Ces travaux de thèse portent sur l'étude expérimentale des propriétés physiques et de la biomécanique des agrégats cellulaires embryonnaires. Le but de cette thèse était d'une part de mieux comprendre l'origine biologique de la viscosité et de la tension de surface tissulaire, d'autre part d'étudier quantitativement en détail l'élasticité cellulaire par des nouvelles mesures de rhéologie en cisaillement. Un premier chapitre concerne les mesures de tension de surface tissulaire par la méthode de compression et de viscosité tissulaire par analyse de la cinétique de fusion de deux agrégats en faisant varier comme paramètre principal la contractilité cellulaire que certains suspectent comme étant la principale origine biologique de ces paramètres. Nous utilisons le formalisme du DITH (Haris, 1976: Differential Interfacial Tension Hypothesis) pour interpréter les données. Le deuxième chapitre concerne les mesures rhéologiques en cisaillement à l'aide d'un rhéomètre commercial plan-plan sur plusieurs centaines ou milliers d'agrégats cisaillés ensembles. Nous montrons que les cellules deviennent moins rigides pour une déformation minimale d'environ 4%, mais sur l'échelle de l'heure les cellules sont capables de se rigidifier à nouveau. Ces expériences sont analysées à l'aide d'un modèle de ressorts qui cassent sous contrainte puis se ressoudent à contrainte nulle.

As a new pediatric dummy family, the Q-family, is suggested for the European childsafety regulations (R44) and the updated EuroNCAP, it needed to be tested andcompared to the older pediatric dummy family, Hybrid III, used in testing at Autolivtoday.In this study, tests were performed with the Q6 and the Hybrid III 6-year-old. Bothdummies were subjected to eight sled tests using a EuroNCAP acceleration pulse. The sled represented the interior of a Volvo V70, with integrated booster cushions mounted onto the car body through a rigid fixture. Standard belt were used for all tests, except one where pretensioning was used. Static tests investigated how the chest deflection on Q6 was affected by the shoulder belt geometry. Large difference in belt interaction was observed between the dummies. The beltslipped off the Hybrid III’s shoulder for all tests except one, while the belt on the Qdummy’swas hard to provoke off the shoulder. The overall kinematic behavior, beforethe belt slipped off the Hybrid III’s shoulder, were similar for both dummies. Differences in chest deflection on the Q6, depending on the belt geometry, were observed in both the dynamic and the static tests; a shoulder belt geometry closer to theneck resulted in minor displacement than a mid-shoulder belt geometry. After testing, five different damages were observed on the Q6. / Då en ny familj av barnkrockdockor, Q-familjen, är föreslagen för det europeiskalagkravet som reglerar barnsäkerhet (R44), uppstod ett behov av att testa och jämföradessa mot den äldre familjen av barnkrockdockor som används vid testning på Autoliv idag, Hybrid III. I den här studien utfördes tester på Q6 och Hybrid III 6 år. Båda dockorna utsattes föråtta stycken slädtest i en accelerationspuls enligt EuroNCAP. Släden representerade enVolvo V70 med integrerade barnkuddar som monterats i riggen via en stel fixtur. I alla test utom ett användes standardbälten (i undantagsfallet användes försträckare). Statiska tester gjordes för att undersöka hur Q6 påverkades av olika geometrier på axelbältet. Stora skillnader observerades mellan dockornas bältesinteraktion. Bältet gled av HybridIII:s axel i alla test förutom ett, medan det istället var svårt att provocera av bältet från Q-dockans axel. Innan Hybrid III gled ur bältet var dockornas kinematik liknande. I både statiska och dynamiska tester observerades skillnader i bröstintryckning på Q6, beroende på bältesgeometrin; en geometri där axelbältet var placerat nära nackenresulterade i en mindre intryckning än då axelbältet var placerat mitt på axeln. Efte ravslutad testning upptäcktes fem skador på Q6.

Les cellules d'un organisme multicellulaire a justent constamment la concentration de leur consti- <br />tuants en fonction de leurs interactions avec leurs voisines et l'environnement. Une reponse adaptee est particulierement importante pendant l'embryogenese. Au cours de cette these, nous avons developpe une technique permettant de controler des fonctions cellulaires a l'echelle de la cellule unique dans un organisme intact. L'utilisation de molecules cagees et de l'excitation biphotonique a permis de remplir le but vise. <br />Dans un premier temps, nous exposons les precautions a prendre et les proprietes necessaires des groupements protecteurs pour l'utilisation d'une telle technique dans un contexte biologique. Dans un deuxieme temps, nous nous interessons a la caracterisation des proprietes d'absorption a deux photons des groupements protecteurs utilises au cours de ce travail. Enfin, nous presentons une application de la technique a la voie de signalisation acide retinoique dans le poisson zebre. Nous montrons que nous pouvons delivrer une concentration bien definie de molecules dans une seule cellule avec une resolution temporelle de la seconde dans un embryon intact. Grace a ceci, nous avons pu etudier la dynamique de cette voie de signalisation et mettre en evidence un controle negatif rapide qui est cellule autonome et identifier la MAP kinase p38 comme etant necessaire a ce phenomene. <br />Nous presentons aussi en annexes la demonstration de principe de l'utilisation de composes cages pour generer des recombinaisons genomiques chez le poisson zebre et inhiber une fonction enzymatique (en l'occurence une activite topoisomerase).

Les traitements de radiothérapie nécessitent la délivrance d'une dose précise au niveau de la tumeur et une bonne connaissance de la dose dans les zones avoisinantes. Ce calcul, habituellement réalisé par les TPS, exige des outils précis et rapides. La plate-forme de simulation Monte-Carlo GATE, basée sur le code GEANT4, offre un outil performant pour les applications de la médecine nucléaire mais aussi des fonctionnalités permettant de faire des calculs dosimétriques de façon fiable et rapide. Dans cette thèse, deux études ont été menées en parallèle: la validation de la plate-forme GATE pour la modélisation de sources d'électrons et de photons de basse énergie et l'exploitation optimisée des infrastructures de grille informatique pour réduire les temps de calculs des simulations. GATE a été validé pour le calcul de points kernels de dose d'électrons mono-énergétiques et comparé avec les résultats d'autres études Monte-Carlo. Une étude détaillée a été faite sur la gestion du dépôt d'énergie au cours du transport des électrons dans GEANT4. Nous nous sommes intéressés aussi à la validation de GATE concernant le dépôt de dose de photons de très basse énergie ( < 35 keV). Pour cela, trois modèles de sources radioactives utilisés en curiethérapie et contenant de l'iode 125 (modèle 2301 de Best Medical International ; Symmetra de UroMed/Bebig et 6711 d'Amersham) ont été simulés. Plusieurs caractéristiques dosimétriques ont été étudiées selon les recommandations du groupe de travail N°43 de l'AAPM (American Association of Physicists in Medecine). Les résultats obtenus montrent une bonne concordance entre GATE et les études prises comme référence et recommandées par l'AAPM. L'utilisation de simulations Monte-Carlo dans les applications médicales pour une meilleure définition de la dose déposée dans un volume tumoral, nécessite des temps de calculs longs. Afin de réduire ces temps, nous avons exploité l'infrastructure de la grille EGEE sur laquelle nos simulations sont distribuées en utilisant des techniques novatrices pour la prise en compte de l'état de la grille de calcul. Les temps nécessaires pour la simulation d'une radiothérapie utilisant des électrons ont été réduits jusqu'à un facteur 30. Une plate-forme web basée sur le portail GENIUS a été développée pour rendre accessible de façon simple toutes les modalités de soumission et de gestion des simulations ainsi que la gestion de données médicales (informations sur les patients, images CT, IRM...) sur les ressources de la grille. L'objectif final visé est de faire de GATE un outil fiable et utilisé en clinique pour des planifications de traitements de radiothérapie avec des temps de calculs acceptables (pas plus de 12 heures de calcul).

Un photosensibilisateur est un composé chimique capable de générer, sous l'effet d'une irradiation lumineuse, des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et donc d'induire directement ou indirectement l'altération d'autres composés. La rétention sélective de ces molécules, dites photo-activables, par les tissus en prolifération leur confère des applications en thérapie anti-tumorale (Photo-Chimio-Thérapie, PDT). La plupart des photosensibilisateurs sur le marché sont des dérivés structuraux de porphyrines et sont généralement fluorescents. Cette propriété est utilisée pour déterminer leur localisation, tant au niveau systémique que cellulaire. Certains composés sont ainsi utilisés pour le diagnostic par fluorescence de certain cancers (FD). Au niveau intracellulaire, un certain nombre de ces photosensibilisateurs se localisent dans les membranes des vésicules d'endocytose. Ils peuvent ainsi induire, sous irradiation lumineuse, la libération dans le cytosol du contenu de ces vésicules, y compris des molécules exogènes incorporées dans la cellules par endocytose et dont la cible intracellulaire est cytosolique ou nucléique (ADN, protéines, nombreux médicaments...). Ces phénomènes sont à la base d'une approche permettant l'activation de macromolécules, l'Internalisation Photo-Assistée (PCI). Cette méthode potentialise considérablement l'activité biologique d'un très large spectre de molécules d'intérêt.Tant la sélectivité de ces photosensibilisateurs pour les tissus en prolifération que leur localisation intracellulaire sont à mettre en relation avec les propriétés physico-chimiques et biologiques du micro-environnement. Leur interaction avec les lipoprotéines de basse densité (LDL) peut favoriser leur entrée dans les cellules du fait de la surexpression par les cellules néoplasiques des récepteurs aux LDL. Cependant, pour certaines molécules photo-activables, un passage transmembranaire par diffusion passive a été mis en évidence. L'incorporation cellulaire est alors facilitée par l'acidification du pH stromatique. Nous nous sommes donc attaché à déterminer l'importance de tels paramètres. Notre objectif a été de définir des caractéristiques structurales déterminant le comportement cellulaire des photosensibilisateurs.Dans un premier temps, afin d'élucider les mécanismes impliqués, les interactions de photosensibilisateurs avec des LDL et des liposomes (SUV, utilisés comme modèles simples de membranes) ont été étudiées à l'équilibre et de façon dynamique. Trois photosensibilisateurs ont été utilisés : la deuteroporphyrin (DP), une porphyrine dicarboxylique et la phtalocyanine d'aluminium disulfonnée (AlPcS2). Ces études ont été menées en nous attachant tout particulièrement aux effets liés au pH. Il faut noter ici que seuls les composés carboxyliques sont susceptibles de subir une neutralisation, ne serait-ce que partielle, de leurs chaînes latérales dans une gamme de pH correspondant à des valeurs physiologiques. Les données obtenues sur ces systèmes simples nous ont ensuite permis de comprendre la localisation sub-cellulaire des photosensibilisateurs sur une lignée humaine de fibroblastes. Enfin, bien que les LDL soient des vecteurs importants des photosensibilisateurs et facilitent leur entrée dans les cellules, la localisation sub-cellulaire semble être directement liée à la dynamique du transfert des photosensibilisateurs par des membranes. En conclusion, les paramètres physico-chimiques déterminés en solutions sont des outils efficaces pour concevoir des photosensibilisateurs, prédire leur capacité d'incorporation cellulaire ainsi que leur localisation sub-cellulaire.

L'appareil de Golgi est un organite central du réseau des voies de transport intracellulaire des cellules eucaryotes. L'étude de son fonctionnement dynamique complexe nécessite le développement de nouveaux outils. J'ai donc suivi plusieurs stratégies en parallèle pour proposer de nouvelles approches d'étude de l'appareil de Golgi. <br />Tout d'abord, j'ai utilisé la technique d'Interférence ARN, qui permet d'inhiber l'expression d'une protéine d'intérêt, et ainsi révélé la complexité de la régulation du transport golgien par la GTPase Rab6. <br />Ensuite, j'ai suivi une stratégie reposant sur l'imagerie in vivo du désassemblage et du réassemblage de l'appareil de Golgi au cours de la mitose, et ainsi mis en évidence une étape particulière du désassemblage golgien. <br />Enfin, le cœur de ma thèse a consisté en la production d'anticorps recombinants dirigés contre des protéines golgiennes par Phage Display, et le développement de leur utilisation pour tracer le comportement des protéines-cibles in vivo.

L'exercice de forces est indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus cellulaires. Chez les eucaryotes, une majorité de ces phénomènes motiles est assurée par la polymérisation et la dépolymérisation spatialement et temporellement contrôlée du cytosquelette d'actine. Le cytosquelette est composé de microfilaments d'actine qui s'associent en structures complexes aux propriétés mécaniques particulières. Au cours des dix dernières années, beaucoup d'efforts ont été menés pour comprendre la dynamique des réseaux branchés de filaments d'actine initiés par le complexe Arp2/3. En revanche, peu de choses sont connues à propos de la dynamique de formation et de désassemblage des câbles de filaments d'actine. Récemment, il fut montré que les formines représentent une famille de protéines essentielles à l'initiation de ces structures.<br />Cette thèse résume dans un premier temps le travail accompli pour comprendre le mécanisme d'action des formines à l'échelle moléculaire. La plupart des formines sont des nucléateurs processifs, c'est-à-dire qu'ils permettent la formation et l'élongation de nouveaux filaments d'actine, tout en restant liées à l'extrémité du filament qui polymérise. Nous avons montré par la technique originale de microscopie à onde évanescente que Arabidopsis Thaliana FORMIN1 représente un nouveau type de formine, qui se déplace sur le côté des filaments d'actine après les avoir formés. Depuis le côté d'un filament préexistant, FORMIN1 est capable de nucléer un autre filament, initiant la formation de câbles de filaments d'actine. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse au mécanisme moléculaire mis en jeu par l'ADF/cofiline pour accélérer la dynamique d'assemblage/désassemblage des filaments d'actine, et traite pour la première fois de la dynamique de l'actine en temps réel à l'échelle du filament individuel ou à l'intérieur de structures organisées de filaments d'actine.

Des progrès récents dans la détection et la manipulation des molécules individuelles offrent de nouveaux outils pour étudier les molécules biologiques et leurs assemblages en conditions physiologiques. Ces outils permettent d'observer la dynamique, les états<br />conformationnels, et l'activité de molécules biologiques individuelles, non masqués par une moyenne d'ensemble. Dans ce cadre, je présente trois études que j'ai réalisées de 1998 à 2006.<br />La première concerne l'étude d'une protéine du cytosquelette, la spectrine. A l'aide d'un microscope à force atomique, nous suivons les états et les transitions de dépliement de protéines polymériques constituées de domaines identiques de la spectrine et montrons que le dépliement d'un domaine de spectrine peut se produire par étapes pendant son étirement.<br />Le second sujet porte sur l'organisation et la dynamique des membranes des cellules vivantes. Nous exposons une méthode fondée sur la spectroscopie de corrélation de fluorescence permettant de détecter des domaines membranaires. Nous revisitons les questions controversées dʹorganisation membranaire en étudiant une grande variété de marqueurs membranaires. Nous<br />montrons que les analogues fluorescents des sphingolipides et les protéines ancrées par un<br />glycosylphosphatidylinositol sont seulement confinés par des microdomaines dʹorigine lipidique.<br />En revanche, le récepteur à la transferrine est compartimenté à la fois par lʹorganisation lipidique et<br />le réseau du cytosquelette. Nous confirmons ainsi lʹexistence dʹune micro‐architecture dʹorigine<br />lipidique par des mesures sur cellules vivantes.<br />Pour améliorer la détection de molécules fluorescentes individuelles et réduire les volumes d'observation sous la limite de diffraction optique, nous utilisons des structures photoniques tels que des miroirs diélectriques ou des trous de taille sub‐longueur d'onde percés dans des films métalliques. A l'aide de ces structures, nous examinons la diffusion membranaire à l'échelle<br />nanométrique et en inférons la structure fine des membranes.<br />Enfin, je présente un projet de recherche sur la géométrie et la mécanique de l'épithélium<br />de l'embryon de drosophile lors de la morphogenèse. Ce projet vise en particulier à développer des<br />méthodes spécifiques pour mesurer et déterminer le rôle des forces de tension corticale du réseau<br />dʹacto‐myosine dans le remodelage des interfaces cellulaires.

Les vésicules géantes sont souvent utilisées comme modèles des membranes cellulaires. On a ici examiné :<br />1. leur adhésion spécifique via deux « colles moléculaires » :<br />– colle faible : fragments terminaux EC12 de E-cadhréine. Cette protéine<br />est impliquée dans la formation de tissus et dans de nombreux phénomènes<br />cancéreux. L'analyse statistique de l'adhésion bicouche supportée/vésicule<br />décorées par EC12 montre qu'existe une adhésion faible sensible au calcium et à une mutation des fragments ;<br />– colle forte : couple streptavidine/biotine. Lors de l'adhésion sur une bi-couche supportée, la tension de la vésicule joue fortement sur la morphologie du contact et sa cinétique.<br />2. la dynamique de pores transitoires (dus à une mise sous tension par éclairement<br />intense), en présence de tensioactif capable de s'insérer à leur bord. La tension de ligne en fonction de la concentration en tensioactif est un isotherme 1D, analysé en termes d'excès de ligne et d'énergie d'adsorption du tensioactif.

Le but initial de ce travail de thèse est de proposer une technique (basée sur la Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS) pour améliorer la sensibilité dans la discrimination de deux molécules ayant des constantes de diffusion proches. C'est dans ce contexte que nous avons étudié la FCCS (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy). A défaut d'améliorer la sensibilité de la Spectroscopie à Correlation de Fluorescence nous avons proposé trois géométries de FCCS pour élargir le champ d'application de la corrélation de fluorescence.