La synchronisation des cellules est importante pour l'analyse des processus moléculaires impliqués dans l'étalement et la motilité. Les interactions électrostatiques entre les cellules et les surfaces ont été étudiées dans le but de synchroniser la première étape de l'adhésion cellulaire. Les cellules Dictyostelium discoideum marquées avec LimE-GFP ont été utilisées pour le suivi en fluorescence des événements de polymérisation de l'actine. Des pics de fluorescence ont été observés pour les cellules individuelles pendant l'étalement en tampon phosphate. Dans une solution de concentration faible (0.17 mM tampon phosphate sucrose) les cellules lévitent au dessous des surfaces conductrices (Indium Tin Oxide, ITO), à cause de la répulsion électrostatique. Un dispositif électrochimique a été construit dans le but d'appliquer un pulse électrique (+2.5 V/Ag,AgCl) sur une surface de ITO pendant 0,1 secondes. Dans ces conditions, l'oxydation de l'eau produit des protons qui réduisent la charge de surface négative de l'ITO et ainsi, les cellules sont attirées simultanément. Ces contacts irréversibles avec la surface déclenchent l'étalement cellulaire. Pour 37 parmi les 47 cellules étudiées (80%), apparaissent des pics de fluorescences successives plus au moins réguliers en temps, montrant une activité de polymérisation de l'actine oscillante. Remarquablement, aucun pic de fluorescence n'apparaît dans les 7 premières secondes d'après l'application du pulse. De plus, 29 des cellules parmi les 37 ont eu le premier pic dans un intervalle de 4 secondes, entre 7,5 et 11,5 secondes après le pulse. Ainsi, nous avons obtenu, pour la première fois, la synchronisation de l'étalement cellulaire d'un groupe de cellules grâce à une méthode électrochimique.

Les plasmides sont des fragments d'ADN extrachromosomaux largement utilisés en tant qu'outil en biologie moléculaire. Un plasmide code pour sa propre fréquence de réplication et peut être à copies multiples au sein de son hôte (e.g. la bactérie). Il peut aussi apporter à son hôte un avantage sélectif tel que la résistance à un antibiotique, ce qui confère un caractère symbiotique au système hôte-plasmide. Nous voulons explorer : 1-les variations du nombre de copies de plasmides (PCN) afin de comprendre les interactions que le plasmide peut avoir avec son hôte 2- la manière dont se fait la régulation de ce nombre de copies. Nous nous sommes fixés quelques plasmides modèles dans lesquels nous avons inséré le gène d'une protéine fluorescente (mOrange). Ces plasmides ont été injectés dans une bactérie contenant le gène d'un autre rapporteur fluorescent (eGFP) sur son chromosome ce qui nous permet d'avoir une référence au sein de chaque bactérie. Nous avons ensuite observé ces bactéries transformées à l'aide d'un dispositif microfluidique développé au la- boratoire qui nous permet des observations de bas niveau de fluorescence sur des bactéries isolées. Pour chaque plasmide étudié, nous avons pu mesurer son PCN moyen par bactérie au sein de la population. Nous avons aussi évalué son PCN moyen à l'aide de techniques usuelles de biologie moléculaire, et avons obtenu approximativement les mêmes résultats. Nous avons constaté pour certains plasmides des variations d'expression de la mOrange plus grandes que pour la eGFP. Nous attribuons cette augmentation de la variabilité d'expression à la variabilité du PCN. Cette variabilité soit d'autant plus petite que le PCN moyen est grand. Ensuite, nous avons pu extraire des données la variation du PCN au sein de la population. Par ailleurs, nous donnons aussi à l'aide d'une méthode plus approximative la distribution du PCN par bactérie. Finalement, nous avons fait croître les bactéries dans un milieu contenant plus ou moins d'antibiotique dont la résistance est portée par le plasmide. Nous n'avons pas réussi à changer les caractéristiques des plasmides, mais avons pu regarder le phénomène de perte dans un de nos plasmides.

La cellule eukaryote est organisée en plusieurs compartiments, appelés organelles, délimités par des membranes. La fission des membranes est nécessaire pour le transport intracellulaire entre organelles. L'endocytose est un mécanisme de transport depuis la membrane plasmique vers les autres organelles. La Dynamine est une guanosine triphosphatase (GTPase) impliquée dans la fission des vésicules pendant l'endocytose médiée par la Clathrine. Elle polymérise en hélice au coup des bourgeons endocytiques. Après hydrolyse du GTP, la structure de l'hélice est modifiée : le rayon interne diminue de 10 à 5 nm et le pas hélical de 13 à 9 nm. Ces modifications indiquent un mécanisme de constriction. La dynamique de constriction est étudiée en suivant la rotation de microbilles attachées à des tubes lipidiques recouverts de Dynamine. La déformation des hélices de Dynamine est concertée et amortie par la friction entre membrane et Dynamine. Cependant la constriction ne suffit pas pour la fission. Pour comprendre davantage son mécanisme, la fission par la Dynamine est étudiée à l'aide de tubes lipidiques extraits de vésicules unilamellaires géantes. La fission se produit au bord de l'hélice, où la membrane est fortement courbée. D'après l'analyse statistique des temps de fission, la réaction de fission peut être modélisée par une unique barrière énergétique. La dépendance du temps de fission en rigidité de membrane, en tension de membrane et en couple est établie théoriquement et validée expérimentalement. Ce travail établit le profil énergétique de la réaction de fission membranaire et évalue à 70 kT la barrière énergétique.

Une étude expérimentale sur la structure et la dynamique d'un complexe hydraté de fragments d'ADN (150 pb) et des phases lamellaires de lipides zwitterioniques est présentée. Par la variation de d'hydratation, il est possible de contrôler le confinement imposé par cette matrice hôte sur les nucléotides insérés dans les couches aqueuses. L'organisation supramoléculaire du complexe est suivie par diffraction des rayons-X et des techniques de microscopie optique et électronique. Un riche polymorphisme de mésophases est observé en fonction du confinement. Dans le régime plus hydraté, les fragments se distribuent selon une orientation nématique. Dans la mesure où la quantité de l'eau diminue, le confinement des bicouches sur les nucléotides monte et des corrélations transmembranaires donnent origine à des phases hautement organisées, avec des symétries rectangulaires et hexagonales (2D) d'ADN dans la phase lipidique. L'incorporation totale des nucléotides par la phase lamellaire est observée uniquement lorsque des grandes quantités d'ADN y sont présentes. Ce fait souligne une importance majeure des interactions de volume exclu. Une analyse du paramètre de Caillé montre que l'insertion des fragments diminue les fluctuations des membranes. A partir des ces observations, il est suggéré que la modification des interactions stériques entre des lamelles, associée à des effets interfaciaux ADN-membranes, est un mécanisme important dans le comportement de phases. Les propriétés dynamiques sont étudiées avec la technique de retour de fluorescence après photo blanchiment (FRAP). Un modèle développé récemment pour l'analyse de diffusion anisotrope est testé avec succès, démontrant une corrélation proche entre structure et dynamique.

Dans les organismes photosynthétiques, la ferrédoxine:NADP oxydoréductase (FNR) fournit le NADPH nécessaire à l'assimilation du CO2, mais elle réduit aussi la ferrédoxine (Fd) à partir du NADPH. La cyanobactérie Synechocystis sp. PCC6803 contient deux isoformes de FNR : une forme courte (FNRS, 34 kDa) et une forme longue (FNRL, 46 kDa) qui est liée au phycobilisome (PBS), un complexe collecteur de lumière. Nous avons purifié un sous-complexe du PBS qui contient la FNRL (FNRL-PC) et comparé les propriétés enzymatiques de FNRL-PC à FNRS. Par rapport à FNRS, FNRL-PC présente des affinités plus faible/forte pour le NADPH/la Fd, conformément aux prédictions des activités relatives des deux isoformes. La plupart des différences observées sont attribuées à l'encombrement stérique amené par la phycocyanine dans FNRL-PC. En conditions de turnover multiple, les deux isoformes catalysent de la même manière la réduction de NADP+ et de plus le transfert d'électrons (TE) depuis Fdred est limitant à force ionique élevée. Lors d'études in vivo, nous avons observé une augmentation de l'oxydation du NADPH par TE respiratoire ou cyclique chez un mutant ne contenant que la FNRS et chez le type sauvage à faible CO2. Les mesures ont montré clairement que FNRS est impliqué dans ce TE alternative et nous proposons que FNRS constitue le module déshydrogénase de NDH-1. La localisation de la FNR et/ou la présence de substrats semblent être essentiels dans les rôles respectifs des isoformes de FNR in vivo. Des études futures devraient nous donner une vue plus complète des processus de TE in vivo et clarifier le rôle du TE dépendant du NADPH et favorisé par FNRS dans la réduction du pool de PQ.

Les tubes de membrane sont omniprésents dans les cellules vivantes eucaryotes. Ce sont des structures très dynamiques qui permettent en particulier la communication entre les différents compartiments de la cellule. Pour comprendre les mécanismes impliqués dans le trafic intracellulaire, il paraît essentiel d'isoler le rôle des différents constituants impliques. Dans ce but, un système minimal qui permet de mimer in vitro les différentes étapes d'extraction, de croissance et d'arrêt des tubes de membrane avec des éléments purifies ou artificiels (kinesines, microtubules, vésicules géantes unilamellaires) a été utilise. La comparaison des résultats expérimentaux avec ceux obtenus par une analyse théorique du système a ainsi permis de caractériser de fa¸con complète ces différentes étapes. Nous avons notamment montre l'existence d'un seuil de formation de tubes qui dépend essentiellement de deux paramètres non locaux supramoléculaires : la tension de membrane et la quantité de kin'esines 'a la surface des vésicules. Lorsque le tube est forme, nous avons évalue le nombre de moteurs qui le tirent et montre qu'ils s'accumulent de fa¸con dynamique au bout du tube. De la mesure de la longueur caractéristique d'accumulation, nous avons déduit un paramètre moléculaire : le taux d'attachement des kin'esines sur un microtubule dans une géométrie proche de celle observée in vivo. Enfin, nous avons mis en évidence un phénomène d'oscillations liées au comportement collectif de moteurs processifs pour des tubes très longs. Ce système, bien que simplifie, permet d'apporter une nouvelle approche du trafic intracellulaire, en proposant des mécanismes physiques qui sont souvent masques, dans les cellules, par des mécanismes mol'eculaires.

Un épithélium est un tissu formé de cellules étroitement juxtaposées dont la fonction est d'isoler des organes entre eux ou vis-à-vis du milieu extérieur. Nous étudions la croissance d'un épithélium en géométrie confinée. En utilisant des techniques de microfabrication, nous avons développé un protocole de traitement de surface permettant de confiner un tissu dans une zone adhésive pendant plusieurs semaines. La résolution spatiale de cette technique est micrométrique, et nous autorise la conception de motifs adhésifs de diverses géométries. Dans notre étude, leurs tailles sont telles que les cellules s'y comportent collectivement. Nous analysons la croissance d'un épithélium de cellules Madine Derby Canine (MDCK) dans des domaines adhésifs circulaires. La migration et la densification du tissu sont étudiées par PIV (Particle image velocimetry) et d'autres techniques d'analyse d'image. Nous caractérisons les champs de vitesse et observons des oscillations de grande amplitude de la vitesse dont la période correspond à l'hypothèse d'une onde de contraintes se propageant dans l'épithélium. Nous caractérisons également l'apparition d'un bourrelet tridimensionnel de cellules à la périphérie de l'épithélium, rappelant les premières étapes de la tubulogénèse. Dans deux autres expériences, en utilisant une géométrie inverse, nous étudions le recouvrement d'un épithélium sur une région anti-adhésive. Nous montrons que ce recouvrement nécessite un câble d'actomyosine supracellulaire, et que la tension de ce câble s'opposant à une tension de surface définit une taille critique au-delà duquel le motif anti-adhésif ne peut pas être recouvert par l'épithélium

Les travaux présentés dans cette thèse constituent une étude des mouvements collectifs des cellules épithéliales lors de la cicatrisation grâce à une méthode de réalisation des blessures à l'aide de pochoirs en PDMS. Cette méthode permet de créer des épithéliums présentant directement la forme choisie au lieu de détruire plus ou moins sélectivement des cellules, nous permettant d'évaluer le comportement des cellules soumises uniquement à un effet de " bord libre " : le seul moyen pour l'épithélium de " détecter " l'existence de la blessure est en effet l'exposition des cellules situées sur ses bords à une surface vierge.Nos observations ont permis de montrer que la cicatrisation constituait un phénomène de migration collective coordonnée des cellules, allant bien au-delà d'un simple étalement de l'épithélium. La cicatrisation s'effectue en effet par l'intermédiaire de digitations présentant à leur extrémité une cellule présentant un phénotype remarquable, s'étendant sur une surface beaucoup plus grande que les autres et très motile. Les expériences que nous avons menées vont dans le sens d'un mouvement collectif largement contrôlé par ces cellules leaders.

Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion des objets d'un système biomimétique modèle (lipides, protéines). L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'α-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2. La dépendance en taille, les valeurs obtenues et le mode opératoire simple permettent d'espérer la réalisation prochaine d'une véritable séparation électrophorétique pour un mélange de protéines.

Le but de ce projet est de développer de nouveaux outils pour explorer des processus d'organisation intracellulaire dynamique dans les cellules vivantes, avec une sensibilité sans précédent. Ce travail se concentre sur deux aspects principaux : le développement d'outils pour l'étude en molécule unique de la division cellulaire asymétrique, et la mise au point de sondes monovalentes qui permettent le suivi d'une protéine individuelle utilisant un nanocristal semiconducteur (ou quantum dot, QD). La division cellulaire asymétrique (DCA) est définie comme une division cellulaire dans laquelle une cellule mère donne naissance à deux cellules filles avec des destins différents (ce qui se manifeste à travers par exemple la taille, le contenu ou le profil d'expression). Notre étude se concentre sur la division cellulaire asymétrique dans les cellules souches neurales de Drosophila melanogaster, appelés neuroblastes. Au cours de la division asymétrique des neuroblasts, avant la séparation de la cellule-mère en deux cellules-filles, certaines molécules dans le cytoplasme se redistribuent de façon asymétrique (polarisée). Ce travail a montré la faisabilité de l'étude de la division cellulaire asymétrique à l'échelle de la molécule unique. Les méthodes ont été conçues et développées pour la conjugaison et la caractérisation des complexes QD-protéines. Nous avons réussi à cibler les protéines localisées de manière asymétrique dans des neuroblastes en division. Cela ouvre la voie à des études intracellulaires de ce phénomène, en utilisant des QDs individuels Ce travail a également mis en évidence la limite principale de ce système expérimental : la nature tridimensionnelle des mouvements. En raison de l'épaisseur de la neuroblate, les QDs sortent du plan focal très souvent. En conséquence, l'obtention des trajectoires suffisamment longues pour le calcul des paramètres de transport, devient très difficile. Toutefois, certaines informations peuvent encore être extraites des données que nous avons obtenues, en analysant la répartition spatiale de "courts-déplacements" dans les films obtenus. Les déplacements des QDs entre deux images consécutives sont regroupés et analysés en fonction de leur emplacement par rapport à une carte polaire normalisée d'un neuroblaste polarisé. Une telle analyse n'a pas besoin des trajectoires longues mais peut, quand même, révèler des differences dans la mobilité des protéines entre les differents domaines de la cellule. Cette analyse est actuellement en cours. Nous avons aussi réussi à produire des sondes monovalentes pour le suivi des proteines membranaires extracellulaires. Ces sondes sont basées sur un fragment de chaîne variable d'anticorp (ScFv). Ces sondes doivent avoir des nombreuses applications dans le suivi des diverses protéines membranaires, mais doivent être améliorées afin de répondre aux exigences rigoureuses du suivi intracellulaire.