31 |
MICROFLUIDIQUE DE GOUTTES POUR LES ANALYSES BIOLOGIQUESChabert, Max 21 September 2007 (has links) (PDF)
Cette thèse présente divers dispositifs fonctionnant sur le principe de la microfluidique diphasique et dédiés aux analyses biologiques.<br /> Dans une première partie, nous décrivons la conception d'un système permettant d'effectuer en flux et sans contamination la réaction de PCR dans des microgouttes transportées par une huile immiscible. Cette étude a débouché sur une plateforme automatisée au débit théorique de 3000 échantillons par jour, égalant les systèmes actuels avec une consommation 50 fois moindre en réactifs.<br /> Dans les parties suivantes, nous présentons deux nouvelles idées pour la manipulation d'objets en microfluidique digitale : l'utilisation de phénomènes hydrodynamiques pour encapsuler des cellules uniques dans des microgouttes et les trier, et l'application de champs électriques pour induire mélange et coalescence de gouttes aqueuses. La combinaison de ces deux méthodes au sein d'une même puce est le premier pas vers un système intégré d'analyse de cellules uniques.
|
32 |
Etude du mécanisme d'action des facteurs de remodelage de la chromatine, à l'échelle de la molécule unique.Praly, Elise 19 June 2009 (has links) (PDF)
Chez les eucaryotes, l'ADN s'associe à des octamères d'histones pour former une structure nucléoprotéique dense appelée chromatine. Sous cette forme compacte, la chromatine agit comme une barrière topologique empêchant des facteurs de transcription par exemple, d'interagir avec l'ADN. Il va donc être essentiel de moduler la structure de la chromatine pour réguler l'accès à l'ADN et donc l'expression des gènes. L'une des stratégies adoptées, implique l'intervention de complexes multi-protéiques, appelés facteurs de remodelage de la chromatine, qui utilisent l'énergie issue de l'hydrolyse de l'ATP pour perturber le positionnement des octamères d'histones par rapport à l'ADN. Les mécanismes sous-jacents, éventuellement variés, sont encore méconnus.<br />Nous utilisons ici un dispositif de pinces magnétiques pour sonder l'action de différents facteurs de remodelage (RSC, yISW1a et CHD1) sur une molécule d'ADN nue. Nous montrons que ces complexes ont des comportements différents vis-à-vis de ce substrat : en l'absence d'ATP, yISW1a et CHD1 s'accrochent à l'ADN de manière coopérative et réduisent son extension bout-à-bout. En présence d'ATP, RSC est capable de former de larges boucles d'ADN, sous-enroulées, dont la taille dépend de la force et de la concentration en ATP. Nous souhaitons maintenant sonder l'action de ces facteurs sur un substrat nucléosomal. Dans ce but, nous avons mis au point un protocole efficace pour préparer un substrat mono-nucléosomal, manipulable en pinces magnétiques, et nous avons défini une procédure pour s'assurer de la présence du nucléosome. Ce substrat de choix va nous servir de base pour l'étude de l'action des facteurs de remodelage de la chromatine.
|
33 |
Modélisation des instabilités du cortex d'actineSalbreux, Guillaume 17 October 2008 (has links) (PDF)
Le cortex d'actine est une fine couche de gel d'une épaisseur de l'ordre du micron, attaché à la membrane lipidique de la cellule. Il est constitué d'un réseau de filaments d'actine qui sont constamment polymérisés à la membrane puis dépolymérisés, dans un mouvement de « tapis roulant ». Des moteurs moléculaires, les myosines, génèrent des contraintes internes dans le gel.Le cortex contrôle ainsi les variations de forme de la cellule. Dans cette thèse nous utilisons le modèle des gels actifs pour explorer certaines propriétés du cortex d'actine. Le gel est décrit a l'échelle mésoscopique comme un matériau viscoélastique nématique dans lequel les myosines utilisent l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP pour produire des contraintes actives, c'est à dire plaçant le système hors d'équilibre thermodynamique. Dans un premier temps nous étudions de quelle façon l'épaisseur du cortex peut être régulée, et nous discutons l'apparition d'instabilités actives dans la couche. Nous utilisons l'instabilité du gel ainsi décrite pour interpréter l'observation expérimentale d'oscillations de formes de fibroblastes induites par des canaux calciques mecanosensibles. En incluant un paramètre d'ordre nématique dans notre description, nous montrons que soumettre le cortex à une concentration inhomogène de myosines doit conduire à l'apparition d'un flux de filaments et à la formation d'un anneau, ainsi qu'observé dans plusieurs systèmes expérimentaux, en particulier lors de la cytocinèse. Nous terminons ce travail par une analyse de la mécanique de formation d'un bleb unique induit par une rupture artificielle du cortex par ablation laser.
|
34 |
Formation, cristallogenèse et détermination de la structure tridimensionnelle, d'un dérivé phosphorylé covalent stable, de l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique.Delavoie, Franck 01 December 2003 (has links) (PDF)
Un dérivé phosphorylé covalent stable de la Ca-ATPase du réticulum sarcoplasmique est obtenu à partir de la protéine modifiée par le FITC. Nous avons produit de façon reproductible, des cristaux de type tubulaire de ce dérivé phosphorylé cuvaient stable, à partir de vésicules de réticulum sarcoplasmique natives. Après un traitement d'image de clichés de cryomicroscopie électronique, nous avons calculé la première structure tridimensionnelle d'un dérivé phosphorylé covalent stable d'une ATPase de type P à 8À de résolution. La comparaison de cette nouvelle structure avec les autres structures existantes de la Ca-ATPase, suggère certaines modifications notamment au niveau ou positionnement des domaines cytoplasmiques. Des expériences de trypsinisation et de chromatographie sur une colonne agarose-Red120, ont permis d affiner ces observations. Les liens entre ces moditications structurales et le mécanisme de transport de calcium couplé à l'hydrolyse d ATP sont discutés.
|
35 |
Structure, dynamique moléculaire et sélectivité de métallochaperones à cuivre et à mercurePoger, David 13 December 2005 (has links) (PDF)
Les métallochaperones à cuivre assurent l'acheminement des ions Cu(I) vers des protéines cibles dans la cellule. Les métallochaperones de la famille d'Atx1 présentent une forte homologie de séquence et le même repliement. MerP, une métallochaperone à mercure, partage ces même caractéristiques de séquence et de structure. <br />Cette thèse vise à mettre en évidence des propriétés dynamiques et structurales responsables de la sélectivité des métallochaperones pour le Cu(I) ou le Hg(II) . Des simulations de dynamique moléculaire des métallochaperones à cuivre, Atx1 et Hah1, et de MerP, dans leurs formes apo, et liées au Cu(I) ou au Hg(II), ont révélé des caractéristiques dynamiques et énergétiques communes aux trois métallochaperones quand elles chélatent leur métal natif. Un réseau d'interactions entre la boucle du site de chélation du métal et deux autres boucles situées autour de ce site, a été identifié et varie d'un état métallé à l'autre. Il pourrait ainsi définir une éventuelle sélectivité pour les métaux. La boucle du site de chélation montre une grande structuration en présence de métal, accompagnée d'une rigidification si ce métal est le métal natif. Les expériences d'absorption de rayons X du Cu(I) chélaté par Atx1 ont montré que le Cu(I) possède toujours une géométrie trigonale dont les ligands sont les deux cystéines du site de chélation, et un ligand endogène ou exogène. Atx1 présente donc au Cu(I) une géométrie qui lui est préférentielle. Cette propriété est un déterminant de la sélectivité au Cu(I) par rapport à d'autre métaux. En présence de glutathion, le complexe Atx1-Cu(I) forme un homodimère binucléaire associé à deux molécules de glutathion. L'implication de ce ligand exogène est proposée comme un facteur de sélectivité in vivo d'Atx1 pour le Cu(I) , et pourrait favoriser la reconnaissance par Atx1 de sa protéine cible.
|
36 |
La recombinaison homologue sur molécule unique d'ADN: mesures de torsion et de couple.Dupont, Aurélie 10 November 2008 (has links) (PDF)
Dans cette thèse, nous avons étudié les aspects mécanique et thermodynamique de la recombinaison homologue, un processus crucial de réparation de l'ADN. Des travaux préliminaires d'observation de molécules d'ADN étirées lors de la recombinaison homologue ont mis à jour la complexité de ce processus et la difficulté de l'observer en fluorescence. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique appelée "pinces magnétiques sensibles au couple" nous permettant de maintenir une molécule unique d'ADN avec une force et un couple connus tout en mesurant son état de torsion avec une résolution de quelques degrés. Nous avons ainsi montré de manière directe que la polymérisation de la recombinase hRad51 a lieu par ajout de monomères chacun déroulant l'ADN de 65° en moyenne. Nous avons également été capables de mesurer le couple d'arrêt de la polymérisation. Une modélisation mécano-chimique nous a finalement permis d'évaluer le potentiel chimique de la polymérisation, en bon accord avec les données biochimiques existantes.
|
37 |
Recombinaison Génétique à l'Échelle de la Molécule Unique : Micromécanique des Jonctions de Holliday et Activité du Complexe RuvABDawid, Alexandre 23 September 2005 (has links) (PDF)
Ce travail présente tout d'abord l'étude, à l'échelle de la molécule individuelle, de l'intermédiaire<br />de recombinaison formé par l'échange de simples brins entre deux molécules d'ADN homologues : la<br />jonction de Holliday.<br />Nous montrons tout d'abord qu'il est possible, à partir d'un ADN portant une séquence entièrement<br />palindromique, de former une jonction de Holliday en appliquant une torsion négative. Une fois<br />la jonction formée, la torsion permet également de contrôler de façon directe l'échange des simples brins.<br />Cette technique nous a permis d'accéder expérimentalement, avec une très bonne précision, à la valeur<br />en solution du pas hélicoïdal de l'ADN : 3.61 ± 0.03 nm/tr.<br />Ensuite nous avons étudié, en présence d'ions magnésium, la cinétique de migration de la jonction<br />de Holliday sous l'influence des contraintes mécaniques. Une modélisation simple du comportement<br />de la jonction de Holliday vis-à-vis des contraintes mécaniques a été développée permettant d'expliquer<br />leur influence sur le mécanisme de migration.<br />L'échange des simples brins peut également être catalysé par certaines enzymes. Le travail<br />mécanique développé au cours de cette activité catalytique fait de ces enzymes des moteurs moléculaires.<br />La seconde partie de ce travail porte sur l'étude en molécule unique d'un tel moteur : le complexe RuvAB<br />de la bactérie Escherichia coli.<br />Nous avons tout d'abord caractérisé la migration de jonctions de Holliday individuelles sous<br />l'action du complexe RuvAB. Nous avons notamment montré la très grande processivité du complexe et<br />nous avons pu estimer la vitesse de migration à 37◦C et en présence d'1 mM d'ATP : ∼ 43 paires de<br />bases échangées par seconde.<br />D'autre part, et pour finir, nous avons mis en évidence le rôle catalytique de la sous-unité RuvA<br />dans l'échange des paires de bases au niveau du point de branchement.
|
38 |
Détection de l'hybridation de l'ADN sur réseaux de transistors à effet de champ avec fixation polylysineGentil, Cédric 26 May 2005 (has links) (PDF)
Ce manuscrit présente l'étude d'une nouvelle méthode de détection électronique différentielle de l'hybridation entre nucléotides, utilisant des réseaux de transistors à effet de champ et une fixation des ADN sondes de type polylysine. Les structures employées sont des réseaux d'EOSFETs, possédant une interface du type électrolyte/oxyde/semi-conducteur (EOS), qui peuvent être immergés dans un électrolyte de mesure dans lequel est plongée une électrode de référence. <br />La première partie de ce travail détaille les expériences nous ayant permis de montrer le faisabilité d'une détection électronique d'abord de polylysine, puis d'ADN sur une réseau d'EOSFETs. Des micro- ou macro-gouttelettes de solutions contenant ces bio-polymères chargés ont été déposées en des endroits prédéfinis sur les réseaux de capteurs. Ces dépots locaux induisent des variations des caractéristiques courant-tension des transistors exposés, pouvant être corrélées à un apport de charges soit positives dans le cas de la polylysine, soit négatives en ce qui concerne l'ADN. Le signal électronique est proportionnel au nombre moyen d'oligonucléotides de 20 bases par unité de surface, tant que celui-ci reste inférieur à 1000-10000 molécules par µm², avec une variation de 10 mV pour 100 à 1000 molécules déposées par µm². Une saturation du signal électronique est observée au delà. La détection de micro-dépots de faibles concentrations en bio-polymères est limitée par l'existence de signaux électroniques parasites observés avec des solutions servant aux dilutions. La variations des signaux électroniques en fonction de la concentration en sel a également été caractérisée.<br />L'utilisation d'un protocole d'hybridation sur fixation polylysine, sans étape de blocage visant à limiter l'adsorption non spécifique de cibles a conduit à la mise en évidence d'un signal différentiel de l'ordre de 5 mV lors d'hybridations et de mesures dans un électrolyte de KCl 20 mM. L'hybridation à haut sel et la détection à bas sel permettent d'obtenir des différences d'environ 15 mV. Aucun signal électronique significatif d'appariement n'a été observé en utilisant un bloqueur. La sensibilité de détection électronique de l'hybridation, estimée à 100-1000 double-brins de 20 paires de bases par µm² est proche de celle associée à la technique classique de fluorescence (0,5 à 80 double-brins par µm²).
|
39 |
Elasticité de la chromatine, étude avec une pince optiqueClaudet, Cyrille 15 December 2005 (has links) (PDF)
Cette thèse s'inscrit dans la recherche des propriétés mécaniques de la fibre de chromatine et de leur rôle. Après un rappel de connaissances sur la chromatine, nous introduisons les techniques de manipulations de molécules uniques en biophysique. Nous esposons ensuite le dispositif de pince optique que nous avons mis en œuvre ainsi que les développements plus récents de manipulations à l'aide d'un champ magnétique rotatif.<br />Nous discutons alors des résultats obtenus sur la transition B-S de l'ADN et tentons de les interpréter en invoquant une différence de comportement sous étirement selon que la séquence est riche en A-T ou en G-C. <br />Les résultats des étirements sur trois principaux types de chromatine sont ensuite présentés : force nécessaire à la rupture d'un nucléosome et longueur d'ADN libérée. En faisant varier les conditions d'étirements (essentiellement concentrations salines et concentrations en chromatine exogène), en modifiant la composition de la fibre de chromatine, nous montrons que le nucléosome n'est pas une entité stable dans les conditions diluées classique des expériences sur molécules uniques. Nous confirmons par ailleurs ce résultats avec des expériences de dilution suivit d'analyse sur gel d'électrophorèse. Les résultats établis après stabilisation nous invitent à poursuivre la discussion du déroulement du nucléosome sous tension à partir d'un modèle existant. Sur la base de ces résultats, nous tentons alors de donner une interprétation du déroulement du nucléosome que nous recadrons dans le contexte de la régulation génétique à l'échelle du nucléofilament.
|
40 |
Mouillage Spécifique de Gouttes d'Emulsion sur des Substrats BiomimétiquesFattaccioli, Jacques 11 September 2006 (has links) (PDF)
Nous avons exploré la capacité des émulsions à adhérer de manière spécifique à des surfaces modèles solides et notamment la relation entre la composition des gouttes à leur interface et la formation d'un angle de contact macroscopique. Nous avons développé une méthode de fonctionnalisation covalente in-situ de l'interface liquide de gouttes d'émulsion H/E par de la biotine puis par de la streptavidine. La distribution de taille et la densité de streptavidine à la surface des gouttes sont caractérisées à l'aide d'une technique originale utilisant un cytomètre à flux. Nous avons montré que l'angle de contact et l'énergie d'adhésion croissent linéairement en fonction de la densité de biotine sur la lamelle et nous avons observé une répartition spatiale différente (disque, couronne) de la streptavidine dans la zone de contact suivant la densité totale en PEG, suggérant une transition de phase à 2D.
|
Page generated in 0.0736 seconds