de colonisation par le biais d'expériences d'exposition contrôlées.J'ai ainsi caractérisé, essentiellement par des approches moléculaires basées sur l'analyse des banques des gènes d'ARNr de la petite sous-unité (SSU rDNAs) et sur des analyses d'empreintes communautaires, la diversité microbienne (procaryote et eucaryote) formant des biofilms matures (exposés depuis plusieurs années) dans plusieurs sites géographiques en Irlande du Nord, en France et en Ukraine, dans la région de Chernobyl. Dans ces biofilms soumis à forte pression sélective, nous avons mis en évidence beaucoup de microorganismes hétérotrophes et phototrophes, mais avec une diversité relativement restreinte en comparaison à d'autres milieux comme les sols ou les systèmes aquatiques. Les archées étaient absentes. Les conditions environnementales auxquelles ce type de biofilm est constamment exposé comme l'irradiation, la dessiccation et la limitation des nutriments sélectionnent des microorganismes qui développent des stratégies pour s'adapter comme, entre autres, la production de pigments. Ce sont des microorganismes fréquemment retrouvés dans des milieux désertiques extrêmes et résistants aussi aux radiations ionisantes qui ont ainsi été identifiés, notamment des Deinococcales et des Actinobacteria, ou encore des champignons ascomycètes (Ascomycota). Parmi les organismes phototrophes, nous avons dénombré des Cyanobacteria, des algues vertes (Chlorophyta) et des Streptophyta. Nous avons mis en évidence que les facteurs environnementaux influencent la composition des biofilms. Toutefois, tandis que la composition de la communauté bactérienne est fortement dépendante de la nature du substrat ou elle se développe, la composition des communautés microbiennes eucaryotes dépend de la distance géographique. Nous avons également mené des expériences de colonisation en exposant un même substrat minéral dans trois sites géographiques en Irlande du Nord et en France. L'analyse de la diversité microbienne lors du processus de colonisation a révélé des changements importants dans la composition des communautés, que ce soit pour les procaryotes ou pour les eucaryotes avec, cependant, des comportements différents de ces deux groupes de microorganismes. Dans le cas des bactéries, on observe une transition des Gammaproteobacteria, qui dominent les temps 0-6 mois et qui correspondent vraisemblablement aux cellules inactives en dispersion, vers des Betaproteobacteria, Bacteroidetes, Alphaproteobacteria et Actinobacteria dans des phases successives de formation du biofilm. Par contre, dès leur détection sur le substrat minéral, les eucaryotes sont massivement dominés par des champignons ascomycètes et basidiomycètes, des algues vertes ainsi que d'autres composantes minoritaires comme des ciliés, étant détectées dans des stades plus tardifs. Nos résultats montrent que les organismes hétérotrophes sont pionniers dans la formation de ces biofilms, ce qui permet d'émettre l'hypothèse qu'ils facilitent l'installation des cyanobactéries et surtout des algues vertes. Ils montrent aussi que le processus d'assemblage des communautés bactériennes dépend du temps de colonisation, alors que le site géographique détermine celui des microorganismes eucaryotes. Ces différences majeures de comportement pourraient être expliquées par des modes de vie différents entre les organismes de ces deux grands groupes.

Les autotransporteurs monomériques représentent le système de sécrétion le plus simple et le plus utilisé chez les bactéries à Gram négatif. Les autotransporteurs monomériques sont des protéines modulaires qui contiennent toute l’information pour leur sécrétion dans leur séquence. Les phénotypes associés à l’expression d’un autotransporteur peuvent être très variés et, souvent, les autotransporteurs sont des protéines multifonctionnelles. C’est le cas notamment des autotransporteurs AIDA-I, TibA et Ag43 d’Escherichia coli qui promouvoient l’adhésion et l’invasion de cellules épithéliales, l’auto-agrégation des bactéries et la formation de biofilm. Ces trois autotransporteurs ont d’ailleurs été regroupés dans une même famille, appelée les autotransporteurs auto-associatifs (SAATs). À cause de leur fonctionnalité, les SAATs sont considérés comme étant d’importants facteurs de virulence d’Escherichia coli. Toutefois, il existe plusieurs différences entre les SAATs qui ne sont pas bien comprises, si bien que leur rôle pour les bactéries n’est toujours pas bien compris. Nous avons donc d’abord caractérisé TibA, le membre des SAATs le moins bien étudié à l’aide d’une étude structure-fonction. Nous avons observé que TibA était une protéine modulaire et que son domaine fonctionnel était composé de deux modules : un module d’auto-agrégation en N-terminal et un module d’adhésion en C-terminal. En comparant nos résultats avec ceux obtenus pour les autres SAATs, nous avons réalisé que l’organisation des trois SAATs était très variée, c’est-à-dire que les trois SAATs sont composés de modules différents. Nous avons par ailleurs observé cet arrangement en modules lorsque nous avons analysé plusieurs séquences d’aidA, suggérant qu’un mécanisme d’échange et d’acquisition de modules était à la base de l’évolution des SAATs. Sans surprise, nous avons aussi observé que la famille des SAATs ne se limitait pas à AIDA-I, TibA et Ag43 et ne se limitait pas à Escherichia coli. La comparaison a aussi révélé l’importance du phénotype d’auto-agrégation dans la fonctionnalité des SAATs. Nous avons donc entrepris une étude du mécanisme d’auto-agrégation. Nos résultats on montré que l’auto-agrégation était le résultat d’une interaction directe SAAT/SAAT et ont mis en évidence un mécanisme similaire à celui utilisé par les cadhérines eucaryotes. De plus, nous avons observé que, comme les cadhérines, les SAATs étaient impliqués dans des interactions homophiliques; un SAAT interagit donc spécifiquement avec lui-même et non avec un différent SAAT. Finalement, les SAATs font parties des quelques protéines qui sont glycosylées chez Escherichia coli. Nous avons déterminé que le rôle de la glycosylation de TibA était de stabiliser la protéine et de lui donner la flexibilité nécessaire pour moduler sa conformation et, ainsi, être pleinement fonctionnelle. Globalement, nos résultats suggèrent que les SAATs sont des molécules « cadhérines-like » qui permettent la reconnaissance de soi chez les bactéries. Une telle habilité à discriminer entre le soi et le non-soi pourrait donc être utilisée par les bactéries pour organiser les communautés bactériennes. / Autotransporters are versatile virulence factors of Gram-negative bacteria and use one of the simplest and most widespread secretion system in bacteria. The name autotransporter originate from the observation that all the information needed for the secretion of the protein is encoded in its own sequence, meaning that autotransporters do not need a specialized secretion apparatus. Many autotransporters are multifunctional proteins and can perform a large variety of functions. The self-associating autotransporters (SAATs), represented by AIDA-I, TibA and Ag43, are such multifunctional proteins and can mediate the adhesion and invasion of epithelial cells, the auto-aggregation of bacteria and the formation of biofilm. Because of these functionalities, SAATs are considered important virulence factors of Escherichia coli. However, there are many differences between the SAATs and we still do not know their exact role for the bacteria. Therefore, we have realized a structure-function study of TibA, the least studied SAAT. Our study showed that TibA is a modular protein and that the functional domain of TibA is composed of two modules: an N-terminal module responsible for auto-aggregation and a C-terminal module responsible for adhesion. Our results showed that the organization of AIDA-I, TibA and Ag43 is different and that the SAATs represent different assemblies of modules. We also observed the modular organization when we analyzed various sequence of aidA, suggesting that the SAATs have evolved by a mechanism of domain shuffling. Not surprisingly, we have found new SAATs in Escherichia coli and in other proteobacteria. Our results also highlighted the importance of auto-aggregation in the functionality of the SAATs. We therefore assessed the mechanism of SAAT-mediated auto-aggregation of bacteria. Our results showed that SAATs mediate auto-aggregation of bacteria through direct SAAT/SAAT interactions and that these interactions were reminiscent of the interactions made by cadherin molecules in eukaryotes. We further observed that the SAATs were involved in homophilic interactions, as it is the case with cadherin molecules. SAATs are part of the few proteins that are glycosylated in Escherichia coli. We therefore characterized the glycosylation of TibA and found that glycosylation of TibA stabilized the protein and allowed the protein to modulate its conformation, resulting in a fully functional protein. Taken together, our results suggest that the SAATs may be cadherin-like molecules by bacteria in order to discriminate between self and non-self. Such an ability to discriminate self from non-self is rarely evoked in bacteria, but could play a role in the organization of multicellular communities.

La gestion de l'infection endodontique est la clé de la réussite de tout traitement endodontique. La reproduction in vitro du biofilm endocanalaire sauvage, qui se compose d'environ 500 espèces bactériennes différentes est à ce jour impossible. Cependant, tester un protocole de désinfection dans des conditions de laboratoire et ce avant toute application clinique reste indispensable. Il ressort que le développement d'un modèle qui ressemblerait structurellement à son type homologue sauvage se montre crucial. Dans le laboratoire MICORALIS (EA 7354) nous nous sommes intéressés à la conception et à la réalisation d'un biofilm polybactérien artificiel. La recherche bibliographique a permis de sélectionner S. salivarius, E. faecalis, F. nucleatum et P. gingivalis qui sont des représentants de différents groupes colonisateurs de l’espace endodontique et qui coexistent. Après une série d'analyse au MEB puis des examens à l'aide de la technique FISH-confocale (sondes ARNr 16S), nous avons pu démontrer que ces bactéries sont présentes dans la composition d’un biofilm mature après 21 jours sur la dentine péricanalaire. Ces investigations nous ont permis de géo-localiser des bactéries dans les tubuli dentinaires jusqu’à 500µm et parmi elles, P. gingivalis était statistiquement prédominante. Afin de répondre aux exigences des objectifs de notre étude, six groupes de 12 échantillons contaminés par le biofilm expérimental ont servi à tester 6 techniques de décontamination endodontique / Management of infection is the key to a successful root canal treatment and development of a study model of endodontic biofilm which resemble structurally to its wild type counterpart seems crucial before any clinical application of different protocols. However, the in vitro reproduction of the root canal biofilm which consists of about 500 different bacterial species is very difficult. In laboratory MICORALIS (EA 7354) we were interested in conception of an artificial polybacterial. The bibliographical research allowed to choose S. salivarius, E. faecalis, F. nucleatum and P. gingivalis which are representatives of different groups of root canal biofilm colonizers. Following a series of periodic Scanning Electron Microscopies of samples and furthermore by help of FISH-Confocal imaging of 16S rRNA, we could prove the presence of these bacteria inside the biofilm structure and illustrate their distribution over the root canal system. In addition, it was possible also to confirm the maturation time needed to obtain the biofilm model, which is resistant enough to be used in vitro for endodontic disinfection investigation. After being characterized, we treated the model biofilm with different endodontic decontamination protocols

The persistence of biofilms in hospital settings are associated with Healthcare Associated Infections (HCAI), causing increased morbidity, mortality and healthcare costs. The resistance of biofilms against commonly used hospital disinfectants has been well reported. Metal and metal oxide nanoparticles (NP) such as silver (Ag), copper (Cu), zinc oxide (ZnO) and copper oxide (CuO) exhibit antimicrobial properties against various pathogens. Methods: Biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in a Centre for Disease Control (CDC) biofilm reactor and a 96 well plate was compared. A three stage approach including Minimum Biofilm Reduction Concentration (MBRC), R2 values and log(10) reductions was used to assess the efficacy of Ag and ZnO NPs both alone and in combination against P. aeruginosa and S. aureus biofilms. Atomic Absorption Spectroscopy (AAS), Scanning Electron Microscopy (SEM) and Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) was used to further assess the antimicrobial ability of the metal and metal oxide NPs. The prevention of P. aeruginosa and S. aureus adherence on Ag and ZnO thin film coating on silicon (Si) surfaces was also investigated, as well as icaC, ebpS and fnbB gene expression in S. aureus biofilms. Results: The CDC biofilm reactor demonstrated to be the most effective method for P. aeruginosa and S. aureus biofilm production in comparison to 96 well plates, with lower standard errors of the mean (SE) and higher replicability. Individual MBRC of ZnO and Ag NPs in suspension were 256 and 50 µg/ml for P. aeruginosa and 16 and 50 µg/ml for S. aureus respectively. The concentrations in combination were reduced by at least a half, with concentrations of 32/25 µg/ml of ZnO/Ag NPs in suspension resulting in a significant (p ≤0.05) reduction of 3.77 log(10) against P. aeruginosa biofilms and 8/12 µg/ml of ZnO/Ag NPs in suspension resulted in a 3.91 log(10) (p ≤0.05) against S. aureus biofilms. Both combinations showed an additive effect. Time point analysis confirmed that a 24 hour treatment is vital for any significant (p ≤0.05) antimicrobial activity. AAS data suggested that the Ag+ ions quenched Zn2+ ions, therefore the antimicrobial efficacy of the combination is mainly due to Ag+ ions. Damage of the biofilms from Ag and ZnO NPs was observed in the SEM imaging and energy dispersive X-ray (EDX) analysis confirmed the adherence of Zn and Ag within the biofilms. CLSM imaging showed dead (red) cells of P. aeruginosa and S. aureus biofilms throughout the depth of the biofilm. P. aeruginosa formation was reduced by 1.41 log(10) and 1.43 log(10) on Ag and ZnO thin film coatings respectively. For S. aureus, a reduction of 1.82 log(10) and 1.65 log(10) was obtained for Ag and ZnO coating respectively. Only low levels of ribonucleic acid (RNA) were achieved so no further gene analysis could occur. Conclusion: Reductions of ≥3 log(10) were observed for P. aeruginosa and S. aureus biofilm treatment with ZnO/Ag NP suspensions. It can be concluded that the ZnO/Ag NP suspensions had greater antimicrobial activity than Ag and ZnO coated surfaces owing to large concentrations of Ag+ and Zn2+ ions acting upon the biofilms. The slower release of ions from coated surfaces suggest an inadequate concentration of ions in the media, which are therefore unable to prevent biofilm formation as rapidly as NP suspensions, however provide a sustained release of ions over time. The results from this investigation propose that Ag and ZnO NPs in suspension could be a potential alternative to disinfectants for use in nosocomial environments against P. aeruginosa and S. aureus biofilms.