A biogênese do ribossomo é um processo complexo, altamente ordenado e regulado, no qual o transcrito primário é processado por endo e exonucleases para gerar os RNAs ribossomais maduros. Este processo foi melhor caracterizado em Saccharomyces cerevisiae, porém alguns fatores atuantes em humanos tiveram uma função divergente descrita. Um desses fatores é a proteína NIP7, altamente conservada em eucariotos, que atua na formação da subunidade ribossomal 60S, em levedura, e 40S, em humanos. Assim, esse trabalho propôs a caracterização funcional da proteína CrNIP7, homóloga a NIP7, presente em Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii é uma alga verde unicelular ancestral a plantas, utilizada como modelo eucarioto para estudos de fotossíntese e de flagelos. Nesse trabalho, um estudo de complementação funcional foi realizado utilizando duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae diferentes e em ambas CrNIP7 complementou a função de Nip7p de leveduras, indicando uma participação na síntese da subunidade 60S do ribossomo. Uma busca por parceiros de interação de CrNIP7 foi também realizada, utilizando CrNIP7 como isca para rastrear uma biblioteca de cDNA de C. reinhardtii em sistema de duplo híbrido em leveduras, o que resultou em dois novos potenciais parceiros de interação. Esses parceiros foram identificados como proteínas preditas conceitualmente no genoma de C. reinhardtii, denominadas Predicted e G-patch. Adicionalmente, a interação entre CrNIP7 e CrSBDS, proteína homóloga a Sdo1 (de levedura) e HsSBDS (de humanos), foi confirmada através de um experimento de duplo híbrido dirigido. A interação entre as proteínas CrNIP7 e CrSBDS foi validada por pull down e um teste preliminar sugeriu que CrNIP7 e Predicted também interagem in vitro. Análises de bioinformática indicam que Predicted, G-patch e CrSBDS tenham regiões intrinsicamente desordenadas, as quais podem se estruturar na interação com seus parceiros. Em conjunto, os resultados desse trabalho contribuem para entendimento do papel de CrNIP7 na biogênese de ribossomos em Chlamydomonas reinhardtii em comparação com outros modelos eucarióticos. / Ribosome biogenesis is a complex, highly regulated and ordered process in which the primary transcript is processed by endo- and exonucleases to generate the mature ribosomal RNAs. This process was best characterized in Saccharomyces cerevisiae, but some factors have been described in humans with different function. One of these divergent factors is NIP7, a highly conserved protein in eukaryotes, which acts in the formation of ribosomal 60S subunit, in yeast, and 40S, in humans. Based on this, this work proposed the functional characterization of CrNIP7 protein, homologous to NIP7, from Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii is a green alga, ancestral to plants, that is used as an eukaryote model for photosynthesis and flagella studies. In this study, a functional complementation assay was performed using two different strains of Saccharomyces cerevisiae and, in both approaches, CrNIP7 protein complemented the function of Nip7p from yeast, indicating its participation in the synthesis of the 60S ribosomal subunit. A two-hybrid assay was carried out using CrNIP7 as bait to screen a C. reinhardtii cDNA library in order to find out CrNIP7 interaction partners, wich resulted in two novel potentially partners. The interacting proteins were identified as conceptually predicted proteins in the genome of C. reinhardtii and were called Predicted and G-patch. Additionally, the interaction between CrNIP7 and CrSBDS, a protein homologous to Sdo1 (yeast) and HsSBDS (humans), was confirmed by a direct two-hybrid assay. The interaction between CrNIP7 and CrSBDS proteins was validated by pull down and a preliminary test suggested that CrNIP7 and Predicted also interact in vitro. Bioinformatics analyzes indicate that Predicted, G-patch and CrSBDS have intrinsically disordered regions, which can be ordered in the moment of interaction. Taken together, the results of this work contribute to understand the role played by CrNIP7 in ribosome biogenesis in Chlamydomonas reinhardtii compared to other eukaryotic models.

Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-10-11T17:34:20Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-24T11:51:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-24T11:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 72038.pdf: 3196059 bytes, checksum: 8c47650717cf5a0ee1266bcc0b5d389d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue é caracterizada como a principal arbovirose humana, representando um grave problema de saúde pública. A superativação de células do sistema imune pode ser destacada como um dos fatores envolvidos na progressão da doença para as formas mais graves. Embora os monócitos sejam reconhecidos como importante fonte de citocinas, a participação das plaquetas na patogênese da dengue permanece pouco explorada. Recentemente, nosso grupo mostrou a contribuição da interação plaqueta-monócito na resposta inflamatória observada durante a dengue. De fato, o papel das plaquetas na resposta imune e inflamatória é cada vez mais frequente. Dentro deste contexto, foi proposto que plaquetas ativadas por estímulo específico sinalizam para mudanças fenotípicas nos monócitos, incluindo a diferenciação em células espumosas que é caracterizada pelo aumento da biogênese de corpúsculos lipídicos (CL) \2013 organelas citoplasmáticas dinâmicas ricas em lipídios relacionadas a processos inflamatórios e infecciosos. Nossos estudos prévios demonstraram um aumento da biogênese de CL tanto em leucócitos isolados de pacientes com a forma grave da doença quanto em células infectadas com o vírus dengue (DENV) in vitro, com participação na localização da proteína do capsídeo viral e na produção de partículas virais infecciosas. Entretanto, os mecanismos que regulam a biogênese e a função destas organelas durante a infecção pelo DENV precisam ser melhor caracterizados. Assim, pretende-se com este trabalho (i) analisar os mecanismos que levam à biogênese de CL em distintos tipos celulares infectados com o DENV in vitro; (ii) estudar os efeitos de plaquetas ativadas com o DENV in vitro sobre a imunomodulação dos monócitos, no que diz respeito, principalmente, à formação de CL; (iii) investigar o efeito de drogas que atuam na gênese de CL e o seu impacto na replicação viral e na secreção de mediadores inflamatórios Inicialmente, nossos resultados demonstram um aumento na formação e/ou tamanho de CL em distintos tipos celulares infectados in vitro, de uma maneira dependente da integridade viral, visto que o vírus inativado por aquecimento falhou em induzir a biogênese destas organelas. Observamos que a modulação da lipogênese e da formação de CL afetam a capacidade replicativa do vírus. Além disso, constatamos que o DENV é capaz de modular positivamente a expressão de genes envolvidos no metabolismo de lipídios, de forma independente do MIF \2013 citocina que induz a gênese de CL em monócitos \2013 secretado durante a infecção. Na segunda parte deste estudo, observamos que plaquetas ativadas com o DENV in vitro rapidamente formam agregados com monócitos quando comparado com plaquetas estimuladas com mock. Adicionalmente, plaquetas ativadas com o DENV sinalizam para que monócitos aumentem a expressão de COX-2 e a secreção de PGE2 e CXCL8/IL-8. De forma recíproca, observamos que estas células contribuem para uma maior ativação das plaquetas, que então secretam níveis elevados de CCL5/RANTES e CXCL4/PF4. Em seguida, constatamos que plaquetas ativadas com o DENV in vitro são capazes de promover a biogênese de CL em monócitos, de uma maneira dependente da enzima ácido graxo sintase Ao utilizarmos o C75, inibidor desta enzima, também observamos uma redução nos níveis de PGE2, mas não de CXCL-8/IL-8, sugerindo um papel dos CL na produção deste mediador lipídico. O MIF, secretado durante a ativação de plaquetas pelo DENV in vitro, também está envolvido na sinalização que culmina na formação de CL em monócitos expostos a plaquetas ativadas. De forma surpreendente, o sobrenadante de plaquetas ativadas com o DENV não induz a biogênese de CL em monócitos, sugerindo a importância do contato direto entre essas células. De fato, a interação com plaquetas ativadas mostrou-se crucial para que os monócitos respondam funcionalmente, incluindo a secreção de mediadores inflamatórios e o aumento da formação de CL. Por fim, a biogênese destas organelas é maior nos agregados formados com plaquetas ativadas com o DENV, corroborando esta hipótese. Sendo assim, esses dados fortemente sugerem que a interação direta com plaquetas ativadas com o DENV seja crucial para que os monócitos respondam com funções específicas e contribuam para a patogênese da doença. Portanto, o conjunto dos resultados obtidos nos revela a importância em estabelecer estratégias terapêuticas adequadas para controlar a resposta do hospedeiro frente à infecção, onde a própria modulação dos CL possa vir a representar um potencial alvo terapêutico para o tratamento da dengue / Dengue is characterized as the most important arthropod-borne human viral disease worldwide, representing a public health problem. Increased activation of immune cells could be involved in the progression of disease to severe forms. Although monocytes have been recognized as important sources of cytokines, the role of platelets in dengue pathogenesis remains understood. Recently our group showed the contribution of platelet-monocyte interaction to inflammatory responses observed in dengue. In fact, it is becoming increasingly clear that platelets have inflammatory functions and can influence innate response. Evidences suggest that specific stimuli-activated platelets can promote phenotypic changes in monocytes, including enhanced foam cell formation, that is characterized by an increase in lipid droplets (LD) \2013 dynamic cytoplasmic lipid-rich organelles, associated to inflammatory and infectious conditions \2013 biogenesis. Our previous works showed a significant increase in LD accumulation in leukocytes from dengue hemorrhagic fever patients, as well as in different cell types infected in vitro. Besides, these organelles were involved in capsid protein localization and virus particle morphogenesis. However, the mechanisms involved in LD biogenesis and function during dengue virus (DENV) infection still unclear. Therefore, this study aim to (i) investigate the mechanisms related to LD formation in distinct cell types during DENV infection; (ii) evaluate the roles of DENV-activated platelets on monocytes immunomodulation in vitro, focusing on LD biogenesis; (iii) analyze the effects of drugs that abrogate LD formation and your impact on viral replication and secretion of inflammatory mediators Our results demonstrate a significant increase in LD number and/or area in distinct cell types infected in vitro. Importantly, heat inactivated DENV failed to induce LD biogenesis in vitro. Besides, modulation of lipogenesis and LD formation, by C75- or triacsin C-treated cells, impair DENV replication. We also observe that DENV is able to modulate genes involved in lipid metabolism, in a MIF \2013 cytokine that induces LD genesis in monocytes \2013 independent fashion. In the second part of this study, we show that platelets exposed to DENV in vitro form aggregates with monocytes and activate signaling cascade in these cells, which culminates in CXCL8/IL-8 secretion. In addition, platelet-monocyte aggregates formation reciprocally increase platelet activation, observed by an enhanced production of CCL5/RANTES and CXCL4/PF4. DENV-activated platelets increase LD formation and COX-2 activation in monocytes, leading to secretion of PGE2. Damping LD biogenesis through treatment with the fatty acid synthase (FAS) inhibitor C75 prevents PGE2, but not CXCL8/IL-8, secretion by platelet-monocyte aggregates. We also demonstrate that DENV-activated platelets secrete high levels of MIF. LD formation in monocytes exposed to DENV-activated platelets is partially dependent on platelet-derived MIF However, the supernatant from DENV-activated platelets is not sufficient to induce LD biogenesis in monocytes. Finally, LD formation is higher in monocytes which have platelets adhered on surface compared to monocytes that do not contact platelets, suggesting that beyond soluble mediators, platelet adhesion is a major event in platelet-mediated modulation of lipid metabolism in monocytes. Thus, our results indicate that DENV infection promotes LD biogenesis and that this event seems to be dependent of host lipid metabolism, since specific inhibition of enzymes involved in lipogenesis blocks the formation of these organelles. This inhibition also leads to decreased DENV replication, suggesting a role of LD in this process. Moreover, our data provide new evidence that DENV-activated platelets modulate LD formation as well as cytokine signaling in monocytes, during cellular aggregates formation, and these events may contribute to dengue pathogenesis. Therefore, the modulation of LD formation might represent an attractive therapeutic target for dengue

A biogênese do ribossomo é um processo complexo, altamente ordenado e regulado, no qual o transcrito primário é processado por endo e exonucleases para gerar os RNAs ribossomais maduros. Este processo foi melhor caracterizado em Saccharomyces cerevisiae, porém alguns fatores atuantes em humanos tiveram uma função divergente descrita. Um desses fatores é a proteína NIP7, altamente conservada em eucariotos, que atua na formação da subunidade ribossomal 60S, em levedura, e 40S, em humanos. Assim, esse trabalho propôs a caracterização funcional da proteína CrNIP7, homóloga a NIP7, presente em Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii é uma alga verde unicelular ancestral a plantas, utilizada como modelo eucarioto para estudos de fotossíntese e de flagelos. Nesse trabalho, um estudo de complementação funcional foi realizado utilizando duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae diferentes e em ambas CrNIP7 complementou a função de Nip7p de leveduras, indicando uma participação na síntese da subunidade 60S do ribossomo. Uma busca por parceiros de interação de CrNIP7 foi também realizada, utilizando CrNIP7 como isca para rastrear uma biblioteca de cDNA de C. reinhardtii em sistema de duplo híbrido em leveduras, o que resultou em dois novos potenciais parceiros de interação. Esses parceiros foram identificados como proteínas preditas conceitualmente no genoma de C. reinhardtii, denominadas Predicted e G-patch. Adicionalmente, a interação entre CrNIP7 e CrSBDS, proteína homóloga a Sdo1 (de levedura) e HsSBDS (de humanos), foi confirmada através de um experimento de duplo híbrido dirigido. A interação entre as proteínas CrNIP7 e CrSBDS foi validada por pull down e um teste preliminar sugeriu que CrNIP7 e Predicted também interagem in vitro. Análises de bioinformática indicam que Predicted, G-patch e CrSBDS tenham regiões intrinsicamente desordenadas, as quais podem se estruturar na interação com seus parceiros. Em conjunto, os resultados desse trabalho contribuem para entendimento do papel de CrNIP7 na biogênese de ribossomos em Chlamydomonas reinhardtii em comparação com outros modelos eucarióticos. / Ribosome biogenesis is a complex, highly regulated and ordered process in which the primary transcript is processed by endo- and exonucleases to generate the mature ribosomal RNAs. This process was best characterized in Saccharomyces cerevisiae, but some factors have been described in humans with different function. One of these divergent factors is NIP7, a highly conserved protein in eukaryotes, which acts in the formation of ribosomal 60S subunit, in yeast, and 40S, in humans. Based on this, this work proposed the functional characterization of CrNIP7 protein, homologous to NIP7, from Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii is a green alga, ancestral to plants, that is used as an eukaryote model for photosynthesis and flagella studies. In this study, a functional complementation assay was performed using two different strains of Saccharomyces cerevisiae and, in both approaches, CrNIP7 protein complemented the function of Nip7p from yeast, indicating its participation in the synthesis of the 60S ribosomal subunit. A two-hybrid assay was carried out using CrNIP7 as bait to screen a C. reinhardtii cDNA library in order to find out CrNIP7 interaction partners, wich resulted in two novel potentially partners. The interacting proteins were identified as conceptually predicted proteins in the genome of C. reinhardtii and were called Predicted and G-patch. Additionally, the interaction between CrNIP7 and CrSBDS, a protein homologous to Sdo1 (yeast) and HsSBDS (humans), was confirmed by a direct two-hybrid assay. The interaction between CrNIP7 and CrSBDS proteins was validated by pull down and a preliminary test suggested that CrNIP7 and Predicted also interact in vitro. Bioinformatics analyzes indicate that Predicted, G-patch and CrSBDS have intrinsically disordered regions, which can be ordered in the moment of interaction. Taken together, the results of this work contribute to understand the role played by CrNIP7 in ribosome biogenesis in Chlamydomonas reinhardtii compared to other eukaryotic models.

O tema desta pesquisa é a influência da atividade de minhocas no solo de uma vertente do Planalto Atlântico Paulista. O local estudado está cercado por áreas de preservação ambiental, possui florestas primárias em bom estado de conservação e apresenta clima quente com precipitações acima dos 2.000 mm por ano. Foi feito um levantamento das comunidades de anelídeos a partir de três diferentes técnicas de extração. Os organismos coletados foram identificados em nível de espécie e sua distribuição foi analisada ao longo da topografia. Demonstrou-se uma variação das populações de minhocas nos três setores da vertente, com maiores densidades no sopé e menores no topo. Verificou-se que há uma intensa atividade desses organismos no solo e que eles não se distribuem igualmente no perfil vertical, concentrando-se em algumas camadas, às vezes superficiais às vezes subsuperficiais, de acordo com o tipo de solo. Observou-se também a presença de espécies exóticas nas áreas antrópicas. Foi constatado que a atividade desses organismos modifica a morfologia (bioagregação) e também os atributos físicos (macroporosidade; bioporos) e químicos do solo (teores de matéria orgânica e dos nutrientes P, K+, Ca2+ e Mg2+; soma de bases; capacidade de troca catiônica), influenciando diversos processos pedológicos. Com seus comportamentos ecológicos (alimentar e construtor), as minhocas criam galerias, canais e produzem dejeções, ajudando na aeração do solo, na dinâmica hídrica e no processo de ciclagem dos nutrientes. Apesar do papel que desempenham na formação da cobertura pedológica, a maior parte dos levantamentos de solo não contempla os agregados biogênicos, por este motivo, demos ênfase especial à descrição destas morfologias. / The focus of this research is the activity of earthworms and their influence on the soil of an Atlantic Plateau hill slope in São Paulo State. Our area of study is surrounded by environmental preservation areas, it has primary forests in good conditions, warm climate and precipitations above 2,000 mm per year. Three different extraction techniques were used for the survey of annelid communities. The collected organisms were identified at the species level and its distribution was analyzed along the topography. We found a variation of earthworm populations in the three sectors of the slope, with the highest densities in the foothills and lower densities in the top. There is an intense activity of these organisms in the soil and they are not equally distributed in the vertical profile, concentrating on a few layers, sometimes in topsoil, sometimes in subsoil. We also observed the presence of exotic species in disturbed areas. The activity of soil fauna changes the morphology (bioaggregation), the physical (macroporosity), and chemical (P, K+, Ca2+, Mg2+ and organic matter dynamics, sum of bases and cation exchange capacity) attributes of soil, affecting many pedological processes. With their feeding and builder ecological behaviors, earthworms create galleries, channels and produce casts, helping in soil aeration, the water dynamics and nutrient cycling processes. Despite the role they play in the formation of soil mantle, most of the ground surveys does not include the biogenic aggregates, therefore, we gave special emphasis on the descriptions of such morphologies.

Atualmente no Brasil mais da metade da população adulta tem excesso de peso e 21% estão obesos. A obesidade é uma doença que se encontra em evidente crescimento, sendo considerada a epidemia do século XXI. Como alternativa de tratamento e prevenção, o uso de ácidos graxos que possuem habilidade de induzir a expressão de genes com importante papel em modulações metabólicas e mitocondriais têm sido estudados. O ácido linoleico conjugado (CLA, 18:2) é da família ômega-6, descrito por sua propriedade antiobesidade relacionada à diminuição da adiposidade e ao aumento do metabolismo corporal. O óleo de peixe (OP) é uma mistura de ácidos graxos poli-insaturados eicosapentaenóico (EPA, 20:5) e docosahexaenóico (DHA, 22:6) da família ômega-3, conhecido por aumentar a sensibilidade à insulina, o colesterol-HDL, pelas suas propriedades antiinflamatórias e sua ação protetora sobre o sistema nervoso. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da suplementação da dieta de camundongos C57BL6 com CLA em conjunto com OP durante 60 dias sobre aspectos bioquímicos, moleculares e fisiológicos do metabolismo mitocondrial e corporal. Verificamos que a suplementação da dieta com CLA e OP in vivo: aumenta o metabolismo corporal, efeito atribuído à ambos os óleos; prejudica o metabolismo da glicose circulante, proporcionado exclusivamente pelo CLA; reduz o nível de movimentação, proporcionado exclusivamente pelo OP. No fígado: aumenta a expressão de UCP2, a atividade de proteínas desacopladoras e a ?- oxidação, efeito atribuído à ambos os óleos; aumenta o número de mitocôndrias, proporcionado exclusivamente pelo OP. CLA aumenta a produção de espécies reativas de O2 (EROs) a qual é revertida pelo OP em conjunto. No músculo sóleo: aumenta a biogênese mitocondrial via PGC- 1? e a expressão de UCP2, proporcionados pelo OP. Por fim, no hipocampo: aumenta o número de mitocôndrias, estimulo dado por ambos os óleos; aumenta a atividade desacopladora e reduz a produção de EROs, proporcionados exclusivamente pelo CLA. Concluímos que na suplementação conjunta os efeitos do OP são predominantes nos metabolismos corporal, hepático e muscular, e na movimentação corporal, enquanto que o efeito predominante do CLA é a diminuição na sensibilidade à insulina. Já no cérebro, o OP potencializa os efeitos do CLA. / Currently in Brazil more than a half of adult population has overweight, and 21% are obese. This evident growing disease is considered the 21th century\'s epidemy. Some fatty acids have been considered an alternative treatment and prevention strategy for obesity due to their ability to stimulate gene expression with important role in cellular and mitochondrial metabolisms. Conjugated linoleic acid (CLA, 18:2) from omega-6 family, with anti-obesity properties related to diminution of adiposity and increments in body metabolism. The fish oil (FO) is a mixture of the poli-unsaturated fatty acids eicosapentaenoic (EPA, 20:5) and docosahexaenoic (DHA, 22:6) from omega-3 family, known for improving insulin sensibility and HDL-cholesterol, anti-inflammatory properties and protective action over the central nervous system. The objective of this study was to examine the effects of dietary supplementation of CLA in conjunction with FO during 60 days over biochemical, molecular and physiological aspects of mitochondrial and body metabolism in C57BL6 mice. Diet supplementation with CLA and FO in vivo: raise body metabolism, an effect attributed to both oils; affect glucose metabolism, exclusively proportionate by CLA; diminish the level of mice movement, exclusively proportionate by FO. In liver: increase UCP2 expression, uncoupling proteins activity and ?-oxidation, stimulated by both oils; increase mitochondrial density, exclusively proportionate by FO. CLA also raises the reactive oxygen species (ROS) production, which is reversed by FO in conjunction. In soleus muscle: increase mitochondrial biogenesis through PGC-1? and the UCP2 expression, exclusively proportionate by FO. Lastly, in hippocampus: increase mitochondrial density, stimulated by both oils; stimulate uncoupling activity and diminish ROS production, exclusively proportionate by CLA. In conclusion, in the dietary supplementation with CLA and FO in conjunction the FO effects are prevalent in metabolisms of body, liver and muscle, and in body movement, while the CLA effects are prevalent in decreasing insulin sensitivity. However in the brain, the FO potentiates the effects of CLA.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T23:10:02Z No. of bitstreams: 1 giselle_b_lima_ioc_bcm_0040_2011.pdf: 7861380 bytes, checksum: c1b5adc38492ad939e7501fe4217d53a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T23:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 giselle_b_lima_ioc_bcm_0040_2011.pdf: 7861380 bytes, checksum: c1b5adc38492ad939e7501fe4217d53a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A dengue, em termos de morbidade e mortalidade, é caracterizada como a principal arbovirose humana, sendo responsável pela infecção de milhares de pessoas nas regiões tropical e subtropical do mundo, causando a morte de adultos e crianças. Uma das razões para a ausência de abordagens terapêuticas adequadas se deve ao pouco conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na interação do vírus dengue com as células hospedeiras. No entanto, evidências sugerem que a regulação de diferentes etapas do metabolismo celular desempenhe funções cruciais tanto na replicação viral quanto na resposta do hospedeiro à infecção. Estudos têm demonstrado que o acúmulo intracelular de lipídios em corpúsculos lipídicos – organelas citoplasmáticas dinâmicas e funcionalmente ativas – está associado a doenças de grande relevância para a saúde pública, incluindo a hepatite C. Além disso, foi observado que estas organelas desempenham funções não apenas na replicação do vírus da hepatite C, mas também na produção de partículas infecciosas; entretanto, o envolvimento dos corpúsculos lipídicos durante a infecção pelo vírus dengue ainda não foi avaliado. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a formação e função dos corpúsculos lipídicos durante a infecção pelo vírus dengue, com foco na interação com proteínas virais, na modulação da capacidade replicativa e/ou infecciosa do vírus e na geração aumentada de mediadores inflamatórios. Nossos resultados demonstraram um aumento no número de corpúsculos lipídicos em leucócitos isolados de pacientes com a forma grave da doença, bem como indução da biogênese destas organelas em diferentes tipos celulares infectados com distintos sorotipos do vírus dengue in vitro. A exposição de células ao vírus dengue inativado por aquecimento não promoveu a formação de corpúsculos lipídicos. Em paralelo à indução da formação destas organelas, em células infectadas in vitro, observamos um aumento na produção de PGE2. Adicionalmente, demonstramos que a proteína do capsídeo viral, bem como o MIF – mediador proinflamatório cuja concentração está diretamente correlacionada com a gravidade da doença – se encontravam colocalizados nos corpúsculos lipídicos durante a infecção. Por fim, observamos que a modulação da lipogênese e da formação de corpúsculos lipídicos, através do tratamento das células com as drogas C75 e triacsin C, afetaram a capacidade replicativa do vírus. Desta forma, os nossos resultados indicam que a infecção pelo vírus dengue promove a biogênese de corpúsculos lipídicos de uma maneira dependente das enzimas ácido graxo sintase e acil-CoA sintetase, uma vez que a inibição destas por drogas específicas leva ao bloqueio da formação destas organelas. Esta inibição também promove uma redução na replicação viral, propondo um papel dos corpúsculos lipídicos neste processo. Além disso, o aumento na geração de PGE2 induzido pelo vírus, bem como a localização do MIF e da proteína do capsídeo viral nestas organelas sugerem que os corpúsculos lipídicos atuem na produção aumentada de mediadores inflamatórios e na regulação temporária do processo viral. Assim, a modulação dos corpúsculos lipídicos pode vir a representar um potencial alvo terapêutico para o tratamento da dengue. / Dengue, in terms of disease and mortality, is characterized as the most important arthropod-borne human viral disease, infecting millions of people in tropical and subtropical regions of the world and being responsible for many deaths in children and adults. The lack of adequate therapeutic approaches for treatment of dengue is a consequence of our limited understanding about the molecular mechanisms that underlie the interaction between dengue virus and human host. However, evidence suggests that the regulation of different steps of cellular metabolism play crucial roles in both viral replication and the host response to infection. Recent studies have shown that intracellular accumulation of lipids within lipid droplets – dynamic and functionally active organelles – is associated with diseases of major relevance to public health, including hepatitis C. Furthermore, it was observed that these organelles play roles not only in hepatitis C virus replication, but also in the production of infectious particles; however the involvement of lipid droplets in dengue virus infection has never been addressed. Therefore, this work aimed to investigate lipid droplets formation and function during dengue virus infection, focusing on interaction with viral proteins, modulation of replication and/or production of infectious virus and increased generation of inflammatory mediators. Our results demonstrated a significant increase in lipid droplets accumulation in leukocytes from dengue hemorrhagic fever patients, as well as induction of biogenesis in different cell types infected with distinct serotypes of dengue virus in vitro. Importantly, heat inactivated dengue virus failed to induce lipid droplets formation in cells infected in vitro. In paralleled to an increased lipid droplets biogenesis, in cells infected in vitro, we observed an increase in PGE2 generation. Additionally, we also demonstrated that the virus core protein and MIF – proinflammatory mediator whose concentration is directly related to disease severity – co-localizes in lipid droplets during infection. Finally, we observed that modulation of lipogenesis and lipid droplets formation, by treatment of the cells with C75 and triacsin C, impaired dengue virus replication. Thus, our results indicate that dengue virus infection promotes lipid droplets biogenesis and that this event seems to be dependent of the enzymes fatty acid synthase and acyl-CoA synthetase, since specific inhibition of these enzymes blocks the formation of these organelles. This inhibition also leads to decreased viral replication, suggesting a role of lipid droplets in this process. Moreover, the increased production of PGE2 induced by dengue virus, as well as MIF and virus core protein localization in these organelles propose that lipid droplets are involved in both increased generation of inflammatory mediators as temporary regulation of viral process. So, the modulation of lipid droplets might represent an attractive therapeutic target for dengue.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / Aging is associated with a decline in mitochondrial function, which is controlled mainly through peroxisome proliferator-activated receptor gamma coativator-1 alpha (PGC-1α), sirtuin 1 (SIRT-1) and AMP-activated protein kinase (AMPK). On the other hand, exercise is known to monitor the levels of SIRT-1 and PGC-1α protein and AMPK phosphorylation, but the effects of exercise intensity of these molecules has not been fully investigated. The present study aimed to investigate the potential effect of race at 1.2 and 0.8 km/h in protein levels of SIRT-1 and PGC-1α and AMPK phosphorylation in skeletal muscle of old adult rats. To this, young Wistar rats two months of age and older adults with eighteen months of age, weighing 218 ± 10 and 526 ± 12 g, respectively, before the exercise protocol, were divided into the following groups (n = 6): non-exercised ( NE ); exercised at 0.8 km/h (0.8 km/h) and exercised at 1.2 km/h (1.2 km/h ). The rats of the exercise groups were subjected to running at a constant speed of 0.8 km/h and 1.2 km/h without inclination, 50 minutes per day, 5 days per week for 8 weeks. Forty-eight hours after the last session of physical exercise, the animals were anesthetized and underwent extraction of the quadriceps for the analysis of intracellular proteins by immunoblot technique and enzyme activities. Our results showed that aging reduces levels of SIRT-1 proteins (45%), PGC-1α (39%) and AMPK (40%) phosphorylation when compared with young rats. On the other hand, the group that exercised to 0.8 km/h increased protein levels and phosphorylation of these molecules, when compared with NE rats, but this increase was higher in young rats. Rats that exercised at 1.2 km/h showed increased levels of SIRT-1, PGC-1α and AMPK phosphorylation, when compared to animals trained to 0.8 km/h, but there was no statistical difference when compared rats young and old adults. It was observed that age-related declines in AMPK, SIRT-1 and PGC-1α molecules can be largely ameliorated by exercise. However, the data demonstrated that, to achieve changes in SIRT-1, PGC-1α and AMPK that are comparable in magnitude with in young rats, higher intensities of exercise are necessary for older adults rats. / O envelhecimento está associado ao declínio da função mitocondrial, que é controlada principalmente através do coativador 1 alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PGC-1α), sirtuína 1 (SIRT-1) e proteína quinase ativada por AMP (AMPK). Por outro lado, o exercício é conhecido por controlar os níveis de SIRT-1 e PGC-1α e a fosforilação da AMPK, porém os efeitos da intensidade do exercício sobre estas moléculas não foi totalmente investigado. O presente estudo objetivou investigar o efeito da corrida a 0,8 e 1,2 km/h nos níveis proteicos da SIRT-1 e PGC-1α e na fosforilação da AMPK em músculo esquelético de ratos adultos velhos. Para tal, ratos Wistar machos jovens com dois meses de idade e adultos velhos com dezoito meses de idade, pesando 218±10 e 526±12 g, respectivamente, foram divididos nos grupos (n=6): não exercitado (NE); exercitado em 0,8 km/h (0,8 km/h) e exercitado em 1,2 km/h (1,2 km/h). Os animais dos grupos exercício foram submetidos à corrida em velocidade constante de 0,8 km/h ou 1,2 km/h sem inclinação, 50 minutos/dia, 5 dias/semana, por 8 semanas. Quarenta e oito horas após a última sessão de execício físico, os animais foram anestesiados e realizou-se a extração do quadríceps para as análises de proteicas pela técnica de imunoblot e atividades enzimáticas. Os resultados mostraram que o envelhecimento reduz os níveis de SIRT-1 (45%), PGC-1α (39%) e a fosforilação da AMPK (40%), quando comparados com ratos jovens. Por outro lado, o grupo exercitado a 0,8 km/h aumentou os níveis proteicos e a fosforilação destas moléculas, quando comparados com ratos NE, mas este aumento foi maior em ratos jovens. Ratos exercitados a 1,2 km/h mostraram aumento dos níveis de SIRT-1, PGC-1α e fosforilação da AMPK, quando comparado aos animais exercitados a 0,8 km/h, mas não houve diferença estatística quando comparado os ratos jovens e adultos velhos. Os declínios relacionados à idade nas moléculas AMPK, SIRT-1 e PGC-1α podem ser melhorados pelo exercício físico. No entanto, os dados demonstraram que, para atingir mudanças na SIRT-1, PGC-1α e AMPK que são comparáveis em magnitude com os ratos jovens, maiores intensidades de exercícios são necessárias para os ratos adultos velhos.

O tema desta pesquisa é a influência da atividade de minhocas no solo de uma vertente do Planalto Atlântico Paulista. O local estudado está cercado por áreas de preservação ambiental, possui florestas primárias em bom estado de conservação e apresenta clima quente com precipitações acima dos 2.000 mm por ano. Foi feito um levantamento das comunidades de anelídeos a partir de três diferentes técnicas de extração. Os organismos coletados foram identificados em nível de espécie e sua distribuição foi analisada ao longo da topografia. Demonstrou-se uma variação das populações de minhocas nos três setores da vertente, com maiores densidades no sopé e menores no topo. Verificou-se que há uma intensa atividade desses organismos no solo e que eles não se distribuem igualmente no perfil vertical, concentrando-se em algumas camadas, às vezes superficiais às vezes subsuperficiais, de acordo com o tipo de solo. Observou-se também a presença de espécies exóticas nas áreas antrópicas. Foi constatado que a atividade desses organismos modifica a morfologia (bioagregação) e também os atributos físicos (macroporosidade; bioporos) e químicos do solo (teores de matéria orgânica e dos nutrientes P, K+, Ca2+ e Mg2+; soma de bases; capacidade de troca catiônica), influenciando diversos processos pedológicos. Com seus comportamentos ecológicos (alimentar e construtor), as minhocas criam galerias, canais e produzem dejeções, ajudando na aeração do solo, na dinâmica hídrica e no processo de ciclagem dos nutrientes. Apesar do papel que desempenham na formação da cobertura pedológica, a maior parte dos levantamentos de solo não contempla os agregados biogênicos, por este motivo, demos ênfase especial à descrição destas morfologias. / The focus of this research is the activity of earthworms and their influence on the soil of an Atlantic Plateau hill slope in São Paulo State. Our area of study is surrounded by environmental preservation areas, it has primary forests in good conditions, warm climate and precipitations above 2,000 mm per year. Three different extraction techniques were used for the survey of annelid communities. The collected organisms were identified at the species level and its distribution was analyzed along the topography. We found a variation of earthworm populations in the three sectors of the slope, with the highest densities in the foothills and lower densities in the top. There is an intense activity of these organisms in the soil and they are not equally distributed in the vertical profile, concentrating on a few layers, sometimes in topsoil, sometimes in subsoil. We also observed the presence of exotic species in disturbed areas. The activity of soil fauna changes the morphology (bioaggregation), the physical (macroporosity), and chemical (P, K+, Ca2+, Mg2+ and organic matter dynamics, sum of bases and cation exchange capacity) attributes of soil, affecting many pedological processes. With their feeding and builder ecological behaviors, earthworms create galleries, channels and produce casts, helping in soil aeration, the water dynamics and nutrient cycling processes. Despite the role they play in the formation of soil mantle, most of the ground surveys does not include the biogenic aggregates, therefore, we gave special emphasis on the descriptions of such morphologies.

Atualmente no Brasil mais da metade da população adulta tem excesso de peso e 21% estão obesos. A obesidade é uma doença que se encontra em evidente crescimento, sendo considerada a epidemia do século XXI. Como alternativa de tratamento e prevenção, o uso de ácidos graxos que possuem habilidade de induzir a expressão de genes com importante papel em modulações metabólicas e mitocondriais têm sido estudados. O ácido linoleico conjugado (CLA, 18:2) é da família ômega-6, descrito por sua propriedade antiobesidade relacionada à diminuição da adiposidade e ao aumento do metabolismo corporal. O óleo de peixe (OP) é uma mistura de ácidos graxos poli-insaturados eicosapentaenóico (EPA, 20:5) e docosahexaenóico (DHA, 22:6) da família ômega-3, conhecido por aumentar a sensibilidade à insulina, o colesterol-HDL, pelas suas propriedades antiinflamatórias e sua ação protetora sobre o sistema nervoso. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da suplementação da dieta de camundongos C57BL6 com CLA em conjunto com OP durante 60 dias sobre aspectos bioquímicos, moleculares e fisiológicos do metabolismo mitocondrial e corporal. Verificamos que a suplementação da dieta com CLA e OP in vivo: aumenta o metabolismo corporal, efeito atribuído à ambos os óleos; prejudica o metabolismo da glicose circulante, proporcionado exclusivamente pelo CLA; reduz o nível de movimentação, proporcionado exclusivamente pelo OP. No fígado: aumenta a expressão de UCP2, a atividade de proteínas desacopladoras e a ?- oxidação, efeito atribuído à ambos os óleos; aumenta o número de mitocôndrias, proporcionado exclusivamente pelo OP. CLA aumenta a produção de espécies reativas de O2 (EROs) a qual é revertida pelo OP em conjunto. No músculo sóleo: aumenta a biogênese mitocondrial via PGC- 1? e a expressão de UCP2, proporcionados pelo OP. Por fim, no hipocampo: aumenta o número de mitocôndrias, estimulo dado por ambos os óleos; aumenta a atividade desacopladora e reduz a produção de EROs, proporcionados exclusivamente pelo CLA. Concluímos que na suplementação conjunta os efeitos do OP são predominantes nos metabolismos corporal, hepático e muscular, e na movimentação corporal, enquanto que o efeito predominante do CLA é a diminuição na sensibilidade à insulina. Já no cérebro, o OP potencializa os efeitos do CLA. / Currently in Brazil more than a half of adult population has overweight, and 21% are obese. This evident growing disease is considered the 21th century\'s epidemy. Some fatty acids have been considered an alternative treatment and prevention strategy for obesity due to their ability to stimulate gene expression with important role in cellular and mitochondrial metabolisms. Conjugated linoleic acid (CLA, 18:2) from omega-6 family, with anti-obesity properties related to diminution of adiposity and increments in body metabolism. The fish oil (FO) is a mixture of the poli-unsaturated fatty acids eicosapentaenoic (EPA, 20:5) and docosahexaenoic (DHA, 22:6) from omega-3 family, known for improving insulin sensibility and HDL-cholesterol, anti-inflammatory properties and protective action over the central nervous system. The objective of this study was to examine the effects of dietary supplementation of CLA in conjunction with FO during 60 days over biochemical, molecular and physiological aspects of mitochondrial and body metabolism in C57BL6 mice. Diet supplementation with CLA and FO in vivo: raise body metabolism, an effect attributed to both oils; affect glucose metabolism, exclusively proportionate by CLA; diminish the level of mice movement, exclusively proportionate by FO. In liver: increase UCP2 expression, uncoupling proteins activity and ?-oxidation, stimulated by both oils; increase mitochondrial density, exclusively proportionate by FO. CLA also raises the reactive oxygen species (ROS) production, which is reversed by FO in conjunction. In soleus muscle: increase mitochondrial biogenesis through PGC-1? and the UCP2 expression, exclusively proportionate by FO. Lastly, in hippocampus: increase mitochondrial density, stimulated by both oils; stimulate uncoupling activity and diminish ROS production, exclusively proportionate by CLA. In conclusion, in the dietary supplementation with CLA and FO in conjunction the FO effects are prevalent in metabolisms of body, liver and muscle, and in body movement, while the CLA effects are prevalent in decreasing insulin sensitivity. However in the brain, the FO potentiates the effects of CLA.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Acute liver failure (ALF) induced by acetaminophen (APAP) is a complex process associated with glutathione (GSH) depletion, energetics metabolism changes and mitochondrial dysfunction, resulting in the impairment of maintenance of tissue normal function. On this matter, organoselenium compounds, such as diphenyl diselenide (PhSe)2, have been highlighted in the last years due to the antioxidant properties and the hepatoprotective effects, however, the (PhSe)2 hepatoprotection mechanism remains unclear. So, this work was aimed to deepen into understanding of the effects of (PhSe)2 on the mitochondrial dysfunction as well as the signaling pathway during the ALF induced by APAP. Firstly, it was performed a comparative study between the organoselenium compound and the classical antidote (N-acetylcysteine, NAC) in the liver homogenate. (PhSe)2 presented similar results to the NAC reducing the oxidative damage markers, maintaining the GSH levels and enhancing the survival after the APAP overdose. The treatment with (PhSe)2 reduced plasmatic levels of transaminases (aspartate and alanine aminotransferase) and the morphological/histological changes. In addition, (PhSe)2 was able to reduce significantly the oxidative damage such as lipid peroxidation, reactive oxygen and nitrogen species generation, mitochondrial protein carbonylation and mitochondrial viability after ALF induced by APAP. In this context, the levels of non enzymatic antioxidants, such as GSH, and enzymatic antioxidants, such as catalase, Mn superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione reductase remained to the control levels. In general, the results noticed in this work the probably (PhSe)2 mechanism is closely related with the maintenance of antioxidant defense system and inhibition of mitochondrial transition permeability (MPT) indicated by reduction of mitochondrial swelling, activity preservation of respiratory complexes I, II and ATPase, and maintenance of H+ gradient with the mitochondrial membrane potential (Δψm) generation. It was observed that (PhSe)2 was able to limit the impairment of mitochondrial bioenergetics function with the normalization of oxidative phosphorilation (OXPHOS) and activation of heat shock protein pathway through the enhance of HSP70 levels, which in turn, modulates the MPT protecting the mitochondrial viability. (PhSe)2 treatment was able to maintain the appropriated levels of cytokines associated with the liver recovery, such as tumoral necrosis factor alfa (TNF-α), interleukin 6 (IL-6) and nuclear factor kappa B (NF-κB). Moreover, the integrity of cellular bioenergetic function could be associated with the increase of peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator (PGC-1α), helping to restore the nuclear respiratory factor 1 (NRF1) levels associated with the mitochondrial biogenesis. Finally, (PhSe)2 could be a useful therapeutic alternative that would contribute to the liver recovery, controlling the quality of mitochondrial function and maintaining homeostasis and cellular health. / A insuficiência hepática aguda (IHA) induzida por paracetamol (APAP) é um processo complexo que envolve depleção de glutationa (GSH), mudanças no metabolismo energético e disfunção mitocondrial, o que resulta na incapacidade de manter o funcionamento adequado do órgão. Neste contexto, a utilização de compostos orgânicos de selênio como o difenil disseleneto (PhSe)2 tem se destacado nos últimos anos, devido as propriedades antioxidantes e efeitos hepatoprotetores, no entanto, o mecanismo pelo qual (PhSe)2 age não está totalmente esclarecido. Assim, este estudo busca aprofundar nossos conhecimentos sobre as ações do (PhSe)2 na disfunção mitocondrial assim como a sinalização intracelular durante a IHA induzida por APAP. Para tanto, estabelecemos primeiramente um parâmetro comparativo entre o composto orgânico de selênio e o antídoto clássico (N-acetil cisteina, NAC), em homogenato. O (PhSe)2 foi tão efetivo quanto NAC reduzindo os marcadores de dano oxidativo, auxiliado na manutenção dos níveis de GSH e aumentando o tempo de sobrevivência após a intoxicação por APAP. O tratamento com (PhSe)2 reduziu alterações morfológica, minimizou o dano quando analisamos histologicamente o tecido hepático e determinou uma redução nos níveis plasmáticos dos indicadores de dano hepatocelular (AST e ALT). Além disso, o (PhSe)2 foi eficaz na redução significativa do dano oxidativo ao limitar a peroxidação lipídica, formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, carbonilação de proteínas mitocondriais e viabilidade mitocondrial após a IHA induzida por APAP. Neste contexto, os níveis de antioxidantes não enzimáticos, tais como GSH, e enzimáticos, tais como as enzimas catalase, manganês superoxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa redutase, também foram mantidos semelhantes ao grupo controle. Em geral os resultados observados neste estudo indicam que um importante mecanismo pelo qual o (PhSe)2 exerce os seus efeitos terapêuticos está relacionado a manutenção da atividade do sistema de defesa antioxidante e inibição da transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) indicados pela redução do inchaço mitocondrial, preservação da atividade dos complexos respiratórios I, II e ATPase, e manutenção do gradiente de H+ com a formação do potencial de membrana mitocondrial (Δψm). Também observamos que o (PhSe)2 limita a perda do funcionamento bioenergético mitocondrial com a manutenção dos níveis adequados de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e ativa a via das proteínas do choque térmico aumentando a expressão de HSP70, a qual apresenta um efeito modulador importante sobre a MPT preservando a viabilidade mitocondrial. O tratamento com (PhSe)2 foi efetivo em preservar níveis apropriados de citocinas envolvidas na recuperação do tecido hepático, tais como fator de necrose tumoral alfa (TNF- α), interleucina 6 (IL-6) e fator nuclear kappa B (NF-κB). Além disso, a manutenção bioenergética celular poderia estar associada com os elevados níveis transcricionais do receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PGC-1α) que auxilia a restaurar os níveis de fator nuclear respiratório 1 (NRF1) os quais estão envolvidos no processo de biogênese mitocondrial. Por fim, o (PhSe)2 poderia ser uma importante alternativa terapêutica a qual auxiliaria na recuperação do fígado, controle de qualidade mitocondrial e manutenção da homeostase e saúde celular.