Les transformacions catalitzades per enzims s’utilitzen cada cop més per a la síntesis d’intermediaris útils destinats a les indústries farmacèutiques, agroalimentàries i de química fina. La utilització d’enzims en síntesi química compleix amb els principis de la “química verda”, com per exemple en la utilització de solvents més segurs (les reaccions enzimàtiques són realitzades usualment, en medi aquós), en el disseny de reaccions amb millor eficiència energètica (les reaccions enzimàtiques es realitzen, sovint, a T ambient), i en la utilització de catalitzadors (els enzims ho són) entre d’altres. La majoria de molècules amb interès farmacèutic o emprades en la “química fina” posseeixen al menys un centre quiral i donades les propietats de quimioselectivitat, regioselectivitat i estereoselectivitat dels enzims, fan que aquests siguin òptims, per a la síntesi d’aquestes molècules. Diversos diols, com 1,3-propàdiol, 1,2-propàdiol, 2,3-butàdiol i 1,4-butàdiol, es consideren productes químics bàsics (“plattform chemicals”) a causa de les seves moltes aplicacions en la indústria, incloent la síntesi de productes químics especials i el seu ús com a precursors de polímers. A més, el 2,3-butàdiol s'ha utilitzat com un agent anticongelant (la forma de l’estereoisòmer (2R,3R)-2,3-butàdiol té un punt de congelació -60 ° C) i com un precursor de diversos compostos, a través de reaccions de deshidratació (obtenint metil etil cetona, que es pot utilitzar com un additiu de combustible), deshidrogenació (donant compostos aromatitzants com acetoïna i diacetil) i esterificació (donant precursors de fàrmacs i plastificants) En el nostre laboratori hem caracteritzat l’enzim Bdh1p de Saccharomyces cerevisiae, implicat en la síntesi de acetoïna i 2,3-butàdiol, que són productes del metabolisme del llevat. També hem caracteritzat l’activitat diacetil reductasa depenent de NADH dels enzims Bdh1p i Adh2p; així com l’activitat diacetil reductasa depenent de NADPH de l’enzim Ara1p. El primer objectiu d’aquesta Tesi és emprar el potencial biotecnològic de Bdh1p en la síntesi de molècules amb dos grups hidroxil veïns amb configuració R, en concret: (2R,3R)-2,3-butàdiol, (2R,3R)-2,3-pentàdiol, (2R, 3R)-2,3-hexàdiol i (3R,4R)-3,4-hexàdiol. Aquesta síntesi s’ha fet a partir de precursors (dicetones) i a diferents nivells: enzims purs (incloent enzims de regeneració de coenzim), soques de llevat que els sobre-expressen i una proteïna de fusió entre Bdh1p i formiat deshidrogenasa. El segon objectiu de la Tesi és estudiar la estereoselectivitat de diferents aldo-ceto reductases (tant de llevat, com humanes) i la seva utilització en la síntesi d’hidroxicetones i diols derivats de dicetones veïnes. El tercer objectiu de la Tesi és desenvolupar una tècnica d’autoclonació per llevat que permeti introduir mutacions específiques en el DNA, sense la introducció d'elements extra que pertorbin el context cromosomal dels gens. El seu ús en soques industrials evitarà la presència de gens que produeixin resistència a antibiòtics i en general de DNA forà a l'organisme. Aquesta tècnica s’ha aplicat per la construcció de soques de llevat que sobre-expressin Bdh1p des de un promotor activable per galactosa. També s’ha utilitzat per introduir mutacions específiques en el gen ADH1de llevat, de manera que s'alteri la seva preferència de coenzim. S’han estudiat els efectes d’aquestes mutacions puntuals en les corbes de creixement de les soques de llevat modificades, en diferents fonts de carboni. / Summary The transformations catalyzed by enzymes are increasingly used for the synthesis of intermediates used in pharmaceutical, food processing and fine chemicals. The use of enzymes in chemical synthesis complies with the principles of "green chemistry", such as the use of safer solvents (enzymatic reactions are usually performed in aqueous medium), the design of reactions with greater efficiency in the use of energy (enzymatic reactions are performed often at ambient T), and the use of catalysts (as enzymes are). Most molecules with pharmaceutical interest or used in "fine chemical" have at least one chiral center and given the properties of chemoselectivity, regioselectivity and stereoselectivity of enzymes, make them an optimal choice for the synthesis of these molecules. Several diols such as 1,3-propanediol, 1,2, 2,3 and 1,4-butanediol are considered basic chemicals ("Plattform chemicals") because of their many applications in industry, including the synthesis of specialty chemicals and their use as precursors of polymers. In addition, 2,3-butanediol has been used as an antifreeze agent (the stereoisomeric form (2R, 3R) -2,3-butanediol has a freezing point of -60 ° C) and as a precursor of several compounds through reactions of dehydration (obtaining methyl ethyl ketone, which can be used as a fuel additive) dehydrogenation (giving flavoring compounds, as acetoin and diacetyl) and esterification (giving precursors of drugs and plasticizers). In our laboratory, we characterized the enzyme Bdh1p from Saccharomyces cerevisiae involved in the synthesis of acetoin and 2,3-butanediol, which are products of the metabolism of the yeast. We have also characterized the diacetyl reductase activities, NADH-dependent of Bdh1p, Adh2p as well as the diacetyl reductase activity of the NADPH-dependent enzyme Ara1p. The first objective of this thesis is to use the potential biotechnological use of Bdh1p in the synthesis of molecules with two neighbors hydroxyl groups, in R configuration, namely: (2R, 3R) -2,3-butanediol (2R, 3R) -2 3-pentanediol (2R, 3R) -2,3-hexanediol and (3R, 4R) -3.4-hexanediol. These syntheses were made from precursors (diketones) at different levels: pure enzymes (including enzymes for coenzyme regeneration) yeast strains that over-express a fusion protein between Bdh1p and formate dehydrogenase. The second aim of the thesis is to study the stereoselectivity different aldo-keto reductase (both yeast and human) and their use in the synthesis of diols and hydroxy derivatives diketone neighbors. The third objective of the thesis is to develop a technique that allows “self-cloning” in yeast to introduce specific mutations in DNA, without introducing extra elements that disturb the context of chromosomal genes. Its use in industrial strains avoids the presence of genes that cause antibiotic resistance and overall foreign DNA of the organism. This technique has been applied to the construction of yeast strains that over-express Bdh1p from a promoter activated by galactose. It has also been used to introduce specific mutations in the yeast gene ADH1, which altered its preference for the coenzyme. We also studied the effects of these mutations on the growth curves of the modified yeast strains in different carbon sources.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-02-21Bitstream added on 2014-06-13T18:47:11Z : No. of bitstreams: 1 borges_m_dr_rcla.pdf: 2628207 bytes, checksum: 40dbe735f136f584dd31579f48cda251 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho aborda a taxonomia, distribuição batimétrica e biologia reprodutiva da classe Ophiuroidea. O material utilizado é procedente dos programas Biodiversidade Bêntica Marinha no Estado de São Paulo- BIOTA/FAPESP-Bentos Marinho, Avaliação do Potencial Sustentável dos Recursos Vivos da Zona Econômica Exclusiva- REVIZEE/Score Sul-Bentos e Utilização Racional dos Ecossistemas Costeiros da Região Tropical Brasileira: Estado de São Paulo- INTEGRADO/Subprojeto Bentos. A área de coleta abrange os Estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Os ofiuróides foram amostrados na região entremarés de praias arenosas, costões rochosos e fauna associada a algas, na plataforma e talude continental, até cerca de 800 m de profundidade, com maior riqueza de espécies na região da plataforma continental. Ao todo foram analisados 28.942 ofiuróides pertencentes a 39 espécies e 8 famílias. Amphiuridae foi a família mais representativa, principalmente na região da plataforma interna, seguida por Ophiuridae, que ocorreu principalmente em áreas de maior profundidade. Quatro espécies representam novos registros para o Brasil, Amphiodia trychna, Ophiochiton ternispinus, Ophiura (Ophiuroglypha) clemens e Ophiomusium eburneum. Ophiomusium acuferum, Ophiactis lymani e Ophiactis savignyi foram redescritas e discutidas esclarecendo equívocos de identificação. O estudo da distribuição batimétrica das espécies mostrou que os padrões observados são semelhantes aos descritos na literatura e estas foram agrupadas de acordo com os ambientes e faixas batimétricas em que ocorrem. A análise histológica das gônadas de Ophioderma januarii permitiu definir o padrão reprodutivo da espécie, a qual é gonocorística, reproduz-se durante todo ano, apresenta um aumento na atividade gonadal nos meses mais quentes e tipo de desenvolvimento lecitotrófico. / The present work approached the taxonomy, bathymetric distribution and reproductive biology of the Class Ophiuroidea. All material used came from three projects: Biodiversidade Bêntica Marinha no Estado de São Paulo- BIOTA/FAPESP-Bentos Marinho, Avaliação do Potencial Sustentável dos Recursos Vivos da Zona Econômica Exclusiva- REVIZEE/Score Sul-Bentos and Utilização Racional dos Ecossistemas Costeiros da Região Tropical Brasileira: Estado de São Paulo- INTEGRADO/Subprojeto Bentos. Study area enclosed the Brazilian States of Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina and Rio Grande do Sul. Ophiuroids were sampled from sandy beaches, sea shores and seaweed as associated fauna, continental shelf and continental slope (until ca. 800 m depth). It was analyzed 28.942 ophiuroids from 39 species and 8 families, and the highest species richness occurred on the continental shelf. Amphiuridae was the most representative family, mainly on the internal continental shelf, followed by Ophiuridae, which mainly occurred in greater depth areas. Four species are new registers to Brazil, Amphiodia trychna, Ophiochiton ternispinus, Ophiura (Ophiuroglypha) clemens and Ophiomusium eburneum. Ophiomusium acuferum, Ophiactis lymani and Ophiactis savignyi were redescribed and discussed, clarifying identification mistakes. The study of the bathymetric distribution of the species showed that the observed patterns were very similar to that described in other studies, and species were grouped according to the environment and bathymetric zones in which they occurred. The reproductive pattern of the gonochoric Ophioderma januarii was described by gonadal histological analysis; this species, that has a lecitotrophic development, reproduced continuously, with a gonadal activity increase during warmer months.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-08Bitstream added on 2014-06-13T19:29:42Z : No. of bitstreams: 1 morais_srl_me_araca.pdf: 668111 bytes, checksum: 130195c7308c7b36db007a5b4626ae68 (MD5) / Os mecanismos envolvidos na adaptação do tecido muscular à prática de exercícios aeróbios, já está bem elucidada em diversos estudos. Essa adaptação ocorre por meio de um processo de reparo desencadeado por dano muscular (processo inflamatório). O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da suplementação com L-arginina sobre os mecanismos envolvidos na liberação de mediadores inflamatórios e fatores regenerativos do tecido muscular esquelético após uma simples sessão de exercício resistido (ER) de alta intensidade, e avaliar o possível papel protetor da L-arginina sobre os efeitos desencadeados pelo ER no tecido muscular esquelético. Ratos machos Wistar foram divididos em 5 grupos: (grupo controle (C), pós-exercício(0), 8, 24 e 48 horas pós-exercício), suplementados com L-arginina (1 g/kg) uma hora antes do início do exercício, ou aminoguanidina (50 mg/kg) 30 minutos antes do início do treino, ambos por gavagem. Os animais foram submetidos a prática do TR durante 4 dias por meio de uma escada com 80° de inclinação, e com aparato de sobrepeso, correspondentes à 80% do peso corporal de cada animal, acoplado aos animais somente no quarto dia de treinamento. O sangue periférico e o tecido muscular esquelético (extensor digitorum longus) foram coletados para a análise de Mieloperoxidase (MPO), fator de necrose tumoral (TNF-α), citocina-induzida quimiotática para neutrófilos (CINC-2), fator transformador de crescimento (TGF-β), Colágeno tipo 1, Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), creatina quinase (CK), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e a Proteína C Reativa (CRP) por RT-PCR e ELISA. A suplementação com L-arginina promoveu grande redução na migração de neutrófilos no tecido muscular esquelético, na produção de TNF-α, CINC-2 e CRP... / The mechanisms involved of muscular adaptation to aerobic exercise have previously been described in several studies. This adaptation occurred through a repair process following tissue damage (inflammatory process). The aim of this study was to analyze the effect of the L-arginine supplementation upon the mechanisms involved on release of inflammatory mediators and regenerative factors of skeletal muscle tissue post a single bout of high intensity of resistance exercise (RE), and evaluate the possible protective role of L-arginine supplementation in the effects of RE in skeletal muscle tissue. Male Wistar rats were divided into 5 groups: (control group (C), post-exercise (0), 8, 24 and 48 hours post-exercise), with L-arginine (1 g/kg) one hour before training began or aminoguanidine (50 mg/kg), 30 minutes before starting training, both by gavage. The animals were subjected to RE practice for four days, through a staircase with 80° tilt, with the overload apparatus corresponding to 80% relative to the body weight on the fourth day. Peripheral blood plasma samples, skeletal muscle (extensor digitorum longus) were collected for analysis of myeloperoxidase (MPO), tumor necrosis factor (TNF-α), cytokine-induced neutrophil chemoattranct-2 (CINC-2), transforming growth factor β (TGF-β), Collagen type 1, vascular endothelial growth factor (VEGF), creatine kinase (CK), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and C-Reactive protein (CRP) by RT-PCR and ELISA. L-arginine promoted a great reduction in neutrophil migration, TNF-α, CINC-2 and CRP, and up-regulated the regenerative factors of skeletal muscle (TGF-β, collagen type 1 and VEGF). Aminoguanidine pre-treatment reversed... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422149-Texto+Completo-0.pdf: 415747 bytes, checksum: c509f9409deb999a7bde0e7f31c283e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Salmonella Enteritidis is a common foodborne pathogen that causes gastroenteritis and systemic infections in humans. The characterization of this bacterium is essential for epidemiological studies. In this context, two molecular methods, MLST and FAFLP, were tested for characterization of 32 S. Enteritidis isolates obtained from South of Brazil, as well as five isolates obtained from other geographical areas. Four isolates of different serovars of Salmonella (S. Panama, S. Senftenberg, S. Typhimurium and Salmonella [4,5:-:1,2]) were included as outgroup. These two techniques were already used to analyze different Salmonella serovars, but this study is the first to use them to discriminate the same S. Enteritidis isolates. The MLST scheme was performed with two housekeeping genes (hemD and mdh) combined with two virulence genes (ssaQ and slyA) to improve the discriminatory power of method. Both methods presented high discriminatory indexes calculated by Simpson’s index of diversity, 0. 99 and 0. 88 for FAFLP and MLST, respectively. These methods were efficient to differentiate isolates of distinct Salmonella serovars, but did not distinguish isolates probable epidemiologically non-related, and also did not group isolates of same phage type. These results suggested that these two techniques can be used as a tool for the epidemiological molecular characterization of S. Enteritidis isolates. / A Salmonella Enteritidis é uma das principais bactérias causadoras de gastrenterite, também podendo ser responsável por doenças sistêmicas. A adequada caracterização deste microrganismo é essencial nos estudos epidemiológicos. Neste contexto, este estudo avaliou a utilização de dois métodos moleculares, Tipificação por Sequenciamento de Múltiplos loci (MLST) e Análise de Fragmentos Polimórficos Amplificados e Fluorescentes (FAFLP), para a diferenciação de 32 isolados de S. Enteritidis oriundos de diferentes fontes do sul do Brasil, bem como de cinco isolados de S. Enteritidis provenientes de outras áreas geográficas. Também foram incluídos neste estudo quatro isolados pertencentes a outros sorovares (S. Panama, S. Senftenberg, S. Typhimurium e Salmonella [4,5:-:1,2]. As duas técnicas escolhidas para este trabalho já foram empregadas concomitantemente para analisar diferentes sorotipos de Salmonella, mas este estudo é o primeiro a utilizá-las para a diferenciação de um mesmo grupo de isolados de S. Enteritidis. O esquema desenvolvido para o MLST incluiu a amplificação de fragmentos de dois genes constitutivos (hemD e mdh) combinado com dois genes de virulência (ssaQ e slyA), aumentando, assim, a capacidade discriminatória do método. Ambas as técnicas apresentaram altos índices de poder discriminatório, calculados pelo índice de diversidade de Simpson, 0,99 e 0,88 para FAFLP e MLST, respectivamente. Além disso, os métodos avaliados também mostraram-se eficientes na discriminação de isolados de diferentes sorovares de Salmonella. Entretanto, a FAFLP e a MLST não foram capazes de diferenciar isolados provavelmente não relacionados epidemiologicamente, bem como não agruparam isolados pertencentes a um mesmo fagotipo. Desta forma, os resultados obtidos sugerem que ambas as técnicas podem ser ferramentas úteis para a análise epidemiológica molecular de isolados de Salmonella, inclusive para um sorovar com grande homogeneidade genética como a S. Enteritidis.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000442543-Texto+Completo-0.pdf: 1310049 bytes, checksum: b871097892a0a347db7e651a3cb4154d (MD5) Previous issue date: 2012 / Liver fibrosis is the wound healing response to repeated injury of the liver. It is characterized by disruption of the liver architecture associated with increased expression of extracellular matrix components. Hepatic stellate cells (HSCs) play a key role in the process of fibrogenesis. In normal liver, HSCs are quiescent and its main function is to store vitamin A. During liver injury, these cells undergo activation, become myofibroblasts and acquire fibrogenic properties. Capsaicin, the active ingredient of red pepper has been extensively studied in recent years for possessing a wide range of pharmacological properties, including analgesic, anti-inflammatory, antiproliferative and anticarcinogenic in a variety of cell types. Therefore, the aim of this study was to investigate the in vitro effects of capsaicin on deactivation, differentiation and proliferation of HSCs, besides studying the possible mechanisms involved. The results showed that capsaicin is capable of inducing the quiescent phenotype in HSCs via PPARγ activation and blockage of TGF-β signaling. Increased levels of antifibrotic cytokines (IFN-γ and IL-10) and the reduction of pro-inflammatory and pro-fibrotic mediators (COX-2, MCP-1, type I collagen) showed that capsaicin inhibits the activation and migration of these cells. Furthermore, the mechanism used by capsaicin to inhibit cell proliferation is via cell cycle arrest. These findings demonstrate that capsaicin has the potential to be a novel therapeutic agent in the treatment of liver fibrosis due to its antifibrogenic and antiproliferative actions. / A fibrose hepática é a resposta cicatricial do fígado a lesões repetidas, caracterizada pelo rompimento da arquitetura hepática associada ao aumento da expressão dos componentes da matriz extracelular. As células estreladas hepáticas (HSCs) desempenham um papel-chave no processo de fibrogênese. No fígado normal, as HSCs encontram-se em sua forma quiescente de depósito de vitamina A. Durante a lesão hepática, essas células passam por uma ativação fenotípica, tornam-se miofibroblastos e adquirem propriedades fibrogênicas. A capsaicina, princípio ativo da pimenta vermelha, tem sido muito estudada nos últimos anos por possuir uma extensa gama de propriedades farmacológicas, que incluem efeitos analgésicos, anti-inflamatórios, antiproliferativos e anticarcinogênicos em uma variedade de tipos celulares. Por essa razão, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos in vitro da capsaicina na inativação, diferenciação e proliferação das HSCs, além de estudar os possíveis mecanismos envolvidos. Os resultados obtidos mostraram que a capsaicina é capaz de induzir o fenótipo quiescente nas HSCs via ativação de PPARγ e bloqueio da sinalização de TGF-β. O aumento nos níveis de citocinas antifibróticas (IFN-γ e IL-10) e a diminuição de mediadores próinflamatórios e pró-fibróticos (COX-2, MCP-1, colágeno tipo I) comprovaram que a capsaicina inibe a ativação e migração dessas células. Além disso, o mecanismo utilizado pela capsaicina para inibir a proliferação celular é via parada do ciclo celular. Essas descobertas mostram que a capsaicina tem potencial para ser um novo agente terapêutico no tratamento da fibrose hepática devido a suas ações antifibrogênicas e antiproliferativas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448460-Texto+Completo-0.pdf: 1711084 bytes, checksum: 65dd3daa12164398aab7aa839028c683 (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis remains as one of the main cause of mortality worldwide due to a single infectious agent, Mycobacterium tuberculosis. The aroK-encoded Mycobacterium tuberculosis Shikimate Kinase (MtSK), shown to be essential for survival of bacilli, catalyzes the phosphoryl transfer from ATP to the carbon-3 hydroxyl group of shikimate (SKH), yielding shikimate-3-phosphate and ADP. Here we present purification to homogeneity, and oligomeric state determination of recombinant MtSK. Biochemical and biophysical data suggest that the chemical reaction catalyzed by monomeric MtSK follows a rapid-equilibrium random order of substrate binding, and ordered product release. Isothermal titration calorimetry (ITC) for binding of ligands to MtSK provided thermodynamic signatures of non-covalent interactions to each process. A comparison of steady-state kinetics parameters and equilibrium dissociation constant value determined by ITC showed that ATP binding does not increase the affinity of MtSK for SKH. In addition, there appears to be a positive free energy coupling of 3. 2 kJ mol-1 for SKH binding to MtSK:Mg2+ATP binary complex, which suggest that ATP displays negative cooperativity for SKH binding. We suggest that MtSK would more appropriately be described as an aroL-encoded type II shikimate kinase. Our manuscript also gives thermodynamic description of SKH binding to MtSK and data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction. The negative value for the change in constant pressure heat capacity (ΔCp) and molecular homology model building suggest a pronounced contribution of desolvation of non-polar groups upon binary complex formation. Thermodynamic parameters were deconvoluted into hydrophobic and vibrational contributions upon MtSK:SKH binary complex formation. Data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction are interpreted in light of astructural model to try to propose the likely amino acid side chains that are the proton donors to bulk solvent following MtSK:SKH complex formation. / A tuberculose se mantém como uma das principais causas de mortalidade ao redor do mundo devido a um único agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. O gene aroK que codifica a enzima Chiquimato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtSK), que se mostrou essencial para a sobrevivência do bacilo, catalisa a transferência de um grupo fosforil do ATP para o chiquimato (SKH), resultando em chiquimato-3-fosfato e ADP. O presente trabalho apresenta a purificação da proteína MtSK até a homogeneidade e a determinação de seu estado oligomérico em solução. Estudos bioquímicos e biofísicos apresentados nesta tese sugerem que a reação catalisada pela MtSK monomérica segue um mecanismo de equilíbrio rápido ordenado aleatório na adição dos substratos e uma liberação ordenada sequencial dos produtos. A análise por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) das interações não covalentes da enzima MtSK com diferentes ligantes resultou na determinação de assinaturas termodinâmicas para cada um desses eventos de ligação.A comparação entre as constantes de afinidade obtidas por espectrofotometria e ITC demostraram que o ATP não aumenta a afinidade da proteína MtSK pelo SKH. Além disso, foi determinada em + 3,2 kJ mol-1 a energia livre de acoplamento do SKH ao complexo binário MTSK:Mg2+ATP, sugerindo que o ATP possui uma cooperatividade negativa em relação ao SKH. Esse trabalho sugere que a MtSK deveria ser mais apropriadamente descrita como uma chiquimato quinase do tipo II codificada pelo gene aroL. Adicionalmente, estre trabalho demonstra a descrição termodinâmica do SKH se ligando a MtSK aonde os resultados sugerem o número de prótons que estão sendo trocados durante a interação bimolecular.O valor negativo encontrado para a capacidade calorífica em pressão constante (ΔCp) e o modelo molecular por homologia criado sugerem uma pronunciada contribuição na dessolvatação de grupos apolares relacionados à formação do complexo. As constantes termodinâmicas foram separadas na contribuição hidrofóbica e vibracional relacionadas à formação do complexo binário MtSK:SKH. Os resultados obtidos relacionados à transferência de prótons durante a formação do complexo binário foram analisados tendo como referência o modelo estrutural da enzima MtSK construído neste trabalho. De acordo com as cadeias laterais que fazem contato com o SKH no modelo proposto, se pode indicar que os aminoácidos Arg58 e Arg136 atuam como fonte de prótons durante a formação do complexo binário.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000397347-Texto+Completo-0.pdf: 984527 bytes, checksum: 31dff3f15a7d672c6b5eff5f99ffff0d (MD5) Previous issue date: 2007 / Acute Lung Injury (ALI) is a syndrome of acute respiratory failure that results from pulmonary inflammation and acute pulmonary edema caused by the increased permeability of the alveolar-capillary barrier. In ALI, capillary endothelium and alveolar epithelium damage occurs resulting from the release of proinflammatory molecules, mainly cytokines, as a response to systemic insults. Free radical production is another important pathologic mechanism mediated by neurophils, which are capable of developing several clinical disorders found in ALI. It is well known that endogenous glutamate production stimulates the release of many inflammatory mediators, including aracdonic acid metabolites, free radicals and nitric oxide (NO). The first report describing a possible involvement of NMDA receptors in pulmonary physiophatology was based on a treatment with a selective inhibitor to this receptor (MK-801) used for the prevention of pulmonary edema caused by the increase of NMDA instilled intratracheally in rats under mechanic ventilation. The aim of this study was to evaluate the use of NMDA receptor antagonist (MK-801) as a protection against the oxidative injury in experimental model of ALI. Adult male Wistar rats were used. The animals were randomly divided into four groups: (1) intratracheal instillation (I. T. ) of 1 mL isotonic saline (n=6); (2) ALI induction with intratracheal LPS (100 \g/100 g of body weight) plus treatment with saline administered intraperitoneally (I. P. ) after ALI (n=6); (3) ALI induction plus MK- 801 (0. 3 mg/kg administered I. P. ) after ALI (n=6); and (4) ALI induction plus MK-801 (0. 3 mg/kg administered I. T. ) after ALI (n=6). Twelve hours after the treatment, the animals were anesthetized for blood collection using retroorbital puncture and bronchoalveolar lavage (BAL) was collected as well. After that, the animals were killed by decapitation and lung tissue was colleted. The treatment with MK-801 promoted a decrease in the total protein concentration, LDH activity and in the total cell number in BAL. In the lung tissue we verified a decrease of the oxidative injury measured by TBARS and NO levels and an improvement in antioxidant levels such as CAT, SOD, GSH and SH. We also verified an improvement in the inflammatory process as observed by the histopathology analysis of lung tissue. The results obtained in this study let us to conclude that treatment with MK-801 promoted an improvement in the inflammatory process and antioxidant levels, as well as a decrease of the oxidative injury in rats with intratracheal LPS-induced ALI. / A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma síndrome caracterizada por inflamação pulmonar aguda e persistente, com edema pulmonar devido ao aumento da permeabilidade vascular. Na LPA ocorre uma lesão do epitélio alveolar e do endotélio capilar por diferentes mediadores pró-inflamatórios, principalmente, pelas citocinas liberadas em resposta à grande variedade de insultos. A geração de radicais livres (RLs) é outro importante mecanismo de lesão utilizado pelos neutrófilos, que são capazes de gerar muitas das alterações encontradas na LPA. Sabe-se que a produção endógena de glutamato estimula uma variedade de mediadores inflamatórios, incluindo metabólitos do ácido araquidônico, RLs e óxido nítrico (NO). O primeiro relato de que os receptores NMDA poderiam estar envolvidos na fisiopatologia pulmonar ocorreu através da demonstração que o tratamento com um inibidor seletivo desse receptor (MK-801) prevenia o edema pulmonar provocado pelo aumento de NMDA instilado na traquéia de ratos sob ventilação mecânica.O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso do antagonista de receptor NMDA (MK- 801) como protetor no dano oxidativo em modelo experimental de LPA. Foram utilizados ratos Wistar, machos. Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais: Grupo 1: Injeção intratraqueal (I. T. ) de 1 mL de solução salina (n=6); grupo 2: Indução da LPA através da injeção de LPS intratraqueal (100 \g/100 g de peso corporal) e tratamento com solução salina intraperitoneal (I. P. ) após indução da LPA (n=6); grupo 3: Indução da LPA e tratamento com MK-801 (0. 3 mg/kg I. P. ) após indução da LPA (n=6) e grupo 4: Indução da LPA e tratamento com MK-801 (0. 3 mg/kg I. T. ) após indução da LPA (n=6). Doze horas após o tratamento, os animais foram anestesiados para a retirada do sangue por punção retro-orbital, coleta do lavado broncoalveolar (LBA) e posteriormente, submetidos à eutanásia por decapitação para coleta do tecido pulmonar.O tratamento com MK-801 promoveu uma diminuição na concentração de proteínas totais, uma diminuição na atividade da lactato desidrogenase (LDH), além de diminuir o número de células inflamatórias no LBA. No tecido pulmonar ocorreu uma diminuição do dano oxidativo avaliado através dos níveis de TBARS e NO, e um aumento nos níveis de antioxidantes como a CAT, SOD, GSH e SH. Também observamos uma melhora do processo inflamatório através da análise histopatológica do tecido pulmonar. Podemos concluir através de nossos resultados que o tratamento com MK-801 promoveu uma melhora do processo inflamatório, uma melhora nos níveis de antioxidantes e uma diminuição do dano oxidativo em ratos com LPA induzida através da injeção intratraqueal de LPS.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000449079-Texto+Completo-0.pdf: 13871444 bytes, checksum: e0066e8269af7789f4e8bf48e9d2231c (MD5) Previous issue date: 2013 / Melanism is a very common coat color polymorphism in felids, and has been defined as an increased production of dark melanin which generates a general darkening of the organism’s tegument. Such coloration variation in mammals is often be regulated by the action of two genes and their products: MC1R and ASIP. Eumelanin (dark pigment) is produced when the Melanocortin-1 receptor (MC1R) is activated by the binding of the Alpha Melanocyte Stimulating Hormone (α-MSH). In contrast, MC1R activation is inhibited by the binding of the antagonist peptide ASIP (Agouti Signaling Protein), whose action leads to a switch to pheomelanin (light pigment) synthesis. Melanism has been documented in 13 out of 37 extant felid species, in some cases reaching high frequencies at the population level. A previous studies has indicated that this phenotype arose multiples times in the Felidae, with three different species exhibiting unique mutations associated with this trait (EIZIRIK et al., 2003). In this context, the present study aimed to identify the mutations implicated in this phenotype in five other felid species, and to investigate in more detail the evolutionary dynamics of melanism in the Felidae. In the first article, we revealed two additional cases of species-specific mutations involved in melanism in Asian wild cats, Panthera pardus and Pardofelis temminckii, and discuss the role of the ASIP gene in the evolution of this mutant phenotype. In the second manuscript, we analyzed the evolution of melanism in an endemic lineage of Neotropical felids belonging to the genus Leopardus. This lineage includes three species of small wild cats that were the focus of this study: L. colocolo, L. guigna e L. geoffroyi. The presence of melanism in these closely-related species, along with relatively high frequencies (ranging from 20% to 30%) of this phenotype observed in some areas of their geographic distribution, suggests that natural selection may be involved in the origin and evolution of this trait. In this context, we identified three novel mutations in the ASIP and MC1R genes, each of them strongly associated with melanism in one of the analyzed species, and revealed that natural selection may have played a role in the evolutionary history of melanism in this lineage of felids. / O melanismo é um polimorfismo de coloração bastante comum em felinos, definido como a ocorrência de uma acentuada produção de melanina escura que gera o escurecimento geral do tegumento do organismo. Sabe-se que esta variação da coloração em mamíferos é frequentemente regulada pela ação de dois genes e seus produtos: MC1R e ASIP. A eumelanina (pigmento escuro) é produzida quando o receptor de melanocortina-1 (MC1R) é ativado pelo hormônio estimulante de melanócito (α-MSH). Ao contrário, a ativação do MC1R é inibida pela ligação de um antagonista chamado ‘proteína sinalizadora de agouti’ (ASIP), cuja ação leva à troca da produção de eumelanina para feomelanina (pigmento claro). O melanismo foi documentado em 13 das 37 espécies atuais de felídeos e, em alguns casos, alcança altas frequências em nível populacional. Um estudo anterior indicou que o fenótipo surgiu múltiplas vezes em Felidae, com três espécies diferentes apresentando mutações independentes associadas ao mesmo (EIZIRIK et al., 2003). Assim, este estudo teve por objetivo identificar as mutações responsáveis por esta característica em outras cinco espécies de felídeos e analisar a dinâmica evolutiva do melanismo na família Felidae. No primeiro artigo, revelamos dois casos adicionais de mutações espécie-específicas envolvidas no melanismo de felídeos asiáticos, Panthera pardus e Pardofelis temminckii e discutimos o papel do gene ASIP na evolução deste fenótipo mutante. No segundo manuscrito, uma abordagem em nível genômico foi utilizada para analisar a evolução do melanismo em uma linhagem endêmica de felídeos neotropicais pertencentes ao gênero Leopardus. Nesta linhagem estão inclusas três espécies de pequenos felídeos que foram o principal foco desta análise: L. colocolo, L. guigna e L. geoffroyi. A presença do melanismo nestas espécies evolutivamente próximas, associada a frequências relativamente altas (20-30%) deste fenótipo em determinadas áreas de suas distribuições geográficas, sugere que a seleção natural pode estar envolvida na origem e evolução dessa característica. Neste contexto, identificamos três novas mutações nos genes ASIP e MC1R, cada uma delas fortemente associada ao melanismo em uma das espécies investigadas, e revelamos que a seleção natural parece ter influenciado a história evolutiva deste fenótipo nesta linhagem de felídeos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000348262-Texto+Completo-0.pdf: 518310 bytes, checksum: b4abe116886b44ee5a0831dd7e1d8b58 (MD5) Previous issue date: 2006 / A artrite reumatóide (AR) é uma doença auto-imune associada com inflamação sinovial crônica caracterizada por infiltração de linfócitos que danifica ossos e cartilagens e eventualmente conduzindo para a destruição das articulações. Ambos o envelhecimento e o tratamento crônico com glicocorticóides (GCs) freqüentemente conduzem à resistência esteroidal. Aqui, nós investigamos se a resistência aos GCs está associada com resistência a múltiplas drogas (MDR). Setenta e quatro pacientes com AR e 26 controles saudáveis fizeram parte deste estudo. Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas e a sensibilidade das células T aos GCs foi avaliada in vitro. A atividade funcional da P-gp, uma molécula bombeadora que diminui as concentrações intracelulares de drogas por aumento do efluxo das drogas, foi avaliada em linfócitos periféricos bem como os polimorfismos do gene ABCB1/MDR1. Os pacientes mostraram aumento da proliferação de células T estimuladas e basais comparados com os controles. O envelhecimento significativamente reduziu a proliferação de células T somente no grupo controle. Pacientes e controles apresentaram sensibilidades semelhantes aos GCs. As células não estimuladas dos pacientes com meiaidade foram mais sensíveis a dexametasona que as dos sujeitos jovens ou idosos. Pacientes apresentaram uma maior porcentagem de linfócitos extruíndo rodamina 123 (Rh123dim) que os controles apesar da semelhante atividade da P-gp. A distribuição dos genótipos ABCB1 nos pacientes não diferiu significativamente dos controles. Estes dados sugerem que as células mononucleares de pacientes com AR sob tratamento com múltiplas drogas são plenamente responsivas aos GCs in vitro e apresentam maior extrusão de drogas apesar da função normal da P-gp.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000428502-Texto+Completo-0.pdf: 4574146 bytes, checksum: 0b828e3a78fb87024bcab2a9d14b3a60 (MD5) Previous issue date: 2010 / In the search for automated solutions, professionals of different areas use similar information technology targeting information agility and reliability. The use of a workflow management system is an example, which is employed by enterprises and scientific labs in order to record executed tasks and to optimize the elapsed time. This thesis presents a workflow pattern, as a scientific workflow component, able to manage large volumes of data and to optimize their processing, identifying promising groups into such data. Bioinformatics is our application area, a multidisciplinary area that uses a lot of computing tools for its experiments, and which can spend years to be finished. The solution proposed here benefits the rational drug design inside Bioinformatics. Then, we contextualize the area of study, and a problem solution is given through the definition of a data pattern that allows a self-adaptation of workflow instances in execution. We named P-SaMI: Self-Adaptive Multiple Instances as our proposed pattern because it is capable to manage large data sets and to take actions during processing time. P-SaMI is formally defined with Petri nets concepts and it is designed by Coloured Petri nets. We performed several tests and achieved the reduction of experiments executed, preserving an acceptable level of resulted quality. / A busca de soluções informatizadas, com o objetivo de se obter agilidade e confiabilidade nas informações, faz com que profissionais de diferentes áreas utilizem tecnologias com propósitos semelhantes. A utilização de sistemas de gerenciamento de workflow é um exemplo desse tipo de solução, a qual empresas e cientistas utilizam para documentar as etapas executadas e otimizar o tempo de execução. Esta Tese apresenta um padrão capaz de manipular grandes volumes de dados e otimizar seu processamento, identificando grupos de dados promissores, como um componente de workflows científicos. A área de aplicação é a Bioinformática, uma área multidisciplinar, que se utiliza de várias ferramentas computacionais para a realização de seus experimentos, os quais podem demorar anos para serem finalizados. A solução proposta beneficia, dentro da Bioinformática, o desenho racional de fármacos. Assim, a contextualização da área de estudo é realizada, e é proposta uma solução para o problema por meio da definição de um padrão de dados que permite a autoadaptação de instâncias de workflow em execução. O P-MIA: Padrão Múltiplas Instâncias Autoadaptáveis, assim denominado por manipular um grande conjunto de dados e por, em tempo de execução, definir as ações a serem executadas sobre os dados, é formalizado com base nas definições de redes de Petri e sua representação gráfica feita por meio de redes de Petri coloridas. Sobre o padrão, são realizados testes experimentais, os quais comprovam que, com a utilização do P-MIA, é possível reduzir a quantidade de experimentos, mantendo um critério de qualidade aceitável.